FABIANO ALVES

MODELAGEM E SIMULAO DE BIORREATOR

OPERANDO COM FUNGOS TRAMETES VERSICOLOR PARA
PRODUO DE ENZIMA LACASE



















SO CAETANO DO SUL
2010



FABIANO ALVES









MODELAGEM E SIMULAO DE BIORREATOR
OPERANDO OM FUNGOS TRAMETES VERSICOLOR PARA
PRODUO DE ENZIMA LACASE

















SO CAETANO DO SUL
2010
Dissertao apresentada Escola de Engenharia Mau do
Centro Universitrio do Instituto Mau de Tecnologia para
obteno do Ttulo de Mestre em Engenharia de Processos
Qumicos e Bioqumicos.

Linha de Pesquisa: Projeto, Anlise e Controle de Processos
Industriais.

Orientador: Prof. Dr. Rubens Gedraite

























































Alves, Fabiano
Modelagem e simulao de biorreator operando com fungos
trametes versicolor para produo de enzima lacase. / Fabiano
Alves So Caetano do Sul, SP : CEUN-EEM, 2010.
80 p.

Dissertao de Mestrado Programa de Ps-Graduao. Linha
de Pesquisa: Projeto, Anlise e Controle de Processos Industriais
Escola de Engenharia Mau do Centro Universitrio do Instituto
Mau de Tecnologia, So Caetano do Sul, SP, 2010.
Orientador: Prof. Dr. Rubens Gedraite


1. Enzimas. 2. Biorreator. 3. Cintica Enzimtica.
I. Instituto Mau de Tecnologia. Centro Universitrio. Escola de
Engenharia Mau. II. Ttulo.






DEDICATRIA






The best way to have a good idea is to have a lot of ideas.
Linus Pauling



As coisas mais insignificantes tm s vezes maior importncia e geralmente por elas
que a gente se perde....
Fidor Dostoivski













Aos meus pais, Antonio e Maria Ansia In Memorian,
que me propiciaram uma vida digna onde eu pudesse
crescer, acreditando que tudo possvel, desde que
sejamos honestos, ntegros de carter e tendo a
convico de que desistir nunca seja uma ao contnua
em nossas vidas; que sonhar e concretizar os sonhos s
dependero de nossa vontade.


Ao meu amor, companheira, fonte de inspirao,... Minha
querida esposa Maria Antonia, te amo.


Aos meus irmos, Denise, Fbio e Gerson que sempre
acreditaram em mim e me apoiaram em meus sonhos e
minhas idias.


A minha sobrinha Raissa pelo incentivo e presena
constante nos momentos difceis.


AGRADECIMENTO

muito bom passar por uma jornada destas e ter tanto a agradecer, e querer a
tantos homenagear ...
muito bom dizer obrigado a tanta gente que, neste perodo, em que se
acometido de tantos surtos de tristeza, incapacidade, euforia, incerteza, cansao,
alegrias, conseguiu se manter simplesmente presente. Por isso, as homenagens.
Ao bom Deus, a Graa de estar simplesmente vivo, e de poder ter chegado at
aqui.....
Em especial ao Prof. Dr. Rubens Gedraite, meu orientador, pelo apoio irrestrito e
pelas orientaes fundamentais, principalmente naqueles momentos mais crticos.
Ao Instituto Mau de Tecnologia, por propiciar condies para a realizao deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Cludio Garcia pelos ensinamentos e dedicao aos alunos.
Aos demais professores da Ps-Graduao do Instituto Mau de Tecnologia que, de
alguma forma, contriburam para a minha formao acadmica e para realizao
deste trabalho.
Aos laboratoristas Sidnei, Douglas e Rubia, pela amizade e participao e
colaborao para a realizao desse trabalho.



RESUMO



A utilizao de enzimas para o tratamento ou remoo de poluentes ambientais tem
interesse crescente, pois apresenta alta eficincia, seletividade e reaes
ambientalmente saudveis. Neste trabalho escolheu-se o fungo Trametes versicolor
conhecido como fungo da podrido branca da madeira, que capaz de produzir
enzimas oxidativas, classificadas como lacase (p-difenol: dioxignio oxidoredutase
EC 1.10.3.2) uma polifenol oxidase que atua sobre uma variedade de doadores de
hidrognio aromticos e espcies inorgnicas, incluindo ons Mn
+2
. O fungo
Trametes versicolor eficiente produtor de lacase e est sendo utilizado com
sucesso na fermentao de resduos agroindustriais e na descolorao de efluente
Kraft, alm de diferentes corantes. A ampla gama de substratos sobre os quais a
lacase pode atuar uma caracterstica que direciona para seu emprego na
biorremediao de ambientes complexos como o efluente de indstrias, que
apresenta uma composio bastante varivel em funo da sazonalidade de
produo. A chave para o sucesso na aplicao industrial est na identificao de
novas enzimas e na pesquisa das condies especficas de trabalho. A primeira
parte do trabalho envolveu a otimizao da produo da lacase em erlenmeyer e a
modelao matemtica dos resultados experimentais para a determinao dos
parmetros cinticos. Para a otimizao da produo da lacase em erlenmeyer,
diferentes indutores foram utilizados: cobre, o-toluidina e etanol. Estudou-se tambm
a situao de limitao de carbono. A segunda parte do trabalho envolveu a
produo de lacase em biorreator utilizando o meio otimizado em erlenmeyer e os
parmetros cinticos estimados, com base no qual foi realizada a simulao do
processo fermentativo atravs dos modelos matemticos propostos que foram
capazes de descrever adequadamente o comportamento do processo, reproduzindo
os dados de literatura.


ABSTRACT


The use of enzymes for the treatment or removal of environmental pollutants has
increased interest, because of its high efficiency, selectivity and reaction
environmentally sound. In this work we chose the fungus Trametes versicolor fungus
known as white rot of wood, which is able to produce oxidative enzymes, classified
as a laccase (p-diphenol: dioxygen oxidoreductase - EC 1.10.3.2) is a polyphenol
oxidase that acts on a variety of aromatic hydrogen donors and inorganic species,
including ions Mn
+2
. The fungus Trametes versicolor is efficient producer of laccase
and is being successfully used in the fermentation of agribusiness wastes and
effluent decolorization of Kraft, as well as different colors. A wide range of substrates
on which the laccase can act is a feature that directs you to its use in bioremediation
of complex environments such as industry effluent, which presents a highly variable
composition depending on the seasonality of production. The key to success in
industry application is the identification of new enzymes and research of specific
working conditions. The first part of the work involved the optimization of laccase
production in erlenmeyer and mathematical modeling of experimental results for the
determination of kinetic parameters. For the optimization of laccase production in
erlenmeyer, different inducers were used: copper, o-toluidine and ethanol. Was also
studied the situation of limiting carbon. The second part of the work involved the
production of laccase in a bioreactor using the optimized medium in erlenmeyer and
kinetic parameters estimated, which was performed to simulate the fermentation
process through a mathematical model that were able to adequately describe the
behavior of the process, reproducing literature data.

LISTA DE SMBOLOS

ABIA Associao Brasileira das Indstrias da Alimentao
ABIR Associao Brasileira das Indstrias de Refrigerantes
BDA agar-batata-dextrose
BSA bovine serum albumin
C concentrao celular
CBQ quinona oxidoredutase
CDH celobiose dehidrogenase
DNS cido 3,5-dinitrosaliclico
EC Enzyme Commission Numbers
f
dil
fator de diluio da amostra
GIOx glioxalacto oxidase
GRAS Generally Recognized as Safe
IUBMB Internacional Unem of Biochemistry and Molecular Biology
k constante de decaimento exponencial
K taxa linear de crescimento
K
s
constante de saturao
k
La
coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio
K
1
taxa de sntese da lacase
K
2
taxa de decaimento da lacase
L razo entre a taxa especfica de crescimento no incio da fase de desacelerao
e a taxa especfica de crescimento na fase exponencial (fator de sobrevivncia)
LiP lignina peroxidase
m massa
M parmetro que representa a mudana de ambiente
MnP mangans peroxidase
MPL meio de produo de lacase
NCM's Nomenclatura Comum do MERCOSUL
P produto
p/v concentrao peso por volume
q
P
taxa especfica de formao de produto
q
S
taxa especfica de consumo de substrato
s segundo
S substrato

SLM sistema lacase-mediador
SLPM litros cbicos standard por minuto
t tempo
t
a
tempo quando se inicia a fase de desacelerao do crescimento
UV/VIS espectrofotmetro de ultravioleta/visvel
U/L unidade por litro
V volume
VAO veratrlico oxidase
X biomassa
X
0
biomassa inicial
X
m
biomassa mxima
constante associada ao crescimento da biomassa
constante no associada ao crescimento da biomassa
Abs valor medido no espectrofotmetro
taxa especfica de crescimento

ap
viscosidade aparente do caldo

m
taxa especfica de crescimento mxima
coeficiente de extino molar
comprimento de onda
dimetro

SUMRIO

INTRODUO ..................................................................................................................................1

1.1.

