CATEGORIE TECHNIQUE

Formation de Master en Sciences de lIngnieur Industriel - Packaging 1re anne.

B5a (physique) - bureau 4/57 Alle du 6 Aot, 17 B-4000 Lige (Sart-Tilman) Tl. : 04 / 366 22 90 / Fax : 04 / 366 22 93 Email : secr.technique@hech.be

Cours de Chimie Analytique et caractrisation des matriaux.

Steve Gillet, D. Sc.

Email : chimiehe@yahoo.fr Website : http://perso.latribu.com/shagar

La spectromtrie.

La spectromtrie.

1.1. Gnralits sur la spectromtrie

Introduction
Dans ce cours, nous allons tudier les diffrentes interactions qui peuvent exister entre la matire et un rayonnement lectromagntique. Plus spcifiquement, nous allons voir comme il est possible dinterprter les rsultats de cette interaction pour en dduire des informations quant la structure atomique et molculaire de la matire irradie et/ou pour doser cette matire. Nous allons galement aborder une technique qui repose sur un principe physique diffrent, mais qui permet galement didentifier la structure de la matire et de la quantifier : la spectromtrie de masse.

Rayonnement lectromagntique
Le rayonnement lectromagntique, dont la lumire est un exemple, est une forme dnergie constitue dondes, c'est--dire de phnomnes vibratoires caractriss par : une vitesse de propagation (en loccurrence c = 3.108 m.s-1, constante pour toutes les ondes lectromagntiques dans le vide), une frquence (nombre de vibrations par seconde) et une longueur donde (distance parcourue pendant une vibration). Ces 3 longueurs sont lies par la relation = c / . Bien quil y ait une continuit totale dans les valeurs possibles de longueur donde (ou de frquence), on distingue (arbitrairement) sur cette base des domaines particuliers du rayonnement lectromagntique, comme indiqu sur la figure 1.1. Il est bon de rappeler galement que lnergie dun rayonnement lectromagntique est relie sa frquence par la relation E = h.

Figure

1.1.

Domaines

particuliers

du

rayonnement

lectromagntique : A noter que lchelle des longueurs donde utilise sur ce schma est logarithmique, chaque intervalle correspondant un facteur de 10, et non une variation de 10 units. Il est galement intressant de voir que le domaine du visible, le seul auquel notre il est sensible, est extrmement troit et est limit entre 400 et 700 nm. A lintrieur de cet intervalle, la longueur donde dtermine la couleur perue.

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La spectromtrie. A chacun des domaines particuliers du rayonnement lectromagntique, ou presque, correspond un type de spectroscopie qui repose sur une interaction particulire de la matire avec ce rayonnement. Ainsi pour le domaine : Des et des RX, le rayonnement est extrmement nergtique et il va pouvoir affecter les lectrons des orbitales atomiques de cur. Ces Interactions sont utilises notamment dans la spectromtrie et dans la fluorescence X. Des UV et du visible, le rayonnement est nergtique et il va pouvoir affecter les lectrons des orbitales atomiques priphriques et/ou des orbitales molculaires. Ces interactions sont utilises notamment dans la spectromtrie

dmission atomique (SEA), la spectromtrie dabsorption atomique (SAA) et la spectromtrie molculaire (UV-vis). De linfra rouge (IR) le rayonnement est faiblement nergtique et ne peut affecter principalement que les modes de vibration des molcules. Ces interactions sont utilises notamment dans la spectromtrie IR et la spectromtrie Raman. Des micro-ondes, finalement, le rayonnement est trs faiblement nergtique et ne peut affecter que les modes de rotation des molcules. Ces interactions sont utilises notamment dans la spectromtrie micro-onde. Dans le cadre de ce cours, nous carterons les deux domaines extrmes pour ne nous attarder que sur lUV-vis. et lIR.

Spectre, spectroscopie et spectromtrie

La spectroscopie est ltude du spectre lectromagntique dun phnomne, visuellement (do le suffixe scopie). Depuis un certain temps, maintenant, lil a t remplac par diffrents types de dtecteurs photolectriques, moins subjectifs et il convient alors de parler de spectromtrie (le suffixe -mtrie indiquant que lon effectue une mesure et non une simple apprciation du phnomne). Dans de nombreux cas, il convient donc de remplacer le terme spectroscopie , par le terme plus exact de spectromtrie toutefois, les vieilles habitudes ayant la vie dure, il est courant de faire lamalgame entre ces deux termes. Quoiquil en soit, il nous reste dfinir le spectre. Il sagit de la distribution en nergie, puissance, intensit, absorbance, transmission, etc (signal en gnral) en fonction de la longueur donde ou de la frquence. On distingue 3 types de spectres : Les spectres continus, pour lesquels il existe un signal pour chaque longueur donde (ou frquence). Ex. Gauche de la figure 1.2. Les spectres discontinus, ou spectres de raies, ou encore spectres discrets, qui ne disposent dun signal que pour certaines frquences (longueurs donde)

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La spectromtrie. spcifiques, caractristique de la matire irradiante ou irradie. Ex. Milieu de la figure 1.2. Les spectres combins qui sont constitus dune superposition dun spectre continu et dun spectre discret. Ex. Droite de la figure 1.2.

Figure 1.2. : Diffrents types de spectre : Gauche : Spectre continue. Milieu : Spectre discret, discontinue ou de raies. Droite : Spectre combin.

mission et absorption
Il peut se produire des changes nergtiques entre la matire et un rayonnement dans deux sens : mission : dans certaines conditions, la matire peut mettre du rayonnement. Cest le cas, par exemple, de toutes les sources lumineuses : soleil, ampoule incandescence, flammes, tubes fluos , vers luisants, etc. Absorption : lnergie dun rayonnement peut tre absorbe par la matire. Lchauffement dun objet au soleil, labsorption des rayons X par les parties denses de notre corps, le phnomne de la couleur, en sont autant dexemples. Cette absorption peut avoir des effets chimiques en dclenchant des ractions chimiques. (Illustration en classe figure 1.3.)

1.2. Spectromtrie dabsorption et dmission atomique

Lexprience montre que les atomes nmettent un rayonnement que si on les soumet une excitation. Celle-ci peut se raliser par chauffage (ex. : flamme jaune en prsence de chlorure de sodium) ou par laction dun champ lectrique (ex. : dcharge dans un gaz). Les spectres obtenus partir des rayonnements ainsi provoqus sont des spectres de raies. Ils comportent un ensemble de frquences, caractristiques de chaque lment. Lanalyse des spectres dmission peut donc constituer une mthode danalyse chimique. Les mtaux sy prtent particulirement bien, et cest une mthode danalyse des Gillet Steve, D.Sc. -3-

La spectromtrie. alliages. Cest aussi en analysant la lumire reue des toiles que lon peut savoir quels lments chimiques y sont prsents. Les frquences caractristiques de chaque lment sont strictement invariables et on les utilise parfois comme talon pour la dfinition de certaines units. Le mtre, par exemple, est dfini comme la longueur gale 1 650 763, 73 longueurs donde dans le vide dune raie mise par le nuclide
133 86

Kr. La seconde, est dfinie

comme la dure de 9 192 631 770 vibrations pour lune des raies mises par le nuclide Cs.

Aspect thorique
La thorie des quanta La thorie des quanta a t formule pour expliquer divers phnomnes, notamment leffet photolectrique (arrachement dlectrons un mtal sous laction dun rayonnement de longueur donde suffisamment courte). Elle repose sur lide que lnergie ne peut pas tre change entre la matire et le rayonnement de manire continue, par quantits aussi petites que lon veut, la limite infiniment petites. Ces changes, quil sagisse dabsorption ou dmission du rayonnement, ne peuvent avoir lieu que par multiples entiers dune quantit minimale dnergie, gale un quantum. Il ne peut pas exister dchanges dnergie entre matire et rayonnement par quantit infrieure un quantum. Cela revient dire que lnergie, comme la matire, est discontinue. En plus de son aspect ondulatoire, qui explique certains phnomnes, on doit aussi lui attribuer un caractre corpusculaire, qui en explique dautres. Un rayonnement peut tre dcrit soit comme une onde, soit comme un flux de particules, les photons, qui reprsentent chacun un quantum dnergie. La valeur dun quantum dpend de la frquence du

rayonnement concern : 1 quantum (photon) =

h .

(joules). Quand un atome absorbe un

rayonnement de frquence , son nergie augmente de la quantit

h..

Et inversement, si

un atome met un rayonnement de frquence , il perd une quantit dnergie gale h..

Le modle de latome de Bohr La prise en compte de la thorie des quanta a conduit Bohr construire un nouveau modle de latome, dont les caractristiques essentielles sont les suivantes : Lnergie de llectron (qui reprsente en fait lnergie de llectron dans le champ dattraction du noyau, donc lnergie de lensemble du systme noyau + lectron )

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La spectromtrie. est quantifie, c'est--dire quelle ne peut prendre que certaines valeurs dtermines, appeles galement niveaux dnergie. chacune des valeurs possibles pour lnergie dun lectron correspond une trajectoire circulaire stable, sur laquelle llectron ne rayonne pas et ne perd donc pas dnergie, et une distance noyau-lectron. Les changements dnergie dun lectron ne peuvent seffectuer que par sauts discontinus dun niveau un autre. On appelle ces sauts des transitions. Si la variation dnergie associe une transition est E, la frquence du rayonnement absorb ou mis est dfinie par la relation E = h.. En labsence dune excitation extrieure, un lectron se trouve en permanence sur le niveau dnergie le plus bas possible. Si tous les lectrons dun atome sont leur plus bas niveau dnergie possible, latome est dans ltat fondamental, sinon il est dans un tat excit. Ce modle rend effectivement compte des observations qui peuvent tre faites propos des spectres dmission atomique. Puisque les lectrons sont normalement au niveau dnergie le plus bas possible, ils ne peuvent pas perdre dnergie. Lmission dun rayonnement ne peut donc avoir lieu que si une excitation (apport dnergie) les porte dabord un niveau suprieur, do ils pourront ensuite redescendre sur un niveau infrieur, en mettant un photon. Lexistence de niveaux dnergie bien dfinis, et celle de la condition E =

h.,

justifient les spectres de raies : seul un rayonnement dont la frquence satisfait cette condition pour lune des transitions possibles peut changer de lnergie avec latome, lmission comme labsorption. Labsorption dun photon de frquence convenable provoque des transitions montantes ; lmission de rayonnement a lieu loccasion de transitions descendantes , qui ramnent llectron au niveau fondamental, directement ou par tapes. Les sries de raies observes dans les spectres dmission correspondent lensemble des transitions descendantes qui aboutissent un niveau dtermin. Il est noter quil existe des rgles de slection, en fonction desquelles certaines transitions sont interdites. Il est noter quun lectron ne peut subir quune seule transition la fois et, si on raisonne sur un seul atome, le schma de la figure 1.3. ne peut justifier lobtention dun spectre dmission dans lequel on observe simultanment toutes les transitions (raies) possibles. Linterprtation microscopique ne rend pas compte de lexistence du phnomne observ au niveau macroscopique. Mais lchantillon avec lequel on produit ce spectre

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La spectromtrie. contient toujours, si petit soit-il, un nombre norme datomes (54 milliards de milliards dans 1 ml, 0C et sous 1 atm) et tout moment, au sein de cet chantillon, toutes les transitions peuvent avoir lieu.

Aspect pratique (mission) Gnralits

Nous venons de voir dans la partie thorique que des atomes excits peuvent voir leurs lectrons retomber des niveaux dnergie plus faible avec mission simultane dune radiation, dont la longueur donde (et donc lnergie) correspond la diffrence dnergie entre les deux niveaux envisags (E =

h .

h.c

/ ). Ces diffrences de niveaux

nergtiques sont caractristiques pour chaque atome, il est donc possible en les identifiant, de dterminer la nature de latome qui les met : on dispose donc dune mthode didentification des atomes. On peut distinguer deux types de spectromtrie dmission atomique en fonction de la nature de la source dexcitation et donc de la plage dnergie mise en uvre : Si lexcitation est dorigine thermique (flamme, plasma dargon,) ou lectrique (atomisation par arc, tincelle,), lnergie mise en uvre est relativement limite et les raies mises se situeront dans le domaine de lUV et du visible (plage dnergie qui correspond aux lectrons priphriques). On parle alors de Spectromtrie dmission Atomique (SEA en franais et AES : Atomic Emission Spectroscopy en anglais) ou encore de Spectromtrie dmission Optique (SEO en franais et OES ; Optical Emission Spectroscopy en anglais). Si lexcitation a pour origine un bombardement lectronique ou lectromagntique de haute nergie ( ou X), le spectre de raies se place dans le domaine des rayons X (plage dnergie correspondant aux lectrons internes). On parle en gnral, dans ce cas, de spectromtrie de Fluorescence X (FRX en franais et XRF : X-Ray Fluorescence en anglais). Dans la suite de ce cours, nous allons surtout nous concentrer sur lmission atomique dans le domaine de lUV-Vis., puisque cest la technique laquelle vous risquez le plus de vous retrouver confronts.

Composition dun spectromtre dmission

Schma gnral

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La spectromtrie. Dans le cas de la spectroscopie dmission atomique, la source de rayonnement est constitue de lchantillon, lui-mme, sous forme datomes excits. Le but de lexcitation est triple : Vaporiser lchantillon (solide ou solution). Atomiser la vapeur (idalement, la distribution des lments doit, ce stade, tre li de faon reproductible leur distribution dans lchantillon. Exciter les atomes libres et les ions forms pour les faire mettre un spectre lectronique caractristique.

Figure 1.4. : Schma gnral dun spectromtre dmission atomique : Une source-chantillon (ici, une flamme), un monochromateur (ici, un prisme), un dtecteur (ici, un CCD) et un systme de traitement du signal (ici, un ordinateur).

Comme nous lavons dj signal brivement, il existe plusieurs techniques dexcitation, que nous verrons un peu plus en dtail dans la suite de ce cours. Quoiquil en soit, les paramtres cruciaux communs toutes ces mthodes sont la stabilit et la reproductibilit, puisquils reprsentent souvent la seule limite de prcision de la mthode. Notons galement, ds maintenant, que larchitecture mme du systme superpose au spectre de raies qui nous intresse : o Un spectre continu provenant des lectrodes chaudes dans le cas dun arc ou dune tincelle ou de la recombinaison ions-lectrons dans le cas dun plasma. o Un spectre de bandes provenant des espces molculaires ventuellement produites haute temprature : par exemple, si on utilise un arc au graphite, on observe souvent des raies molculaires C-C et C-N (air) ou des raies OH. La spectroscopie dmission atomique requiert ensuite la dispersion du rayonnement polychromatique, issu de la source-chantillon, en srie de zones de faibles largeurs sur le plan des longueurs dondes (en raies). Pour ce faire, on utilise un monochromateur, dont nous parlerons plus en dtail dans la suite de ce cours. Une fois le rayonnement mis par lchantillon dcompos en ses constituants, il est ncessaire de dtecter ces derniers. Mises part la dtection visuelle et la dtection

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La spectromtrie. photographique, quasi abandonnes cause de laspect subjectif de lune et de lincompatibilit pour lanalyse quantitative de routine de lautre, il existe diffrents types de dtecteurs qui font appel la conversion de lnergie radiante en nergie lectrique, ce sont les dtecteurs lectriques. Nous verrons plus en dtail le fonctionnement de quelques uns de ces dtecteurs. Finalement, le signal dtect doit tre trait graphiquement la main (ce qui devient de plus en plus rare) ou via un ordinateur.

Sources dexcitation La flamme : Il sagit dun moyen dexcitation purement thermique. La solution contenant la substance analyser est injecte directement dans la partie centrale de la flamme sous forme darosol. La figure 1.5 reprsente une coupe longitudinale schmatique dun brleur de Beckman, dans lequel le comburant (ici de loxygne) assure laspiration de la solution. Dans la flamme, la gouttelette de solution se vaporise et, de manire dpendante de la temprature de la flamme, un certain nombre datomes sont excits lectroniquement par voie thermique.

Figure 1.5. : Coupe longitudinale schmatique dun brleur Beckman : Lchantillon, en solution, est aspir dans la flamme par le comburant, ici de loxygne.

Sachant que la distribution dnergie thermique rpond une distribution de Boltzmann (au comportement comparable la distribution de Maxwell-Boltzmann vue dans la section consacre la cintique des gaz), on se rend compte que plus la temprature de la flamme est leve, plus il y a aura datomes possdant une nergie suffisante pour provoquer une transition responsable dune raie et que donc lintensit de cette dernire sera plus importante. Donc, plus la flamme est chaude, plus on gagne en sensibilit. En outre, des tempratures plus leves permettent dexciter des lments de potentiel dionisation de plus en plus levs. Ainsi, 3000 C, il est possible de dtecter jusqu une soixantaine dlments. Cela dit, cest principalement pour lanalyse des alcalins et des alcalino-terreux, facilement ionisables (potentiels dionisation bas : 4 5 eV), que cette mthode est la plus

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La spectromtrie. utilise. Le tableau suivant reprend quelques exemples de comburants / carburants possibles, ainsi que la temprature de la flamme associe : Comburant air 1850 C 1900 C 2100 C 2200 C dioxygne 2800 C 2900 C 2780 C 3050 C 4550 C 2600 2800 C

Combustible Gaz naturel Butane Hydrogne Actylne Cyanogne Actylne + NO (% divers)

Larc et ltincelle : Ces sources utilisent une dcharge disruptive de haute tension (tincelle) ou une dcharge lectrique continue (arc) entre deux lectrodes pour vaporiser et exciter les atomes analyser. Les lectrodes peuvent tre en mtal ou en graphite. Si lchantillon analyser est un mtal, il peut dailleurs servir lui-mme dlectrode. Les chantillons non-conducteurs sont placs dans llectrode de graphite infrieure en forme de coupelle. Nous ntudierons pas plus en dtail ces mthodes dexcitation, puisquelles ont t remplaces dans de nombreuses applications par les plasmas ou les sources lasers et ne sont pratiquement plus utilises que dans lindustrie des mtaux.

Figure 1.6. : Schma dune source arc ou tincelle : Dans le cas illustr, lchantillon analys nest pas conducteur, il est donc plac dans une lectrode de graphite qui possde une forme de coupelle.

Le Plasma Haute Frquence Couplage Inductif (Inductively Coupled Plasma, ICP) : Par dfinition, un plasma est un mlange gazeux dans lequel une fraction importante des espces prsentes est sous forme dions. En gnral, on utilise un plasma dargon. Quand un chantillon est introduit dans ce milieu, latomisation se produit en raison de la temprature leve (jusque 10 000 K). Les ions dargon, une fois forms dans le plasma, sont capables dabsorber suffisamment dnergie dune source extrieure pour que se maintienne la temprature requise la continuation du processus dionisation. Quatre sources de puissance ont t utilises en spectroscopie au plasma dargon :

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La spectromtrie. Une source de courant continu capable de maintenir une intensit de plusieurs ampres entre deux lectrodes plonges dans un courant dargon (on parle alors de DCP = Direct-Current Plasma, en anglais). Un laser CO2 de haute puissance (on parle alors de LIPS = Laser Induced Plasma Spectroscopy ou de LIBS = Laser Induced Breakdown Source). Un gnrateur de micro-ondes. Un gnrateur de radiofrquence (ICP en tant que tel). Dans ces deux derniers systmes, il y a transformation de lnergie magntique en nergie thermique. Lorsque la frquence du champ magntique est convenable, il y a couplage inductif, lionisation et la temprature du plasma saccroissent notablement. Le systme radiofrquences tant lune des sources les plus courantes en spectroscopie de plasma dargon, nous nous y attarderons un peu plus. La figure 1.7 donne le schma dune source ICP. Elle est constitue de trois tubes concentriques de quartz au travers desquels passe un flux dargon. La partie suprieure des tubes est entoure dun enroulement inductif, refroidi leau, raccord un gnrateur de hautes frquences qui produit une puissance rglable de lordre de 1 3 kW 27 MHz. Tel quel, le systme ne pourrait produire de plasma, mme si le gnrateur HF fonctionne. Par contre, si on ionise largon par une dcharge de Tesla, juste avant quil nentre dans lenroulement inductif, les ions et les lectrons forms interagissent avec le champ magntique oscillant. Cette interaction fait se mouvoir les ions et les lectrons en des trajectoires circulaires. Ils sont freins dans leur mouvement par le gaz qui schauffe par effet Joule et sionise progressivement. Le plasma ainsi form sentretient de lui-mme. La temprature du gaz atteignant 8 000 10 000 K, une isolation thermique est requise entre les deux tubes de quartz les plus extrieurs. On obtient celle-ci par un flux dargon introduit tangentiellement aux parois.

Figure

1.7.

Coupe

longitudinale

schmatique dune torche ICP.

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La spectromtrie. Linjection de lchantillon se fait sous forme darosol par un flux dargon grce un nbuliseur pneumatique ou ultrasons. La forme torodale du plasma permet aux particules darosol de passer en son centre, les exposant une temprature trs leve pendant une priode relativement longue (2,5 ms). Cette forme particulire du plasma nest possible que grce la haute frquence du gnrateur ( 5 MHz, le plasma a une forme plus sphrique). Le cur, le plus chaud, a un aspect blanc intensment brillant et ne dpasse le tube dinduction que de quelques millimtres, mettant un rayonnement quasi continu d des recombinaisons ions-lectrons. A ce rayonnement se superpose le spectre atomique (raies) de largon. Entre 10 et 30 mm au dessus de lenroulement inductif, le rayonnement continu disparat, le plasma est optiquement transparent et est en outre quasi exempt des raies de largon. Cest souvent cette zone de temprature quasi uniforme, qui sert lanalyse. LICP reprsente donc une source dexcitation particulirement intressante : Les temps de rsidence levs et la haute temprature sont particulirement favorables, ce qui se traduit pas une augmentation importante de la sensibilit par rapport la flamme. Latomisation se fait en atmosphre inerte au sein du canal axial du plasma torodal de temprature assez uniforme. Moyennant rgulation de lalimentation en puissance de la source, la stabilit de lmission permet datteindre une erreur relative de 0,5 1 % dans une grande zone de concentration. Elle prsente toutefois un inconvnient majeur : le cot lev de ces instruments et de leur utilisation (argon).

Monochromateurs Les monochromateurs pour lUV, le visible et lIR sont similaires sur le plan de la construction dans le sens quils emploient les mmes lments constitutifs : Une fente dentre, s, pour donner au faisceau une forme et des dimensions bien dfinies. Un collimateur dentre C1 de distance focale F1 (lentille ou miroir) pour produire un faisceau parallle de radiations. Un disperseur D (rseau ou prisme). Un lment de focalisation C2 de distance focale F2 (lentille ou miroir) qui forme limage de la fente dentre sur une surface plane (plan focal PF). Un plan focal PF

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La spectromtrie. Tous ces lments sont centrs sur laxe optique AO. En outre, la plupart des monochromateurs ont des fentres dentre et de sortie destines protger les composants contre la corrosion.

Figure 1.8. : Deux montages courants de monochromateurs : (a) : Un rayon lumineux vert (V) pntre par la fente dentre (s) avant dtre redress en un faisceau parallle par la lentille de collimation (C1). En passant dans le prisme (D), la lumire est disperse en ses deux composantes jaune (J) et bleue (B). Finalement, la lentille de focalisation (C2) concentre les rayons disperss sur le plan de focalisation (PF). Ce type de monochromateur porte le nom de montage prisme de Bunsen . (b) : Un rayon lumineux vert (V) pntre par la fente dentre (s) avant dtre redress en un faisceau parallle par un miroir concave (C1). En passant sur le rseau rflection (D), la lumire est disperse en ses deux composantes jaune (J) et bleue (B). Finalement, un deuxime miroir concave (C2) concentre les rayons disperss sur le plan de focalisation (PF). Ce type de monochromateur porte le nom de montage rseau de Czerney-Turner .

Dtecteurs Le dtecteur, dans un spectromtre, va jouer le rle qua la rtine dans lil, c'est-dire convertir les impactes photoniques en impulsions lectriques, qui seront ensuite traites. Il est donc logique que le premier dtecteur utilis ait t lil. Mais cette mthode, trop subjective a rapidement laiss la place la dtection par mulsions photographiques. Comme cest le cas pour la photographie, la rapidit et la facilit, du traitement numrique, ont progressivement pouss les scientifiques avoir recours la dtection lectrique pour remplacer lmulsion photographique. Les diffrents dtecteurs lectriques possdent plusieurs paramtres caractristiques quil convient de comparer pour dterminer quel type de dtecteur convient le mieux lutilisation que lon compte faire du spectromtre (ex. : analyse qualitative et / ou quantitative, mesures en routine et / ou pisodiques, analyse en

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La spectromtrie. continu et / ou ponctuelles de phnomnes rapides et / ou lents, etc). Le tableau suivant reprend ces diffrents paramtres, ainsi que leur dfinition :

Paramtre Rponse spectrale Rsolution Sensibilit Efficacit quantique Ecart dynamique (linarit) Rapport signal sur bruit Lag blouissement

Dfinition Plage des longueurs dondes dans laquelle il y a une rponse du dtecteur. Capacit du dtecteur discriminer deux points cte cte comme tant spars. Rapport entre le courant produit et la quantit de lumire reue. Probabilit quun photon incident provoque lapparition dun lectron. Rapport entre le signal le plus lev et le plus faible qui peuvent tre enregistrs linairement. Rapport entre la grandeur du signal et celle du bruit. Quantit de signal restant dans le photolment de la mesure prcdente. Possibilit de dbordement du signal dune zone intensment illumine vers les zones voisines.

Barrettes de diodes (PDA = Photo Diode Array) : Ce dtecteur est constitu dune range de photodiodes individuelles. Les photodiodes, habituellement constitues dune couche de semi-conducteur entre deux lectrodes, produisent un courant lectrique fonction de la quantit de rayonnement lumineux quelles reoivent. Capteur transfert de charge (CCD = Charged Coupled Device) : Ce type de dtecteur est en gnral constitu dun tableau de pixels (consistant en une photodiode de silice), qui stockent les charges produites lorsquun photon les heurte. Au bout dun temps dtermin, la charge accumule de chaque pixel est transfre de photodiode photodiode jusqu un registre avant dtre amplifie et numrise (AD = Analogic to digital). Capteur pixels actifs (APS = Active Pixel Sensor ou encore CMOS = Complementary Metal Oxide Semi-conductor) : Concurrent direct du CCD, il est lui aussi constitu dun tableau de pixels qui comportent chacun un lment photosensible, un amplificateur et un convertisseur analogique numrique. Cest en quelque sorte une version sur puce des barrettes de diodes. Comparaison de trois dtecteurs commerciaux de types diffrents :

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La spectromtrie.