JUSTIFICATIVA PARA A REALIZAO DESTE TRABALHO.................................................1

1.2.

OBJETIVOS DESTE TRABALHO.............................................................................................4

1.3.

ESTRUTURA DESTA DISSERTAO DE MESTRADO.........................................................4

REVISO BIBLIOGRFICA..............................................................................................................6

2.1.

CONSIDERAES GERAIS.....................................................................................................6

2.2.

CONSIDERAES SOBRE A NATUREZA DOS FUNGOS....................................................7

2.3.

CONSIDERAES SOBRE ENZIMAS LIGNINOLTICAS.................................................... 11

2.4.

CONSIDERAES SOBRE O USO DE ENZIMAS E SEU POTENCIAL DE MERCADO... 15

2.5.

CONSIDERAES SOBRE A PRODUO INDUSTRIAL DE ENZIMAS ........................... 20

2.6.

CONSIDERAES SOBRE BIORREATORES..................................................................... 21

2.7.

CONSIDERAES SOBRE CINTICA DE PROCESSOS FERMENTATIVOS................... 25

2.8.

CONSIDERAES SOBRE MODELAGEM E SIMULAO DE PROCESSOS
FERMENTATIVOS.................................................................................................................. 33

MATERIAIS & MTODOS ............................................................................................................. 42

3.1.

MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS..................................................................... 42

3.2.

METODOLOGIA EMPREGADA............................................................................................. 44

RESULTADOS OBTIDOS.............................................................................................................. 50

4.1 PRODUO DE LACASE EM ERLENMEYER....................................................................... 50

4.2 MODELAGEM MATEMTICA DA PRODUO DE LACASE EM ERLENMEYER............... 59

4.3 PRODUO DE LACASE EM BIORREATOR........................................................................ 60

4.4 MODELAGEM MATEMTICA DA PRODUO DE LACASE EM BIORREATOR................ 63

ANLISE E DISCUSSO DOS RESULTADOS OBTIDOS........................................................... 65

5.1.

PRODUO DE LACASE EM ERLENMEYER - EFEITO DA CONCENTRAO INICIAL DA
FONTE DE CARBONO........................................................................................................... 69

5.2.

PRODUO DE LACASE EM ERLENMEYER - A EVOLUO DO PH DO MEIO DE
CULTURA PARA AS DIFERENTES CONCENTRAES INICIAIS DE FONTE DE
CARBONO.............................................................................................................................. 70

CONCLUSES & RECOMENDAES........................................................................................ 72


REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................................................... 74
ANEXOS......................................................................................................................................... 74



1
Captulo 1
Introduo


1.1. Justificativa para a realizao deste trabalho
Estudos envolvendo a biodegradao de compostos txicos presentes em
efluentes tem aumentado significativamente nos ltimos anos. Industrialmente tem
crescido o interesse em enzimas extracelulares de fungos devido ao seu potencial
de degradao de vrios compostos xenobiticos, fenlicos altamente txicos e da
lignina.
A indstria de alimentos a que mais tem se beneficiado com o uso das
enzimas, sendo utilizadas em 15% dos processos industriais. Alm disso, este setor
est em crescente expanso faturando aproximadamente R$230,6 bilhes em 2007,
o que representa um crescimento de 10,6 % em relao a 2006 (ABIA, 2008). Desse
total, a indstria de sucos naturais teve uma produo de 190 milhes de litro nos
primeiros cinco meses de 2007 representando um crescimento de 17,3 % em
relao ao mesmo perodo de 2006 (ABIR, 2008).
O escurecimento e turvao durante o processo de armazenamento dos
sumos e vinhos um dos maiores problemas da indstria de alimentos. Os
compostos fenlicos esto envolvidos nestes processos. Convencionalmente, estas
substncias eram adsorvidas e removidas usando, por exemplo, gelatina e
bentonita, que normalmente tinham baixa especificidade e podiam afetar a cor, o
aroma e causar problemas de depsitos.
A lacase pode ser usada para remover ou modificar sacardeos fenlicos,
melhorar transparncia, aparncia de cor, aroma, sabor, estabilidade de sumos de
frutas e bebidas alcolicas fermentadas. As substncias fenlicas no desejadas
podem, depois de polimerizadas pela lacase, ser removidas por filtrao.
Casos h em que a presena da lacase indesejvel em produtos
alimentares dado que provoca o escurecimento dos mesmos. Nestes casos, a sua
inibio pode ser conseguida usando substncias como: cido ferlico, cido oxlico
ou removendo o O
2
.
2
Nas ltimas duas dcadas, muitos esforos tm sido feitos para entender os
mecanismos de biodegradao da lignina por lacase para uso em aplicaes
industriais, principalmente para deslignificao/branqueamento de polpas Kraft.
O tratamento enzimtico de efluentes de esgoto requer a produo de
grandes quantidades de enzimas, neste caso lacases, a baixo custo. O preo
comercial atual de lacases elevado, constituindo uma desvantagem para seu uso.
Um processo barato para a produo de lacases necessrio para um tratamento
enzimtico de efluentes de esgoto sustentvel. Ento, necessrio estabelecer um
procedimento fcil e barato para a produo de lacase.
A lacase tem sido referida como meio de evitar as manchas dos txteis
tingidos ou estampados. Pode ainda ser usada no acabamento do algodo,
substituindo oxidantes convencionais como o hipoclorito de sdio e no processo de
lavagem dos "denim" tingidos com ndigo, conseguindo-se variados efeitos de
lavagem nos produtos.
A lacase pode ser usada em processos de desinfeco, atravs de oxidao
do iodeto com formao in situ de iodo, composto correntemente usado como
desinfetante. A aplicao de um sal lacase-iodeto tem vantagens em relao
aplicao direta do iodo dado que mais estvel e mais seguro que o iodo em
termos de armazenamento, transporte e manuseio. Podendo ainda a liberao de
iodo ser facilmente controlada, por ajuste da concentrao de lacase na preparao.
O sistema pode ser usado em aplicaes industriais, domsticas ou de cuidados
pessoais. Pode aplicar-se desinfeco de guas para beber ou de piscinas, por
exemplo.
A pintura dos cabelos envolve processos oxidativos que implicam no uso de
produtos qumicos com odores desagradveis, irritantes para os tecidos ou de difcil
manuseio. O uso de sistemas com lacase torna o processo menos irritante e permite
atuar em condies muito menos drsticas de pH e concentrao de solventes mais
baixas.
Oxidaes catalisadas por lacases tm sido referidas na pintura de cabelos e
processos de ondulao. Estes sistemas associam a uma maior facilidade de
processamento de certo efeito cosmtico.
A lacase pode ser usada para ensaios de outras enzimas. Neste caso, a
enzima com interesse catalisa a produo de um composto que pode ser depois
3
oxidado pela lacase provocando uma mudana fsica detectvel. O produto de
reao com a lacase regulado pela atividade da enzima com interesse. Este
mtodo pode ser usado para a amilase, aminopeptidase, fosfatase alcalina,
angiotensina convertase, arilamidase, celobiose oxidase, quimiotripsina,
glucosidase, para dar alguns exemplos.
A lacase ligada covalentemente a um anticorpo ou antigene pode ser usada
como marcador enzimtico em imunoensaios.
A lacase pode ser usada na sntese de vrios compostos orgnicos
funcionais, incluindo polmeros com determinadas caractersticas mecnicas,
eltricas ou pticas, corantes txteis, pigmentos para cosmtico, aldedos
aromticos, pesticidas e compostos heterocclicos como a fenoxazina.
Pode ser usado na sntese de compostos medicinais complexos como as do
grupo dos antiinflamatrios, anestsicos, sedativos, da vimblastina (antitumoral), da
"Penicillin X dimer", cefalosporinas (antibiticos). A lacase usada no cross-linking
de polissacardeos para a produo de compsitos.
Outra aplicao interessante na rea dos curtumes. Usa-se na
transformao oxidativa e conseqente acoplamento de precursores de corantes
matriz de colgeno dos couros. Os precursores solveis dos corantes podem ser
adsorvidos, oxidados e polimerizados dando os efeitos de curtimento desejados.
Este processo melhora a eficincia do tingimento e as caractersticas do couro ao
mesmo tempo em que permite reduzir o custo do processo.
Aplicaes da lacase na rea de diagnsticos e/ou usadas em biosensores na
deteco de substncias como fenis, anilinas e O
2
.
Com as vrias aplicaes industriais da enzima lacase e com o comrcio
nacional de enzimas sendo dependentes em sua maioria de importaes, tornando o
custo suscetvel as oscilaes cambiais e agregando despesas com transporte
intercontinental. O emprego de microorganismos considerados GRAS (Generally
Recognized as safe) no processo de produo destas enzimas tambm um fator
de grande importncia.
Por fim, a produo de enzimas com tecnologia nacional tem menor custo em
relao s enzimas importadas, podendo utilizar resduos agrcolas como substrato
para o seu desenvolvimento, como considerado um microorganismo GRAS
4
General Recognized As Safe (no produz metablitos txicos) sendo de fcil
desenvolvimento e multiplicao.