Dtecteur Type # pixels, pitch* Sensibilit Signal / bruit Plage de longueurs dondes

TAOS 102 PDA 102, 85 m 100 V.lx .s 1000 : 1 360 1100 nm

-1 -1

HAM 1024 CMOS 1024, 25 m 22 V.lx .s 2000 : 1 200 1000 nm

-1 -1

Sony 2048 CCD 2048, 14 m 160 V.lx-1.s-1 250 : 1 200 1000 nm

*pitch : distance entre deux pixels

Applications de la spectroscopie dmission

Pour finir la partie de ce cours concernant la spectroscopie dmission, nous citerons simplement quelques exemples dapplications (les valeurs numriques donnes dans ces exemples correspondent lutilisation dun ICP-OES) : Dtection de la prsence de mtaux lourds, et leur quantification, dans des chantillons deau. On peut typiquement dtecter une trentaine dlments et les quantifier des concentrations de lordre de 0,01 5 g.l-1. Dtection dlments traces dans des mtaux tels que lor, le cobalt, le nickel ou le palladium (de lordre du g.kg-1). Dtermination de la prsence de plomb, chrome, cadmium et mercure dans des polymres. Analyse dchantillons cliniques ou pharmaceutiques pour dterminer, par exemple, la quantit de sodium, potassium, magnsium, calcium, aluminium et chlore quils contiennent.

Aspect pratique (absorption) Bref historique

Lhistorique de la spectroscopie dabsorption atomique est li aux observations du spectre solaire au dbut du 19me sicle. En 1802, Wollaston dcouvrit des raies noires dans le spectre brillant de la lumire solaire. Ce phnomne, tudi plus en dtails par Fraunhofer (1814), fut partiellement interprt par Brewster (1832) et lucid par Kirchoff (1860) qui montra que les raies noires taient dues labsorption par divers lments (H, O, Ca, Na, etc.) prsents dans latmosphre solaire. Avec Bunsen (1861), Kirchoff jetait ainsi les bases dune nouvelle mthode danalyse chimique. Ils montrrent notamment, par une exprience dsormais classique (figure 1.9), que la raie jaune typique mise par le sodium dans une flamme tait identique la raie noire catalogue D dans le spectre solaire. A la

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La spectromtrie. suite de ses expriences, Kirchoff mit la loi suivante, base de labsorption atomique : tout corps chimique peut absorber certaines radiations quil met lui-mme.

Figure 1.9. : Schma de lexprience de Kirchoff et Bunsen : Le schma du dessous reprsente la dispersion du rayonnement dmission du sodium et celui du dessous, les raies noires (dabsorption) obtenues lors de la dispersion dun rayonnement solaire aprs passage au travers dun nuage de sodium. On voit que les raies dmission correspondent bien aux raies dabsorption pour llment sodium.

Gnralits
Nous savons quun atome excit thermiquement ou lectriquement un tat E2 met une radiation de frquence lorsquil revient un tat infrieur E1. Cest le phnomne dmission que nous avons dj amplement tudi et qui est rgi par lquation de Planck

h. = E2 E1. Labsorption atomique rsulte du processus inverse, savoir labsorption du

photon

h. (de mme nergie) qui fait passer latome de ltat E1 ltat E2 (dnergie

suprieure). Ainsi, lintensit dune onde lumineuse de longueur donde (I ) traversant un chantillon homogne s qui absorbe cette longueur donde, diminuera progressivement pendant toute la dure de son trajet travers lchantillon. Il a t dtermin quil existe une proportionnalit entre la fraction absorbe (dI traverse

/ I)

et lpaisseur

dx, normale au trajet lumineux. De l, on peut dduire :

dI = k s dx . Dans cette I

relation, k s est une constante pour une longueur donde et un milieu donns. Lintgration de cette quation pour un trajet allant de 0 la longueur

l de lchantillon, ce qui correspond I

(aprs

la diminution de lintensit lumineuse depuis I0 (avant passage dans s) jusqu

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La spectromtrie.
I0 = k s .l . Cette dernire I

passage dans s), donne une quation appele loi de Lambert : ln

relation scrit frquemment en passant aux logarithmes dcimaux et on appelle

I0 k s .l s .l . Dans cette relation, s est absorbance , A, le rapport A log = 2,302 I

appel coefficient dabsorption la longueur donde du milieu s. Il arrive galement que lon parle de transmission au lieu dabsorbance, pour dsigner, cette fois, le pourcentage de lumire transmise, soit T %

I 100 100 et on a ainsi : A = log . T I0

Notons que toutes ces considrations sont valables non seulement pour labsorption atomique, mais galement pour labsorption molculaire (spectroscopie UV-Vis) que nous allons tudier plus en dtail dans une section ultrieure. Sachant cela, nous pouvons poursuivre notre raisonnement au cas dune solution assez dilue pour laquelle labsorbance du solut (1) est donne par la relation :

A = 1 .C1 .l

loi de Beer-Lambert

Les units les plus courantes sont la mole par litre pour la concentration (C en mol.l-1) le centimtre pour la longueur (l en cm) et, ds lors, le coefficient dabsorption molaire est exprim en litre par centimtre par mole ( en l.cm-1.mol-1) puisque labsorbance na pas dunit. Il est important de garder lesprit que des carts par rapport la loi de BeerLambert peuvent exister. Ces dviations peuvent avoir deux origines : Chimique ou physico-chimique (seulement dans le cas de la spectroscopie molculaire) : Si la concentration en solut est trop leve, il peut apparatre des interactions entre ses molcules, ainsi quune modification de lindice de rfraction de la solution, ce qui peut faire varier le coefficient dabsorption molaire. Instrumentale : o Si la lumire incidente nest pas suffisamment monochromatique, c'est-dire si la largeur de la bande spectrale incidente nest pas suffisamment petite vis--vis de la largeur de la bande spectrale dabsorption, labsorbance nest plus une fonction linaire de la concentration. o Le rayonnement sortant dun monochromateur peut tre contamin par de la lumire diffuse (provenant de diffusions et de rflexions dans le montage),

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La spectromtrie. engendrant le mme genre de problme que la polychromaticit de la lumire incidente. o La non linarit du dtecteur peut galement causer un cart apparent la loi de Beer-Lambert.

Composition dun spectromtre dabsorption atomique

Schma gnral La figure 1.10 reprsente le schma dun spectromtre dabsorption atomique :

Figure 1.10. : Schma gnral dun spectromtre dabsorption atomique : Une source de rayonnement (ici, une lampe), un chantillon (ici, latomiseur est une flamme), un monochromateur (ici, un prisme), un dtecteur (ici, une photodiode) et un systme de traitement du signal (ici, un ordinateur).

Les diffrents lments constitutifs en sont : Une source mettant le spectre de raies de llment doser. Un atomiseur qui transforme lchantillon (solution) analyser en une population datomes. Un monochromateur qui isole la raie de rsonance en liminant les autres raies de la source et autant que possible, lmission propre de la flamme. Un photomtre dtection photolectrique qui mesure lintensit de la raie de rsonance en prsence et en labsence de la population datomes absorbants dans la flamme. La prcision des mesures, dans ce type de systme simple faisceau, est tributaire de la stabilit de lensemble et de latomiseur en particulier, en fonction du temps. Il nest possible dliminer ce problme quen ayant recours au systme double faisceau.

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La spectromtrie.

Figure 1.11. : Schma dun spectrophotomtre dabsorption atomique double faisceau : Un miroir rotatif permet la fois de hacher la lumire (ce qui permet de diminuer linfluence de lmission dexcitation de llment analys, dans la flamme) et de la faire passer alternativement dans latomiseur et dans le faisceau de rfrence. Les deux faisceaux sont alors recombins gomtriquement par un miroir semitransparent (Mst) situ derrire latomiseur.

Sources Les qualits essentielles dune source utilisable en spectroscopie optique sont : une stabilit et une puissance suffisantes. La puissance lumineuse dune source varie de manire exponentielle avec la puissance lectrique du gnrateur. La stabilit est donc assure par la rgulation de la puissance lectrique. Lampes cathode creuse : De tels systmes produisent des spectres de raies caractristiques dun grand nombre dlments. La figure 1.12 en donne un schma. La cathode est construite au moyen du mtal dont on dsire mesurer le spectre ou est recouverte dune couche de ce mtal. Ces lampes sont donc spcifiques. On construit cependant des lampes multi-lmentaires dans lesquelles la cathode est recouverte dun mlange des lments analyser. Un potentiel appliqu entre les lectrodes provoque lionisation du gaz et on obtient un courant de 5 10 mA par migration des ions aux lectrodes. Si le potentiel est suffisant, les cations en heurtant la cathode lui arrachent des atomes de sa surface, ce qui produit un nuage atomique (processus de pulvrisation). Une partie de ces atomes est dans un tat excit, ils retournent vers ltat fondamental par mission de radiations caractristiques. La conformation cylindrique de la cathode favorise la concentration du rayonnement en une rgion limite du tube. Elle augmente aussi la redposition, sur la cathode, des atomes de mtal plutt que sur les parois du tube.

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La spectromtrie.

Figure 1.12. : Schma dune lampe cathode creuse : La cathode creuse est fabrique au moyen du mtal dont on dsire mesurer le spectre ou est recouverte dune couche de ce mtal ou dun mlange de mtaux.

Atomiseurs Le rle de latomiseur est de raliser une population datomes reprsentative de la composition de lchantillon en solution. Atomiseurs flamme : Nous nentrerons pas ici dans les processus qui se produisent dans le systme nbuliseur-brleur, ni des exigences de stabilit de fonctionnement, ces deux points ayant dj t abords lors de ltude de lmission dans la flamme. Dans le cas prsent, la flamme doit tre suffisamment chaude pour obtenir une atomisation maximale ; elle ne peut galement tre trop chaude car on veut viter au maximum les phnomnes dexcitation et dionisation. Nous avons vu, cependant, que mme 3000-4000 K, la proportion datomes excits est faible, sauf pour les lments trs bas potentiel dionisation. La population est donc essentiellement constitue, en gnral, datomes neutres non excits. Il y a par ailleurs moyen de pallier aux inconvnients dus lmission de flamme par hachage du faisceau incident, mais nous nentrerons pas dans les dtails de ce procd. Le problme de formation doxydes reprsente un autre problme technique contourner. On le minimise soit en augmentant la temprature de la flamme, soit en utilisant un mlange gazeux plus riche en combustible. Les flammes les plus courantes sont : Air propane 1950 C, air actylne 2200 C et N2O actylne 2950 C. Frquemment, on utilise des brleurs allongs dun trajet optique atteignant 10 cm, ce qui augmente la sensibilit, et la nbulisation est produite par ultrasons, technique qui fournit des gouttelettes de volume plus uniforme que par simple aspiration.

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La spectromtrie.

Figure

1.13.

: le

Schma

dun

brleur qui

de

spectromtre dabsorption atomique : Notons spcifiquement nbuliseur, assure laspiration et la pulvrisation de lchantillon dans la chambre de mlange des gaz. Les gouttelettes qui seraient trop grosses pour assurer une bonne atomisation dans la flamme sont prcipites par le dispositif de triage, avant de scouler vers lvacuation.

Atomiseurs sans flamme fours en graphite : Le systme le plus utilis est le four tubulaire de Massmann (Figure 4.16). Le chauffage est ralis par effet Joule dans le tube graphite lui-mme. On introduit un petit volume de solution (5 10 l) dans un tube par lorifice (a) du tube de graphite. En gnral, on a sa disposition la slection dun programme automatique qui assure les meilleures performances dans chaque cas particulier. Par exemple : schage 15 100 C, minralisation 60 400 C, atomisation 10 2100 C (mesure de labsorbance), nettoyage de four 5 2600 C. La limite de dtection peut tre 1000 fois plus basse avec le four de Massmann quavec une flamme. La cadence danalyse est cependant plus faible quavec une flamme.

Figure 1.14. : Schma dun four en graphite de type Massmann : a) b) c) d) e) Orifice du tube de graphite Cne en graphite Ouverture dintroduction de lchantillon Support Isolant

Monochromateurs Cfr. spectromtre dmission atomique, avec une prdominance des systmes rseau.

Dtecteurs Cfr. spectromtre dmission atomique.

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La spectromtrie.

Avantages et inconvnients de la spectroscopie dabsorption atomique

En dpit de la ncessaire mise en solution des chantillons, qui peut tre lente et dlicate, on peut citer au crdit de labsorption atomique : Rapidit des mesures Spcificit spectrale Bonne prcision relative Excellente limite de dtection pour un grand nombre dlments. A ce niveau, dailleurs, lexprience montre que lmission et labsorption atomiques sont deux techniques complmentaires. Par contre, la nature mme de la source (majoritairement des lampes cathode creuse) proscrit lanalyse multilmentaire simultane. Il sagit donc dune analyse squentielle. Nous lavons signal, le commerce fournit des lampes multilmentaires, mais, en gnral, leur rapport signal / bruit est plus faible que celui des lampes monolmentaires. En outre, le risque dinterfrence augmente avec le nombre dlments. Les lampes multilmentaires peuvent cependant tre utiles en analyse de routine.

Applications de la spectroscopie dabsorption atomique

Elles touchent de nombreuses disciplines et sont souvent comparables aux applications de lmission atomique. En voici quelques unes : Analyse clinique : analyse de mtaux dans les fluides biologiques comme le sang et lurine. Analyse environnementale : dtermination de la quantit de certains lments dans leau des rivires, de la mer, de leau potable et dans le ptrole. Industrie pharmaceutique : Lutilisation courante de catalyseurs (mtalliques) dans la synthse de mdicaments, ncessite la vrification de labsence de traces de ce dernier dans les produits finis. Industrie minire : En dterminant la quantit dun lment dtermin dans des chantillons de minerais, il est possible dvaluer la rentabilit de lexploitation ce ces minerais. Mdecine lgale : Dosage de substances toxiques (ex. : arsenic) dans des tissus (cheveux, ongles, etc.) Alimentation et cosmtique : Dosage de substances toxiques.

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La spectromtrie.

1.3. Spectromtrie UV Vis

Aspect thorique
Ce type de spectromtrie repose principalement, pour les molcules organiques, sur des interactions entre les rayonnements lectromagntiques et les lectrons des orbitales molculaires, et plus spcifiquement des lectrons et des paires libres. On appelle alors chromophore les groupes fonctionnels insaturs porteurs de tels lectrons. Cest une spectromtrie base sur labsorption du rayonnement lectromagntique et les spectres UV-vis seront en gnral reprsents en Absorbance en fonction de la longueur donde (A vs ). Dans la majeure partie des cas, les spectres UV-visibles sont continus et constitus de bandes larges (exception faite des spectres de lanthanides et actinides) qui correspondent la superposition de transitions lectroniques (fortement nergtiques), vibrationnelles (faiblement nergtiques) et de transitions rotationnelles (trs faiblement nergtiques). Ces spectres prsentent un ou plusieurs maximum(s) dabsorbance, auquel correspond une longueur donde note max, qui sera, dans le cas des molcules organiques, plus ou moins caractristique dun certain motif de dlocalisation des lectrons. Cela dit, les spectres UV-vis ntant pas fins, de sorte que plusieurs molcules peuvent prsenter le mme spectre, ils ne servent en gnral pas une identification des structures, mais se rvlent trs pratiques au niveau des dosages. En effet, labsorbance UV-vis, dans certaines conditions, est fonction de la concentration suivant la loi de Beer-Lambert : A = lC (o est le coefficient dextinction une longueur donde donne, pour une famille de composs donne ; l est le trajet optique et C est la concentration de la solution tudie). Notons que est de lordre de 10 100 l cm-1 mol-1 pour les transitions n* et de 103 104 l cm-1 mol-1 pour les transitions *. En pratique, donc, le spectre UV-vis est surtout reprsentatif des transitions *.

Figure 1.15. : Deux exemples de spectres molculaires : Notons que ces spectres sont continus et que les bandes sont relativement larges. A noter galement, sur le spectre de droite, les bandes correspondant aux transitions n* et *.

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La spectromtrie.

Quest-ce qui, dans la structure dune molcule organique, va influencer la valeur de lmax ?
Influence de la dlocalisation Supposons les molcules suivantes concentrations gales dans une solution :

Molcule Types de liaisons 1 C=C 10 000 184 2 C=C non conjugues 20 000 185 2 C=C conjugues 21 000 217

(l cm-1 mol-1) max (nm)

On peut constater que la dlocalisation a deux effets : Effet hyperchromique : Alors que pour des liaisons non conjugues, la valeur du coefficient dextinction est simplement proportionnel au nombre de liaisons doubles, pour des liaisons conjugues, on observe une augmentation importante d. Effet bathochromique (red shift) : La dlocalisation dplace le maximum dabsorbance vers des longueurs donde plus leves. En rsum, plus la dlocalisation sera importante, plus et max seront importants. (Illustration en classe figure 1.16) Influence du solvant Laugmentation de la polarit du solvant saccompagne, en gnral, dun effet bathochromique pour les transitions * et dun effet hypsochromique (blue shift = dplacement vers des longueurs dondes plus faibles) pour les transitions n*.

Figure 1.17. : Effet du solvant sur le spectre molculaire de la benzophnone : La courbe 2 discontinue correspond au spectre pris dans un solvant plus polaire. Effet bathochromique (red shift) pour les transitions * et effet hypsochromique (blue shift) pour les transitions n*.

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La spectromtrie.

Influence des auxochromes Un auxochrome est un substituant prsent sur le chromophore, qui nabsorbe pas, lui-mme, une longueur donde suprieur 200 nm, mais qui modifie tout de mme le spectre dabsorption. Ce type de groupement possde en gnral une paire libre dlectrons qui va pouvoir se dlocaliser sur lensemble des doubles liaisons conjugues et avoir un effet bathochromique et parfois, hyperchromique. Si on prend lexemple du thiophnol, par rapport au benzne, on observe des effets bathochromique et hyperchromiques importants, alors que le groupement SH, en lui-mme, nabsorbe pas une longueur donde suprieure 200 nm. Notons galement que cest la prsence dun ou plusieurs auxochromes qui explique la variation de couleur des indicateurs pH en fonction de ce dernier (comme on peut le voir dans une moindre mesure avec les exemples du phnol et de laniline). Molcule Benzne Thiophnol Phnol Phnolate Aniline Ion anilinium

max (nm)
204 236 211 235 230 203

max (l mol-1 cm-1)

7 900 10 000 -

Rgles de Woodward-Fieser Lanalyse structurale partir des spectres lectroniques est assez alatoire, dans la mesure o leur relative simplicit a pour corollaire un faible apport dinformations. Dans les annes 40, cependant, avant larrive des techniques plus puissantes didentification dont nous disposons prsent, la spectromtrie UV-Vis a t utilise cette fin. Ltude des spectres dun grand nombre de molcules a permis dtablir des corrlations entre structures et maxima dabsorption. Les plus connues sont les rgles empiriques dues Woodward, Fieser et Scott, qui concernent les dines et composs carbonyls insaturs. A partir de tableaux rassemblant, sous forme dincrments, les divers facteurs et particularits de structure prendre en compte, on peut prvoir la position de bandes dabsorption * de ces systmes conjugus particuliers. (Tables + exercices en classe)

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La spectromtrie.

Aspect pratique Composition dun spectromtre dabsorption molculaire

Schma gnral Le schma gnral dun spectromtre dabsorption molculaire (figure 1.18) reprend globalement les mmes lments quun spectromtre dabsorption atomique, si ce nest que la slection de la longueur donde se fait ici en amont de lchantillon.
Figure 1.18. : Schma gnral dun spectromtre dabsorption molculaire : Une source de rayonnement (ici, une lampe), un monochromateur (ici, un prisme), un chantillon (ici, une solution dans une cuvette), un dtecteur (ici, une photodiode) et un systme de traitement du signal (ici, un ordinateur).

Sources Pour la spectroscopie dabsorption UV-Vis, on utilise des sources fournissant un spectre continu aussi intense que possible. Lampes hydrogne ou deutrium : On obtient un spectre continu dans lUV par dcharge lectrique dans le gaz basse pression. La dcharge produit une molcule excite dnergie quantifie EH2 qui se dissocie en deux atomes anims dnergie cintique ECH1 et ECH2. Le phnomne est accompagn de lmission dun photon h. dans lUV. On a donc EH2 = ECH1 + ECH2 + h.. Comme la somme des nergies cintiques peut varier de 0 EH2 et ce, de manire continue, lnergie des photons varie aussi de faon continue. On obtient ainsi, en pratique, une source continue utilisable entre 160 et 375 nm. En consquence, les fentres du tube dcharge doivent tre constitues de quartz, transparent dans cette zone. On peut provoquer lexcitation de diffrentes faons : Soit par dcharge entre deux lectrodes daluminium entre lesquelles une diffrence de potentiel de 2000 6000 V est applique ; un refroidissement par eau est requis aux puissances leves. Soit par formation dun arc entre un filament recouvert doxyde et chauff par effet Joule, et une lectrode mtallique place un potentiel de +40 V, par exemple, par rapport au filament. Lampes filament de tungstne : Cest certainement la source la plus utilise dans le visible et lIR La distribution nergtique est grosso modo, celle dun corps noir (que vous

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La spectromtrie. avez peut-tre tudi dans votre cours de physique). Rappelons-en les caractristiques : le maximum dmission se fait une longueur donde qui varie par linverse de la temprature. La temprature normale dun filament de tungstne est de 2870 K. A cette temprature, la plus grande partie de lnergie est mise dans lIR Cette source est utile pour la zone comprise entre 320 et 2500 nm. Notons qu prsent, il nest pratiquement plus fait usage que de lampes dites halognes . Ces dernires ncessitent une temprature leve pour bien fonctionner, lenveloppe de ces lampes est donc constitue de quartz, ou de verre spcial, plus rsistants. La prsence de lhalogne permet daugmenter la dure de vie de la lampe en sadditionnant au tungstne sublim, dans la partie froide de lampoule, pour le redposer dans la partie chaude, c'est--dire sur le filament lui-mme (figure 1.19). Cela dit, le filament na pas pour autant une dure de vie infinie, les atomes se redposant rarement l do ils sont partis, des zones fragilises se crent donc au cours du temps.

Figure 1.19. : Schma de fonctionnement dune lampe halogne : Lorsquil est port incandescence, des atomes de tungstne se librent du filament. Arrivs la paroi de lampoule, plus froide, ces atomes sont capturs par les atomes dhalogne, qui circulent dans lampoule. Quand cet assemblage arrive nouveau proximit du filament, il se casse et libre les atomes de tungstne qui se redposent sur le filament.

Lampe arc au xnon : Lmission est produite par dcharge dans le gaz. Le spectre est continu entre 250 et 600 nm avec un maximum 500 nm. On peut obtenir des intensits trs leves. Dans certains cas, la dcharge est intermittente grce linterposition dune capacit.

Monochromateurs Cfr. spectromtre dmission atomique.

chantillons Le plus frquemment, il sagit de substances en solution. En gnral, on utilise des rcipients (cellules) dpaisseur fixe et calibre. En effet, pour les travaux quantitatifs, la

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La spectromtrie.

longueur de trajet travers la cellule (l) doit tre connue avec prcision (10,00 0,01 mm) pour pouvoir dterminer des concentrations via la loi de Beer-Lambert. Des cellules de 0,5 50 mm de trajet optique sont dutilisation courante. On utilise aussi des cellules dpaisseur variable vis micromtrique. En tout tat de cause, comme les faces du monochromateur, les cellules doivent tre faites dun matriau transparent la longueur donde utiliser (UV = quartz, visible = verre ou plastic). Leurs faces doivent tre optiquement planes. Dans le mme ordre dide, deux critres importants sont considrer lorsquon choisi le solvant de lchantillon : Transparence : dans le domaine spectrale intressant pour labsorption du solut. Interactions ventuelles solvant-solut : un solvant polaire, comme leau, les alcools, etc. peut modifier fortement le spectre dabsorption dun solut par effets bathochromique et hypsochromique, comme nous lavons vu. En gnral, une substance dissoute dans lhexane donne un spectre se rapprochant plus de celui de la vapeur (structure fine) que le spectre obtenu dans un solvant polaire. Dautre part la variation du pH des solutions aqueuses ou hydroalcooliques peut conduire lapparition despces ioniques ou molculaires distinctes dont le spectre dabsorption est diffrent. Cest le cas notamment des indicateurs colors dont la forme acide HIn et basique In- ont des couleurs diffrentes. En fait, la proportion de chacune des formes en fonction du pH, peut tre dtermine par mesure de labsorbance au maximum de chaque bande caractristique et dbouche sur la valeur de pK de lindicateur.

Dtecteurs Photomultiplicateur : Outre les dtecteurs de type photodiode ou CCD, que nous avons dj dcrits prcdemment, les spectromtres dabsorption molculaire utilisent parfois des photomultiplicateurs. Ce dernier joint lmission lectronique de la photocathode, sous limpact dun photon, un processus damplification par une mission dlectrons secondaires par des dynodes successives places des potentiels positifs de lordre de 100 V lune par rapport lautre. Ces dynodes, ou anodes secondaires, sont recouvertes dun dpt de nature voisine celle de la photocathode, mais mieux adapt lmission secondaire dlectrons sous limpact dlectrons incidents. Chaque photolectron expuls de la photocathode est acclr et focalis sur la dynode d1 et de celle-ci, sen expulsent en moyenne 2 6 lectrons qui viennent frapper d2 et ainsi de suite. Aprs la dernire dynode, les lectrons sont collects sur Gillet Steve, D.Sc. -27-

La spectromtrie. lanode. Un photomultiplicateur de 9 dynodes fournit une amplification suprieure 106 par rapport au courant photocathodique.

Figure 1.20. : Schma de la coupe dun photomultiplicateur : Un photon incident jecte un lectron de la photocathode. Llectron est ensuite dirig vers la premire dynode par une lectrode collimateur. La dynode tant un potentiel positif de 100 V, llectron est acclr et son impact produit ljection de 2 (ou plus) lectrons. Ce processus se rptant chaque dynode, le signal sen trouve amplifi.

Champs dapplication de la spectroscopie UV-vis.

Analyse quantitative de substances simples absorbantes (dosage directe) : o Composs organiques insaturs (e- et n) Composs aromatiques dans leau (tyrosine, acide benzoque, etc.) Composs polyniques naturels (vitamine A, carotne, etc.) Composs contenant des chromophores conjugus tels que C=O et C=N (chlorophylle, hmoglobine, strols, etc.) Drivs aromatiques substitus (polluants tels que la dioxine, pesticides tel que DDT, etc.) o Les mtaux de transition (e- O.A. d)

Figure 1.21. : Spectres UV de deux mtaux de transition : En haut, une solution de Cu

2+ bas, une solution de Co . 2+

et en

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La spectromtrie. Les lanthanides et les actinides

Figure 1.21.

: Spectres UV de deux
3+

lanthanides : En haut, une solution de Ho3+ (Holmimum) et en bas, une solution de Er (Erbium).

o -

Certains composs inorganiques, dont des complexes. Formation dun (ex. : dosage du Fe2+ avec

Analyse quantitative de substances simples non absorbantes (dosage indirecte) : o complexe color lorthophnantroline). o Raction transformant la substance doser en une substance colore (ex. oxydation de Mn2 en MnO4- pour le dosage du manganse dans le ciment).