1.2. Objetivos deste trabalho
O presente trabalho tem como objetivo geral o de estudar a cintica de
produo da enzima LACASE usando como critrio o crescimento de fungos
filamentosos (Trametes versicolor) em biorreator batelada, assumindo condies
controladas de temperatura, concentrao de substrato, pH e aerao.
O presente trabalho tem como objetivo especfico desenvolver o modelo
matemtico que representa a cintica de produo da enzima LACASE
considerando o emprego de dois tipos diferentes de indutores.

1.3. Estrutura desta dissertao de mestrado
Com o intuito de se alcanar o objetivo proposto neste trabalho, o texto
apresenta a seguinte estrutura:
No Captulo 1 so apresentadas as motivaes e objetivos usados no
desenvolvimento deste trabalho de pesquisa bem como a organizao do texto.
No Captulo 2 apresentada uma reviso bibliogrfica pertinente ao assunto
abordado neste trabalho. Para este trabalho escolheu-se o fungo Trametes
versicolor conhecido como fungo da podrido branca da madeira, que capaz de
produzir enzimas oxidativas como a enzima lacase, o trabalho envolve a otimizao
da produo da lacase em erlenmeyer e em biorreator e a simulao e modelamento
matemtico dos resultados experimentais.
No Captulo 3 so apresentados os materiais e equipamentos utilizados, bem
como a metodologia empregada para o desenvolvimento do trabalho. Os ensaios
foram realizados no Laboratrio de Engenharia Bioqumica da Escola de Engenharia
Mau.
No Captulo 4 so apresentados os resultados obtidos com o uso do sistema
montado.
No Captulo 5 so apresentada a anlise e discusso dos resultados obtidos.
No Captulo 6 so apresentadas as concluses a que se chegou com o
desenvolvimento das atividades contidas no escopo desta dissertao de mestrado,
5
so discutidas as causas dos desvios encontrados com os dados tericos e as
sugestes de continuidade de trabalhos a respeito do tema.


6
Captulo 2
Reviso Bibliogrfica


2.1. Consideraes Gerais
A LACASE uma enzima amplamente distribuda em plantas superiores e
fungos. Lacases fngicas so produzidas por ascomicetos (Aspergillus nidulans,
Neurospora crassa, Podospora anserina), por deuteromicetos (Botrytis cinerea) e por
basidiomicetos (Collybia velutipes, Fomes annosus, Fomes fomentarius, Lentinus
edodes, Phanerochaete chrysosporium, Pholiota mutabilis, Pleurotus ostreatus,
Poria subacida, Sporotrichum pulverulentum, Trametes sangnea, Trametes
versicolor, Rhizoctonia praticola, Ceriporiopsis subvermispora, Coriolus hirsutus,
Dichomitus squalens) (BOLLAG e LEONOWICZ, 1984; KARAHARIAN et al., 1998;
PERIE et al., 1998). Em funo disto, os fungos degradadores da madeira podem
ser divididos em trs grupos de acordo com a morfologia da degradao que estes
produzem na madeira: fungos de degradao branca, marrom e macia. Os
basidiomicetos de degradao branca so os mais eficientes organismos
degradadores de lignina e outros fenis, sendo capaz de degradar lignina
eventualmente at CO
2
e H
2
O (KIRK e FARRELL, 1987; ORTH et al., 1993;
HATAKKA, 1994; TUOR et al., 1995). A habilidade comum destes fungos oxidar
compostos fenlicos relacionados lignina, que na maioria das vezes est
associada com enzimas extracelulares ligninolticas, em particular a lacase (BARR e
AUST, 1994). As lacases produzidas por diferentes fungos diferem quanto a sua
inducibilidade, nmero de isoformas, massa molecular, pH timo e especificidade
pelo substrato (BOLLAG e LEONOWICZ, 1984).
Em algumas espcies de fungos, a introduo de substncias indutoras no
meio de cultivo inicia a biossntese de uma nova forma extracelular, enquanto que as
formas constitutivas so sintetizadas continuamente. Segundo BOLLAG e
LEONOWICZ,(1984), os fungos Fomes annosus, Pholiota mutabilis, Pleurotus
ostreatus e Trametes versicolor apresentam uma nova isoforma da enzima induzida
por 2,5-xilidina (2,5-dimetilanilina). Esta, dentre os indutores de lacase, vem sendo
7
muito utilizada para o estudo desta enzima em fungos, tais como: Ceriporiopsis
subvermispora (FUKUSHIMA e KIRRK, 1995), Trametes villosa (YAVER et al., 1996)
e Pycnoporus cinnabarinus EGGERT et al., 1996.

2.2. Consideraes sobre a natureza dos fungos
Os fungos so organismos eucariticos quimioorganotrficos. Apresentam
dois tipos morfolgicos principais: os fungos filamentosos, assim chamados por
formarem hifas (ou filamentos revestidos de parede rgida) e as leveduras, fungos
normalmente unicelulares. Os fungos constituem um grupo muito diversificado no
que diz respeito forma, estrutura e capacidade metablica. A maior parte
desenvolve-se de matria orgnica morta. O seu crescimento afetado por fatores
fsicos e qumicos tais como temperatura, umidade, concentrao de oxignio, pH,
micronutrientes, fontes de carbono e nitrognio, entre outros.
Nos fungos, os ncleos esto dispersos em um miclio (conjunto de hifas)
contnuo ou septado. No possuem plastos ou pigmentos fotossintticos e sua
nutrio obtida por absoro. So saprfitos, parasitas facultativos ou biotrficos e
predominantemente filamentosos, mas algumas espcies so leveduriformes.
Os fungos filamentosos so morfologicamente complexos e heterogneos, e
podem exibir diferentes formas estruturais durante o seu ciclo de vida. A sua
estrutura vegetativa bsica de crescimento constituda por um filamento tubular, a
hifa, que originada a partir de um nico esporo reprodutivo (PAPAGIANNE, 2004).
A colnia de um fungo filamentoso uma estrutura muito repetitiva. composta de
uma rede tridimensional ramificada de hifas interconectadas e possui um indefinido
nmero de pontos de crescimento (READ, 1994). A rea superficial relativa faz com
que as hifas estejam bem adaptadas para a absoro, segregao e excreo de
substncias. Quando crescem em culturas submersas, os fungos filamentosos
exibem diferentes formas morfolgicas, dispondo-se desde filamentos miceliares
dispersos at densas massas miceliares agregadas, chamadas de pellets
(PAPAGIANNI, 2004). Os pellets so agregados de hifas apresentando uma forma
esfrica ou elipsoidal, com uma estrutura interna varivel. A forma particular exibida
determinada no somente pelo material gentico, mas tambm pelas condies
fsicas e qumicas do meio de cultura em que se encontram (KOSSEN, 2000;
ZNIDARSIC & PAVKO, 2001).
8
Reconhece-se a existncia de trs classes nesse grupo: basidiomicetos,
ficomicetos e ascomicetos. Os basidiomicetos (fungos superiores) so seres
heterotrficos, necessitam de meios eficientes de segregao de enzimas digestivas
extracelulares. So providos de talo pluricelular formado de hifas septadas. Seu
miclio pode ter crescimento indefinido ou formar, nos tipos mais evoludos, corpos
frutferos de estrutura constante. A estrutura reprodutora caracterstica do grupo o
basdio, que a extremidade de uma hifa dilatada, uni ou pluricelular, e que emite
ramificaes, cada uma suportando em sua extremidade um esporo, ou
basidisporo. Este grupo apresenta uma grande importncia econmica, pois
compreende as espcies causadoras de uma srie de doenas nas plantas
cultivadas. Os basidiomicetos superiores separam-se em dois grupos: os
himenomicetos e os gasteromicetos. Entre os primeiros esto os fungos destruidores
da madeira.
Os fungos da podrido branca da madeira e suas enzimas ligninolticas tm
sido muito estudados devido sua grande eficincia em degradar a lignina e as
possveis aplicaes na indstria de papel (AKHTAR et al., 1997), alm de
apresentar grande potencial para a bioremediao de poluentes com estruturas
similares a lignina (POINTING, 2001).
Os substratos de crescimento para este tipo de fungo a celulose e a
hemicelulose. A degradao da lignina, que altamente recalcitrante, ocorre no fim
do crescimento primrio, atravs de um metabolismo secundrio quando h
deficincia em nutrientes (POINTING, 2001). O ataque do fungo lignina um
processo oxidativo aerbio, no qual so oxidados compostos fenlicos, metxidos e
alifticos da lignina atravs do rompimento de anis aromticos e da criao de
novos grupos carbnico. Estas mudanas na estrutura da lignina resultam na sua
despolimerizao e na produo de dixido de carbono (KIRK & FARRELL 1987).
Os fungos da podrido branca da madeira degradam a lignina tanto
seletivamente como no seletivamente. Na degradao seletiva, tanto a lignina
como a hemicelulose so significativamente mais degradas do que a celulose,
enquanto que na degradao no-seletiva, quantidades iguais de todos os
componentes de lenhinocelulose so degradadas. Alguns fungos como Ganoderma
applanatum, Heterobasidion annosum e Phellinus pini, so capazes de realizar
ambos os tipos de degradao (BLANCHETTE, 1995).
9
Vrios tipos de enzimas ligninolticas, envolvidas na degradao da lignina,
so produzidas pelos fungos da podrido branca da madeira. Alm dessas, eles
tambm podem produzir celulases, xilanases e outras hemicelulases (HATAKKA,
1994). Quase todos os fungos da podrido branca da madeira produzem MnP e
lacase, mas somente alguns produzem LiP (HATAKKA, 1994). A lignina peroxidase
(LiP) oxida as unidades no fenlicas da lignina (KIRK & FARRELL, 1987). A
mangans peroxidase (MnP) oxida Mn
2+
, que pode ser encontrado na madeira e no
solo, a Mn
3+
. A alta reatividade do Mn
3+
faz oxidar os anis fenlicos da lignina em
radicais livres instveis, que se decompem espontaneamente (HOFRICHTER,
2002). A lacase oxida os anis fenlicos em radicais fenoxlicos. Outras enzimas
como a celobiose: quinona oxidoredutase (CBQ), celobiose dehidrogenase (CDH),
glioxalacto oxidase (GlOx), glucose oxidase, lcool veratrlico oxidase (VAO) e
algumas esterases tambm podem apresentar algum papel no complexo processo
da degradao da madeira, mas no atuam sozinhas. Enquanto as enzimas
ligninolticas oxidam compostos fenlicos e criam radicais fenxidos, os compostos
no fenlicos so oxidados via radicais ction (CALL & MUCKE, 1997; GARG &
MODI, 1999).
O sistema de degradao de materiais ligninocelulsicos envolve uma srie
de reaes. As espcies de basidiomicetos, incluindo as do gnero Trametes, so
capazes de realizarem a degradao, devido ao complexo enzimtico
ligninoceluloltico especfico.
O fungo Trametes Versicolor, por vezes classificado como Coriolus, Polyporus
e Polysticus o mais comum habitante encontrado na madeira, causando a
podrido branca (ALEXOPOULUS & MIMS, 1979; ARCHIBALD et al., 1997). Este
fungo pertence classe dos Basidiomycetes, ordem Polyporales, famlia
Polyporaceae (ALEXOPOULUS & MIMS, 1979). Existem cerca de 100 gneros
nesta famlia.
um cogumelo facilmente reconhecido pelo seu corpo frutfero (ou
basidiocarpo) que se apresenta em forma de cauda de peru, como mostra a Figura
2.1. As cores das bandas podem variar dependendo da sua gentica e do ambiente
onde se encontram. A maior parte das bandas de cor castanha escura a clara,
alternando- se com as bandas de cores claras (as hifas).
O seu ciclo de vida inicia-se com um esporo produzido pelo corpo frutfero
(cogumelo). Os esporos germinam e tornam-se hifas, que se agrupam formando o
10
miclio (fase vegetativa). Este por sua vez cresce originando o cogumelo (fase
sexual) (ALEXOPOULUS & MIMS, 1979).