Analyse quantitative de mlanges (ex. Dosage simultan du chrome et du manganse dans un alliage, cfr. chimie analytique 2BBM) Dtermination de constantes de formation de complexes, de constantes de dissociations dacides, etc. Titrage photomtrique. La spectrophotomtrie prsente de nombreux avantages dans le cadre des dosages :

Analyse quantitative Bonne prcision (de lordre de 0,2 0,5 % relatif). Bonne sensibilit (typiquement de 10-4 10-5 M et jusque 10-7 M dans les cas les plus favorables). Moyenne grande slectivit (en choisissant judicieusement la longueur donde laquelle on effectue lanalyse). Facilit de mise en uvre et cot rduit. Large domaine dapplication Rien dtonnant ds lors que lutilisation de lUV-vis comme moyen de dosage reprsente 95 % des analyses quantitatives dans le domaine de la sant.

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La spectromtrie. Bases de lanalyse quantitative Lanalyse quantitative par spectrophotomtrie UV-vis repose sur le respect de la loi de Beer-Lambert. Il est ds lors important de se rendre compte que cette loi nest valable que sous certaines conditions : Le faisceau lumineux source doit tre bien monochromatique (puisque le coefficient dextinction est fonction de la longueur donde). La concentration doit se situer dans le domaine dynamique (c'est--dire quelle doit se situer au-del de la limite de mesure quantitative et rester dans le domaine de rponse linaire).

Figure 1.22. : Courbe rponse vs concentration dun dtecteur UV : Ce schma illustre les diffrents paramtres importants sur ce type de courbe : Cm : la concentration en dessous de laquelle la substance ne peut tre objectivement dtecte. LMQ : la concentration en dessous de laquelle substance ralise. LRL : la concentration au-del de laquelle la rponse nest plus directement proportionnelle la concentration. une ne quantification peut tre de la prcisment

La solution doit tre suffisamment dilue (C<10-2M), sinon linfluence des molcules les unes sur les autres provoque une modification du spectre. Il convient galement de se rappeler tout moment que labsorbance est influence

par plusieurs paramtres, tels que : La nature du solvant (ex. : effet bathochromique et hypsochromique en fonction de la polarit). De la temprature. Du pH (ex. : phnol-phnolate) De substances interfrentes. La plupart de ces observations rsultent du fait que le coefficient dextinction est fonction de : La structure de la substance absorbante (cfr. exercices sur Woodward-Fieser) Le solvant

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La spectromtrie. La longueur donde du rayonnement incident

Mthodes danalyse spectrophotomtrique Il existe plusieurs procds pour dterminer une concentration par dosage UV-vis. Mthode de ltalon externe : On compare labsorbance (AS) dune solution de concentration connue (CS) labsorbance (AX) dune solution de concentration inconnue (CX). La loi de Beer-Lambert indique que :

A S =lCS et A X =lCX d'o

A C A X lCX CX = X S = A S lCS AS

Mthode de ltalon interne (ou mthode de lajout dos) : Le principe consiste mesurer labsorbance AX de la solution de concentration CX inconnue et de volume VX. Dans un second temps, on ajoute un volume v (faible par rapport VX) dune solution standard de concentration CS. Labsorbance AXS est alors mesure. On a alors que

CX =

A XCS v . Cette mthode prsente lavantage de tenir compte des effets de A XS (VX +v)-A X VX

matrice. Par contre, elle est relativement lente, puisquelle ncessite un ajout par chantillon. A noter que cette mthode, comme celle de ltalon externe, supposent que la loi de BeerLambert est bien respecte, ce qui nest pas toujours le cas (notamment pour les solutions concentres.

Figure 1.23. : Illustration de la mthode de ltalon interne : En (1) la cuvette avec lchantillon doser. En (2) lchantillon doser, auquel on a jout un volume trs faible dune solution trs concentre dtalon. La volume de solution talon ajoute est trs faible pour limiter son effet sur la matrice.

Mthode de la droite dtalonnage : Consiste mesurer labsorbance de diffrentes solutions contenant des quantits connues et croissantes de llment doser. On trace ensuite la droite A=f(C). On dtermine, finalement, labsorbance de la solution inconnue, puis on reporte cette valeur sur la droite dtalonnage pour en dduire la concentration.

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La spectromtrie.

Figure 1.24. : Illustration de la mthode de la droite de dtalonnage solutions : Les de absorbances talon

diffrentes concentrations sont mesures et reportes sur une courbe Absorbance vs concentration. Labsorbance de linconnue est ensuite reporte sur la droite dtalonnage, ce qui permet de dterminer sa concentration.

Cas des mlanges et additivit des absorbances Pour une longueur donde donne, labsorbance dun mlange est gale la somme des absorbances de chaque composant.

Figure 1.24. : Cas de mlanges : Les absorbances de diffrents composants dun mlange sont additives.

Ainsi, supposons un mlange de M et de N, labsorbance totale est la somme des absorbances des deux composs individuels. La dtermination de la concentration en M et N ncessite 2 tapes : 1re tape : Dtermination de M et N 1 et 2. Pour ce faire, construire quatre courbes talons (une pour chaque coefficient dextinction dterminer). Soit deux courbes avec des talons de M mesurs aux deux longueurs donde et deux courbes avec des talons de N mesurs aux deux longueurs donde.

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La spectromtrie.
2me tape : Mesure de A M +N aux deux longueurs donde de sorte que lon obtient

un systme de deux quations deux inconnues (CM et CN dans la solution inconnue).

1 1 1 AM +N = M lCM + N lCN 2 2 2 AM +N = M lCM + N lCN

Figure 1.25. : Spectre UV dun mlange : En bleu clair : spectre dune substance M une concentration CM, en bleu fonc : spectre dune substance N une concentration CN, en rouge : spectre dun mlange de M + N des concentrations respectives de CM et CN.

Titrage photomtrique Le principe du titrage photomtrique est identique celui dun titrage avec indicateur pH (qui leut cru ?), si ce nest que la dtection des modifications de couleur nest plus visuelle, mais instrumentale. On obtient alors des courbes de type absorbance en fonction du volume de titrant (A=f(VT)). Le point de fin de titrage correspond alors lintersection des droites obtenues par extrapolation des deux parties linaires. Prenons lexemple suivant : S (substrat) + T (titrant) P (produit) Cas 1. S et P nabsorbent pas (S = P = 0) et T absorbe (T > 0)

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La spectromtrie. Cas 2. S et T nabsorbent pas (S = T = 0) et P absorbe (P > 0)

Cas 3. P et T nabsorbent pas (P = T = 0) et S absorbe (S > 0)

Cas 4. S et T absorbent (S > T > 0) et P nabsorbe pas (P = 0)

Cas 5. P et T absorbent (T > P > 0) et S nabsorbe pas (P = 0)

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La spectromtrie.

1.4. Spectroscopie de fluorescence (UV)

Il est important de noter que pour chaque niveau dexcitation lectronique, il existe plusieurs niveaux dexcitation vibrationnelle (IR) et que pour chacun de ces derniers, il existe plusieurs niveaux dexcitation rotationnelle (MO), ce qui est illustr dans la figure 1.26. La matrise de ce concept est ncessaire la bonne comprhension de la fluorescence, et principalement bien voir la diffrence qui existe entre ce phnomne et une simple r-mission. Cest dailleurs par cela que nous commencerons laspect thorique de la spectroscopie par fluorescence.
Figure 1.26. : Niveaux dnergie lectronique et vibrationnelle (et structure fine rotationnelle) : Deux niveaux lectroniques sont reprsents, le niveau

Eel, fondamental et le niveau Eel excit. Les deux barres

diagonales grises qui sparent ces niveaux, indiquent que lchelle nest pas respecte et quils sont en fait beaucoup plus loigns en nergie que ce qui est illustr. Pour chaque niveau lectronique (UV-Vis) on voit quil existe plusieurs niveaux dnergie vibrationnelle (IR). Quelques transitions possibles sont reprsentes par des flches et le spectre correspondant est illustr dans le dessous de la figure. En outre, il existe des niveaux dnergie rotationnelle pour chaque niveau dnergie vibrationnelle, mais ils ne sont pas reprsents pour des raisons de clart. Par contre, deux exemples de structures fines sont illustrs dans le spectre.

Aspect thorique Dsexcitation

Une fois la molcule porte dans un tat excit par labsorption dun photon, plusieurs voies de dsexcitation sont possibles : Dissociation. La molcule excite se brise en deux fragments. Dans ce cas, aucun phnomne spectroscopique autre que celui dabsorption initial nest observ, moins que les fragments nirradient de lnergie par un des processus mentionns ci-dessous. R-mission. Si labsorption a lieu comme illustr dans la figure 4.57, alors la rmission est exactement linverse de celle-ci. La radiation mise, qui peut tre mesure et reprsente comme un spectre dmission, est identique en frquence avec celui dabsorption.

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La spectromtrie. Fluorescence. Si, comme cela est reprsent dans la figure 1.27, la molcule se retrouve dans un tat de vibration lev aprs une excitation lectronique et lexcs dnergie vibrationnelle peut tre perdu par des collisions intermolculaires. Lnergie vibrationnelle est convertie en nergie cintique et apparat sous forme de chaleur dans lchantillon ; un tel transfert entre les niveaux dnergie est dit non radiatif et on parle dans ce cas de conversion interne (CI). Ce phnomne est reprsent par des flches ondules sur la figure 1 .27. Lorsque la molcule excite a atteint un niveau vibrationnel plus bas (ex :

= 0), elle peut alors mettre une

radiation et retourner ltat fondamental ; la radiation mise, appele spectre de fluorescence , est normalement de frquence plus basse que celle de labsorption initiale, mais dans certaines conditions, elle pourrait tre de frquence plus leve. Le temps entre labsorption initiale et le retour ltat fondamental est trs court, de lordre de 10-8 s. Phosphorescence. Ce phnomne peut avoir lieu quand deux tats excits, diffrents par leur spin total (S = 0 multiplicit de spin = 2S+1 = 1, tat singulet : les deux lectrons sont de spins opposs ou S = 1 multiplicit de spin = 2S+1 = 3, tat triplet : les deux lectrons sont de spins identiques), ont des nergies comparables. Dans la figure 1.27, on voit que ltat fondamental (S0) et lun des tats excits (S1) sont des singulets, alors quun tat excit voisin (T1) est un triplet. Mme si une rgle de slection (S = 0) interdit quil y ait une transition spectroscopique entre un tat singulet et un tat triplet, il nest pas interdit que le transfert entre les tats excits (S1 T1) se droule cintiquement, c'est--dire suivant des transitions non radiatives induite par des collision. On parle alors de conversion inter-systmes (CIS). Lorsque la molcule est arrive ltat triplet et a perdu un peu dnergie vibrationnelle dans cet tat, elle ne peut retourner ltat excit singulet. Elle va donc finalement atteindre le niveau vibrationnel fondamental de ltat triplet. Maintenant, et bien quune transition vers ltat fondamental (singulet) est interdit, il se peut quelle ait lieu, mais de faon bien plus lente quune transition lectronique permise. Dans le cas contraire, elle peut galement rejoindre ltat fondamental via une nouvelle conversion inter-systme (T1 S0) et une cascade de conversions internes. La lenteur de la transition non autorise de ltat triplet ltat fondamental explique pourquoi les substances phosphorescentes continuent dmettre des radiations lumineuses des secondes, des minutes ou mme des heures aprs labsorption initiale. Contrairement la fluorescence, un spectre de phosphorescence est exclusivement constitu de frquences plus faibles que celles absorbes. Gillet Steve, D.Sc. -36-

La spectromtrie.

Lmission stimule. Ce phnomne, dont ne nous parlerons pas plus en dtail dans le cadre de ce cours, est lorigine de la production de radiations laser.

Figure 1.27. : Diagramme de Perrin-Jablonski : CI : Conversion interne. CIS : Conversion inter-systmes. SX : tat singulet. TX : tat triplet.

Les niveaux dnergie lectronique sont reprsents par des traits horizontaux gras, les niveaux dnergie vibrationnelle par des traits horizontaux fins, les transitions radiatives (avec absorption ou mission de lumire) par des flches verticales droites et les transitions non radiatives (sans mission de lumire) par des flches ondules.

Fluorescence
Les principales caractristiques de lmission de fluorescence dune molcule organique sont : La longueur donde dexcitation (ex), qui correspond la longueur donde dabsorption pour laquelle il y a une fluorescence maximale (et qui correspond en gnral au maximum du spectre dabsorption). La longueur donde dmission (em), qui correspond au maximum du spectre de fluorescence. La dure de vie de fluorescence (F), qui correspond au temps que passe la molcule ltat excit avant dmettre le photon. Le rendement quantique de fluorescence (F), qui correspond au nombre de photon mis par photon absorb. Cette grandeur, comprise entre 0 et 1, caractrise en quelque sorte lefficacit du phnomne de fluorescence pour une molcule. Lefficacit dun fluorophore dpend donc non seulement de ce paramtre, mais galement de du coefficient dabsorbance, puisque plus une molcule Gillet Steve, D.Sc. -37-

La spectromtrie. fluorescente sera capable de capter de photons, plus elle sera susceptible den rmettre. La fluorescence a connu un trs fort dveloppement dans de nombreux domaines (physique, biologie, mdecine, environnement, industries pharmaceutiques, etc.) en particulier du fait de la trs grande dpendance de la lumire mise par une molcule son environnement (polarit, pH, temprature, pression, viscosit, liaisons hydrognes, etc.)

Aspect pratique Composition dun spectromtre de fluorescence UV

Schma gnral
Figure 1.28. : Schma gnral dun fluorimtre UV : Une source de rayonnement (ici, une lampe), un monochromateur (ici, un prisme), un chantillon (ici, une solution dans une cuvette), un dtecteur (ici, une photodiode) dans laxe optique et 90 et un systme de traitement du signal (ici, un ordinateur).

Comme on peut le voir la figure 1.28, le schma gnral dun fluorimtre est en tout point comparable au schma gnral dun spectromtre UV, si ce nest que cette fois, on dtecte le signale, non seulement dans laxe optique (mesure du spectre dabsorbance), mais galement 90 de cet axe, pour dtecter les missions de fluorescence.

Applications de la fluorescence UV
Afin de bien montrer ltendue des applications de la fluorescence, nous ne nous limiterons pas la spectroscopie par fluorescence UV exclusivement. tudes cintiques : Si, un compos fluorescent est le produit ou le ractif dune raction, il est possible de suivre lvolution de cette dernire par mesure de la fluorescence de lchantillon. Cela permet galement, par exemple, dvaluer lefficacit dun catalyseur, comme le montre la figure 1.29.

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La spectromtrie.
Figure 1.29. : Photo de 4 puits dune plaque de test : Les Puits 1 et 2 ne contiennent pas un des ractifs de la raction. Le puits 3 contient les deux ractifs, sans catalyseur ; on y observe une faible fluorescence aprs plusieurs minutes, trahissant lapparition dun produit fluorescent. Dans le puits 4, en prsence dun catalyseur, la florescence est plus importante.

Marquage : Certains composs fluorescents ont t crs pour avoir en plus une certaine affinit pour lune ou lautre organelle cellulaire, ce qui permet de les colorer spcifiquement, comme lillustre la figure 1.30.

Figure 1.30. : Photo de spermatozodes de taureau : Ces spermatozodes vivants ont t colors avec un fluorophore bleu qui marque spcifiquement les noyaux des cellules (tte) et un fluorophore vert qui marque spcifiquement les mitochondries (queue).

Dtection de mtaux : Il est possible de crer des composs dont la fluorescence va dpendre de la complexation dun mtal. Fixation lADN : Le bromure dithidium, reconnu pour tre un bon intercalant de lADN, permet la coloration des gels dADN pour vrifier lefficacit dune PCR ou dune digestion de plasmide, comme vous lavez peut-tre vu ou allez peut-tre le voir dans votre cours de biotechnologie ou de microbiologie.

1.5. Spectromtrie de masse

La spectromtrie de masse (SM) permet de recueillir des informations sur la nature, la composition et la structure des espces prsentes dans l'chantillon. Les instruments correspondants sont les spectromtres de masse, appareils de conceptions diverses, dont certains drivent de montages imagins au dbut du 20me sicle par les physiciens pour l'tude des particules ou des atomes ioniss tandis que d'autres utilisent le principe des piges ions. La spectromtrie de masse trouve ses applications dans des secteurs trs divers, tels ceux de la chimie organique, de la biochimie, de la parachimie, de l'environnement, de l'agro-alimentaire, de la gochimie, ainsi que dans beaucoup de contrles de procds industriels.

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La spectromtrie.

Aspect thorique Principe de la spectromtrie de masse

L'analyse par spectromtrie de masse repose sur l'ionisation, gnralement dans une enceinte o rgne un vide pouss (10-4 Pa), d'une trs petite quantit d'chantillon, afin de crer des ions ; ces espces charges sont alors soumises l'action de champs lectriques et/ou magntiques, suivant les appareils. L'tude des trajectoires suivies permet de dterminer le rapport masse/charge des ions, donc ventuellement leur nature. La reprsentation sous forme graphique de l'abondance des ions sur la base de leur rapport masse/charge constitue le spectre de masse (figure 1.31). Celui-ci traduit la fragmentation, l'chelle statistique, du trs grand nombre d'espces individuelles qui composent tout produit soumis cette analyse. La mthode, d'une extrme sensibilit, dtruit l'chantillon.

Figure 1.31. : Diffrents types de spectres de masse : tracs en histogrammes au dessus (a et b) et trac en continu, en dessous (c).

En rsum, lorsque l'on soumet un compos molculaire cette analyse, on initie un processus en plusieurs tapes enchanes : Ionisation : les molcules prsentes dans l'chantillon passent l'tat gazeux, par effet du vide, et sont ioniss par un des procds existants. Il en rsulte un mlange d'ions issus de la fragmentation des molcules de dpart. Acclration : sitt forms, les ions sont dirigs vers le dispositif de sparation, par effet d'un champ lectrique qui accrot leur nergie cintique. Sparation : les ions sont alors tris suivant leur rapport masse/charge (m/e). Plusieurs procds peuvent tre employs cette fin. Dtection : aprs sparation, les ions sont recueillis par un dtecteur sensible aux charges lectriques transportes.

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La spectromtrie. Traitement du signal : le signal en sortie de l'appareil conduit au spectre de masse, reprsentation conventionnelle de l'abondance des ions en fonction de leur rapport masse/charge, mesurable jusqu' 104. Selon le spectromtre, on accde aux masses individuelles des ions prsents avec plus ou moins de prcision. Les meilleurs appareils peuvent dterminer les masses avec une extrme prcision : la marge d'erreur ne dpasse pas 10-5 uma. Tous les appareils, quelles que soient leur performances, conduisent une prsentation standardise des rsultats sous forme de spectre de fragmentation qui correspond une rpartition des ions, regroups aux valeurs nominales entires (qui n'existe que de nom et non de fait) les plus proches de leur masse relles, et dont les intensits sont exprime en % du pic le plus intense, appel pic de base. Ce "spectre-btons", qui correspond la distribution des masses rparties en classes dont les hauteurs sont proportionnelles leurs abondances, n'est autre qu'une sorte d'histogramme. Nanmoins cette reprsentation a pour inconvnient qu' une mme masse nominale il peut correspondre plusieurs ions, par ailleurs totalement diffrents, qui se confondent dans ce type de reprsentation. C'est pourquoi les spectromtres de masse permettent galement une autre prsentation des rsultats, sous forme d'un trac continu des masses balayes. Les signaux prennent alors l'aspect de pics gaussiens, plus ou moins larges selon l'appareil. La position de chaque maximum correspond un rapport masse/charge prcis. Pour identifier un compos molculaire par spectromtrie de masse, on dispose de deux approches : soit en faisant appel une spectrothque o est rpertori un grand nombre de spectres, parmi lesquels on retrouvera celui du compos tudi s'il existe dans la collection, soit en essayant de reconstituer la structure du compos de dpart la manire d'un puzzle. La seconde mthode est un exercice d'une grande difficult, les fragmentations tant souvent assez difficilement prvisibles. Il faut alors disposer de plusieurs spectres, enregistrs dans des conditions diffrentes. La spectromtrie de masse est devenue progressivement un moyen d'investigation irremplaable des composs structurs. Elle s'applique galement l'analyse de la composition lmentaire des milieux inorganiques (technique ICP/MS) et peut tre tendue l'tude des mlanges molculaires, condition de placer en amont du spectromtre de masse un chromatographe (liquide ou gazeux) ou une lectrophorse capillaire pour sparer les composs.

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La spectromtrie.

Action d'un champ lectrique force de Coulomb

Le fonctionnement des diverses catgories de spectromtres de masse est bas sur l'action des champs lectrique et magntique sur les ions dans le vide. Lorsque l'on cre une diffrence de potentiel V (volts) entre deux plaques parallles distantes de d (m), il apparat un champ lectrique E (V/m) uniforme si le milieu est homogne et orient vers les faibles potentiels. On pose : V d

E=

E grandeur vectorielle dtermine la force de Coulomb qui s'exerce sur l'ion de masse m porteur de la charge q et plac dans ce champ. =qE F a le mme sens que E , et inversement. Cette force est indpendante de Si q > 0, F la vitesse de l'ion. En spectromtrie de masse, on remplace souvent q par e ou z pour dsigner la charge, bien que les ions portent quelquefois plus d'une seule charge lmentaire.

Action d'un champ magntique formule de Lorentz

La force qui s'exerce sur une particule ou un ion, porteur d'une charge q, anim , est donne par et soumis l'action d'un champ d'induction magntique B d'une vitesse v une expression connue sous le nom de formule de Lorentz que l'on crit :

=qv F B

Si = /2 et si on remplace q par e, on a F = evB (e en coulomb, v en m s-1, B en tesla et F en newton). La formule de Lorentz est dduite de la loi plus gnrale de Laplace

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La spectromtrie. , parcouru par un qui exprime la force laquelle est soumise un conducteur de longueur dl . courant I, dans un champ d'induction magntique B

=ldl F B
Le champ magntique ne modifie pas la vitesse des ions, donc leur nergie cintique. Par application de la relation fondamentale de dynamique, qui s'crit, dans le repre du =ma , on en dduit, si = /2 : laboratoire, F e v B m

= a

Seule la composante centripte du vecteur acclration intervient ( = /2). L'ion et amorce une trajectoire circulaire de rayon R, dans un plan perpendiculaire B . De ce fait, a = v2/R, soit en remplaant a par sa valeur tire de l'expression cicontenant v dessus,

m RB mv = ou R = e v eB
La spectromtrie de masse ne permet d'accder qu'au rapport masse/charge des ions, port en abscisse du spectre (c'est pourquoi on crit par convention m/q ou m/e). Si tous les ions portent la mme charge, l'chelle de masse est la mme, un facteur prs. C'est pourquoi l'chelle des spectres est indique en uma (ou Da). Par contre, si un mme fragment m est porteur de charges diffrentes, il apparatra plusieurs positions, l'appareil ne pouvant diffrencier, par exemple, m/2e et (m/2)/e.

Aspect pratique Introduction et ionisation de l'chantillon

Modes d'introduction directe des chantillons Le mode d'introduction dans le spectromtre de masse varie suivant l'tat physique de l'chantillon et la technique choisie. Dans le cas d'un gaz ou d'un compos l'tat de vapeur, on introduit un peu de l'chantillon dans un rservoir qui communique avec la

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La spectromtrie. chambre d'ionisation par une fuite rglable. Pour un liquide, on utilise une microseringue. Le liquide se trouve vaporis par effet du vide rgnant dans la chambre d'ionisation. Les solides peuvent tre introduits en les dposant l'extrmit d'une canne mtallique chauffante, pour assurer la sublimation du compos, ou par vaporation partir d'une solution dans un solvant volatil.

Introduction dans le cas d'un couplage CG/SM L'interfaage le plus simple pour la technique couple CG/SM (GC/MS), consiste runir la colonne capillaire et le spectromtre de masse, soit en introduisant directement l'extrmit de la colonne dans la chambre d'ionisation, soit par le relais d'un capillaire de transfert chauff, plac entre le chromatographe et le spectromtre de masse. A condition que le dbit dans la colonne ne dpasse pas quelques ml/min, et que les colonnes soient trs longues, les pompes peuvent maintenir le vide ncessaire l'analyse. Pour les colonnes garnissage dont le dbit est plus lev, ou pour permettre un emploi moins restrictif de la colonne capillaire, on adapte une microvanne et un restricteur, appel sparateur.
Figure 1.32. : Coupage dune CG un SM : a/ Couplage par un capillaire relais chauff. b/ Couplage par un restricteur.

Introduction dans le cas d'un couplage CLHP/SM L'interfaage CLHP/SM pose plus de difficults par suite de la nature de la phase mobile, particulirement lorsqu'il s'agit d'liminer un solvant aqueux (1 ml/min) au niveau de l'interface entre les deux appareils. Il existe toutefois diffrentes possibilits pour remdier ce problme. Introduction directe de lluant dans la rgion de la source dions : - Ne peut supporter un dbit de 1 ml / min. Un tel dbit donne un volume de gaz gal 1,2 l / min, ce qui dpasse de loin les capacits dune pompe vide. Il est donc ncessaire dutiliser un systme split/splitless pour des dbits aussi grands. - Sadapte au dbit dune colonne capillaire qui est de lodre de 5 50 l / min. Les composs ne sont jamais compltement dsolvats.

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La spectromtrie.

Thermospray : Volatilisation rapide par passage de lluant, dont le dbit se situe entre 1 et 2 ml/min, dans un capillaire chauff en prsence dun lectrolyte comme lactate dammonium. Un systme de pompage situ en face du capillaire produit un jet supersonique de vapeur contenant de trs fines gouttelettes. La taille de ces dernires diminue mesure quelles se dplacent (vaporisation) et, un certain moment, les ions sen dtachent et entrent dans le spectromtre de masse. ICPA (Ionisation Chimique Pression Atmosphrique) : Cest un procd assez comparable au thermospray, mais avec une ionisation pression atmosphrique.

Figure

1.33.

Ionisation

pression atmosphrique.

lectrospray : Lluant entre dans une chambre, maintenue la pression atmosphrique, travers un fin capillaire en acier inoxydable. Un potentiel lev est appliqu entre un manchon compos dune solution dont le rle est de maximiser lionisation des molcules de lluant, et une contre-lectrode. Ce potentiel a pour effet de crer un champ lectrique puissant qui provoque lapparition de charges la surface des gouttelettes qui sortent du capillaire en jet trs fin. Ces gouttelettes se dplacent dans un courant dazote travers un orifice de la contre lectrode, processus qui contribue lvaporation du solvant prsent dans les gouttelettes. Ce mme courant dazote transporte les ions dans le spectromtre de masse. Les ions forms par ce type dionisation possdent un rapport m/z (masse sur charge) lev, ce qui permet de faire lanalyse de molcules de masse molaire leve comme les protines. Inconvnients : - Limit un dbit assez faible (quelques l par minute). - Problme de nbulisation si changement de solvant (utilisation de gradient). Dveloppements rcents dans ce mode dionisation : - Addition de gaz qui aide la nbulisation du liquide et la dsolvatation des ions. - Chauffage du capillaire (permet daugmenter le dbit).