Figura 2.1 - O fungo Trametes Versicolor na forma de cauda de peru.


O T. versicolor um dos mais eficientes fungos degradadores da madeira que
promove a deteriorao simultnea da lignina, celulose e hemicelulose (TANAKA et
al. 1999). As enzimas oxidativas extracelulares produzidas por este fungo iniciam o
ataque madeira. Esta espcie ligninolticas chamada de fungo da podrido
branca porque confere um aspecto esbranquiado madeira medida que esta
apodrece (LEWIN & GOLDSTEIN, 1991). Estas caractersticas fazem com que este
fungo e as suas enzimas ligninolticas sejam estudados e/ou aplicados como
alternativa ao branqueamento qumico da pasta de papel, na indstria txtil para a
remoo de cor (SWAMY & RAMSAY, 1999; WONG & YU, 1999; AMARAL et al.
2004), no tratamento de efluentes industriais (MODI et al. 1998) e na bioremediao
de uma srie de poluentes orgnicos (POINTING, 2001).
Este fungo tambm bastante usado na medicina tradicional Asitica devido
s suas propriedades medicinais (CUI & CHISTI, 2003). No Japo chamado de
Kawaratake ou cogumelo junto ao rio e na China como Yun Zhi ou cogumelo nuvem.
Na medicina tradicional este fungo colhido, seco, modo e extrado com gua
quente. Ele usado no tratamento de infeces pulmonares, hepatite e em doentes
com cancro devido s suas propriedades imunomoduladoras (moduladoras do
sistema imunolgico). Estas propriedades so atribudas aos polissacardeos do T.
versicolor (SUGIURA et al. 1980; Ng, 1998).
11
2.3. Consideraes sobre Enzimas Ligninolticas
As enzimas so protenas globulares que atuam como catalisadores
biolgicos conduzindo as reaes bioqumicas nas clulas dos organismos vivos.
Esto grandemente distribudas na natureza. Quimicamente, as enzimas contm
uma ou mais cadeias de centenas de aminocidos numa complexa estrutura tri-
dimensional, que muito importante para a sua ao. Como em toda a catlise, uma
catlise enzimtica definida como uma reao de parceria que aumenta a
velocidade de uma reao qumica, sem que o catalisador sofra mudanas em todo
o processo. Esta definio implica que uma nica molcula de enzima capaz de
converter muitas molculas de substrato durante o seu tempo de vida. A taxa de
converso destas reaes chamada de atividade de uma enzima. As enzimas
diferem dos catalisadores qumicos em muitos aspectos, tais como: altas taxas de
reao; condies de reao no agressivas e alta especificidade de reao (CALL
& MUCKE, 1997). As enzimas so classificadas pela IUBMB (Internacional Unem of.
Biochemistry and Molecular Biology) atravs do nmero EC, que as agrupa de
acordo com a sua classe e reao que catalisa.
A interao de uma enzima com o substrato pode ser ilustrada pelo modelo
chave -e- fechadura. Somente um substrato (chave), que pode encaixar no centro
ativo (fechadura), ser convertido no centro cataltico, que uma parte do centro
ativo. A respeito desta imagem simplista, as reaes so certamente muito mais
complicadas e s podem ser descritas por modelos muito mais complexos. Ao
contrrio da catlise qumica, as enzimas podem direcionar para reaes especficas
atravs da combinao de mtodos altamente sofisticados com a engenharia
gentica e design computacional de protenas.
As enzimas so grandemente utilizadas como catalisadores na indstria, tal
como acontece na indstria de papel. Os fungos da podrido branca da madeira so
os principais produtores de enzimas ligninolticas. As principais enzimas ligninolticas
so a lacase, a mangans peroxidase (MnP) e a lignina peroxidase (LiP), mas outras
enzimas como algumas esterases tambm podem apresentar um papel significativo
no processo de degradao da madeira.
A Lignina Peroxidase (LiP) uma glicoprotena hmica que catalisa uma
variedade de compostos fenlicos, no fenlicos, hidratos de carbono aromticos e
outros compostos que so resistentes ao ataque microbiano. Requer perxido de
hidrognio como co-fator e a reao ocorrem atravs do mecanismo de oxidao de
12
um eltron seguido por uma srie de reaes no enzimticas (GARG & MODI,
1999). Estas reaes incluem a degradao oxidativa das ligaes -O-4, C-C e
outras ligaes na lignina. Os fungos segregam para o meio de cultura vrias
isoenzimas que apresentam uma massa molecular entre 39 e 43 kDa e propriedades
espectrais e catalticas semelhantes (KIRK & FARELL, 1987).
Alguns estudos mostram que, no T. versicolor, a LiP no importante no
biobranqueamento da pasta de papel (PAICE et al., 1993).
A mangans peroxidase (MnP) constitui o segundo grupo de glicoprotenas
hmicas que requer ons de mangans livres para a sua atividade. A atuao desta
enzima requer tambm a presena de perxido de hidrognio. Inicialmente catalisa a
oxidao do Mn
2+
para o Mn
3+
, que subseqentemente oxida vrios compostos
fenlicos (GARG & MODI, 1999). Os fungos tambm segregam vrias isoenzimas da
MnP para o meio de cultura, embora algumas tambm possam estar ligadas
parede celular (HATAKKA, 1994). A MnP purificada pode desencadear a
despolimerizao de ligninas sintticas e tambm degradar cloroligninas. Verificou-
se que inicialmente o sistema MnP pode igualar a extenso de branqueamento
obtida com o fungo, mas com o decorrer do tempo, os seus nveis diminuem.
A Lacase benzenodiol:oxignioredutase, uma polifenol oxidase, pertencente
classe de enzimas oxidoredutase, tambm conhecida como oxidase de cobre azul.
Pode ser dividida principalmente em duas categorias segundo a sua origem: plantas
e fungos. Foi descoberta por Yoshida em 1883 nas plantas e caracterizada como
uma oxidase de cobre por Bertrand em 1985 (MAYER & STAPLES, 2002). A lacase
de fungos foi descoberta alguns anos depois (CALL & MUCKE, 1997).
Os principais microorganismos produtores de lacase so os fungos da
podrido branca da madeira. T. Versicolor um dos mais estudados fungos da
podrido branca da madeira produtor de lacase (GARG & MODI, 1999). Neste tipo
de fungo, a lacase produzida dentro das clulas e excretada para o exterior dos
filamentos das hifas. O nmero de isoenzimas da lacase pode ser superior a cinco,
dependendo da espcie do fungo e das condies ambientais de crescimento.
A produo da lacase por microorganismos uma caracterstica de muitos
basidiomicetos, particularmente os associados decomposio da madeira, entre
eles o T. Versicolor. So muitos os fatores que afetam a sua produo, a saber: (i)-
concentrao de inoculo; (ii)- composio do meio de cultura; (iii)- concentrao e
propores relativas de carbono e nitrognio; (iv)- pH, (v)- temperatura, (vi)- taxa de
13
aerao e agitao do meio de cultura; (vii)- presena de indutor; e (viii)- ausncia
de inibidores.
Para que a aplicao da lacase seja realizada com sucesso, necessrio que
a sua produo seja feita em grandes quantidades. Por isso, alm de se estudar os
fatores ambientais da produo, muitos autores tm considerado a adio de
indutores ao meio de cultura. O indutor pode ser o substrato da prpria enzima ou
um composto estruturalmente anlogo. No caso da lacase os compostos aromticos
so os mais promissores. Deste modo, pode-se aumentar a produo da lacase
numa grande variedade de fungos ligninolticos pela induo por compostos como
2.5-xilidina, lcool veratrlico, cido felrico, guaiacol, etanol, cobre e produtos
secundrios da indstria do papel como a xilidina e ligninosulfonados, entre outros.
O composto 2.5-xilidina tem sido o mais estudado e mais comum indutor da
produo de lacase. Quando comparado com lcool veratrlico em fermentao
semi-slida por T. versicolor, xilidina mostrou ser um melhor indutor (COUTO et al.,
2002). Outro estudo desenvolvido com T. versicolor em fermentador air lift
comparou a adio de xilidina, etanol e lcool veratrlico na produo da lacase e
mostrou que todos os indutores aumentaram a produo enzimtica, entretanto a
xilidina apresentou melhores resultados de atividade enzimtica (cerca de 1500 U/L),
com um aumento de 14 vezes em relao ao controle (nenhum indutor adicionado
ao meio) (RANCAO et al., 2003). A induo por etanol e lcool veratrlico
apresentou um menor aumento na atividade da lacase, no passando de 400 U/L.
BOLLAG & LEONOWICZ,(1984) verificaram tambm que a xilidina estimulou a
produo de lacase em Fomes annosus, Pholiota mutabilis, Pleurotus ostreatus.
Com o fungo T. modesta, a adio de xilidina, entre muitos indutores testados, foi a
que conduziu a maiores atividades enzimticas (NYANHONGO et al., 2002). A
adio de ABTS juntamente com xilidina na produo de lacase por Trametes sp.
mostrou ser um indutor mais eficiente, com um aumento na atividade de 3,59 vezes
em relao ao controle, enquanto que a xilidina sozinha apresentou um aumento de
2,84 vezes (JANG et al., 2002). A induo da produo da lacase por Pycnoporus
cinnabarinus com ligninosulfonatos e lcool veratrlico aumentou a atividade em
cerca de duas a trs vezes enquanto que o guaiacol no apresentou nenhuma
induo. Obteve-se um aumento de nove vezes na atividade da lacase quando se
empregou xilidina como indutor e no se observou nenhuma alterao na estrutura
da lacase (EGGERT et at. 1996).
14
A introduo de lcool veratrlico em diferentes meios de cultura aumentou a
produo da lacase desde 1,6 at 16 vezes em diferentes fungos utilizados.
Similarmente a adio de guaiacol aumentou a produo enzimtica em at 38
vezes. Entretanto, a maior produo de lacase foi obtida com a adio de
preparados de lignina (indulina, polifom, reax e ligninosulfonato) com um aumento
na produo at 100 vezes com o fungo Phlebia floridensis (ARORA & GILL, 2000).
A adio de pirogalol ao quarto dia da fermentao com T. versicolor aumentou em
trs vezes a produo da lacase (OSIADACZ et al., 1999). A adio de lcool
veratrlico aumentou dez vezes a produo da lacase pelo fungo do gnero
Trametes (MANSUR et al., 1997).
Como a lacase uma enzima que contm cobre, estudos tm mostrado que a
sua adio deste elemento, aumenta a produo da enzima. GIARDINA et al.
(1999), observaram que a adio de sulfato de cobre ao meio de cultura de P.
ostreatus aumentou a atividade da enzima e que este aumento foi proporcional
quantidade de cobre adicionado, atingindo um valor mximo com 150 M de sulfato
de cobre. Outro estudo, tambm com P. ostreatus, mostrou um aumento de oito
vezes na atividade da lacase com a adio de cobre (1mM) ao meio de cultura
(BALDRIAN & GABRIEL, 2002). Com o fungo Trametes, o cobre induziu produo
da lacase nas seguintes espcies: T. versicolor (COLLINS & DOBSON, 1997), T.
pubescens (GALHAUP & HALTRICH, 2001; GALHAUP et al. 2002a), T. modesta
(NYANHONGO et al., 2002) e T. hirsuta (COUTO et al., 2004b).
Como todos os fungos, os fungos filamentosos so heterotrficos. Isto
significa que eles necessitam de compostos orgnicos como fonte de carbono e de
energia, embora alguns casos indiquem que alguns fungos filamentosos possam
fixar dixido de carbono (PAPAGIANNI, 2004). Deste modo, a composio do meio
de cultura tambm um fator importante na produo da lacase. JANG et al., (2002)
estudaram o efeito das seguintes fontes de carbono: glucose, glicerol, xilose,
dextrana e verificaram que a glucose foi melhor fonte de carbono para a produo
de lacase por Trametes sp. NYANHONGO et al. (2002) avaliaram diferentes
concentraes de glucose na produo da lacase por T. modesta e observaram que
a concentrao ideal foi de 0,87 g/L e que concentraes acima de 1 g/L inibem a
sua produo.
Outro importante fator na produo da enzima o pH do meio de cultura. Ele
pode afetar a atividade e estabilidade da enzima (OCALLAGHAN et al., 2002). A
15
maioria dos fungos tolera a variao do pH num intervalo compreendido de 4 a 9,
enquanto que a enzima mais sensvel s variaes do pH (PAPAGIANNE, 2004).
A maior parte das enzimas extracelulares so produzidas em maiores quantidades
em um pH prximo do pH timo da sua atividade
JONSSON et al., (1997) mostrou que o meio de crescimento tamponado em
pH 6,0 foi necessrio para se obter atividade de lacase em culturas lquidas durante
o cultivo de Pichia pastoris e que a manuteno do pH foi extremamente importante
para a produo de altas concentraes de lacase. Outro estudo mostrou que o pH
inicial do meio de cultura de Trametes sp. afetou a produo da lacase. Dentre os
diferentes valores de pH testados (de 3 a 9), o pH de 4,5 foi encontrado como timo
(JONSSON et al., 1997) enquanto que para T. modesta o pH ideal foi de 6,9
(NYANHONGO et al. 2002).
Em fermentaes submersas, a agitao importante para se obter uma boa
mistura do meio evitando limitaes na transferncia de massa e de calor. Em
processos aerbicos, a mistura necessria para se garantir uma suficiente
transferncia de oxignio.