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La spectromtrie.

Figure 1.34. : lectrospray

Ionisation par impact lectronique L'ionisation par impact lectronique, drive des premires expriences sur les tubes dcharge, les "rayons canaux" et les rayons cathodiques. Elle est provoque par impact d'lectrons sur l'chantillon. Le standard d'ionisation 70 eV est obtenu avec des lectrons produits par effet thermoionique, acclrs par une diffrence de potentiel de 70 V. Afin d'accrotre, sur le spectre, l'intensit relative du pic molculaire M , il est possible de choisir une nergie d'ionisation plus faible, 15 eV par exemple.
Figure 1.35. : Schma du processus dionisation par impact lectronique : 1. 2. 3. 4. Bombardement lectronique. Formation dun ion-radical. dical. Ionisation. Fragmentation.
+

Dsorption / ionisation L'chantillon est ionis par impact d'atomes lourds (Xe ou Ar), ou avec des ions (Cs+ ou Na+), anims d'une grande vitesse. Ainsi dans la mthode de bombardement par des atomes rapides (FAB), on ionise un gaz atomique avec des lectrons, puis on acclre les ions forms afin de les faire entrer en collision avec des atomes du gaz rests l'tat neutre. Ceux-ci sont projets grande vitesse sur l'chantillon dpos, l'tat de film, sur un support mtallique. Cette technique vite de chauffer les composs et permet de faire des tudes de plus longue dure. Gillet Steve, D.Sc. -46-

La spectromtrie.

Figure 1.36. 1. 2.

: Schma du processus de

dsorption/ionisation : Bombardement lectronique du Xe et

+ formation dun cation Xe .

(ainsi que 3 et 4), propulsion dun atome

+ de Xe par collision avec un cation Xe .

Sur le schma du dessous : Les atomes de Xe viennent heurter lchantillon qui se trouve sur un support mtallique, ce qui provoque ljection
+ dions secondaires, alors que les cations Xe sont

dvis par des es dflecteurs.

Ionisation chimique (IC) L'chantillon est bombard par des ions issus de petites molcules. Pour cela, on introduit dans la chambre d'ionisation, conjointement au compos analyser, un gaz en large excs, tel que le mthane, l'ammoniac ou l'isobutane, la pression de 0,1 Pa. On bombarde ce mlange par des lectrons. La pression du gaz tant telle que le libre parcours moyen des molcules est faible, il se produit des collisions entre les espces ractives. En prenant l'exemple du mthane, on a : Ionisation primaire : CH4 + e- CH4+ + 2eIons secondaires : CH4+ CH3+ + 2H CH4+ + CH4 CH5+ + CH3 CH3+ + CH4 C2H5+ + H2 Collisions : CH5+ + M MH+ + CH4 CH5+ + M MCH4+ + H C2H5+ +M MC2H5+ (ion M+1) (ion M+16) (ion M+29)

En gnral, la prsence d'ions relativement lourds dans ces milieux rend inopportune l'tude du spectre en dessous de 45 uma. L'ion quasi molculaire MH+ (qui n'est pas un ion radical) a une moindre tendance se fragmenter que l'ion molculaire M en ionisation lectronique. Il permet gnralement de reprer la masse molculaire. La formation de MH+ dpend cependant de l'affinit de M pour H+, si bien que dans d'assez nombreux cas, on observe un ion (M-1)+, ce qui fait que l'ionisation chimique laisse toujours planer un doute sur la valeur de la masse molculaire du compos tudi.
+

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La spectromtrie. CH5+ + M [M-H]+ + CH4 + H2 NH4+ se comporte comme CH5+. Quant l'isobutane, il donne avec facilit l'ion (CH3)3C+ stable, qui conduit l'ion (M+1), en se transformant en isobutne : (CH3)3C+ + M MH+ + CH2=C(CH3)2

Ionisation par plasma (ICP/MS) Cette mthode est rserve l'analyse lmentaire des chantillons en solution aqueuse. Elle convient bien aux sels inorganiques. L'chantillon nbulis est introduit au centre d'un plasma d'argon plac l'entre du spectromtre et dont la temprature est de l'ordre de 7000 K.
Figure 1.37. : par Schma plasma du :

processus

Lchantillon est atomis et ionis, par un systme comparable celui tudi dans la section consacre la spectromtrie de dmission masse atomique, avant dentrer dans le spectromtre proprement dit.

Aprs dsolvatation, vaporisation et dissociation, les lments dont l'nergie de premire ionisation est infrieure 10 eV sont totalement ioniss (ceci concerne une cinquantaine d'lments). Les ions sont aspirs par le spectromtre de masse en passant par une interface conue autour d'un dispositif sparateur refroidi, assez semblable au systme utilis dans le couplage CLHP/SM.

Dtecteurs ions
La dtection repose sur les mesures lectriques des charges transportes pour lesquelles on retrouve des principes qui sont communs avec la dtection des photons. Ces dtecteurs fixes imposent que l'on explore le domaine m/e par un balayage en fonction du temps. Certains modles ont une telle sensibilit qu'ils peuvent reprer l'impact d'un seul ion. Ordinairement le nombre d'ions d'une mme espce est grand, de sorte que le signal est de type analogique. On distingue : Les multiplicateurs d'lectrons dynodes spares. Dont le fonctionnement est comparable aux photomultiplicateurs, si ce n'est que cette fois, l'arrachement initial

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La spectromtrie. d'lectrons n'est pas provoqu par l'impact d'un photon, mais par l'impact d'un ion. Malheureusement, ces dtecteurs vieillissent assez mal, mais il est possible de les remplacer par des photomultiplicateurs, en ajoutant un systme de conversion ion photon, ce qui conduit un montage appel dynolite. Les multiplicateurs d'lectrons dynode continue (channeltron). Les ions sont dvis vers un collecteur dont l'entre en forme de cornet est constitue d'un verre dop au plomb qui fait office de cathode de conversion. Les lectrons librs sont attirs par un gradient de potentiel vers une lectrode positive. Les chocs successifs des lectrons sur les parois provoquent leur multiplication, comme sur des dynodes spares. Le montage est dsax, par rapport la trajectoire incidente des ions, pour prserver la partie sensible du dtecteur de l'impact des espces neutres ainsi que des photons mis par le filament, susceptibles galement d'arracher des lectrons.

Figure 1.38. dtecteurs Multiplicateur

: Schmas des ions : a/ dlectrons

dynodes spares. b/ Dynolite (convertisseur dions en photons, coupl un photomultiplicateur. d/ Channeltron (multplicateur dlectrons dynode continue).

Performance des spectres de masse

Limite en masse Chaque appareil permet la mesure du rapport m/e des ions jusqu' une valeur limite. Cette valeur suprieure est exprime en uma pour un ion porteur d'une seule charge lmentaire. Certains constructeurs prennent pour valeur, la masse partir de laquelle on ne peut distinguer M de M+1. Il va de soi que si l'ion est porteur de n charges, la limite en masse se trouve multiplie par n.

Sensibilit

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La spectromtrie. La sensibilit d'un appareil se mesure en masse d'chantillon consomm par seconde (de l'ordre du pg), pour obtenir un signal d'intensit normalise.

Pouvoir de rsolution Les pics des spectres de masses des appareillent prsentent l'aspect de courbes gaussiennes plus ou moins larges par la suite d'imperfections diverses. Le pouvoir de rsolution est un paramtre qui permet de juger de l'efficacit des appareils sparer des ions de masses voisines. Il est dfinit par R = M/M, calcul sur un enregistrement rel, aprs que l'appareil ait t rgl au mieux de ses performances. La masse M est mesure au milieu du pic choisi. Quant M, il correspond : soit la largeur du pic mi-hauteur, en units de masse. soit l'cart minimum entre deux masses voisines, de mme intensit, tel que la valle, entre les pics, ne dpasse pas 10 % de leur hauteur. Le pouvoir de rsolution est sans dimension. Avec des appareils secteur magntique, M varie avec M et il faut donc prciser la masse ayant servi au calcul. Avec des appareils filtres quadrupolaires, M est constant.
Figure 1.39. : Calcul de la rsolution dun SM : A gauche, M correspond lcart minimum entre deux masses voisines, de mme intensit, tel que la valle, entre les pics, ne dpasse pas 10 % de leur hauteur. A droite, M correspond la largeur du pic mi-hauteur.

Spectromtrie secteur magntique et double focalisation

Cette catgorie d'appareils spare les ions par effet d'un champ magntique orient perpendiculairement la trajectoire des ions.

Figure

1.40.

Elments

constitutifs dun spectromtre secteur magntique et double focalisation.

Dans certains montages, l'ordre des deux secteurs est invers (le secteur lectrostatique est plac avant le secteur magntique). Etant donn la quantit Gillet Steve, D.Sc. -50-

La spectromtrie. d'informations produites au cours d'une seule analyse, le traitement des donnes par l'ordinateur s'avre indispensable pour la correction, la manipulation, la conservation et la visualisation des donnes, sans oublier l'impression des rsultats et le diagnostic des pannes de l'appareil.

Acclrateur d'ions Environ 5 % des ions forms amorcent le parcours qui va les mener jusqu'au dtecteur. Les ions (supposs ici positifs) sont acclrs au moyen de plusieurs plaques portes des potentiels ngatifs croissants, la diffrence de potentiel totale pouvant atteindre 10 000 V. Le vide doit tre excellent pour viter la formation d'arcs lectriques. Les ions acquirent tous une mme nergie cintique Ec = eU. La vitesse acquise aprs acclration est donc inversement proportionnelle la racine carre de leur masse :

vi =

2eU mi

Cependant leur nergie cintique E0 avant acclration, bien que trs petite devant celle qu'ils ont acquise, est la cause d'une faible dispersion de leur nergie cintique totale. Etotale = E0 + Ec Secteur lectrostatique L'inhomognit nergtique prcite est neutralise en faisant passer les ions travers un secteur constitu de deux lectrodes cylindriques concentriques qui slectionnent les ions ayant la mme nergie, quelle que soit leur masse. Ce systme champ radial, galement focalisateur en direction, redresse les trajectoires quelque peu divergentes, l'entre du secteur. qui s'exerce sur les ions est perpendiculaire la trajectoire centrale de =eE La force F rayon R et ne modifie donc pas leur nergie. En grandeur, elle est gale F = mv2/R. En remplaant le produit mv2 par son quivalent en fonction de tension acclratrice (mv2 = 2eU), on aboutit la relation fixant les conditions de passage des ions dans le secteur radial :

Gillet Steve, D.Sc.

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La spectromtrie.

E=

2U R

Lorsque E et U sont relis par cette expression, seuls les ions ayant exactement l'nergie acquise au cours de l'acclration passeront par la fente de sortie. En reliant U la diffrence de potentiel V entre les plaques du secteur distantes de d (V = Ed), l'expression devient :

V=

2d U R

Figure 1.41. : Schma de fonctionnement du secteur lectrostatique dun spectromtre

secteur magntique et double focalisation.

Secteur magntique A la suite du secteur lectrostatique, se trouve le secteur magntique. Les appareils se partagent entre le montage Nier-Johnson pour lequel la courbure impose par le champ magntique est de mme sens que la courbure due au secteur lectrostatique et le montage de type Mattauch-Herzog o ces deux courbures sont opposes.

Figure

1.42.

Schma du

de

fonctionnement magntique secteur deux dun

secteur

spectromtre et

magntique montages

double Nier-

focalisation : A gauche, illustration des possibles : Johnson et Mattauch-Herzog. A droite, illustration de la focalisation par le secteur magntique.

En liminant la vitesse v par combinaison des relations vues prcdemment, on retrouve la formule de dflexion des appareils classiques secteur magntique :

Gillet Steve, D.Sc.

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La spectromtrie.

m R2B2 = e 2U
Seuls les ions ayant suivi la trajectoire de rayon R, impos par la construction, pourront tre dtects. Par consquent, pour reprer les masses prsentes on fait varier B (mode normal d'utilisation) ou U, de manire progressive, pour que les ions suivent successivement l'unique parcours qui permet leur dtection. Comme le secteur lectrostatique, le secteur magntique encore appel prisme magntique est focalisateur en direction : un faisceau d'ions identiques abordant le secteur magntique sous un petit angle de divergence , est focalis en F2, fente image de F1. A chaque instant une seule masse peut suivre la trajectoire de rayon R. Le qualificatif de double focalisation donn ces appareils, vient de ce que les montages en tandem des deux secteurs permettent de corriger la fois les aberrations angulaires et en nergie des ions (focalisation en direction par le secteur magntique et en vitesse par le secteur lectrostatique).

Spectromtre temps de vol

L'interdpendance entre la masse et la vitesse des ions est la base du principe des appareils temps de vol. Les ions sont soumis, durant un temps trs bref, un potentiel acclrateur (ex. 2000 V durant 10 s, de manire rptitive). L'instrument mesure ensuite le temps ncessaire aux divers ions pulss pour parcourir, d'un mouvement rectiligne uniforme dans le vide du tube analyseur, une distance L, libre de tout champ. En liminant v entre les deux expressions mv2 = eU et L = vt, on obtient la relation classique de ces appareils qui relie temps de parcours et masse :

m=

2eU 2 t L2

Figure

1.43.

Schma

de

fonctionnement dun spectromtre temps de vol.

Gillet Steve, D.Sc.

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La spectromtrie.

Spectromtre rsonance cyclotronique

Cette catgorie de spectromtre utilise la technique des piges magntiques ions. Elle conduit une trs grande prcision dans la mesure des masses, mais leur prix lev reste un handicap leur diffusion. Nous nen parlerons donc pas plus en dtail.

Spectromtre filtre quadrupolaire

La plupart des applications relevant de la spectromtrie de masse n'exigent pas des spectres de haute rsolution. Aussi trouve-t-on, ct des instruments prcdents, d'autres montages aux performances plus modestes, mais moins coteux et peu encombrants. C'est dans cette catgorie que se situent les appareils champ lectrique seul bass sur les filtres quadrupolaires, trs utiliss comme dtecteurs de masses dans la technique couple CG/SM ainsi que dans nombre d'applications industrielles concernant le vide ou l'analyse des gaz.

Potentiel et champ lectrique dans un filtre quadrupolaire Un filtre quadrupolaire est compos de quatre barres conductrices de quelques dcimtres de longueur, raccordes lectriquement deux deux, entre lesquelles ont cre une diffrence de potentiel V0 continue.

Figure

1.44.

Schma

de

fonctionnement dun spectromtre filtre quadrupolaire : En haut, gauche, de illustration dans En des une barres coupe conductrices. En haut droite : lignes champ transversale. bas : trajectoires

empruntes par les ions dans lespace dlimit par les barres conductrices.

tude du trajet des ions dans un filtre quadrupolaire Lorsqu'un ion positif entre dans le filtre, les composantes de son vecteur vitesse dans les trois directions xyz vont dterminer sa trajectoire qui sera, en gnral, complexe sauf dans deux cas bien particuliers : Gillet Steve, D.Sc. -54-

La spectromtrie.

composante de vitesse nulle suivant Oy : dans ce cas, la trajectoire reste dans le plan xOy. L'ion se dplace entre deux parois charges positivement qui le repoussent vers le centre, correspondant une valle de potentiel. Une transposition image est celle d'une bille que l'on lance dans l'axe d'une gouttire horizontale. Le trajet central est favoris, mme s'il existe une composante de vitesse selon Ox, auquel cas la bille effectuera des oscillations.

composante de vitesse nulle suivant Ox : la trajectoire se situe dans le plan yOz ; la situation des diffrente de la prcdente. L'ion, attir vers les barres charges ngativement, est sur une bosse de potentiel, correspondant une trajectoire instable (l'amplitude va dpasser r0). Pour reprendre l'image prcdente, il faudrait envisager cette fois une bille que l'on enverrait sur le dos d'une gouttire : on imagine aisment la trajectoire qu'elle suivrait !
Figure 1.45. : Analogie de la trajectoire dun ion avec celle dune bille dans une gouttire : a/ Cas o lion se trouve dans une valle de potentiel. b/ Cas o lion se trouve sur un maximum de potentiel.

Utilisation d'un filtre quadrupolaire pour trier les ions On superpose la tension continue V0 une tension alternative VRF de frquence et d'amplitude maximale VM ( est de l'ordre de 1,2 MHz et VM/V0 de 6). VRF = VMcos(2t) Les tensions alternatives sont dphases de entre les deux jeux de barres. En chaque point, l'intrieur du filtre, mis part l'axe Oz, le potentiel varie, de mme que le champ. On obtient les quations du mouvement d'un ion partir des forces Fx, Fy et Fz qui s'exercent sur lui. Ces quations de Mathieu permettent de dfinir des trajectoires ayant la forme d'une hlice de tir-bouchon. Empiriquement, tudions nouveau ce qui se passe dans les deux cas particuliers dj abords :

Gillet Steve, D.Sc.

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La spectromtrie. composante de vitesse nulle suivant Oy : la trajectoire reste dans le plan xOz. Les parois devenant alternativement positives et ngatives, les ions lourds auront une inertie trop grande pour suivre ces variations d'orientation du champ lectrique : ils resteront peu perturbs. Par contre, les ions lgers se mettront osciller et ne pourront pas, en gnral, trouver le trou de sortie du filtre. On a ralis ce qu'on appelle un filtre passe-haut. composante de vitesse nulle suivant Ox : la trajectoire restera dans le plan yOz. Les ions lourds vont continuer comme si de rien n'tait, tandis que les ions lgers vont pouvoir tre ventuellement rcuprs. On est en prsence d'un filtre passe-bas. Par choix judicieux des potentiels V0 et VRF, on dmontre que le filtre ne laisse passer qu'un petit intervalle en masses, en particulier si V0/VRF < 0,2. En faisant varier cette bande passante, on slectionne les ions de masses croissantes et on comprend qu'il soit ainsi possible d'obtenir un spectre de masse.

Spectromtre pigeage d'ions

Un dernier type d'appareil est reprsent par les piges lectriques ions, par opposition aux piges magntiques des montages rsonance cyclotronique. Les ions sont confins entre des lectrodes de formes particulires, soumises des potentiels de radiofrquence. Simples en apparence, mais complexes d'un point de vue fondamental, ces dtecteurs pigeage d'ions sont plus sensibles que des filtres quadrupolaires. Le volume dlimit par les lectrodes, dites suprieure, infrieure et annulaire, constitue la fois la chambre d'ionisation et le filtre de masse.

Figure 1.46.

: Schma dun

pige ions : A gauche, en haut, coupe transversale dun pige ions. A gauche, en bas, photo dun pige ion. A droite : trajectoires complexe empruntes par les particules lintrieur du pige. Notez la dstabilisation dans le second cas.

Gillet Steve, D.Sc.

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La spectromtrie. Une approche qualitative du fonctionnement peut se rsumer comme suit. Le compos introduit dans cette cavit est ionis par un bombardement d'lectrons, de trs courte dure dfinie par une lectrode de contrle. Une radiofrquence fixe, applique l'lectrode annulaire, confine les ions forms dans l'espace central o ils dcrivent des trajectoires complexes, amorties par effet d'une faible pression d'hlium, de l'ordre de 0,01 Pa. L'analyse des ions se fait en les extrayant dans l'ordre des masses croissantes par augmentation de l'amplitude du champ de radiofrquence : l'amplitude d'oscillation des ions crot dans la direction axiale et va jusqu' conduire leur jection vers les lectrodes d'entre ou de sortie. Ceux qui traversent l'lectrode de sortie, perce en son centre, atteignent le dtecteur (channeltron). Par introduction conjointe de l'chantillon et d'un gaz ractant dans le pige on obtient, sans autres modification, une ionisation chimique.

tablissement des formules dveloppes des composs molculaires

La spectromtrie de masse permet d'obtenir des renseignements sur la composition atomique et surtout sur la structure des composs molculaires, ce qui revt une grande importance en chimie organique o l'analyse d'un compos peut se faire plusieurs niveaux.

Dtermination des formules brutes Suivant le matriel dont on dispose, il existe plusieurs mthodes pour rsoudre ce problme. Mthode utilisant un appareil haute rsolution La dtermination de la masse d'un ion avec une grande prcision, par la technique de "peak-matching", peut mener directement la formule brute recherche. Toute ambigut est leve, ds lors que l'on connat la nature des lments prsents et la masse avec quatre ou cinq dcimales exactes. Aux dbuts de la spectromtrie de masse, la seule solution consistait rechercher dans des tables classes par masse et composition, la formule brute s'approchant le plus de celle dtermine exprimentalement. Maintenant les appareils proposent la formule brute la plus probable en fonction de la masse trouve. L'algorithme de recherche tient compte des lments que l'on suppose tre prsents afin de limiter les calculs. Mthode utilisant un appareil basse rsolution Si l'appareil ne permet d'accder qu'aux masses nominales, on compare les intensits des pics de l'amas isotopique de l'ion parent (pics M, M+1, M+2, etc.) car elles

Gillet Steve, D.Sc.

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La spectromtrie. refltent les abondances isotopiques naturelles des lments prsents. Les amas isotopiques forment des combinaisons uniques pour chaque formule brute. L'utilisation de cette mthode pour dterminer la formule brute suppose que l'on dispose d'une table de valeurs calcules ou bien d'un ordinateur pour rechercher la formule brute dont l'amas isotopique s'approche le plus des valeurs exprimentales. Pour les composs ne comportant que les lments C, H, N, O, F, P, les intensits des pics M+1 et M+2 sont donnes par les formules simplifies suivantes : (M+1)% = 1,1 nC + 0,36 nN (M+2)% = nC(nC -1).1,12/200 + 0,2 nO Le pic M+1 sera d'autant plus important que le nombre d'atomes de 13C, de 15N ou de
35

S sera plus grand. Par contre, le pic M+2 dpend de 18O, 34S, 37Cl, etc. Ces formules permettent aussi de dduire le nombre maximum de C dans un

compos dont on connat l'amas isotopique. Mthode utilisant les ions molculaires polychargs Les masses molculaires trs leves, rencontres notamment en biochimie (protines, glycoprotines, polysaccharides, etc.), peuvent tre dtermines par SM, en tudiant les ions polychargs (2 10 30 fois la charge de l'lectron). En effet, plus la charge de l'ion est grande, plus on recule la limite en masse de l'appareil, qui donne le rapport m/e (et directement la masse, dans tous les cas o la charge de l'ion est unitaire). Ainsi avec un appareil dont la limite est m/e = 4000, il est possible d'observer un ion de masse 120 000 si ce dernier est porteur de 30 charges lmentaires. Ces analyses sont couramment ralises avec les procds d'ionisation douce lectrospray ou thermospray.

Identification d'un compos l'aide d'une spectrothque Plusieurs algorithmes de comparaison sont utiliss pour retrouver dans une spectrothque quels sont les spectres les plus semblables celui que l'on veut identifier. Gnralement, la recherche est divise en trois stades : Rduction des donnes. Le spectre du compos est ramen 16 pics au maximum, en donnant la prfrence aux pics lourds, plus significatifs que les pics lgers. De mme, chaque spectre en bibliothque est rduit 8 pics.

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La spectromtrie. Prrecherche. On slectionne les spectres rduits de la spectrothque, ayant les pics aux mmes positions que dans le spectre rduit du compos, mme si l'intensit est diffrente. Recherche principale. Enfin, la slection prcdente est reprise par un algorithme plus fin, qui, partir de critres de choix faisant intervenir intensit, masse et raret du pic, affecte un indice de 0 1000 (identit) chaque spectre, ce qui permet de les classer par similarit croissante. Cet algorithme de puret n'est pas unique. En modifiant les critres de choix, on peut videmment affiner la recherche en procdant par recoupement entre divers classements. Ce procd est devenu d'usage courant pour l'analyse des composs rpertoris.

Rgles de fragmentation L'identification des composs avec l'aide d'une spectrothque constitue une aide efficace, mais cette approche peut conduire des erreurs. C'est pourquoi l'interprtation de la nature et l'origine des pics de fragmentation en masse reste toujours d'un grand intrt. Des ouvrages spcialiss y sont consacrs. Elle ncessite une grande exprience. Le chimiste organicien y est gnralement bien prpar, car il retrouve les mmes types d'ions dans les mcanismes ractionnels en phases condenses, la diffrence cependant que les ions se dplacent ici dans le vide et sans entrer en collision. Les temps de parcours tant trs brefs, on peut envisager des espces trs instables. Toutes les liaisons n'ont pas la mme prdisposition se couper. En ionisation lectronique, l'action commence par l'arrachement d'un lectron de la molcule, appartenant une liaison ou un doublet libre. A ce stade, la molcule est ionise, mais non fragmente. Dans un second temps, l'ion molculaire va pouvoir voluer. Ainsi l'ionisation de l'isobutane peut conduire la perte d'un radical mthyle, le cation isopropyle sera favoris car il est thermodynamiquement plus stable que le cation mthyle. Pour les composs qui comportent des htroatomes, l'ionisation se porte de prfrence sur l'un d'eux. Les modes de dcomposition sont plus nombreux. La fragmentation de la butanone fait ainsi apparatre l'ion actyle 43, l'ion 57 tant 10 fois moins intense. A ct de ces exemples lmentaires de fragmentation, il existe bien d'autres transformations possibles dans lesquelles les ions se rarrangent, quelquefois suivant des voies trs complexes. Toutes ces transformations font l'objet de rgles semi-empiriques qui sont utilises dans l'tude des composs inconnus et qui servent aussi, plus simplement,

Gillet Steve, D.Sc.

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La spectromtrie. contrler les rsultats auxquels conduisent les recherches automatises avec les spectrothques.

1.6. Spectroscopie IR
Tout dabord, notons quen spectroscopie IR on fera plus souvent rfrence au nombre donde dun rayonnement qu sa frquence ou sa longueur donde. Il faut ds lors savoir que le nombre donde ( ) reprsente le nombre doscillations de londe par unit de longueur et est ainsi dfini comme : = 1 / avec la longueur donde dans le vide exprime en cm. Lunit du nombre donde est donc le cm-1. Rappelons prsent que la rgion IR du spectre comprend la rgion de longueur donde comprise entre environ 0,78 et 1000 m (ou de nombre donde de 12 800 10 cm-1). Il est utile, tant sur le plan des applications que sur le plan de linstrumentation, de diviser cette zone du spectre en trois rgions : Linfrarouge proche : 12 800 4000 cm-1 Linfrarouge moyen : 4000 200 cm-1 Linfrarouge lointain : 200 10 cm-1 Notons galement ds prsent que la zone la plus intressante sur le plan analytique se situe entre 4000 et 670 cm-1. La spectroscopie IR trouve des applications trs tendues sur le plan des analyses tant qualitatives que quantitatives. Son utilisation la plus courante est lidentification de composs organiques parce que le spectre dun compos organique, gnralement complexe, reprsente une de ses proprits physiques caractristiques : si lon excepte le cas des isomres optiques, deux substances ne possdent jamais de spectres identiques. Outre ses possibilits remarquables comme outil danalyse qualitative, la spectroscopie IR offre des utilisations intressantes sur le plan quantitatif : son atout majeur est la slectivit qui rend possible une dtermination dune substance inconnue dans un mlange complexe sans sparation pralable. Ces applications sont cependant limites, pour divers motifs que nous expliciterons ultrieurement. Les plus importantes dentre elles se rapportent la mesure de polluants atmosphriques provenant de processus industriels (autant dire que vous risquez peu dy tre confronts).

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La spectromtrie.

Figure 1.47. : Spectre dabsorption IR de la cyclohexylamine : Lordonne est donne en transmission et labscisse
-1

est

linaire

en

nombres donde (cm ). Cest sous cette forme que son habituellement prsents les spectres dabsorption IR, mais il peut arriver que lordonne soit donne en absorbance et / ou labscisse en longueur donde.

La figure 1.47 nous servira de base pour faire quelques remarques sur le mode de prsentation des spectres IR. Lordonne est gnralement donne en transmission, bien que certains enregistrements soient reprsents en absorbance. Dautre part, labscisse est linaire en nombre donde et, bien que cette terminologie ne soit pas correcte, les spectroscopistes utilisent frquemment le terme frquence en lieu et place de nombre donde.

Aspect thorique
Nous avons vu que pour obtenir des transitions lectroniques, il est ncessaire de recourir des nergies dans le visible et lUV. Labsorption IR est pour sa part confine principalement des transitions molculaire de type vibrationnel et rotationnel. Pour quune molcule puisse absorber une radiation IR, elle doit subir une modification de son moment dipolaire, lors de son mouvement vibrationnel ou rotationnel. Ce nest que sous cette condition que le champ alternatif du rayonnement interagira avec la molcule et provoquera un changement damplitude du mouvement considr. Par exemple, la distribution de charge dune molcule telle que HCl nest pas symtrique, le moment dipolaire tant dtermin par limportance de la diffrence de charge et la distance entre les deux centres de charge. Si la molcule HCl vibre longitudinalement, on observe une fluctuation rgulire de son moment dipolaire. Si la frquence du rayonnement correspond celle de la frquence naturelle de vibration de la molcule, un transfert dnergie se produit : le rsultat en est une augmentation de lamplitude de vibration. De la mme manire, la rotation asymtrique autour de leur centre de masse a pour rsultat une variation dipolaire asymtrique : de nouveau, une interaction avec le rayonnement incident de frquence ad hoc est possible. Notons que les molcules homopolaires telles que O2, N2, Cl2, etc. ne subissent pas de variation de moment dipolaire lors de leur vibration ou de leur rotation : elles ne peuvent pas absorber dans lIR.

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La spectromtrie.

Transition de rotation
Lnergie requise pour induire un mouvement de rotation est trs faible : elle correspond au rayonnement de 100 m ou plus ( 100 cm-1). Comme les niveaux de rotation sont quantifis (ce que je vous demande de croire sur parole, moins que vous ne dsiriez vraiment la dmonstration), labsorption par les gaz dans cette zone de lIR lointain est caractrise par des raies discrtes bien dfinies pour autant que lappareillage puisse dtecter lIR lointain et que sa rsolution soit suffisante (< 1 cm-1). Dans les liquides et les solides, les collisions entre les molcules font disparatre cette structure fine et on observe des bandes vibro-rotationnelles plus larges.

Transition de vibration-rotation
Les niveaux vibrationnels dnergie sont aussi quantifis (comme nous allons le voir ultrieurement) et les diffrences nergtiques entre niveaux correspondent aux rgions aisment accessibles du spectre IR : environ 0,75 15 m (1300 675 cm-1). Le spectre IR dun gaz consiste, en gnral, en des sries de raies rapproches, parce quil y a plusieurs niveaux rotationnels dnergie par tat vibrationnel. Par contre, la rotation est inhibe dans les liquides et les solides : dans de tels chantillons, les raies discrtes vibro-rotationnelles disparaissent, le rsultat tant des pics vibrationnels quelque peu largis. Nos proccupations se limitent principalement aux spectres de solides, liquides et solutions dans lesquelles les effets rotationnels son minimaux.

Types de vibrations molculaires Les positions relatives des atomes dans une molcule ne sont pas exactement fixes mais fluctuent de manire continuelle en raison de divers types de vibrations. Pour des molcules diatomiques ou triatomiques, il est ais de dfinir le nombre et la nature de telles vibrations et de faire la relation entre celles-ci et les nergies dabsorption. Une telle analyse devient difficile, sinon impossible pour des molcules polyatomiques, non seulement en raison du grand nombre de centres de vibration, mais aussi cause des interactions entre ces centres de vibration. Il y a deux types gnraux de vibration : longation (vibration de valence) et dformation. Une longation consiste en une variation de longueur dune liaison entre deux atomes, tandis quune dformation consiste en la variation dun angle entre deux liaisons.

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La spectromtrie. La figure 1.48 reprsente les divers types de vibration dun groupe de formule gnrale XY2. Tous ces types de vibration sont possibles dans une molcule contenant plus de deux atomes.

Figure 1.48.

: Modes de vibration dun

groupement plan XY2 : Les schmas du dessus reprsentent les vibrations de valence (longation) symtrique (gauche) et asymtrique (droite). Les schmas du milieu reprsentent les vibrations de dformation, dans le plan, de cisaillement (gauche) et de balancement (droite). Finalement, les schmas du bas reprsentent les vibrations de dformation, hors du plan, de torsion (gauche) et de balancement (droite).

Aspect pratique Composition dun spectromtre dabsorption IR (non FTIR)

Schma gnral Sur le plan des principes, linstrumentation utilise en absorption IR est identique celle utilise en UV-Vis (figure 1.49). Seuls diffrent la nature de la source, des matriaux optiques (sur le plan de la transparence, dispersion, rsolution, etc.) et des dtecteurs. En outre, cette fois, la slection de la longueur donde, se fait plutt en aval de lchantillon. Il est noter que les appareils transforme de Fourier, dont nous parlerons un peu plus ultrieurement, remplacent galement de plus en plus les monochromateurs optiques.

Figure 1.49. : Schma gnral dun spectromtre dabsorption IR : Une source de rayonnement (ici, une lampe), un chantillon (ici, une pastille KBr), un monochromateur (ici, un rseau), un dtecteur (ici, un dtecteur pyrolectrique) et un systme de traitement du signal (ici, un ordinateur).

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La spectromtrie.

Sources Filament de Nernst (Nernst Glower) : Il sagit dun cylindre (l = 20 mm, = 1 2 mm) doxydes de terres rares auquel sont relis des fils de platine servant de conducteurs lectriques. La rsistance du systme prsente un coefficient de temprature ngatif (c'est--dire que la rsistance diminue si la temprature augmente) : il doit en pratique tre chauff au rouge sombre par une source externe pour que le courant puisse passer avec une intensit suffisante. En raison de ce coefficient de temprature ngatif, le circuit doit ncessairement limiter le courant de manire viter une auto-destruction du systme. Globar : Il sagit toujours dun cylindre (l = 50 mm, = 5 mm), mais cette fois de SiC chauff lectriquement qui prsente sur le systme prcdent lavantage dun coefficient de rsistance positif. Les connexions requirent cependant un refroidissement par eau. Les domaines spectraux du filament de Nernst et du Globar sont comparables, sauf dans la rgion < 5000 nm (> 2000 cm-1) o le Globar fournit un rayonnement dintensit plus forte. Fils incandescents : Un fil de nichrome ou de rhodium enroul en spirale et chauff lectriquement fournit une source de vie plus longue quun Globar ou un filament de Nernst, mais aussi dnergie radiante plus faible.

chantillons Nature et techniques de prparation : Comme nous lavons vu, les spectres IR sont obtenus le plus souvent partir de solutions dilues, la valeur optimale de labsorbance tant obtenue par ajustement de la concentration ou de la longueur de la cellule. Malheureusement, en raison de lorigine mme des spectres IR, il nexiste aucun solvant qui soit transparent dans tout le domaine IR. En consquence, dans lIR, on doit souvent utiliser des techniques qui rendent la mesure prcise et exacte du coefficient dabsorption molaire difficile voire impossible. Nous discuterons ci-dessous quelques techniques propres labsorption IR. chantillons gazeux : Le spectre dun liquide bas point dbullition, ou dun gaz, peut tre obtenu en introduisant lchantillon dans une cellule pralablement mise sous vide. On dispose ainsi de cellules dont les trajets lumineux peuvent atteindre plusieurs mtres (cellules compactes avec rflexions internes).

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La spectromtrie.

Solutions : La figure 1.50 donne la liste des solvants les plus courants utiliss pour ltude du spectre IR de substances organiques. Cette figure montre clairement quaucun solvant ne peut couvrir ne ft-ce que la zone IR moyen. CS2 et CCl4 sont assez complmentaires : toutefois CS2 ne dissout que peu de substances. Leau et les alcools sont rarement utiliss, non seulement parce quils absorbent fortement, mais parce quils attaquent les halognures alcalins qui constituent les matriaux les plus courants des fentres des cellules. Pour ces raisons aussi, les divers solvants utiliss doivent tre desschs avant usage. Notons que pour des solutions contenant un peu deau, on peut utiliser des matriaux de fentre plus rsistants : AgCl ; Irtran-1 (MgF2), Irtran-2 (ZnS) ; Irtran-4 (ZnSe). En particulier, lIrtran-2 se travaille bien pour obtenir un poli optique.

Figure 1.50. : Tableau des solvants les plus courants utiliss en spectroscopie dabsorption IR : Les rgions ouvertes sont celles pour lesquelles le solvant transmet plus de 25 % de la lumire incidente pour 1 mm dpaisseur.

En raison de labsorption lumineuse par les solvants, les cellules IR ont, en gnral, un trajet lumineux court (quelques centimes de mm 1 mm). Ces cellules sont le plus souvent dmontables (figure 1.51) et sont constitues de deux lames parallles de matriau transparent, spares par une mince feuille de plomb, cuivre, tflon munie dun orifice permettant le remplissage. Lpaisseur de cette feuille, ou spacer , fixe la longueur du trajet optique. Pour des travaux quantitatifs, lpaisseur des cellules doit tre contrle : elles
' I0 sutilisent par paires lorsquon emploie la technique classique de mesure de . Notons I

quexistent galement des cellules dpaisseur rglable avec prcision.

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La spectromtrie.

Figure 1.51. : Vue clate dune cuve dabsorption IR pour solutions.

Liquides purs : Quand la quantit dchantillon est faible ou quun solvant adquat nexiste pas, il est courant denregistrer le spectre sur le liquide pur. La technique la plus utilise (figure 1.52) consiste presser une goutte de liquide entre deux lames de matriau transparent (NaCl ou KBr sont souvent utiliss). On obtient ainsi une paisseur assez mal dfinie de 0,01 mm ou moins. Une telle technique donne de bons rsultats en analyse qualitative.

Figure 1.52. : Vue clate dun systme lamelles de NaCl : Une goutte dchantillon liquide est dpose entre deux lamelles de NaCl qui sont ensuite presses pour former un film de faible paisseur.

Solides : Pour les chantillons solides qui ne peuvent tre dissous dans un solvant adquat, plusieurs techniques peuvent tre envisages : Si la substance est fusible, sans dcomposition, on peut en raliser une couche mince par fusion sur une lame de NaCl, par exemple (cette technique est rarement utilise en pratique). Sinon, on ralise une suspension de lchantillon dans un milieu non absorbant dans la zone tudier. Une condition essentielle pour lobtention de spectres satisfaisants est que les dimensions des particules en suspension soient plus petites que la longueur donde du rayonnement. Si cette condition nest pas ralise, les pertes lumineuses par diffusion deviennent importantes. Deux milieux liquides sont couramment utiliss : la paraffine (nujol) ou le perfluorokrosne (fluorolube). Ce dernier milieu est utilis quand les bandes CH sont susceptibles de gner. Dans les deux cas, la suspension (2 5 mg dchantillon ; particules < 2 m) est presse entre

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La spectromtrie. deux lames transparentes. On peut aussi utiliser la technique des pastilles qui consiste broyer 1 quelques mg dchantillon avec 200 mg de KBr sec et presser le mlange 1 plusieurs tonnes par cm2 pendant quelques minutes de manire obtenir une pastille homogne. De meilleurs rsultats sont obtenus si lair occlus est limin par pressage sous vide. Le disque est utilis tel quel dans le faisceau lumineux. En dpit des prcautions, lhumidit absorbe conduit lapparition de bandes 3400 et 1600 cm-1.

Monochromateurs Cfr. Spectromtre dmission atomique. En gnral, cest un monochromateur rseau qui est utilis dans les spectromtres dabsorption IR.

Exemples de Dtecteurs Thermocouple : Ce type de dtecteur est largement utilis dans lIR. Sous sa forme la plus simple, le thermocouple est ralis par jonction de deux pices dun mtal donn avec les extrmits dune pice dun autre mtal ou alliage. Une diffrence de potentiel se dveloppe entre les deux jonctions lorsquelles se trouvent des tempratures diffrentes. Contrairement aux dtecteurs prcdents, les thermocouples ont une rponse non slective en . En pratique, les jonctions utilises pour la dtection dans lIR sont formes de trs fins fils de mtal tels que Bi-Ag, Pt-Sb, etc. Pour augmenter la sensibilit, on ralise de telles soudures en srie (piles thermolectriques) avec alternance de soudures chaudes (celles recevant le rayonnement) et froides (rfrence). Les soudures chaudes sont noircies pour mieux absorber les radiations mesurer. Elles sont scelles sous vide dans une enceinte munie dune fentre transparente aux radiations mesurer. Dtecteur de Golay : Il sagit essentiellement dun thermomtre gaz sensible : une enceinte tanche de forme cylindrique contient du xnon et une membrane noircie destine absorber le rayonnement incident qui pntre par une fentre transparente lIR. Lautre face du cylindre est faite dun diaphragme flexible dont le ct extrieur est argent. Un faisceau lumineux est rflchi sur cette face vers la cathode dun photo-tube. Lorsque le rayonnement incident pntre le tube, la membrane noircie schauffe et chauffe son tour le xnon qui, en se dilatant, dforme le diaphragme : la fraction de lumire rflchie qui frappe la photocathode est modifie, ce qui produit une variation du courant qui dpend de lnergie dissipe dans le gaz par le rayonnement IR (figure 1.53). Le dtecteur de Golay est

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La spectromtrie. plus coteux que les autres dtecteurs de type thermique, mais nest pas plus sensible dans lIR proche ou moyen. Il est par contre suprieur dans le domaine de lIR lointain. Le dtecteur de Golay a une rponse plus rapide que le thermocouple.

Figure 1.53. : Schma de la coupe transversale dune cellule de Golay : Des radiations incidentes IR traversent la fentre de la cellule et son absorbes par la membrane noire. Cette dernire schauffe et chauffe le xnon emprisonn dans la cellule. La dilatation de ce dernier modifie la gomtrie du diaphragme argent qui se situe lextrmit de la cellule et sur lequel se rflchit une lumire incidente visible. Ce phnomne entrane une modification du signal reu par la photocathode et donc de lintensit lectrique mesure. Cette diffrence dintensit lectrique sera donc fonction de la quantit de radiations IR incidentes.

Spectromtre dabsorption IR transforme de Fourier (IRTF ou, en anglais FTIR = Fourier Transform Specroscopy)
Le principe de fonctionnement dun spectromtre IRTF repose sur lutilisation dun interfromtre (la plupart du temps de type Michelson). Autrefois trs chers et rservs aux laboratoires spcialiss, on les retrouve prsent un peu partout. Comparons prsent la STF (spectroscopie par transforme de Fourier) la dispersion conventionnelle : 1) Lavantage essentiel de la spectroscopie par transforme de Fourier sappelle lavantage de Fellgett. Dans un instrument dispersif conventionnel, chaque lment de rsolution est observ seulement pendant la fraction du temps total denregistrement. La rapport signal sur bruit (S/N) est alors proportionnel (T/M)1/2 o T est le temps total denregistrement et M, le nombre dlments de rsolution observs pendant ce temps T (c'est--dire la largeur totale du spectre enregistrer divis par la rsolution utilise). Dans un spectromtre transforme de Fourier, chacun des lments rsolution est observ pendant tout le temps denregistrement, puisque toutes les frquences atteignent le dtecteur en continu.

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La spectromtrie. Ici, M = 1 et S/N (T)1/2. Lavantage thorique entre les deux types de disperseurs est donc de (M)1/2. 2) Un autre avantage est dnomm lavantage de Jacquinot. Puisquil ny a pas de fente dans spectromtre TF, Jacquinot a montr quil est thoriquement possible de laisser entrer plus de lumire dans un spectromtre TF que dans un monochromateur classique. En pratique, toutefois, cet avantage est compens par dautres inconvnients : Il est ncessaire dutiliser des collimateurs (qui rduisent dons la luminosit) pour rendre la lumire aussi parallle que possible. Le sparateur prsente une forte perte de lumire par rflexion et par absorption. 3) En pratique, ce type dappareil sera utilis avec profit surtout pour les applications demandant une grande sensibilit (spectroscopie IR par mission, analyse dans lIR lointain, analyse de gaz, de microchantillons ou analyses ultra-rapides). Le gain en sensibilit est au moins dun facteur 10 et un spectre IR peut tre enregistr en moins dune seconde avec une rsolution moyenne.

Applications de la spectroscopie dabsorption IR

Analyse qualitative Nous avons vu que la frquence approximative laquelle un groupe fonctionnel organique tel que C=O, C=C, CH3, CC, etc. absorbe une radiation IR peut tre calcule partir de la masse des atomes et de la constante de force de la liaison. Ces frquences appeles frquences de groupements fonctionnels varient quelque peu dune molcule lautre en raison dinteractions avec dautres vibrations affectant lun ou lautre des atomes du groupement. Cependant, en gnral, leffet de telles interactions est frquemment faible, et ds lors, on peut avec une probabilit leve, prvoir la zone de spectre dans laquelle on trouvera le pic correspondant un groupement fonctionnel donn. A ce stade, on peut donc tablir avec un certain degr de confiance la prsence ou labsence dun groupement fonctionnel donn. Au cours des dcennies, on a accumul une somme importante de donnes exprimentales concernant la zone de frquence laquelle on peut sattendre, en pratique, trouver labsorption de divers groupements fonctionnels. Les tables rassemblent des telles donnes sous une forme directement utilisable pour lidentification. La figure 1.54 reprend une version simplifie de ces

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La spectromtrie. nombreuses tables de corrlation qui peut servir de point de dpart dans le processus didentification dune molcule.

Figure 1.54. : Table de corrlation simplifie : Les plages dabsorption correspondant des vibrations dlongation sont indiques en haut et les plages dabsorption correspondant des vibrations de dformation sont indiques dans le bas.

Le chimiste intress lidentification dun compos organique examinera dune manire systmatique, certaines rgions bien choisies du spectre. Rgion de vibration de valence de latome dH : 3700 2700 cm-1 : Des pics dabsorption intenses dans cette rgion proviennent souvent de la vibration de valence entre H et un autre atome (C, O, N). Latome H lui-mme est lespce qui se dplace en ordre principal, puisquil est beaucoup plus lger que les autres atomes avec lesquels il est susceptible dtre li : en consquence, labsorption nest gure affecte par le reste de la molcule. En outre, la frquence de cette vibration est beaucoup plus leve que celle des autres liaisons chimiques et ds lors, linteraction de cette vibration avec les autres est souvent faible. Des pics dans la zone 3700 3100 cm-1 sont souvent dus aux vibrations de valence O-H et N-H, les premires apparaissent souvent pour des plus levs. Les bandes OH sont souvent plus larges que les bandes NH et apparaissent seulement dans les solvants non polaires en milieu dilu. En effet, les liaisons par ponts hydrogne largissent les pics et les dplacent vers des plus faibles. Les vibrations C-H aliphatiques se trouvent dans la rgion 3000 2850 cm-1. La plupart des composs aliphatiques ont suffisamment de liaison C-H pour quon observe un pic important dans cette zone. Toute variation structurale affectant la force de liaison C-H sera la cause dun dplacement du maximum du pic : par Gillet Steve, D.Sc. -70-

La spectromtrie. exemple, la bande C-H dans un groupe Cl-C-H se trouve juste au-dessus de 3000 cm-1 comme les C-H des olfines et des aromatiques. Par contre, la C-H actylnique se trouve 3300 cm-1. Lhydrogne dun aldhyde CHO produit un pic distinct dans la zone 2745 2710 cm-1. Le remplacement de H par le deutrium provoque un dplacement vers des plus faibles par un facteur , ainsi que permet de le prvoir la thorie. Cet effet est utilis pour lidentification des pics de valence C-H. Rgion des liaisons triples : 2700 1850 cm-1 : Un nombre limit de groupes absorbe dans cette rgion, leur prsence est donc aisment visible. On peut citer les zones suivantes : CN : 2250 2225 cm-1 N+C- : 2180 2120 cm-1 CC : 2260 2190 cm-1 Dans cette rgion sont galement situs les pics de vibration X-H, avec X = S, P, Si S-H : 2600 2550 cm-1 P-H : 2440 2350 cm-1 Si-H : 2260 2090 cm-1

Rgion des liaisons doubles : 1950 1550 cm-1 : La vibration de valence C=O absorbe dans cette zone. Ctones, aldhydes, acides, amides et carbonates ont tous des pics dabsorption aux environs de 1700 cm-1. Les esters, les chlorures dacide et les anhydrides organiques absorbent vers 1770 1725 cm-1. Le processus de conjugaison tend abaisser le pic dabsorption denviron 20 cm-1. Au vu de ce grand nombre de possibilits, on ralise quil est frquemment impossible de dterminer la nature dun groupe C=O uniquement sur la base de labsorption dans cette zone ; cependant, lexamen dautres rgions spectrales permet parfois de lever le doute : cest ainsi que les esters ont une forte bande de valence C-O-R 1200 cm-1 tandis que les aldhydes, comme nous lavons dj vu, prsentent une bande C-H juste au dessus de 2700 cm-1. Les pics dabsorption des vibrations de valence C=C et C=N sont situs dans la zone 1690 1600 cm-1. Des informations prcieuses relatives la structure des olfines peuvent tre dduites de la position exacte de tels pics. La zone 1650 1450 cm-1 est importante en ce qui concerne les drivs aromatiques. Les composs aromatiques prsentant peu de substituants possdent 4 pics aux environs de 1600, 1580, 1500 et 1460 cm-1. Le nombre et la dispersion de ces substituants produisent des modifications spectrales prvisibles, mais indpendantes de la nature des substituants. Rgion de 400 1650 cm-1 : Dans cette rgion sont situes les bandes de vibration de valence des liaisons simples C-C et C-X (X = O, N, S, halognes) ainsi que les bandes des modes de dformation de nombreuses liaisons simples. La position de ces bandes est trs sensible aux changements de structure, si bien que leur ensemble peut tre considr comme caractristique dune substance bien dfinie. En particulier, le domaine spectral Gillet Steve, D.Sc. -71-

La spectromtrie. compris entre 650 et 1350 cm-1, appele rgion des empreintes, prsente un spectre complexe qui rsulte dinteractions entre liaisons voisines : il dpend donc de la structure mme du squelette de la molcule. Linterprtation complte du spectre dans cette zone est rarement possible en raison de sa complexit. Cependant, cette complexit mme conduit un spectre caractristique de chaque substance, ce qui est extrmement utile pour lidentification de la substance par comparaison. Quelques groupements fonctionnels importants ont, en outre, des vibrations caractristiques dans cette zone, notamment : Vibration de valence de C-Cl entre 700 et 800 cm-1. Vibration de valence de C-O-C des esters et des thers vers 1200 cm-1. Des groupements organiques tels que SO42-, PO43-, NO3-, CO32- absorbent galement en dessous de 1200 cm-1. En analyse fonctionnelle, c'est--dire pour identifier des groupements, les tables et les rgles de corrlation donnent dexcellents rsultats, condition de procder par recoupements en utilisant toutes les rgions du spectre, ce qui permet de faire les contrles ncessaires ; par exemple, nous avons vu quune raie vers 1700 cm-1 est caractristique dun groupe carbonyle. La prsence additionnelle dune bande forte vers 1200 cm-1 permet daffirmer quon a affaire un ester. La situation est toute diffrente si on veut identifier sans ambigut une substance pure ou une substance dans un mlange, ou contrler la puret dune substance. Il est clair que dans le domaine de lidentification dune substance pure, les tables de corrlation ne constituent que le premier pas vers la solution. Une identification sans ambigut doit reposer sur la connaissance dautres proprits telles que la temprature de fusion, dbullition, lindice de rfraction, la densit, lanalyse lmentaire, etc. A ce stade, le problme est grandement simplifi et sa rsolution est aise si on dispose dune bibliothque de spectres. Dans ces conditions, la spectroscopie dabsorption IR constitue une des mthodes les plus rapide, sre et bon march pour identifier une substance inconnue. La spectroscopie IR permet galement didentifier une substance dans un mlange. Il arrive, en effet, frquemment en synthse organique, quune raction ne donne pas un produit pur, mais un mlange parfois complexe disomres, par exemple. Ds lors, connaissant le spectre des diffrents isomres purs, il est possible de dceler sans ambigut les isomres prsents dans un mlange, en utilisant les bandes caractristiques de chacun deux. Finalement et dans la mme optique, la spectroscopie IR permet de facilement tester la puret des substances solides et des liquides, comme les solvants, par exemple. Le contrle est ralis partiellement sur un appareil double faisceau : en comparant

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La spectromtrie. lchantillon dans la cellule de mesure avec la substance pure dans la cellule de rfrence, seules les bandes des impurets apparaissent. En gnral, on peut dire que la limite de dtection atteinte est loin dtre aussi basse quen absorption UV. En moyenne, on ne dpasse gure le dixime de pourcent en poids pour une paisseur de cuve de 1 cm. Il existe cependant des cas favorables, comme la recherche dune impuret fortement absorbante prsente dans un solvant qui lest peu.