2.4. Consideraes sobre o uso de enzimas e seu
potencial de mercado
A biotecnologia, atravs da utilizao de microorganismos ou dos insumos
produzidos por eles, tem sido amplamente empregada nos processos industriais. A
crescente necessidade da substituio de catlise por biocatlise tem impulsionado
um aumento significativo no consumo de enzimas a nvel internacional. A tecnologia
enzimtica vem sendo utilizada em diversos setores industriais em processos
tradicionais da indstria de alimentos e da indstria de qumica fina. Existe ainda um
grande interesse no desenvolvimento de novos processos de sntese de compostos
quirais. A implementao da tecnologia enzimtica resulta em produtos de maior
qualidade obtidos por processos com menor consumo energtico e de menor
impacto ambiental. Entretanto, apesar de todos os benefcios, as enzimas
apresentam algumas limitaes que esto relacionada com fatores econmicos e de
biossegurana.
O mercado mundial de enzimas apresenta valor comercial de US$2 bilhes de
dlares anuais e vem crescendo a cada ano com taxas de 8 a 10% (Ministrio da
16
Cincia e Tecnologia, 2007). Deste total, o Brasil participa com 5% do mercado
atravs de importaes, que segundo dados de 2005 do Ministrio do
Desenvolvimento chegaram a US$100 milhes de dlares. As enzimas industriais
correspondem a aproximadamente 60% do mercado total de enzimas e tende a
crescer a uma taxa de 5,7% ao ano. Est dividido em trs segmentos: enzimas
tcnicas, destinadas indstria txtil e de produtos de limpeza; enzimas para
alimentos e bebidas, que est em constante crescimento devido procura de novas
aplicaes na rea de laticnios e panificao; e enzimas para rao animal, com
crescimento acelerado devido ao grande interesse dos criadores de aves e sunos
em aumentar o valor nutricional da rao e facilitar sua digestibilidade. As principais
enzimas industriais so: proteases, amilases, lpases, celulases, xilanases e fitases.
O mercado brasileiro de importao e exportao de enzimas industriais no
perodo de 1998 a 2005, utilizando como dados primrios a base de dados "Alice"
(aliceweb.desenvolvimento.gov.br) do Ministrio do Desenvolvimento Indstria e
Comrcio Exterior indicam que os dados para 2005 o mercado externo brasileiro foi
US$ 47 milhes, correspondendo a 2% do mercado mundial. Verificou-se tambm
um total de US$ 31 milhes em importaes e US$ 3 milhes em exportaes. As
enzimas mais importadas so as amilases (US$ 4 milhes e 465 ton a um preo que
varia entre 1,77 a 14,10 US$/kg), seguidas das proteases (US$ 2,5 milhes e 320
ton. a um preo mdio de 7,88 US$/kg), o que corresponde a 14% e 8% do total de
importaes brasileiras, respectivamente. As celulases representam atualmente
apenas 3% da demanda por enzimas industriais no mercado brasileiro (US$ 1
milho e 204 ton. a um preo mdio que varia entre 4,20 e 13,90 US$/kg). Vale
ressaltar que a maior parte das enzimas importadas (73%) est classificada nos
NCM's (Nomenclatura Comum do MERCOSUL) genricos: 3507.90.39 - outras
enzimas e seus concentrados e 3507.90.49 - outras enzimas preparadas, no sendo
possvel a sua identificao. A relao entre quantidades de enzimas e preparaes
enzimticas importadas e exportadas e os valores de importao e exportao
sugerem exportao de matria-prima e importao de produto j industrializado. O
avano da tecnologia enzimtica no Brasil aumentar a sua representatividade
comercial e econmica no cenrio nacional e internacional e trar benefcios sociais
e ambientais.
A lacase uma cuproprotena do pequeno grupo de enzimas chamadas
cuproprotenas azuis, cuprooxidases azuis ou ainda apenas oxidases azuis
17
(THURSTON, 1994). As lacases geralmente apresentam quatro tomos de cobre
circunvizinhos, os quais esto distribudos entre diferentes stios de ligao e so
classificados em trs tipos: cobre tipo um, dois e trs diferenciados por possurem
propriedades caractersticas especficas que os permitem desempenhar papel
importante no mecanismo cataltico da enzima. Na Figura 2.2 apresentada a
estrutura do stio ativo da lacase (MALMSTROM et al., 1975; YAROPOLOV et al.,
1994; MCMILLIN e EGGLESTON, 1997). Segundo CALL e MCKE,(1997); os
cobres tipo um e dois esto envolvidos na captura e transferncia de eltrons e os
cobres tipo dois e trs em ligaes com o oxignio. Na Figura 2.3 apresentado o
esquema do ciclo cataltico da lacase (DURN et al., 2002).
A lacase uma fenoloxidase (p - difenol oxidase, EC 1.10.3.2) que catalisa a
oxidao de vrias substncias aromticas e inorgnicas (particularmente fenis)
com a concomitante reduo de oxignio para gua. Oxida polifenis, metoxi fenis
substitudos, diaminas e uma considervel srie de outros substratos (THURSTON,
1994; XU, 1996; MINUSSI et al., 2002). Compostos fenlicos esto amplamente
distribudos na natureza e sua oxidao ou derivatizao oxidativa importante em
processos tais como oxidao celular, proteo da parede celular, escurecimento em
frutas, processamento de sucos e vinhos, deslignificao de polpas, fortalecimento
de produtos compostos, descoramento de tecidos, detoxificao de solos e guas
poludas.
As lacases oxidam compostos fenlicos at radicais ariloxila, os quais
polimerizam espontaneamente formando complexos insolveis, que podem ser
removidos por precipitao, filtrao ou centrifugao (Figura 2.4). Siringaldazina
(N,N'-bis(3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzilideno hidrazina) considerada um substrato
somente de lacase, sendo que o perxido de hidrognio deve estar excludo uma
vez que este composto tambm oxidado pela peroxidase dependente de
mangans produzida por muitos basidiomicetos ligninolticos (ALBERTI e
KLIBANOV, 1981; XU, 1996; SMITH et al., 1997; DURN e ESPOSITO, 2000;
MINUSSI et al., 2002).
18

Figura 2.2 - Representao esquemtica do stio ativo da lacase (DURN et al., 2002).


Figura 2.3 - Representao esquemtica do ciclo cataltico da lacase (DURN et al., 2002).

19

Figura 2.4.- Representao esquemtica da oxidao de grupos fenlicos de lignina pela lacase


As aplicaes prticas da lacase tm conduzido a um incremento da
pesquisa nas fontes produtoras da enzima, nomeadamente fungos da podrido
branca, e no uso de mediadores, que facilitam a ao cataltica do sistema.
Basicamente, todas as aplicaes da lacase podem estar relacionadas com uma
propriedade da enzima, que a habilidade para produzir um radical livre a partir de
um substrato adequado. conhecido durante as ltimas dcadas que a lacase
catalisa a oxidao direta de fenis e aminas tais como os clorofenis e corantes.
Atualmente tem-se estudado a degradao de compostos xenobiticos como os
pesticidas e efluentes domsticos e industriais.
A remoo da lignina um processo que tem desencadeado uma grande
quantidade de investigaes, especialmente devido sua importncia na indstria
de papel.
Para se aumentar a produo de etanol, lacase obtida pelo T. versicolor foi
expressa em Saccharomyces cerevisiae de modo a aumentar a sua resistncia a
inibidores fenlicos nos hidrolisados ligninocelulsicos (LARSSON et al., 2001).
Em anlise de frmacos, um novo mtodo baseado na lacase foi desenvolvido
para distinguir morfina de codena em amostras de medicamentos (BAUER et al.,
1999).
20
A lacase imobilizada tem sido utilizada com sucesso na remoo de fenis da
uva branca para a clarificao de vinhos (SERVILI et al., 2000).
Em bioremediao, a enzima de fungos tem mostrado muito eficaz na
degradao de uma variedade de poluentes ambientais. A lacase tem aumentado a
eficincia de processos de bioremediao (GELO et al., 1999; POINTING, 2001)
para a degradao de triclorofenol (LEONTIEVSKY, 2000), alcenos (NIKU &
VIIKARI, 2000), efluentes industriais (FUKUDA et al., 2001), descolorao de
pigmentos (YESILADA et al., 2003; ZAMORA et al., 2003, AMARAL et al., 2004;
BLNQUEZ et al., 2004; COUTO et al., 2004a) e degradao de herbicidas
(MOUGIN et al., 2001).

2.5. Consideraes sobre a produo industrial de
enzimas
A produo industrial de enzimas faz-se principalmente pelo processo de
fermentao submersa (em meio lquido), que envolve o crescimento de
microorganismos em um meio rico e com elevadas concentraes de oxignio.
Atualmente este o mtodo mais divulgado. Devido ao desenvolvimento de
tecnologias de fermentao em grande escala, a produo de enzimas microbianas
representa uma parcela significativa nas indstrias de biotecnologia. As
fermentaes em meio lquido podem ser divididas em diversas fases, a saber:
preparao de inoculo, formulao do meio de cultura e condies de fermentao.
Os processos de fermentao mais utilizados para a produo so o processo
contnuo e o processo em batelada alimentada. Parmetros operacionais como
temperatura, pH, taxa de alimentao, consumo de oxignio e formao de dixido
de carbono so medidos e controlados para otimizar o processo de fermentao. O
primeiro passo para a remoo da enzima do meio a remoo das clulas, que
normalmente feito por centrifugao ou microfiltrao. A maioria das enzimas
industriais so extracelulares e permanecem no meio fermentado aps a remoo
da biomassa. A enzima remanescente concentrada por evaporao, filtrao por
membrana ou cristalizao, dependendo da sua aplicao, e posteriormente
comercializada.
Por outro lado, as enzimas tambm podem ser produzidas por fermentaes
em estado slido. As fermentaes de substratos slidos ocorrem em materiais
insolveis em gua. O mais tradicional processo para a produo de enzimas o
21
Koji, que foi desenvolvido a partir da arte oriental de fermentao de gros de
cereais e de soja, por fungos. Apresenta como vantagens a simplicidade, a reduo
nos custos energticos e no volume do fermentador, facilidade em arejamento e a
pequena quantidade de gua usada permite a obteno de metablitos de forma
concentrada, tornando a recuperao dos mesmos mais rpida e econmica.
Entretanto, apresenta os seguintes inconvenientes: lentido, dificuldade em dissipar
energia, em controlar a homogeneidade e parmetros de funcionamento e de
operao contnua (PEREIRA, 1996). Estudos mais recentes (SCHUTYSER et al.,
2003) sugerem a utilizao de modelos matemticos para uma melhor transferncia
de calor e melhor distribuio de gua por pulverizao.

2.6. Consideraes sobre biorreatores
Com o atual desenvolvimento da biotecnologia, os produtos oriundos da
biotransformao como enzimas, corantes, hormnios, antibiticos e anticorpos so
agora comuns. Outra rea em crescimento est relacionada com a aplicao das
tcnicas de cultura de clulas e tecidos vegetais, visando produo de "mudas"
(micropropagao) em larga escala.
Os biorreatores so equipamentos usados para converter matrias-primas em
produtos utilizando microrganismos, clulas animais ou vegetais ou enzimas. Os
biorreatores tm por objetivo proporcionar as condies adequadas de temperatura,
pH, concentrao de substrato, sais minerais, vitaminas e oxignio (para organismos
aerbios) para que microrganismos e clulas cresam e produzam os metablitos de
interesse.
Ao mesmo tempo, modernos biorreatores tm sido construdos para as mais
diversas necessidades de produo (Figura 2.4), com sistemas de controle para
todas as variveis de processo e com uma imensa gama de acessrios (Figura 2.5),
projetados para operao em condies asspticas, com sistemas de auto-limpeza e
de esterilizao local. Embora com todos esses avanos, a utilizao comercial do
potencial da biotecnologia moderna para muitas aplicaes permanece limitada. O
conhecimento insuficiente da engenharia de bioprocessos um dos vrios limitantes
do sucesso de projetos e do aumento de escala das pesquisas em laboratrio.
O projeto e o desenvolvimento de bioprocessos obedecem a uma seqncia
cujo centro representado por um biorreator, seguido pelo desenvolvimento dos
22
sistemas de separao e purificao dos produtos. Sistemas de troca de calor,
utilitrios e o sistema de controle completam o processo. O projeto do biorreator, por
sua vez, envolve vrios aspectos, como a cintica das reaes, os fenmenos de
transporte, as formas de operao, alm das questes da estrutura fsica (CHISTI,
1989).

Figura 2.4 - Biorreator instrumentado do tipo tanque agitado (Bioengineering AG).



Figura 2.5 - Acessrios utilizados na construo de um biorreator: controladores, sistemas de
amostragem, vlvulas, sistema de limpeza automtico, etc. (Bioengineering AG).
Muitos tipos de biorreatores so empregados em processos biotecnolgicos.
Tradicionalmente, o tipo mais utilizado o de tanque agitado (STR). A primeira
aplicao data dos anos 40, quando foi utilizado durante a II Guerra Mundial no
cultivo aerbio para produo do antibitico penicilina (BAILEY, 1980), sendo
utilizado para produo de inoculante de fungos ectomicorrzicos pela primeira vez
na Frana em 1983 (LE TACON et al., 1983). Presentemente, cerca de 90% dos
biorreatores aerbios utilizados na indstria so do tipo tanque agitado tradicional.
Os 10% restantes so representados pelos biorreatores pneumaticamente agitados
tais como os airlifts e os do tipo colunas de bolhas (KOSSEN, 1984).
23
Embora muito utilizados, os biorreatores de tanque agitado no so os mais
adequados para cultivo de microrganismos (ROYSE, 1987), sobretudo porque o grau
de agitao requerido para atingir a transferncia de massa adequada, em muitos
casos, causa danos aos microrganismos devido s zonas de alto cisalhamento das
ps do agitador. Alm disso, a energia mecnica necessria para manter uma boa
mistura e promover a transferncia de massa muito alta e, ao se dissipar no fluido
como calor, precisa ser removida para manter a temperatura controlada. Outra
considerao muito importante que a maioria dos bioprocessos exige que o cultivo
se mantenha assptico por longos perodos, necessitando que os biorreatores de
tanque agitado sejam equipados com selos mecnicos complexos. Assim, os
biorreatores convencionais so mais caros e apresentam maior tendncia
contaminao do que vrios outros tipos de biorreatores. Essas desvantagens tm
conduzido a estudos visando desenvolver outros tipos de biorreatores, como o
caso dos biorreatores de colunas de bolhas (SCHGERL et al., 1977) e os airlift
(BLENKE, 1979; CHISTI e MOO-YOUNG, 1987).
Na indstria de fermentao, os biorreatores tipo tanque agitado e aerado so
os mais empregados. Algumas das razes por assegurar correta distribuio dos
nutrientes (homogeneizao), um mnimo de morte celular resultante da adio de
cido e base concentrados para o controle de pH, uma confivel transferncia de
calor para o controle da temperatura e de massa para o suprimento de oxignio, e
por fim a facilidade no aumento de escala (CHARLES, 1985).
Os caldos fermentativos contendo microrganismos filamentosos exibem
freqentemente um comportamento pseudoplstico (no-Newtoniano), que pode ser
descrito pelo modelo da lei de potncia. Este comportamento exerce um profundo
efeito no desempenho do biorreator, afetando o padro de mistura e os processos
de transferncia de massa e energia (GAVRILESEU et al., 1993).
Em fermentaes aerbias, o crescimento celular eleva a demanda de
oxignio do processo e simultaneamente a viscosidade aparente do caldo (
ap
), que
acaba por dificultar a transferncia de oxignio da fase gasosa para a lquida,
reduzindo o coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (k
La
), o que pode
limitar o crescimento do microrganismo e a prpria biossntese do produto desejado
(BADINO et al., 2001).
O biorreator tipo tanque agitado e aerado, entendido como convencional ou
padro, normalmente apresenta altura do lquido prxima ao dimetro do tanque,
24
sendo agitado por um ou mais impelidores tipo turbina com 6 ps planas, dimetro
igual a 1/3 do dimetro do tanque.
Com o objetivo de evitar a formao de vrtice, usa-se um sistema de quatro
chicanas, diametralmente opostas, apresentando cada uma a largura de 1/10 ou
1/12 do dimetro do tanque.
Apesar de existir a descrio desse tanque padro, na verdade raramente
verifica uma perfeita obedincia a essas relaes geomtricas, observando-se,
freqentemente, tanques com altura maior do que o dimetro, turbinas de dimenses
superiores recomendada, alm do emprego de mltiplas turbinas. Justifica-se tal
procedimento pela necessidade de se obter maior homogeneizao do contedo do
biorreator e transferncia de oxignio mais efetiva (SCHMIDELL, 2001).
A agitao deste tipo de biorreator tem vrias funes, como a transferncia
de quantidade de movimento, calor, massa e homogeneizao do meio reacional. A
necessidade de otimizao de tarefas especficas no biorreator convencional
resultou na elaborao de diferentes tipos de impelidores, sendo mais utilizado o
impelidor turbina de seis ps planas ou tipo Rushton, com o aspersor de gs
localizado abaixo do impelidor (ASENJO e MERCHUK, 1994).
O impelidor turbina de ps planas apresenta fluxo de descarga na direo
radial, ou seja, na direo das paredes do tanque.
Tendo em vista a importncia da agitao do meio, de se esperar que
quanto maior for agitao maior ser a transferncia de oxignio, fator limitante em
processos fermentativos envolvendo o cultivo de microrganismos aerbios. No
entanto, quanto maior a agitao maior ser o cisalhamento celular que pode causar
mudanas morfolgicas irreversveis no microrganismo, e por conseqncia,
mudanas reolgicas no caldo fermentativo, influenciando desta forma a biossntese
do produto de interesse (MERCHUK e GLUZ, 1999).
De fato, os processos biolgicos aerbios necessitam de um correto
dimensionamento do sistema de transferncia de oxignio para se ter um
cisalhamento celular aceitvel e uma transferncia de oxignio da fase gasosa para
a lquida que atenda demanda requerida pela respirao da populao celular.
Os biorreatores pneumticos so caracterizados pela ausncia de sistemas
de agitao, o que simplifica a construo e a operao, alm de apresentar
considervel economia de energia (CHISTI e MOO-YOUNG, 1989). Por outro lado,
25
exigem vazes de aerao mais elevadas, a fim de manter um bom nvel de
agitao e transferncia de oxignio. Atualmente, os biorreatores pneumticos so
empregados com maior freqncia em processos fermentativos e no tratamento de
guas residuais, entre outras operaes.
Dentre os vrios tipos de biorreatores pneumticos, onde a homogeneizao
do meio e a aerao so realizadas pela injeo de ar ou por outros gases atravs
de um aspersor localizado na base, destacam-se os biorreatores airlift e coluna de
bolhas.
H uma grande variedade de configuraes de biorreatores airlift na literatura,
contudo dois principais tipos tm recebido vrias aplicaes: o de circulao externa
e o de circulao interna (CHISTI e MOO-YOUNG, 1989).
Segundo ONKEN e WEILAND,(1983); o biorreator airlift de circulao externa
possui dois tanques cilndricos e paralelos conectados no topo e na base.
Normalmente os dois tanques tm dimetros diferentes, o tanque de maior dimetro
tem a base gaseificada pelo aspersor. J o airlift de circulao interna composto de
um tanque cilndrico, geralmente com um tubo concntrico. A injeo de gs pode
ocorrer na regio anular, entre o tubo concntrico e a parede da coluna ou no interior
do tubo concntrico. Ainda, segundo os autores, o airlift com tubo concntrico o
mais investigado e usado em processos industriais e em escala de bancada.
Uma importante caracterstica dos biorreatores airlift a razo
altura/dimetro. Na indstria essa razo pode ser superior a dez (ONKEN e
WEILAND, 1983). Salientando que esses equipamentos costumam ser projetados
com altura bem superior ao seu dimetro, a fim de permitir maior tempo de
residncia do gs em contato com o lquido e proporcionar maior transferncia de
massa.
2.7. Consideraes sobre Cintica de processos
fermentativos
O estudo cintico de um processo fermentativo consiste inicialmente na
anlise da evoluo dos valores de concentrao de um ou mais componentes do
sistema de cultivo, em funo do tempo de fermentao. Entende-se como
componentes, o microrganismo (ou a biomassa), os produtos do metabolismo (ou
metablitos) e os nutrientes ou substratos que compem o meio de cultura.
26
Tais valores experimentais de concentrao (X, P e S respectivamente),
quando representados em funo do tempo, permitiro os traados das curvas de
ajuste. Pode-se apresentar dados do processo como: crescimento da biomassa,
velocidade do crescimento, rendimento do processo, calor gerado, etc.
A curva de crescimento microbiano - Aps a inoculao de um meio de
cultura, favorvel ao desenvolvimento do microrganismo em estudo, sob temperatura
controlada e agitao adequada, observa-se um comportamento nos valores da
concentrao celular. Quando essa cultura microbiana se desenvolve em um
sistema fechado, pode-se obter sua curva de crescimento. So observadas as
seguintes fases no crescimento: lag, log, estacionria e de declnio.
A fase lag definida como o perodo varivel, onde ainda no h um aumento
significativo da populao. Ao contrrio, um perodo onde o nmero de organismos
permanece praticamente inalterado. Esta fase apenas observada quando o inculo
inicial proveniente de culturas mais antigas. A fase lag ocorre porque as clulas de
fase estacionria encontram-se depletadas de vrias coenzimas essenciais e/ou
outros constituintes celulares necessrios absoro dos nutrientes presentes no
meio.
A fase lag tambm observada quando as clulas sofrem traumas fsicos
(choque trmico, radiaes) ou qumicos (produtos txicos), ou quando so
transferidas de um meio rico para outro de composio mais pobre, devido a
necessidade de sntese de vrias enzimas. Assim, durante este perodo observa-se
um aumento na quantidade de protenas, no peso seco e no tamanho celular.
A fase log ou exponencial definida como a etapa na qual as clulas esto
plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes,
crescendo e se duplicando. Deve ser levado em conta tambm que neste momento,
a quantidade de produtos finais de metabolismo ainda pequena. A taxa de
crescimento exponencial varivel, de acordo com o tempo de gerao do
organismo em questo. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que
eucariotos. Nesta fase so realizadas as medidas de tempo de gerao.
Na fase estacionria, os nutrientes esto escasseando e os produtos txicos
esto tornando-se mais abundantes. Nesta etapa no h um crescimento lquido da
populao, ou seja, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de
clulas que morrem. Na fase estacionria que so sintetizados vrios metablitos
secundrios, que incluem antibiticos e algumas enzimas.
27
Foram detectados alguns genes que so necessrios sobrevivncia das
clulas na fase estacionria. Alm destes, existem outros genes (fatores alternativos
polimerase, protenas protetoras contra dano oxidativo).
A fase de declnio aquela na qual a maioria das clulas est em processo
de morte, embora outras ainda estejam se dividindo. A contagem total permanece
relativamente constante, enquanto a de viveis cai lentamente. Em alguns casos h
a lise celular.
Culturas descontnuas tendem a sofrer mutaes que podem repercutir na
populao como um todo. As prprias condies ambientais tendem a promover
variaes de carter fenotpico (reversvel) nas culturas.
Vrios modelos cinticos tm sido desenvolvidos para descrever o
crescimento de fungos filamentosos incluindo: linear, exponencial, logstico e rpida-
acelerao/lenta-desacelerao no crescimento como mostra a Tabela 2.1. As
curvas tpicas destes modelos esto mostradas na Figura 2.6. As equaes que
descrevem estes modelos esto apresentadas na Tabela 2.1 (IKASARI & MITCHEL,
2000).


