Analyse quantitative En principe, lanalyse quantitative par absorption IR repose, comme dans le cas de labsorption atomique et de labsorption UV-Vis., sur la loi de Beer-Lambert. En pratique, toutefois, la loi de Beer-Lambert est, le plus souvent dans le cas prsent, sujette des carts pour les raisons suivantes : La condition de monochromaticit : difficile respecter parce que les bandes dabsorption IR sont nettement plus fines que les bandes dabsorption UV-Vis. les sources IR mettent peu dnergie et lensemble des composants optiques transmet moins bien la lumire, si bien que lon est oblig, pour obtenir un signal suffisant au niveau du dtecteur, dutiliser des bandes passantes qui ne sont pas de largeur faible vis--vis de la bande dabsorption. Les courbes analytiques rsultantes ne sont pas droites. La lumire diffuse (parasite) dans le monochromateur : peut atteindre un niveau gnant. En effet, surtout aux grandes longueurs donde, lnergie de la source devient de plus en plus faible, alors que la lumire totale entrant dans le monochromateur est leve : la lumire parasite est proportionnelle cette lumire totale. Il existe toutefois des moyens techniques pour amliorer la situation. La planit et le paralllisme des fentres : difficile obtenir. Sensibilit lenvironnement : Fonction de la concentration du solut, de la nature du solvant, etc. Ds lors, en absorption IR quantitative, on emploie le plus souvent des courbes dtalonnage empiriques, mais on prfre en gnral avoir recours une autre technique qui se prte mieux aux analyses quantitatives (comme labsorption UV-Vis, par exemple).

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La chromatographie et l'lectrophorse.

La chromatographie et l'lectrophorse.

2.1. Introduction
Dfinition
La chromatographie, mthode danalyse physico-chimique, spare les constituants dun mlange (les soluts) par entranement au moyen dune phase mobile (liquide ou gaz) le long dune phase stationnaire (solide ou liquide fix), grce la rpartition slective des soluts entre ces deux phases. Chaque solut est donc soumis une force de rtention (exerce par la phase stationnaire) et une force de mobilit (due la phase mobile).

Les diffrents types de techniques chromatographiques

La classification des chromatographies peut se faire en fonction des mcanismes de sparation. Les facteurs qui interviennent dans le partage des molcules sparer entre les phases fixe et mobile sont : la solubilit dans un solvant liquide, la taille (la forme), la polarit, la charge lectrique, la prsence de groupements datomes formant des sites particuliers. Les diffrents types de chromatographie rsultent du fait que lon a privilgi leffet de lun de ces facteurs, mais lexclusivit dun mcanisme nest jamais totale au cours dune sparation chromatographique.

Chromatographies en phase liquide (CPL ou CL ou encore LC pour liquid chromatography en anglais)

Dans ce cas, la phase mobile est un liquide. Selon la nature de la phase stationnaire, on distingue :

Les chromatographies de partage

La chromatographie de partage : Cest une chromatographie liquide-liquide. La phase stationnaire est un liquide fix sur un support inerte (ex. : de leau sur la cellulose dun papier). Cette chromatographie est ainsi dnomme car elle est base sur le partage du solut dans les deux phases liquides. La chromatographie dexclusion : On lappelle galement chromatographie dexclusiondiffusion, tamisage molculaire, gel-filtration ou permation de gel. La phase stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont exclues de la phase fixe, en revanche, les petites particules incluses diffusent dans les pores du gel.

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Les chromatographies dadsorption

La chromatographie dadsorption : Cest une chromatographie liquide-solide. La phase stationnaire est un adsorbant solide polaire. La chromatographie dadsorption en phase inverse : Cest une chromatographie liquidesolide dans laquelle la phase stationnaire est apolaire. La chromatographie sur changeurs dions : La phase stationnaire est un changeur dions constitu par une rsine porteuse de groupements ioniss ngativement ou positivement, exerant des interactions de type lectrostatique avec les soluts ioniques du milieu. La chromatographie daffinit : La phase stationnaire est un support macromolculaire chimiquement inerte, sur lequel est greff un effecteur qui prsente une affinit biologie (bioaffinit) pour un solut de lchantillon analyser (affinit enzyme-substrat, ligand-rcepteur, antigne-anticorps).

Chromatographies en phase gazeuse (CPG ou CG, ou encore GC pour Gas chromatography en anglais)
La phase mobile est un gaz appel gaz vecteur ou encore gaz porteur. On distingue dans ce cas :

La chromatographie gaz-liquide : Cest une chromatographie de partage. La phase stationnaire est un liquide fix par imbibition dun support inerte. La chromatographie gaz-solide : Cest une chromatographie dadsorption. La phase stationnaire est un solide adsorbant.

En rsum
Les diffrents principes de chromatographie rsultent du fait que lon a privilgi un des facteurs suivants, afin de sparer des composs constituant un mlange : Facteur Solubilit dans un solvant liquide Taille et forme Polarit Charge lectrique Groupement datomes formant des sites particuliers Technique chromatographique Chromatographie de partage Chromatographie dexclusion Chromatographie dadsorption et dadsorption en phase inverse Chromatographie par change dions Chromatographie daffinit

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Les diffrentes types de technologies en chromatographie Colonne

Une colonne de verre, plastique ou mtal est remplie de phase stationnaire, souvent sous forme de sphrules trs petites. Lcoulement de la phase mobile seffectue par gravit, sous pression lgre, ou encore sous haute pression (Chromatographie Liquide Haute Pression = CLHP, dont nous parlerons plus en dtail ultrieurement). ThoriedelaCLsurcolonne(notionsdebase) Caractristiquesdellution

La reprsentation graphique de llution dun compos (figure 2.1), exprime en concentration en fonction du temps ou en fonction du volume de leffluent est une courbe de distribution typiquement gaussienne. La mesure de la concentration peut seffectuer par la mesure de labsorbance, la fluorescence, etc

Figure 2.1. : Reprsentation graphique de llution dun compos (chromatogramme) : t0 correspond au dbut de linjection, Vm au volume mort de la colonne, tm au temps mort, Ve est le volume dlution dun compos (aussi appel Vr pour volume de rtention), tr est le temps de rtention (ou encore dlution te) dun compos. Ve est le volume dlution rduit, tr est le temps de rtention rduit, Wb la largeur du pic la base et Wh la largeur du pic mi-hauteur.

Il est important de noter quil est possible de dterminer les volumes en fonction du dbit et du temps, en effet, V = d.t, avec d = dbit (ex. : Ve = d.tr). Ds lors dans la suite de notre discussion, on parlera indiffremment, par exemple, de temps de rtention et de volume dlution, puisqu dbit donn, lun est directement proportionnel lautre. Le temps de rtention tr (le volume dlution Ve) est le temps (le volume) que met la substance, de linjection jusqu la sortie de la colonne. Ce paramtre dpend beaucoup de lluant, autrement dit de la phase mobile. Ainsi, un constituant peut tre beaucoup moins retenu par lajout dun luant dune plus grande force. De plus, la rtention dune substance dpend du choix de la phase stationnaire.

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Les molcules du solut ne passent pas tout le temps tr dans la phase stationnaire. Elles consacrent le temps tm parcourir les vides et interstices de la colonne. En pratique, cette dure comporte galement le temps de balayage des volumes de linjecteur, du dtecteur et des tuyaux de raccordement, volumes quil convient de rduire au maximum, mais qui ne peuvent tre compltement limins. Ce temps tm, qui est en quelque sorte le temps de rtention dun compos non retenu, est appel temps mort. En soustrayant ce temps mort du temps de rtention, on obtient le temps de rtention relatif tr, appel aussi temps de rtention rduit. Ce temps de rtention rduit tr mesure le temps pass par la substance sur la phase stationnaire, et il est donc li au phnomne de rtention. De mme, il est bien entendu possible de dterminer un volume dlution rduit Ve en soustrayant au volume dlution Ve le volume mort Vm. Ve = Ve Vm et tr = tr tm Coefficientdedistribution

Soit K, le coefficient de distribution du compos entre la phase stationnaire et la phase mobile : K = CS / CM avec CS = concentration lquilibre du solut dans la phase stationnaire et CM = concentration lquilibre du solut dans la phase mobile. Facteurdecapacit

Afin de pouvoir comparer les chromatogrammes de sparations obtenues sur des colonnes diffrentes, avec des conditions dluants diffrentes, on utilise une grandeur sans dimension appele facteur de capacit, qui permet de saffranchir des paramtres gomtriques dune colonne. Not K, le facteur de capacit est dfini trs simplement laide de la relation K = tr / tm dans laquelle tr dsigne le temps de rtention rduit, dont nous avons parl plus haut et tm le temps mort. Comme prcdemment, au lieu dutiliser le temps de rtention et le temps mort pour dfinir le facteur de capacit, il est possible dutiliser le volume dlution Ve dun compos et le volume dlution Vm dune substance inerte (le solvant, par exemple). K est alors obtenu par la relation K = (Ve Vm) / Vm. Lorsque K = 0, le compos nest pas retenu sur la phase stationnaire. Lorsque K est infrieur 1 et dune faon plus gnrale, pour les faibles valeurs de K, cela signifie que les composs ne sont que trs peu retenus sur la colonne. Les pics correspondants sortent trs prs du pic inerte.

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Le domaine optimal de sparation se situe gnralement pour un K variant de 1 15. Cela correspond un temps de rtention plus long et un largissement du pic. K varie avec la force dlution du solvant : quand elle augmente, K diminue. Plateauxthoriques

Sur le modle de la distillation, on considre que la colonne de chromatographie est constitue par un empilement de plateaux appels plateaux thoriques. Un plateau thorique est dfini comme le plus petit volume de colonne o lquilibre de distribution du solut entre phases fixe et mobile est ralis, ou, en dautres termes, un volume dans lequel la distribution du solut entre les deux phases est toujours celle dfinie par K. On dfinit Vh comme tant le volume quivalent de phase mobile dans le plateau thorique et N le nombre de plateaux thoriques dans la colonne. Le volume dlution Ve est alors gal N.Vh. On peut reprsenter la migration du solut travers la colonne, comme le dplacement dans la phase mobile (en quilibre avec la phase fixe) dune couche trs mince de solut le long de la colonne. Leffet de diffusion brownienne (et de la diffusion de solut entre les phases fixe et mobile), qui est relativement rapide dans la phase mobile se superpose ce mouvement. Ceci explique que plus un compos est retenu dans la colonne, plus la diffusion est efficace et plus le pic dlution est large, ce qui explique que lon cherche en gnral acclrer llution en dehors du fait que lon gagne du temps par la mme occasion.

Figure 2.2. : Reprsentation graphique dun pic dlution : La forme du pic permet de dterminer certains paramtres tels que la largeur mi hauteur () ou la largeur la base (). Ces paramtres permettent de calculer le nombre de plateaux dune colonne, caractristique qui reflte lefficacit de cette colonne.

Il est possible de dmontrer (mais nous le ferons pas) que Wb (), la largeur du pic la base (figure 5.9), est gal

4.t R N

. Donc, plus le nombre de plateaux est important,

plus le pic est fin, par contre, plus le temps de rtention est grand, plus la pic est large (ce qui correspond bien ce que nous venons de discuter ci-dessus).

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La chromatographie et l'lectrophorse. Surfacedespics

La surface des pics, c'est--dire lintgrale de laire sous la courbe dun pic dlution, permet de mesurer la concentration dune substance, pour autant que la rponse du systme soit proportionnelle la concentration de lchantillon. Sparationdespics

Si on purifie plusieurs composs, on peut finalement dfinir deux nouveaux paramtres : Coefficientdeslectivit()

= (Ve2 Vm) / (Ve1 Vm) = tr2 / tr1 = K2 / K1 rend compte de lefficacit de la sparation de deux pics voisins.
Si = 1, cela signifie que le systme utilis ne permet pas de sparer les composs analyss. La valeur minimale de est 1,1. En dessous, il vaut mieux changer dluant ou de phase stationnaire. ne prend pas en compte la largeur des pics. Aussi dfinit-on le coefficient de rsolution de 2 pics (R). Coefficientdersolutionde2pics(R)

Le but dune analyse chromatographique est dobtenir des pics spars. La sparation entre deux pics est dautant meilleure que la rsolution R est grande. Par dfinition, la rsolution est le quotient entre la diffrence des temps de rtention entre les deux pics et la moyenne des largeurs des pics la base.

R = 2.(Ve2 Ve1) / (Wb1 + Wb2) Dans les bonnes sparations, les valeurs de R sont suprieures 1 et idalement comprises entre 1,4 et 1,6. Cest en effet pour la valeur de 1,5 quil y a un retour la base suffisant entre les deux pics. Au-del de cette valeur, seul le temps danalyse est augment, sans quil y ait aucune information supplmentaire intressante de fournie. Cela dit, mme des valeurs de R = 0,5 permettent de donner des informations sur le nombre de composs prsents dans le mlange, mais ne permettent plus de les quantifier correctement.

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Plaque
Une plaque, sur laquelle est fix le support solide, sous forme dune mince pellicule, est trempe dans un bain de phase mobile, dans une cuve ferme, permettant la saturation de lair par la phase mobile. Cette dernire remonte le long de la plaque par capillarit.
Figure 2.3. : Schma dun montage

chromatographie liquide-liquide ascendante : La plaque de papier (cellulose) qui sert de support la phase aqueuse (phase fixe) est reprsente de ct. Cest au bas de cette dernire, juste au dessus du niveau de solvant (phase mobile) que sont dposs les

chantillons sous forme de micro-gouttes,

Rapportfrontal On appelle rapport frontal, RF (ou rfrence front , coefficient de migration ), le rapport Distance parcourue par le solut / Distance parcourue par le solvant. Le schma de la figure 2.4 montre comment calculer le RF dans le cas dune chromatographie liquide ascendante.
Figure 2.4. : Schma montrant comment dterminer le rapport frontal dune

substance : On mesure la distance x parcourue par la substance partir de la ligne de dpt. On mesure galement la distance

y parcourue x / y

par le solvant partir de la ligne de dpt, jusquau front de solvant. Le rapport

toujours infrieur 1 reprsente le rapport frontal de la substance (RF).

Un solut trs soluble dans la phase fixe aura un RF faible, alors quun solut trs soluble dans la phase mobile aura un RF lev et proche de 1. Chromatographiebidimensionnelle Dans le cas o le mlange contient des soluts de mobilits voisines, on peut augmenter le pouvoir sparateur en ralisant une chromatographie bidimensionnelle : sur le mme support, on ralise une premire chromatographie laide dun systme de solvants, puis une deuxime laide dun second systme de solvants, dans une direction perpendiculaire la premire (figure 2.5).

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Figure

2.5.

Chromatographie bidimensionnelle :

liquide-liquide

Comme indiqu en (a), on commence par raliser la chromatographie de faon classique avec un certain

systme de solvants. Nous aurons donc une premire sparation. La plaque est ensuite tourne 90 et une nouvelle lution est ralise avec un autre systme de solvants (b).

2.2. La chromatographie de partage

Principe
Cette chromatographie liquide-liquide est fonde sur la rpartition diffrentielle de chacun des soluts entre deux liquides non miscibles, lun constituant la phase stationnaire, lautre la phase mobile. Cest une technique essentiellement qualitative. Cette technique est un peu comparable une extraction liquide-liquide.

Thorie de la partition
La distribution dun solut A entre deux solvants non-miscibles, lun aqueux (Saq), lautre organique (Sorg), relve de lquilibre AS aq ASorg . La constante dquilibre, qui est appele coefficient de partage ou coefficient de distribution , est gale

[ AS org ] [ AS aq ]

. Cest lquation de Nernst pour le partage dune substance entre deux phases

liquides non miscibles, avec [ ASorg ] : la concentration en solut

A dans la phase organique

et [ AS aq ] : la concentration en solut A dans la phase aqueuse. En gnral, le solut est plus miscible dans le solvant organique que dans le solvant aqueux et K est donc suprieur 1. La transposition de cette partition dun compos entre deux phases liquides dans un systme chromatographique est rendue possible par la fixation de lun des solvants sur un support inerte, lautre solvant constituant la phase mobile (figure 2.3). Un solut trs soluble dans la phase fixe migrera lentement, la force de rtention prdominant sur la force dentranement. A linverse, un solut soluble dans la phase mobile migrera rapidement.

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Solvants
Les deux solvants sont caractriss par leur diffrence de polarit et leur non miscibilit. Gnralement, le solvant fixe est polaire et trs souvent, ce sera leau. Le solvant mobile sera quant lui non polaire et constitu dun mlange choisi selon les ncessits de la sparation.

Technologie
Comme nous lavons dj indiqu, cest une technique essentiellement qualitative. Sur colonne : La colonne est remplie dun support inerte imprgn du solvant fixe, le tout constituant la phase stationnaire. Or, les supports sont rarement totalement inertes, il est donc difficile de dterminer ce qui relve du partage et de ladsorption (dont nous parlerons ultrieurement). Autrement dit, les soluts vont tre spars selon deux mcanismes : le partage et ladsorption. Sur papier : En chromatographie ascendante ou descendante. Ici aussi lintervention du papier ne peut tre nglige : on assistera un mlange de phnomnes dadsorption et de partage. Sur couche mince : le support inerte du liquide qui constituera la phase fixe est coul sur une plaque de verre. Les solvants migreront par capillarit.

2.3. La chromatographie dexclusion

Principe
Figure 2.6. : Schma illustrant le principe de la chromatographie dexclusion : Les plus petites molcules peuvent pntrer dans de nombreux pores, se rpartissant entre le gel et la phase mobile, ce qui rend leur trajet plus lent parcourir et les fait luer en dernier. Les molcules de taille moyenne peuvent pntrer seulement dans quelques pores, la rpartition entre le gel et la phase mobile est plus rapide que pour les petites molcules, le trajet parcouru est moins long et elles sont lues plus rapidement.

Finalement, les grosses molcules ne peuvent pntrer dans les pores du gel (elles sont exclues), il ny a donc pas de rpartition entre la phase mobile et le gel, leur trajet est donc rduit au minimum et elles sont lues en premier.

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Cette technique permet la sparation des molcules en fonction de leur taille et de leur forme. On utilise pour cela des granules de gel poreux. Les grosses molcules (dont le diamtre est suprieur celui des pores) sont exclues et sont donc lues les premires, au niveau du volume mort (Vm ou V0). Les petites et moyennes molcules sont lues plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freine. Les soluts sont donc lus dans lordre inverse des masses molculaires. Il existe une relation linaire entre le volume dlution et le logarithme de la masse molculaire. Lensemble de ces considrations est illustr schmatiquement dans la figure 2.6.

Types de gels
Gels hydrats (les plus utiliss) : le SphadexTM (G10 G200) qui sont des polyosides bactriens de type dextran et le SpharoseTM (agarose). Le gain deau correspond au nombre de grammes deau fixs par gramme de substance sche. Gels permanents : Ce sont des copolymres organiques ou bien des minraux (silice). Ici, des effets dadsorption sajoutent au tamisage molculaire.

Reprsentation des rsultats

Soit on porte le logarithme de la masse molculaire en fonction du volume dlution, comme indiqu dans la figure 5.5 : log MM = f(Ve).

Figure 2.7. : Graphique du log de la masse molculaire en fonction du volume lu : Les grosses molcules, totalement exclues sont

toutes lues les premires, au niveau du volume mort. Les petites et moyennes molcules sont lues plus tardivement et finalement, les petites molcules, totalement incluses, sont lues en mme temps au niveau du volume V*.

Les grosses molcules (dont le diamtre est suprieur celui des pores) sont exclues et sont donc toutes lues les premires, au niveau du volume mort (Vm). Les petites et moyennes molcules sont lues plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est gne. Une molcule totalement incluse sera lue avec un volume V* = Vm + Vi, o Vi est le volume deau interne aux granules de gel. Les soluts sont donc lus dans lordre inverse des masses molculaires.

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Thorie de la chromatographie dexclusion

On considre une colonne de volume totale Vt remplie dun gel solvat : Vt = Vm + Vi + Vg, o Vm est le volume mort, c'est--dire le volume deau externe aux granules, Vi est le volume deau interne aux granules et Vg est le volume du gel. Un solut est distribu entre leau interne et leau externe selon un coefficient de distribution (de partage) : K. Si K = 0, le solut est totalement exclus. Si 0 < K < 1, le solut est partiellement inclus. Le taux dinclusion augmente avec K. Si K = 1, le solut est totalement inclus dans le gel. Si K > 1, le solut est non seulement inclus, mais aussi adsorb par le gel.

2.4. La chromatographie dadsorption

Principe
Cette chromatographie liquide-solide est base sur la rpartition des soluts entre ladsorbant fixe et la phase liquide mobile. Chacun des soluts est soumis une force de rtention (par adsorption) et une force dentranement par la phase mobile. Lquilibre qui en rsulte aboutit une migration diffrentielle des soluts de lchantillon analyser, ce qui permet leur sparation.

Adsorption vs absorption
Ladsorption est un phnomne de surface par lequel des molcules se fixent sur la surface dun adsorbant, selon divers processus plus ou moins intenses. Le phnomne inverse, par lequel les molcules adsorbes sur une surface sen dtachent se nomme la dsorption. Il existe diffrents types dadsorption : Ladsorption physique ou physisorption met en jeu des liaisons faibles, du type forces de Van der Waals. Elle est en gnral rversible et un quilibre de partage stablit entre la phase mobile et la phase fixe. Ladsorption chimique ou chimisorption met en jeu des liaisons fortes dont lnergie est comparable celle de formation des liaisons chimiques. Elle est souvent irrversible (formation de liaisons covalentes) ou difficilement rversible (formation de liaisons ioniques) et engendre une couche monomolculaire. Labsorption, par contre, est un phnomne de profondeur, par lequel une substance sincorpore dans une autre substance.

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Les adsorbants
Ce sont des solides trs diviss (ladsorption est un phnomne de surface), ainsi, 1 g dalumine pour chromatographie peur reprsenter une surface de lordre de 100 m2. On peut distinguer : Les adsorbants faible capacit dadsorption, comme le talc ou le carbonate de sodium. Les adsorbants forts, comme le gel de silice, lalumine ou le charbon actif. Certains adsorbants prsentent une forte polarit lectrique, comme le gel de silice ou lalumine, alors que dautres, comme le charbon actif ou les phases inverses (dont nous parlerons plus en dtail ultrieurement) ont une faible polarit.

Les solvants
Pour un systme chromatographique donn (caractris par une phase stationnaire, une temprature, une pression et un solut), le pouvoir luant dpend de la polarit du solvant. Prenons, par exemple, une phase stationnaire constitue dun adsorbant polaire (le gel de silice), dun solut polaire adsorb et dun solvant polaire (la propanone). Le solvant polaire possde un pouvoir luant lev, fortement adsorb, il dplace le solut. En revanche, un solvant apolaire comme lther de ptrole possdera un mauvais pouvoir luant, mais entranera un solut apolaire. Le tableau suivant reprend quelques solvants classs dans lordre croissant de polarit (srie luotropique).

ther de ptrole Cyclohexane Ttrachloromthane Trichlorothne Tolune Benzne

Dichloromthane ther dithylique Trichloromthane thanoate dthyle Pyridine Propanone

Propan-1-ol thanol Mthanol Eau Acide thanoque

Technologie
La chromatographie dadsorption est applique selon diffrentes techniques : Sur colonne : ouverte pression ambiante, en flash chromatographie, moyenne pression, en CLHP (chromatographie liquide haute performance ou haute pression). Sur couche mince : le gel adsorbant (cellulose, silice) est coul sur une plaque (verre, aluminium, plastique), mlang un liant (pltre).

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La chromatographie et l'lectrophorse.

2.5. La chromatographie dadsorption en phase inverse

Principe
Cest une chromatographie dadsorption liquide-liquide dans laquelle la phase stationnaire se distingue par son apolarit. Elle est constitue, la plupart du temps, par des silices apolaires greffes (figure 2.8). Il existe des greffons apolaires de tailles diffrentes, de 2 18 atomes de carbone (C2 C18), donc de polarit diffrentes.
O O Si O OH O O Si O O CH3 Si CH3 (CH2)17 CH3 O O Si O O (CH2)17 CH3

Figure 2.8. : Phase normale et phase inverse : De gauche droite sont reprsentes : Une silice non greffe (phase normale), une silice greffe organosilane de type C18 (phase inverse) et finalement, une silice greffe par une chane aliphatique de type C18 galement (phase inverse).

Technologie
Dans la pratique, cette chromatographie ne sapplique quen CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance ou Pression) que lon dsigne souvent sous son sigle anglais HPLC (pour High Pressure Liquid Chromatography). Cette technique sapplique bien la sparation de petites molcules peu polaires : lipides, acides amins, peptides.

Notion de paire dions

Les composs ioniques tels que A- ou C+ se sparent mal dans ce type de chromatographie, do lutilisation dune technique appele paire dions : on forme un ensemble neutre et apolaire tel que (A- / X+) ou (C+ / Y-) qui est chromatographi.

2.6. La chromatographie sur changeurs dions

Principe
Les changeurs dions sont des macromolcules insolubles portant des groupements ionisables qui ont la proprit dchanger, de faon rversible, certains de leurs ions au contact dautres ions provenant dune solution.

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Rsine cationique
Cest une rsine qui change rversiblement des cations, elle est donc charge ngativement. Le groupement ngatif, habituellement la base conjugue dun acide (carboxylique ou sulfonique), est li la rsine (souvent un polymre organique) de faon covalente et est en gnral sous forme protonne avant utilisation (cest donc le cation H+ qui est alors chang). Rsine-G- / X+ + cation+ Rsine-G- / cation+ + X+

Le tableau suivant reprend les caractristiques des deux types de rsines cationiques les plus utilises. Rsine Fortement acide Groupement -SO3H -CO2H Rgnrateur HCl ou H2SO4 en excs (3 q.) HCl ou H2SO4 (1 q.) pH dutilisation 1-13 Cations changs Mtaux lourds (ex. : Na+, Cu2+) Cations valences multiples

Faiblement acide

4-13

Rsine anionique
Cest une rsine qui change rversiblement des anions, elle est donc charge positivement. Le groupement positif, habituellement une amine ou un ammonium est li la rsine (souvent un polymre organique) de faon covalente. Rsine-G+ / Y- + anion- Rsine-G+ / anion- + Y-

Le tableau suivant reprend les caractristiques des deux types de rsines anioniques les plus utilises. Rsine Fortement basique Faiblement basique Groupement -N+(CH3)3 -N(CH3)2 Rgnrateur NaOH en excs (3 q.) HCl ou H2SO4 (1,5 q.) pH dutilisation 1-12 Anions changs Anions acides faibles et forts Anions dacides forts

1-4

Technologie
La chromatographie par change dions se pratique le plus souvent sur colonne, mais la mthode peut tre transpose sur couche mince. Du papier changeur dions est

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La chromatographie et l'lectrophorse.

galement commercialis. Enfin, lchange dions peut tre ralis en batch : la rsine est mise en suspension dans la solution et agite mcaniquement.

Capacit de rtention dun changeur dions

Cest le nombre de millimoles (mmol) dions (monovalents) que la rsine peut changer par unit de masse. On lexprime par gramme de rsine sche (ou moins souvent par unit de volume : par ml de rsine humide).

Exemples de rsines changeuses dions

Les rsines polyosidiques charges de type SephadexTM sont utilises pour la sparation de macromolcules ionises : protines, acides nucliques, La matrice polyosidique (compose de cellulose ou de dextranes) porte les groupements chargs suivants :

Echangeurs anioniques :

Echangeurs cationiques :

2.7. La chromatographie daffinit

Principe
Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est un support macromolculaire chimiquement inerte sur lequel est greff un effecteur qui prsente une affinit biologique pour un solut de lchantillon analyser. Trois types daffinit sont utiliss : Affinit enzyme substrat Affinit ligand rcepteur

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Affinit antigne anticorps Trs souvent la molcule fixe sera sur le substrat, le ligand ou lanticorps. Ceci

permettra de purifier lenzyme, le rcepteur ou lantigne, respectivement.

Etapes dune chromatographie daffinit Etape de fixation

Le mlange de molcules contenant le compos purifier est charg sur la colonne daffinit. Seule la molcule prsentant une affinit pour la colonne sera retenue par leffecteur greff sur la phase stationnaire.

Etape de purification
En continuant faire passer du tampon dans la colonne, toutes les molcules contaminantes sont limines et lues.

Etape dlution
La molcule est finalement dcroche de la colonne et recueillie dans lluat.

Lensemble de ces trois tapes est schmatis dans la figure 2.9.

Figure 2.9. : Schma des tapes de purification par chromatographie

daffinit : A ltape de fixation, le compos ayant une affinit pour la colonne y est retenu. Pendant ltape de purification, le rinage avec du tampon permet dliminer les contaminants. Finalement, lors de llution, le compos dsir est rcupr.

Phase stationnaire
Le gel daffinit est constitu dun effecteur fix par covalence un support (carboxymthylcellulose, SephadexTM, gel de polyacrylamide) par lintermdiaire dun bras de fixation ( spacer en anglais), le plus souvent constitu dune chane carbone de longueur variable, choisie de manire limiter les contraintes striques. Les effecteurs peuvent tre de diffrents types : Affinit enzyme-substrat : substrat, analogues, inhibiteurs rversibles, effecteurs allostriques, coenzymes. Affinit ligand-rcepteur : hormones, peptides, analogues peptidiques.

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Affinit antigne-anticorps : haptnes, antignes, anticorps.

Elution
Elle peut tre ralise de diffrentes faons : Tampon de pH diffrent de celui ayant permis la charge changement de ltat dionisation de la protine dsorption. Tampon de force ionique diffrente de celle ayant permis la charge changement de conformation de la protine. Comptition avec un ligand libre.

2.8. La Chromatographie Liquide Haute Performance

Cest en fait une chromatographie sur colonne, mais haute pression, ce qui permet dviter toute perte de charge et de maintenir un dbit constant. Hormis la chromatographie de partage, tous les types de chromatographie vus dans ce chapitre peuvent tre adapts cette technique (exclusion, adsorption en phase normale et inverse, change dions et affinit). Tous ces phnomnes sont directement lis la surface de la phase stationnaire solide. Plus cette dernire est importante, plus il y a dinteractions avec le solut et plus la sparation sera bonne. Il est donc intressant dutiliser des particules de phase stationnaire de la plus petite taille possible (meilleur empilement, plus grand rapport surface / volume). Pour augmenter la surface de contact entre la phase mobile et la phase fixe, on peut galement simplement allonger la colonne, ce qui augmentera lefficacit. Par contre, on ne dsire pas de pertes de charges trop importantes, ni augmenter trop le temps danalyse. Lensemble de ces considrations explique lusage dune haute pression dans ce systme. Cela dit, il est impossible de simplement pousser linfini la pression exerce dans la colonne, cause de considrations mcaniques (crasement de la phase stationnaire, entre autre). Cest une technique extrmement intressante et complmentaire la CG, puisquelle permet ltude de mlange dont les composants sont peu volatils ou qui se dgradent haute temprature. Etant donn limportance croissante de cette technique dans la plupart des laboratoires, nous allons nous attarder un peu sur elle.

Instrumentation
Dans tous les appareils CLHP, on retrouve un ensemble de modules relis entre eux par des tubes de faible diamtre. Une, ou plusieurs pompes assurent le dbit du solvant dlution. En aval de linjecteur se trouvent la ou les colonnes o seffectuera la sparation,

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La chromatographie et l'lectrophorse.

puis au bout de la chane se trouve le dtecteur (figure 2.10). Par la suite, nous allons aborder un peu plus en dtail chacun des composants essentiels dune CLHP.
Figure 2.10. : Schma gnral dun systme CLHP : Les modules principaux sont : a) Pompe(s) : qui peu(ven)t tre quip(es) dun systme gradients. b) Injecteur : qui peut tre reli un passeur automatique dchantillons. c) Colonne : thermorgule ou non, pouvant contenir diffrents types de phase. d) Le dtecteur : ici un UV, mais dautres sont possibles.

Pompes
Nous avons vu que la CLHP fonctionnait dbit constant, hors, une simple pompe ne permet que davoir un dbit puls, puisquil y a une phase daspiration du solvant, puis une phase dexpulsion du solvant. Ds lors que le dbit de la pompe est puls, la ligne de base ne sera pas continue, ce qui ne nous intresse pas. En pratique, donc, on travaille avec des systmes de pompage plus complexe, tel que celui reprsent dans la figure 2.11. La came de forme cardiode fait fonctionner les deux pistons, en quelque sorte, en opposition de phase, de sorte que le dbit total, constitu de la somme des dbits de chaque piston est continu.

Figure 2.11. : Schma gnral dune pompe deux ttes : Les deux ttes sont montes en opposition et actionnes par une came en forme de cardiode. En (b) sont illustrs les profils du dbit dlivr par chacun des deux pistons A et B, ainsi que le dbit total. On remarque que le

fonctionnement en opposition de phase des deux ttes de pompes permet dobtenir un dbit global constant.

Les pompes actuelles permettent galement, souvent, de raliser des gradients de concentration dluant. Ainsi, il est possible, par exemple de passer graduellement dun luant trs polaire (ex. : eau) un luant moins polaire (ex. : actonitrile). Cette possibilit permet denvisager la sparation de substances de polarits trs diffrentes. Que ce soit durant le pompage tout simplement, dans la chambre de mlange ou encore dans la colonne elle-mme, si les solvants ne sont pas dgazs, il peut se former

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La chromatographie et l'lectrophorse.

des bulles lintrieur du systme, ce qui peut provoquer lapparition de pics fantmes, le dsamorage de la pompe, etc Il convient donc dliminer au maximum lazote et loxygne qui peuvent tre prsents dans les solvants. Pour cela, il existe plusieurs techniques : Barbotage lhlium : ce gaz, trs peu soluble, permet de dplacer loxygne et lazote dans la plupart des solvants. Filtration sous vide : cette technique permet en outre de se dbarrasser des petites impurets qui pourraient se trouver dans le solvant. Il convient toutefois dviter de filtrer des mlanges de solvants dans lesquels un des composant serait fortement volatil, puisquil risquerait, alors, dy avoir un changement important de la composition du mlange. Bain ultrasonique : permet dliminer environ 50 % de lair contenu dans la phase mobile. Tube poreux : cette technique consiste faire passer la phase mobile dans un tube poreux au travers dune enceinte sous vide. Le tube poreux tant conu pour ne laisser passer que les gaz, lluant est progressivement dgaz.

Injecteur
Il est constitu dune vanne haute pression (manuelle ou non) plusieurs voies dont le fonctionnement se droule en deux tapes :

1. Remplissage de la boucle : le solvant dlution circule librement de la pompe (en 1) la colonne (en 2). Linjection est ralise (en 6) dans la boucle (tuyau mtallique enroul en boucle et de volume connu, typiquement de lordre de 10 l). Le surplus de solvant est vacu dans leffluent, communment appel lvier (en 4).

2. Injection de lchantillon : On bascule la vanne par action dun levier et le solvant va alors balayer la boucle (de 1 4) et entraner lchantillon dans la colonne.

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Colonne
La colonne est gnralement un tube en acier de 5 30 cm de longueur et de diamtre de lordre de 5 mm. La phase stationnaire est constitue de grains sphriques calibrs de diamtre allant de 5 10 m. La nature de la phase est fonction du type de chromatographie liquide que lon souhaite raliser (exclusion, adsorption, ).

Dtecteurs
Typesdedtection

Il existe en gros deux types de dtections bass : - Sur les proprits gnrales (solvant + solut) ; ex. : indice de rfraction, conductivit, constante dilectrique, etc. - Sur les proprits des soluts ; ex. : UV, radioactivit, etc.

Principauxparamtres Bruit : Qui se dfinit comme la variation du signal de sortie dun dtecteur non attribuable au passage du solut dans la cellule. a) bruit court terme : zigzags sur la ligne de base b) bruit long terme : pics et valles c) drives : dviation constante de la ligne de base vers le haut et le bas de lchelle. Sensibilit : a) absolue : mesure par un dplacement sur tout lchelle de lenregistreur lorsque la sensibilit du dtecteur est maximale sans interfrence de bruit de fond. b) relative : concentration minimale de solut dtectable pour un signal au moins gal deux fois la hauteur du bruit de fond. La sensibilit peut changer avec la nature du bruit de fond (type de dtecteur), avec le dbit (polarographie) et la temprature ambiante. En outre, le volume mort, llargissement des pics dans la cellule et les raccords peuvent augmenter la quantit minimale dtectable dun chantillon. Linarit : Rgion o il y a une proportion linaire entre le signal de sortie et la concentration du solut.

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La chromatographie et l'lectrophorse. SpectroscopiedanslUVetleVis.

Mesure labsorbance absolue dun solvant + solut ou la diffrence dabsorbance entre le solvant et le solvant + solut (en prsence dune cellule de rfrence) la longueur donde fixe de 254 ou 280 nm, ou longueur donde variable entre 190 et 800 nm, ou longueurs donde multiples lorsquon utilise une barrette de diodes (cfr. Chapitre consacr la spectroscopie). Les cuvettes doivent tre construites de faon empcher la production de faisceaux parasites et viter la formation de bulles dair. La figure 2.12 illustre une de ces cuvettes.

Figure 2.12. : Schma dune cuvette de dtecteur UV-Vis. : On voit que la forme en Z du conduit dans lequel circule lluant permet de suivre labsorbance de ce dernier en continu avec un trajet optique relativement important (ce qui ne serait pas le cas dune simple lecture sur la tranche du tube). A noter que les fentres de la cellule sont en quartz.

Les avantages du dtecteur UV-Vis sont nombreux : - Sensibilit : Dtection de substances de concentrations de lordre de 5.10-7 5.10-8 M par lutilisation de cuvettes de volume aussi petit que 5 l pour une trajectoire optique de 1 cm. - Slectivit : Il est possible de choisir une ou des longueurs dondes qui permettront de voir apparatre le pic correspondant certaines substances choisies plutt que toutes. Les dtecteurs pouvant mesurer labsorbance quatre longueurs donde simultanment ou ceux barrettes de diodes permettent de sassurer de lhomognit dun pic et ainsi se rendre compte dune possible colution. - Renseignements spectraux sur les substances par le spectre UV (rseau de diodes). - Peu sensible aux variations de dbit et de temprature. - Utilisation et entretien facile. - Peut tre utilis en mode gradient dlution. Il possde toutefois galement quelques dfauts : - Les substances doivent tre chromophores. - Les facteurs de rponse sont diffrents pour chaque compos.

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La chromatographie et l'lectrophorse. Fluorimtrie

Mesure lnergie de fluorescence dun solut excit par une radiation ultraviolette. Lmission de lumires est mesure angle droit du faisceau dexcitation. Ce procd sert pour les composs fluorescents ou les drivs fluorescents de certains composs. Avantages : - Encore plus sensible que le dtecteur UV-Vis. - Trs spcifique. - Peu sensible aux variations de dbit et de temprature. - Peut tre utilis en mode gradient dlution.

Inconvnients : - Les substances doivent tre fluorescentes. - Sensibilit loxygne dissous dans la phase mobile (quench = dsactivation)

Spectromtriedemasse Cfr. 3me BBM.

2.9. Les chromatographies en phase gazeuse

Principe La chromatographie gaz-liquide (partage)
La phase stationnaire est un liquide non volatil fix par imbibition dun support inerte. Le solut se partage entre le gaz vecteur et le liquide stationnaire. Plus un solut est soluble dans la phase stationnaire, plus le RF (distance parcourue par le solut / distance parcourue par la phase mobile) est petit et le temps dmergence lev.

La chromatographie gaz-solide (adsorption)

La phase stationnaire est un solide adsorbant (gel de silice, alumine, etc.). Plus ladsorption dun solut sur la phase stationnaire est leve, plus le RF est faible et le temps dmergence lev.

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Dans les deux cas, le gaz vecteur est le gaz qui vhicule les soluts ; la phase mobile est constitue du gaz vecteur et des soluts gazeux.

Instrumentation
Un appareil de chromatographie en phase gazeuse comporte trois parties : injecteur, colonne et dtecteur (figure 2.13) travers lesquels un gaz vecteur entrane les substances dun mlange sparer. Le gaz vecteur le plus utilis est lhlium, les autres sont lhydrogne, lazote ou largon. Il doit tre trs pur et surtout ne contenir ni oxygne, ni eau. Le dbit du gaz est ajust par un rgulateur.

Figure

2.13.

Schma

dun

appareil

chromatographie en phase gazeuse.

chantillons
Les limites de sensibilit sont, selon les appareils, de lordre du nanogramme et mme du picogramme. Le traitement de lchantillon varie selon les substances analyses : Lorsque les soluts sont directement volatilisables, les substances sont solubilises dans un solvant et chromatographies. Lorsque les soluts ne sont pas volatils la temprature du chromatographe ou bien sont dcomposs cette temprature, il faut les transformer en drivs volatils stables : les acides amins sont ainsi estrifies par le butanol, les acides gras estrifis par le mthanol, les oses rduits en alditols, puis actyls,

Injecteur
Il sert lintroduction du mlange analyser dans la colonne. Cette opration est faite : A laide dune microseringue pour les liquides et les solutions. A laide dune vanne boucles pour les mlanges gazeux. En rgle gnrale, la chambre dinjection doit tre une temprature plus leve que celle de la colonne pour faciliter lvaporation des chantillons. La temprature

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La chromatographie et l'lectrophorse.

idale est celle qui est 20 plus leve que le point dbullition de la substance la moins volatile. Le choix de linjecteur est dict par le type de colonne utilise (remplie ou capillaire) et par la nature des produits sparer (leur rsistance la dcomposition lorsquils sont soumis de hautes tempratures). Il y a essentiellement deux techniques dinjection, si on ne tient pas compte de la vanne boucles : la vaporisation directe dans la colonne et lintroduction dans la colonne dune fraction de ce qui est inject (split / splitless). Cette dernire technique est utilise avec les colonnes capillaires. Pour viter les dcompositions catalytiques causes par les mtaux qui composent le corps de linjecteur, on y place un tube de verre dans lequel est introduit le mlange analyser. Injectionchaudavecvaporisationdirectedanslecorpsdelinjecteur

Ce type dinjection (figure 2.14) prsente linconvnient de favoriser la dcomposition des substances fragiles car la temprature de linjecteur est passablement plus leve que celle de la colonne. Il est surtout utilis avec les colonnes remplies.

Figure 2.14. : Injecteur avec vaporisation directe chaud : Remarquez la simplicit de laccessoire.

Injectionchauddanslacolonneavecvaporisationdirecte

vite la dcomposition des substances sensibles au niveau de linjecteur mais prsente deux inconvnients : Lobstruction de la seringue parce quelle risque de piquer dans la phase stationnaire. La perte de phase stationnaire dans la section de colonne qui se trouve dans linjecteur. Injecteursplit/splitless

Les injections sur colonnes capillaires ou mgabores doivent obir trois critres importants : Garantir la composition du mlange (fiabilit). -97-

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Mnager la colonne. Maintenir la reproductibilit des injections (prcision). Ce type dinjecteur (figure 5.20) ne laisse entrer dans la colonne quune petite partie

du volume inject. Cette fraction est ajustable et peut atteindre 1 / 200. Il est aussi quip dune purge de septum qui joue deux rles : Celui de compenser laugmentation de volume lors de lvaporation de lchantillon. Celui de laisser sortir le surplus de gaz provenant de linjection prcdente.

Figure 2.15. : Injecteur split / splitless du modle 8310 de la compagnie Perkin-Elmer.

Injectionfroidsuiviedunebrusquemontedelatemprature

Cette mthode est utilise lors de la sparation de substances trs fragiles. Cette technique permet la condensation lentre de la colonne de produits qui ne supportent pas les hautes tempratures des injecteurs conventionnels. Une fois linjection faite, la temprature de linjecteur est trs rapidement leve de faon ne chauffer les substances injectes que sur un temps beaucoup plus court que celui pass dans linjecteur chaud.

La temprature
On adopte gnralement une temprature lgrement suprieure au point de vaporisation du constituant le moins volatil. Dun point de vue technique, la colonne est maintenue dans un four bain dair thermostat.

Les colonnes
Elles peuvent tre mtalliques, en plastique pour des sparations basse temprature, en verre et joints Tflon. Diverses formes ont t utilises : rectilignes, en U, en spirales (la plus rpandue). Il existe deux grands types de colonnes avec des variantes (figure 2.16) : Les colonnes remplies ou garnissage (packed). Les colonnes capillaires (open tubular) -98-

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La chromatographie et l'lectrophorse.

Figure 2.16. : Types de colonnes : Vous A gauche, colonne remplie. A droite, colonne capillaire. remarquerez que les

reprsentations ne sont pas lchelle entre colonnes remplie et capillaire.

Caractristiques des colonnes remplies ou garnissage (packed)

Diamtre interne : 1/8 (3,2 mm) ou (6,4 mm). Longueur : 0,5 3 mtres. Tube : acier inoxydable (assez inerte et bon conducteur de chaleur) ou verre (inerte mais mauvais conducteur de chaleur).

Garnissage pour chromatographie gaz-solide : Granul polymrique de gel de silice traite trs haute temprature ou par un procd hydrothermique par lequel il est possible dobtenir des pores de dimensions voulues. La surface de ce matriel poreux peut atteindre 500 m2 / g. Polymre organique du type thylvinylbenzne-divinylbenzne qui possde des pores dont le diamtre varie de 7.5 800 m. Garnissage pour chromatographie gaz-liquide : Cest un support solide poreux et inerte imprgn dun liquide non volatil, qui constitue la phase stationnaire et qui peut tre de nature diverses, comme nous le verrons ultrieurement. Il est en gnral constitu de gel de silice, qui peut tre active, si il possde beaucoup de groupements -Si-OH libres ou dsactive si on le fait ragir avec du dichloromthylsilane ou du dimthylsilazane. Il est en gnral lav lacide pour enlever les oxydes mtalliques, en particulier les oxydes de fer et lav par une base pour permettre la chromatographie de substances basiques. Caractristiquedescolonnescapillaires

Diamtre interne : de 0,1 2 mm. Longueur : de 15 100 m. Tube : silice fondue recouverte dune mince couche de polyimide.

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La chromatographie et l'lectrophorse. Choixdesphasesstationnaires

Ce choix se fait en fonction de la nature des substances sparer. Molcules Exemples Phases stationnaires SPB-octyl Non polaires Hydrocarbures normaux (n-alcanes) Poly(mthylsiloxane), SE-30 SPB-5, PTE-5, SE-54 Alcools, thers, thiols, amines, Polaires acides carboxyliques, esters et ctones Poly(mthylphnylsiloxane) Poly(cyanopropylmthylsiloxane) PEG, Carbowax 10, 20M Poly(cyanopropylsiloxane) Polarisables Alcnes aromatiques Poly(cyanopropylphnylsiloxane) TCEP

Les dtecteurs
Dtecteurionisationdeflamme(FIDpourFlameIonizationDetector)

Des ions sont forms par la flamme provenant de la combustion de lhydrogne dans lair. Si une substance carbone (organique) est prsente dans cette flamme, le nombre dions forms augmente considrablement. La buse du brleur tant une des bornes dun circuit et une lectrode collectrice lautre, les ions produits capts par cette dernire permettent le passage du courant et indique par le fait mme la prsence dun solut (figure 2.17). La rponse du dtecteur FID est proportionnelle la masse du solut qui passe dans le brleur.

Figure 2.17. : Dtecteur FID du modle 8310 de la compagnie Perkin-Elmer.

Ce type de dtecteur possde les caractristiques suivantes : Trs sensible. Montre une rponse linaire en fonction de la masse de solut. -100-

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Sensible aux changements de temprature et de dbit. Non slectif universel. Destructif (les substances sont brles).

Ce dtecteur, bien quconomique et universel, ne donne aucun renseignement sur la nature des substances dtectes, le temps de rtention ntant pas une caractristique spcifique dun compos. Cest pourquoi, la tendance actuelle est de coupler des spectromtres de masse aux chromatographes en phase gazeuse. Dtectionparspectromtriedemasse Cfr. 3me BBM

2.10. L'lectrophorse de zone

Principe
Lorsqu'une particule est place dans un milieu fluide, elle est soumise deux forces, celle de sdimentation, qui est la force gravitationnelle et la force oppose, qui est la force de friction et qui est proportionnelle la vitesse de la particule. Ces forces agissent dans des directions opposes et finissent par se compenser, menant un mouvement uniforme de la particule dans le milieu liquide (c'est dire que la particule se dplace une vitesse constante). Si le champ gravitationnel est remplac par un champ lectrique, une macromolcule peut y rpondre de deux faons diffrentes. Si la molcule est charge, elle va migrer dans le champ lectrique, vers l'lectrode de charge oppose. C'est le principe sur lequel repose l'lectrophorse. Si la molcule a une distribution de charge asymtrique (c'est dire possde un moment dipolaire permanent), la molcule va tendre s'orienter dans un champ lectrique. Ce principe fournit les bases des techniques de birfringence lectrique et de dichrosme. Nous ne discuterons toutefois que de l'lectrophorse. Considrons le simple cas d'une particule charge (+Q) se dplaant dans un champ lectrique (E) dans un milieu non conducteur, tel que l'eau. Si la particule se dplace une vitesse constante vers l'lectrode ngative, la force nette (Ftot) s'exerant sur la particule est nulle (puisque F = m.a, et que l'acclration de la particule (a) est nulle vitesse constante). Deux forces sont exerces sur la particule, l'une FE est la force exerce par le champ lectrique sur une particule charge, laquelle s'exerce dans la mme direction que le dplacement de la particule, et l'autre, Ff est la force de friction qui tend freiner le dplacement vers l'lectrode ngative, et donc s'exerce dans la direction oppose au Gillet Steve, D.Sc. -101-

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dplacement. Ds lors Ftot = FE + Ff = 0 (1) o FE = QE (2) est la force lectrique et Ff = -fv (3) est la force de friction, avec v, la vitesse de la particule et f, une constante appele coefficient de friction. L'quation (3) montre que la force Ff s'opposant au dplacement vers l'lectrode ngative est proportionnelle la vitesse de la particule. Il parat, en effet, intuitivement logique de s'attendre ce que la force de friction s'opposant au mouvement augmente lorsque la vitesse augmente. Le coefficient de friction dpend de la taille et de la forme de la molcule. Plus la molcule est grande, plus le coefficient de friction est grand. Il peut tre dmontr que le coefficient de friction pour une particule sphrique est donn par f = 6 Rs (4) o est la viscosit et Rs (rayon de Stokes) est le rayon de la sphre hydrate. De (1), (2) et (3), on dduit que FE = Ff, c'est dire QE = fv. Donc v/E = Q/f = U = mobilit lectrophortique ou encore, U = v/E = Q/6 Rs (6). C'est pourquoi la mobilit lectrophortique U est proportionnelle la densit de charge (charge/taille, Q/Rs) de la particule. Les macromolcules de diffrentes densits de charge peuvent donc tre spares par lectrophorse. Cette discussion se rapport au cas le plus simple, puisque en ralit, il y a des contre-ions dans la solution qui forment un nuage entourant la macromolcule charge, lequel "protge" partiellement la macromolcule charge du champ lectrique E. Les lectrophorses modernes sont conduites dans des gels solides (p. ex. polyacrylamide), qui sont forms partir de solutions d'acrylamide liquide aprs addition d'un agent de polymrisation, comme nous le verrons un peu plus en dtail ultrieurement. Le gel solide est poreux aux molcules de solvant et de solut et sert de milieu pour l'lectrophorse, tout en aidant liminer les forces de convection dans le liquide, qui interfreraient avec la sparation. Une complication qui affecte la description de l'lectrophorse que nous venons de faire, dans les gels de polyacrylamide, rsulte du fait que les gels ont des pores travers lesquels les macromolcules se dplacent. Les molcules les plus petites peuvent passer plus facilement travers les pores que les grosses molcules, il y a donc un effet de tamisage additionnel qui contribue la mobilit effective. Cet effet de tamisage du gel tend augmenter le pouvoir de rsolution de cette technique. Y a-t-il un moyen d'obtenir des informations sur la masse molculaire, en plus de la dtermination de la puret, sur un seul gel ? Qu'arrivera-t-il si deux protines diffrentes, de mme masse molculaires et de mme charge totale nette, mais ayant des formes diffrentes, sont analyses sur un seul gel d'acrylamide ? Celle qui possde la forme la plus allonge (rayon de Stokes lev) aura la plus faible mobilit lectrophortique (U = Q/6 Rs). Un Rs plus lev va galement rendre plus dlicate la pntration dans les pores.

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Donc, la mobilit lectrophortique et les effets de tamisage vont tous deux rendre le dplacement de cette protine anormalement lent et donc lui donner une masse molculaire apparente plus leve. On peut galement imaginer le problme que va poser l'analyse de deux protines globulaires de diffrentes tailles, mais avec des diffrences de charges qui compensent, de sorte que les deux protines vont migrer la mme vitesse dans le gel. Une technique permettant d'viter ces problmes consiste raliser l'lectrophorse dans des conditions dnaturantes, ce dont nous allons parler ultrieurement. En rsum, la technique d'lectrophorse permet, entre autre, de : Dterminer le nombre de sous-units d'une protine et de dterminer leur masse respective D'valuer le degr de purification d'une protine De sparer des protines pour les rvler par la technique de Western blot (raction avec un ou plusieurs anticorps) par exemple. De sparer des protines sur des gels bi-dimensionnels, selon 2 paramtres : point isolectrique (isofocalisation), puis masse molaire De squencer l'ADN De dterminer la taille de fragments d'ADN De sparer des acides nucliques pour les analyser par la technique de Northern blot (ARN) ou de Southern blot (ADN) D'tablir le profil de restriction (hydrolyse par des enzymes de restriction) de fragments d'ADN

Gel d'lectrophorse des protines en conditions dnaturantes

La technique du gel d'lectrophorse en conditions dnaturantes ("sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis" ou SDS-PAGE) a t dcrite par Ulrich Laemmli en 1970. On fait bouillir un mlange de protines, pendant environ 3 minutes en prsence : D'un dtergent anionique fort (agent dnaturant) : le sodium dodcyl sulfate (SDS). Ce dtergent se lie et dnature la plupart des protines, avec environ 1,4 g de SDS li par gramme de protine (soit environ 1 SDS / 2 acides amins). Comme il y a une charge ngative par molcule de SDS, sa liaison masque toutes les charges de la protine, et lui confre une charge globale ngative leve. En outre, les complexes protine/SDS ont gnralement une forme allonge cylindrique. Comme la quantit de SDS li par unit de masse de la protine est constante, la densit de charge globale de toutes les protines est similaire, donc la mobilit lectrophortique est Gillet Steve, D.Sc. -103-

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seulement dtermine par les effets de tamisage. Le SDS limine galement les diffrences dues la forme des protines au niveau des effets de tamisage, puisque toutes les protines ont la mme forme gnrale cylindrique. La mobilit devient seulement une fonction de la masse molculaire de la protine, et non de sa forme.

Figure 2.18. : Sodium dodcylsulfate (SDS) : Dtergent anionique possdant une tte hydrophile de type sulfate et une queue lipophile carbone.

D'un agent rducteur : le -mercaptothanol qui rduit les ponts disulfures, ce qui permet une dnaturation complte des protines et leur permet d'adopter la forme cylindrique dont nous venons de parler. Des masses molculaires apparentes peuvent tre obtenues sous des conditions non rductrices, mais elles ne doivent tre considres que comme des estimations. L'analyse de protine la fois en prsence et en absence d'agent rducteur peut fournir des informations importantes sur la structure des sous-units d'une protine. Une protine multimrique dont les sous-units sont maintenues ensembles par des ponts disulfures peut tre rsolue en ses diffrents composants individuels lorsque l'agent rducteur est ajout. Si les sous-units sont maintenues ensemble par des attractions intermolculaires non covalentes, les protines vont luer de la mme faon dans des conditions dnaturantes (ce qui va liminer les interactions des sous units), en prsence ou en absence d'agent rducteur. Pour dterminer la composition en sous units d'une protine, lorsqu'elles sont maintenues ensembles par des interactions non covalentes, l'lectrophorse doit tre ralise en absence d'agent dnaturant. En rsum :

Les protines sont dnatures : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native Les protines n'ont plus de ponts disulfures : elles sont sous une forme monomrique Les protines de l'chantillon sont ensuite spares par une lectrophorse sur gel

de polyacrylamide en prsence de SDS. C'est un gel rticul obtenu par polymrisation : D'acrylamide qui forme des chanes Et de bis-acrylamide qui ponte les chanes d'acrylamide.

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Figure

2.19.

Diffrentes

molcules

intervenant dans la formation des gels de polyacrylamide : Acrylamide : monomre TEMED : catalyseur de polymrisation Bis-acrylamide : agent de rticulation

La raction de polymrisation est : Amorce par la formation de radicaux libres par le persulfate d'ammonium (APS) Catalyse par le TEMED (N,N,N',N'-ttramthyl-1-2-diaminomthane) Rappelons-nous que plus le pourcentage d'acrylamide est lev, plus la densit des chanes est leve et les mailles du rseau sont serres. En consquence : Plus le pourcentage d'acrylamide est lev, moins les molcules volumineuses peuvent migrer Une protine globulaire (assimilable une sphre) migre d'autant moins que sa masse molaire est leve. Pourcentage d'acrylamide 7,5 10 12 15 Gamme de sparation en kDa 45 400 22 300 13 200 2,5 - 100

Figure 2.20. : Matriel ncessaire pour couler un gel lctrophortique : Plaque de verres, entre lesquelles le gel sera coul. Support pour couler les gels, sur lequel seront fixes les plaques de verre. Peignes qui permettent la formation de puits lors de la polymrisation. Cuve lintrieur de laquelle la migration des protines pourra avoir lieu une fois le gel polymris et les chantillons chargs.

Le gel est coul, en deux tapes, entre des plaques de verre fixes sur un support. La partie infrieure du gel, appel "gel de migration" (running gel) est celui au niveau duquel la sparation va avoir lieu. Son pH se situe habituellement vers 8,7 et sa concentration en acrylamide (entre 7 et 15 %, en gnral) dpend de la taille des

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protines que l'on dsire analyser. La partie suprieure du gel, dans lequel un peigne est enchss pour former des puits, est appel "gel de concentration" (stacking gel). Son pH se situe vers 6,5 et sa concentration en acrylamide est de l'ordre de 2 4 % seulement. L'utilit d'un gel divis en deux parties rside dans le fait que les protines vont se dplacer rapidement dans le gel de concentration et s'accumuler l'interface avec le gel de migration avant de pntrer ce dernier. Cela accrot la concentration des protines avant qu'elles n'entrent dans le gel de migration, ce qui augmente la rsolution. Comment cela marche-t-il ? Lorsque les lectrodes sont branches, les ions glycine, de la partie suprieure du rservoir pH environ 8,7 (cf. composition du tampon d'lectrophorse ci-dessous), qui ont, ce pH, une charge partielle moyenne ngative, entrent dans le gel de concentration. Les ions du tampon du gel de concentration continuent de se dplacer dans le gel de concentration, mais les ions glycines, eux, lorsqu'ils se trouvent pH 6,5, deviennent des zwitterions avec une charge nette de zro et donc cessent de se dplacer. La rsistance lectrique dans le gel de concentration augmente alors, puisque le nombre d'ions se dplaant travers le gel de concentration diminue. Pour maintenir le courant constant dans le circuit, il va y avoir une augmentation locale du potentiel dans le gel de concentration (puisque suivant la loi de Ohm, V = iR). Cela va provoquer une migration rapide des protines et leur accumulation dans une tranche trs troite juste derrire les ions Cl- dans le gel de concentration (lesquels sont en front de migration, puisqu'ils possdent la plus grande densit de charge et mobilit lectrophortique de tous les ions se trouvant dans le gel de concentration). Les protines ne vont pas dpasser les ions Cl- puisque sils le faisaient, ils seraient immdiatement ralentis, ne se trouvant plus dans une zone appauvrie en porteurs de charges et donc de haut potentiel. A l'interface gel de concentration / gel de migration, les protines ne peuvent toutes se dplacer la mme vitesse cause de l'effet de tamisage du gel plus concentr et donc elles se sparent dans le gel de migration. La glycine finit par entrer dans le gel de migration, si on suppose qu'elle est totalement charge pH 8,7, dpasse les protines et comble la dficience de charge qui tait apparue dans le gel de concentration. Aprs polymrisation du gel, le peigne est retir formant ainsi des puits. La taille et le nombre de dents des peignes sont variables, ce qui permet de dposer des volumes allant de 20 l 200 l d'chantillon de protines sparer. Les plaques de verre contenant le gel polymris sont places dans une cuve d'lectrophorse. Du tampon d'lectrophorse conducteur (lectrolytes) est mis dans la cuve et la migration s'effectue sous l'action d'un champ lectrique : Tampon d'lectrophorse : Tris 50 mM Glycine 0,2 M SDS 0,1 % - pH 8,3 8,8

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Tris : nom commun du 2-amino-2-hydroxymthyl-1,3-propanediol Glycine : acide faible Voltage : 100 150 V

Les chantillons de protines dnatures sont dposs dans les puits. La plupart des protines n'absorbent pas la lumire dans les longueurs d'onde visibles, elles ne seront donc pas visibles durant la migration. Pour s'assurer que les protines ne soient pas lues dans le rservoir infrieur (analyse trop longue) un colorant anionique de faible masse molculaire, le bleu de bromophnol, est ajout aux protines avant qu'elles ne soient places sur le gel. L'lectrophorse est arrte lorsque le colorant approche de l'extrmit infrieure du gel de migration.

Figure 2.21. : Schma de la migration des protines : En rouge, fond du puits o sont dposes les chantillons. Les protines, charges ngativement, migrent vers llectrode positive (en bas).

A noter galement que l'on ajoute un peu de glycrine l'chantillon de protines pour rendre cette solution plus dense que le tampon, ce qui va lui permettre de se dposer dans le fond du puits plutt que de diffuser dans le tampon d'lectrophorse. Aprs migration, le gel est dmoul. Les protines sont fixes dans le gel par une solution qui contient du mthanol et de l'acide actique. Les protines sont rvles par une coloration : par exemple avec le bleu de Coomassie ou le nitrate d'argent (10 50 fois plus sensible). On peut galement modifier les protines avec un marqueur fluorescent ou radioactif, avant sparation par lectrophorse, ce qui augmente encore la sensibilit. On obtient diffrentes bandes pour chaque puits. La masse molaire des protines est dtermine l'aide de marqueurs qui sont des protines standards de masses molaires connues. Exemple de marqueurs : Myosine (205 kDa) b-galactosidase (116 kDa) Phosphorylase (97,4 kDa)

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Albumine (66 kDa) Ovalbumine (45 kDa) Anhydrase carbonique (29 kDa)

Figure 2.22. : Exemple de gel color au bleu de coomassie : A noter, dans le dernier puits, le marqueur de masse molculaire et dans le fond de chaque puits, le bleu de bromophnol qui marque le front de solvant.

Dtermination de la masse molaire d'une protine

La mobilit relative est le rapport entre la distance de migration d'une bande et la distance de migration du front de migration. La droite log(masse molaire) = f(mobilit relative) permet de dterminer la masse molaire d'une protine inconnue.

Variations sur le thme de l'lectrophorse Electrofocalisation

Dans cette technique, un gradient de pH est tabli l'intrieur du gel de polyacrylamide. Ce gradient est tabli par prlectrophorse d'une srie de molcules de faibles masses molculaires contenant des groupes aminos et carboxyles appels ampholytes. Lorsqu'elles sont soumises un champ lectrique, la plus ngative des espces va se concentrer l'lectrode positive, alors que la plus positive va se concentrer l'lectrode ngative. Les ampholytes intermdiaires vont se rpartir entre eux, avec comme rsultat global une migration des ampholytes vers leur point isolectrique et l'tablissement d'un gradient linaire de pH dans le gel. Une protine analyse sur ce type de gel va migrer jusqu'au pH correspondant sont point isolectrique et s'y arrter.

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Electrophorse 2D
Cette technique consiste typiquement soumettre les protines une lectrofocalisation dans un gel de polyacrylamide coul dans un tube cylindrique troit. Aprs cette lectrophorse, le tube de gel est enlev et plac au dessus d'un gel de concentration et soumis une SDS-PAGE classique dans une direction de 90 par rapport l'exprience d'lectrofocalisation initiale. Si les protines sont obtenues partir de cellules marques la
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Met, un gel 2 D reprsentant toutes les protines produites par une

population cellulaire donne, peut tre obtenu.

Figure 2.23. : Exemple de gel 2D.

Western blot :
Aprs une lectrophorse standard sur plaque, le gel est recouvert d'une membrane de nitrocellulose. Le sandwich de gel et de membrane est replac dans une chambre d'lectrophorse, de sorte que les protines migrent du gel vers la nitrocellulose, o elles se lient irrversiblement. La membrane peut alors tre te et trempe dans une solution contenant un anticorps de la protine d'intrt. Ce complexe protine-anticorps, form sur la membrane peut alors tre dtect par ajout d'un anticorps marqu et qui se lie sur le premier anticorps utilis (celui qui est prsent li la protine d'intrt).
Figure 2.24. : Schmatisation du principe de fonctionnement du western blot : La protine dintrt est fixe sur une membrane de nitrocellulose. Un anticorps primaire (anti-protine

cible) se fixe sur la protine. Un anticorps secondaire (anti-anticorps primaire), sur lequel est greff une enzyme ou un fluorophore se fixe sur lanticorps primaire. Lenzyme ou le fluorophore et lorigine du signal permettant de dtecter la prsence de la protine dintrt.

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Figure 2.25. : Exemple de rsultat que lont peut obtenir avec un western blot : A gauche, le gel color au bleu de Coomassie. A droite, le rsultat du western blot correspondant.

Gel d'lectrophorse d'ADN

La sparation de brins d'ADN ou d'ARN par lectrophorse repose sur le mme principe que celle des protines, si ce n'est que cette fois, c'est la charge ngative des groupes phosphates ports par l'ADN et l'ARN qui provoquent leur migration vers l'lectrode positive. Pour le squenage de l'ADN et pour les analyses de brins de petites tailles, on peut utiliser des gels de polyacrylamide, comme pour les protines, par contre, en gnral, pour de simples analyses de restrictions ou pour valuer le rsultat d'une PCR, on prfrera utiliser des gels d'agarose.

Figure 2.26. : Structure de lADN : La charge ngative due aux phosphates permet au brin de migrer vers llectrode positive lors de llectrophorse.

Outre l'utilisation d'un gel d'agarose la place d'un gel de polyacrylamide, l'autre diffrence notable entre la sparation de protines et la sparation d'ADN par lectrophorse rside dans la gomtrie de la cuve lectrophorse, qui est, en gnral, horizontale dans le cas de l'ADN.

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Figure 2.27. : Electrophorse dADN : Le gel dagarose est dpos lhorizontale.

Agarose et facteurs affectant la migration

On utilise en gnral un gel de 1 2 % M/V (1 2 g d'agarose pour 100 ml de volume final). L'augmentation de la concentration en agarose dans le gel rduit la vitesse de migration et permet la sparation de fragments d'ADN de plus petite taille. Le potentiel, lui, affecte la vitesse de migration. Plus le potentiel est lev, plus la migration est rapide. Toutefois, il convient de limiter l'intensit du potentiel pour viter une augmentation trop importante de la temprature du gel pouvant provoquer sa fonte. Le facteur le plus important est toutefois la longueur de la molcule d'ADN, ce qui permet la sparation en fonction de la taille. A noter que, comme pour les protines, la conformation de l'ADN est un facteur galement important. Ainsi, pour viter les problmes lis ce paramtre, on ne spare en gnral sur gel d'agarose que de l'ADN linaire. La conformation d'ADN plasmidique non digr par une enzyme de restriction migre diffrentes vitesses (du plus lent au plus rapide) : ADN circulaire, ADN linaire et ADN superenroul.

Applications et avantages
Estimation de la taille d'un fragment d'ADN aprs une digestion par des enzymes de restriction. Analyse d'ADN ou d'ARN aprs amplification PCR Sparation de fragments ADN digrs avant Southern blot ou d'ARN dans le cas du Northern Blot Prparation aise et rapide des gels d'agarose Pas de dnaturation des chantillons Agarose plus ferme que le gel de polyacrylamide Les chantillons peuvent tre rcuprs en vue d'analyses supplmentaires.

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Rvlation de l'ADN
La mthode la plus utilise est la rvlation au bromure d'thidium (BET), qui est un agent d'intercalation fluorescent couramment utilis comme marqueur d'acides nucliques en laboratoire de biologie molculaire. Lorsqu'il est expos des rayonnements UV, il prend une coloration rouge-orange, 20 fois plus intense lorsqu'il est li l'ADN. Cet effet est du l'augmentation de l'hydrophobie de l'environnement.

Figure 2.28. : Bromure dEthidium : En haut gauche : exemple de rvlation au bromure dthidium. En haut droite : structure du bromure dthidium. A droite : Schmatisation de lintercalation du bromure dthidium au sein de lADN.

2.11. L'lectrophorse capillaire

L'lectrophorse capillaire (EC) est une technique sparative plus rcente que la chromatographie, qui correspond une amlioration technologique considrable de la mthode d'lectrophorse de l'lectrophorse de zone, dont nous venons de parler, grce aux acquis de la CLHP. Elle se caractrise par un grand pouvoir de sparation, une excellente sensibilit, et par la possibilit de quantifier aussi bien les petites molcules que les biomolcules pour lesquelles la CLHP est beaucoup moins performante. Utilise en divers modes, l'lectrophorse capillaire prend le nom d'ionophorse lorsqu'il s'agit de l'analyse des ions inorganiques. En bref, elle a considrablement tendu le champ d'application de l'lectrophorse bandelette, dont elle permet d'liminer les tches manuelles associes la manipulation des gels, ainsi que l'tape subsquente de scannrisation des lectrophorgrammes.

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Gnralits
Dans cette technique, le gel classique est remplac par un tube capillaire ouvert ses extrmits, en verre de silice (quartz fondu, verre extrmement pur appel parfois Silice UV) de trs faible diamtre (30 100 m) d'une longueur variant de 0,3 1 m et rempli d'une solution tampon. Les extrmits plongent dans deux rservoirs d'lectrolyte, auxquels on applique une diffrence de potentiel pouvant atteindre 30 kV pendant le temps ncessaire.

Figure

2.29.

Schma

gnral

dune

lectrophorse capillaire : Un tube capillaire dont les extrmits sont plonges dans des rservoirs contenant des lectrolytes et soumis une diffrence de potentielle importante.

L'intensit du courant, dans ces conditions, ne dpasse pas 100 A, soit une puissance dissipe d'un maximum de 3 W, ce qui limite l'chauffement du capillaire qui doit nanmoins tre plac dans une enceinte thermostatise. L'lectrolyte est un mlange soigneusement filtr et dgaz contenant divers additifs. Un dtecteur est plac un peu avant l'extrmit du capillaire. En mode de dtection UV, le capillaire sert directement de cellule de mesure de l'absorbance. On vite ainsi tout volume mort et le mlange des composs spars. Le trajet optique tant extrmement faible, on peut l'augmenter en utilisant un capillaire avec bulbe ou en faisant la dtection l'intrieur d'un Z, mais ces deux procds diminuent bien entendu la rsolution de la mthode. On peut galement raliser une dtection lectrochimique, des lectrodes tant alors insres dans le capillaire. Finalement, la dtection peut se faire par spectromtrie de masse.

Mobilit lectrophortique et flux lectrostatique

Dans ce paragraphe, nous allons voir comment la thorie, que nous avons brivement dveloppe dans la section consacre l'lectrophorse de zone, s'applique l'lectrophorse capillaire. Les particules en suspension dans un liquide, de mme que les molcules solvates, peuvent porter une charge lectrique rsultante dont la grandeur et le signe dpendent de la Gillet Steve, D.Sc. -113-

La chromatographie et l'lectrophorse.

nature du milieu et en particulier de son pH. Cette charge provient de la fixation, leur surface, d'ions contenus dans le milieu tampon. Pour des ions de tailles comparables, les vitesses de migration sont plus grandes s'ils sont porteurs de charges plus importantes. Pour chaque ion, la vitesse de migration rsulte de l'quilibre entre la force lectrique FE qui s'exerce dans le champ E sur la particule de charge Q (F = QE), et les forces de frottement qui dpendent de la viscosit du milieu. Pour les ions minraux, les temps de migration dpendent de leur conductivit limite quivalente. En lectrophorse capillaire, on observe que les constituants d'un mlange se sparent dans le temps par effet de deux facteurs principaux appels mobilit lectrophortique et flux lectro-osmotique, qui sont dfinissables pour les ions, les molcules, les particules ou les micelles.

Mobilit lectrophortique
La mobilit (ou migration) lectrophortique Ue correspond au dplacement des molcules charges, dans un lectrolyte suppos immobile, vers les lectrodes de signe oppos. Ue correspond au quotient de la vitesse de migration de l'ion, ve, par la valeur du champ lectrique, E. Ue = ve/E = ve.L/V, o L reprsente la longueur du capillaire et V la diffrence de potentiel applique ses extrmits. U (cm2.V-1.s-1) s'obtient partir d'une mesure exprimentale faite au dpart d'un lectrophorgramme. On affecte la mobilit Ue le signe (+) ou (-) selon la nature de la charge porte; elle est nulle pour une espce sans charge nette.

Flux lectro-osmotique
Le second paramtre qui contrle le mouvement des soluts est appel flux lectroosmotique Uos. Il est d l'coulement de l'lectrolyte par effet de la paroi interne du capillaire, qui est tapisse de groupements silanols qui se dprotonnent si le pH est suprieur 2 pour former une couche polyanionique fixe. Les cations du milieu tampon, qui viennent recouvrir la paroi, se mettent en mouvement ds qu'un champ lectrique est appliqu au capillaire. Les ions du tampon et les ions H+ (sous forme d'ions H3O+) entranent les molcules lectrolytiques de l'chantillon. Ainsi, mme un anion peut se dplacer vers l'lectrode ngative. Ce dplacement de l'lectrolyte, produit par la charge des ions et le potentiel appliqu, peut tre contrl en modifiant la tension, le pH ou en introduisant des additifs. On dfinit Uos par une relation calque sur la prcdente, vos reprsentant la vitesse lectro-osmotique des molcules neutres de la phase mobile : Uos = vos/E = vos.L/V.

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Figure 2.30. : Schmatisation de la cration du flux lectro-

osmotique.

Pour calculer Uos on doit dterminer vos. Celle-ci est obtenue partir du temps de parcours que met un marqueur neutre pour traverser le capillaire. On choisit une molcule organique, non polaire au pH de l'lectrolyte utilis et facilement dtectable par absorption dans le proche UV, par exemple. Dans les appareils d'lectrophorse capillaire, on met profit le flux lectroosmotique pour imposer l'ensemble des espces charges de l'chantillon une mme direction de migration dont le sens va de l'anode (+) vers la cathode (-). L'accroissement de vitesse du flux lectro-osmotique vos diminue l'cart entre les temps d'arrive des ions, allant dans le mme sens, au niveau du dtecteur. L'emploi de tubes capillaires en silice fondue, partiellement dsactivs par un revtement interne, permet de moduler le flux lectro-osmotique. Ainsi, avec une paroi rendue hydrophobe, comme en CLHP, par un traitement avec un alkylsilyle, les protines deviennent sparables, alors qu'elles ont tendance rester accroches la paroi lorsque celle-ci n'est pas traite. A la limite, on peut ne rcuprer qu'une seule catgorie d'ions, en fonction de la direction du champ appliqu.

Mobilit apparente
Le flux lectro-osmotique, responsable d'une circulation de la phase mobile vers la cathode (-), est donc prendre en compte pour valuer la vitesse relle de migration des molcules charges. On observe que chaque ion a une vitesse apparente vapp facilement mesurable partir de laquelle on dfinit une mobilit lectrophortique apparente Uapp telle que : Uapp = Uos + Ue. En dsignant par L, la longueur du capillaire, et par V la tension applique, le temps de migration t est donn par :

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t=

L2 Uapp V

Expression que l'on retrouve facilement partir de Uapp = vapp.L/V et vapp = L/t. Pour simplifier la comprhension de ce phnomne, on pourrait assimiler la migration des molcules dans le capillaire une course de natation dans une rivire dont le courant serait la transposition du flux lectro-osmotique. Si les nageurs vont leurs vitesses propres d'un point amont un point aval, ils arriveront moins spars dans le temps que sils remontent le courant de l'aval vers l'amont. Si le courant est moins rapide que la vitesse des nageurs, ils effectueront le mme parcours, mais en mettant plus de temps. Enfin deux troncs d'arbres (transposition de molcules neutres) partis au mme instant arriveront sans que soit modifie la distance les sparant.

Instrumentation
Pour introduire l'chantillon dans le capillaire, deux procds d'injection sont utiliss : L'injection hydrostatique consiste plonger l'extrmit du capillaire dans la solution chantillon et provoquer une aspiration l'autre extrmit, ou exercer une pression sur la solution chantillon. Ce mode d'injection n'est pas utilisable en lectrophorse sur gel. L'injection par lectro-migration est obtenue en immergeant quelques secondes l'extrmit du capillaire dans le mlange chantillon, au contact d'une lectrode parcourue par une haute tension, dont on choisit la polarit. Par opposition avec le procd prcdent, ce mode d'injection provoque une action discriminante sur les composs prsents qui conduit faire une prise d'essai non reprsentative de la composition de l'chantillon de dpart.

lectrophorse en veine liquide ou en solution libre

Procd classique caractris par un capillaire rempli soit avec un tampon de pH acide (phosphate ou citrate) ou basique (borate), soit avec un ampholyte (molcule possdant une fonction acide et une fonction basique). Le flux lectro-osmotique crot avec le pH de la phase liquide.

lectrophorse capillaire sur gel

C'est l'lectrophorse de zone actualise. Le capillaire est rempli avec un lectrolyte contenant un gel qui stabilise le milieu contre le phnomne de convection et limite la Gillet Steve, D.Sc. -116-

La chromatographie et l'lectrophorse.

diffusion. La sparation rsulte des effets conjoints de l'lectrophorse et de la chromatographie par permation de gel. La rsolution s'en trouve grandement amliore.

lectrophorse capillaire lectrocintique micellaire

Cette variante, encore appele chromatographie lectrocintique, s'avre utile pour les molcules qui ont tendance migrer sans sparation. On ajoute dans la phase mobile un dtergent cationique ou anionique, tel le SDS, pour former des micelles. Ces infimes gouttelettes, non miscibles la solution dont la surface est polaire, emprisonnent les composs neutres plus ou moins efficacement par affinit du type hydrophile/hydrophobe.

Figure 2.31. : Structure dune micelle.

lectrophorse focalisation isolectrique

Cette technique est comparable l'lectrofocalisation, dont nous avons parl dans la section consacre l'lectrophorse de zone, qui consiste crer un gradient de pH dans le capillaire avec un mlange ampholyte. Dans un premier temps, les composs migrent jusqu'au point o le pH de l'lectrolyte la mme valeur que leurs potentiels isolectriques (pI). Ensuite, on change l'lectrolyte pour dplacer l'ensemble des produits spars vers le dtecteur. Les rsolutions leves, observes avec ce procd, permettent de sparer des peptides dont les pI ne diffrent que de 0,02 % d'unit de pH.

Performances de l'lectrophorse capillaire

Les lectrophorgrammes, dont l'aspect est identique aux chromatogrammes, servent aussi calculer les mmes paramtres de sparation (facteurs de capacit, slectivits, rsolutions). L'efficacit peut tre dtermine, soit graphiquement partir d'un pic, soit partir du coefficient de diffusion D du solut :

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La chromatographie et l'lectrophorse.

N=

Uapp V L2 ou N = 2 s 2D

L'efficacit peut atteindre 400 000 plateaux par mtre. La relation ci-dessus montre qu'elle crot avec la diffrence de potentiel applique et que les macromolcules, dont les facteurs de diffusion sont normalement plus petits que pour les petites molcules, conduisent de meilleures sparations. La mise au point d'une sparation revient trouver un milieu tampon adapt au problme rsoudre. L'lectrophorse capillaire est comparable la chromatographie liquide quant aux performances. Elle complte utilement cette dernire pour les sparations de protines, d'enzymes, de sucres et d'oligonuclotides. La sensibilit est trs grande : on connat des exemples de dtection de quelques milliers de molcules vraies. La quantit requise d'chantillon est trs faible et la consommation de ractifs ou de solvants est ngligeable. Enfin, il est possible de runir lectrophorse capillaire et spectromtrie de masse en ligne, ce qui a donn un intrt accru cette mthode pour l'analyse des composs biologiques. L'effluent du capillaire est mlang un lectrolyte d'appoint avant d'tre nbulis, ionis et enfin introduit dans le spectromtre de masse.

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