Figura 2.6 - Vrios perfis cinticos de crescimento: (A) exponencial; (B) logstico; (C) linear; (D)
rpida-acelerao/lenta-desacelerao (Adaptado de MITCHELL et al., 2004).

28
A eq. (1) representa a cintica de crescimento celular, na qual a velocidade de
crescimento diretamente proporcional concentrao de biomassa.
(1)
1
dt
dX
X
=
A equao (1) vlida para meios definidos, nos quais a taxa especfica de
crescimento durante a fase exponencial apresenta um valor constante para um dado
microrganismo em determinadas condies de fermentao.
Tabela 2.1 - Formas diferencial e integrada de vrias equaes de crescimento
a

Forma diferencial Forma integrada

Linear


0
. X t K X + =
(6)



Exponencial





Logstico




Duas fases











a
X a biomassa microbiana, t o tempo, K a taxa linear de crescimento, a taxa especfica de
crescimento, X
0
a biomassa inicial, X
m
a biomassa mxima possvel, t
a
o tempo quando se inicia
a fase de desacelerao do crescimento, L a razo entre a taxa especfica de crescimento no incio
da fase de desacelerao e a taxa especfica de crescimento na fase exponencial e k a taxa
especfica do decaimento exponencial (MITCHELL et al., 2004).
A traduo matemtica da dependncia de com diversos fatores (substrato,
biomassa, produto, etc.) tem originado os mais diversos modelos. A proposta de
MONOD (1942) representada pela equao (11), para a taxa especfica de
crescimento, o mais conhecido e utilizado nas reas de biotecnologia e
29
microbiologia. No inclui o efeito das diferenas entre as clulas, nem as alteraes
da composio celular. Ele representa a dependncia de com a concentrao de
um substrato limitante e tem a forma de uma equao hiperblica (11):
(11)
) (
) (
t S K
t S
S
m
+
=


onde
m
a taxa especfica de crescimento mxima, K
S
o parmetro de afinidade
do microrganismo com o substrato (constante do substrato) e S a concentrao do
substrato. Quanto maior a constante do substrato menor a sua afinidade.
A equao (11) um modelo que no leva em conta o efeito inibidor, tanto
pelo substrato como pelo produto formado. Essa, porm, no a nica interpretao
referente a tal condio ideal de cultivo.
Outras equaes foram propostas e que merecem ser citadas (MOSER,
1985).
Equao de Teissier (12) 1
m X

S
K
S
e
Moser (13)
m X n
S
n
S K
S
+
=
Contois e Fujimoto (14)
.

m X
S X K
S
S
+
=
Powell (15)
) (

m X
S K K
S
D S
+ +
=
H pelo menos mais seis outras expresses, propostas por outros autores
que no levam em conta o fenmeno inibio.
A ausncia da inibio no processo fermentativo na verdade uma situao
pouco comum na prtica, principalmente durante um cultivo descontnuo, onde h
um crescente acmulo de metablitos que acabam interferindo desfavoravelmente
sobre o metabolismo e crescimento microbianos.
O problema poderia ser atenuado se fosse, por exemplo, utilizado um valor
inicial relativamente baixo da concentrao de substrato e que assim resultasse
baixas concentraes de produtos inibidores.
30
Essa , entretanto, uma alternativa pouco interessante do ponto de vista
industrial, onde baixas concentraes de produtos acarretariam custos elevados, na
fase posterior de separao e purificao da substncia de interesse.
Nessas circunstncias, a inibio pelo substrato um fenmeno que no
pode ser ignorado.
O efeito do substrato se manifesta quando um valor alto da concentrao
inicial S pode, ao invs de aproximar
x
de
m
provocar um efeito contrrio,
ocasionando uma inibio no crescimento celular.
Este fenmeno est ilustrado na Figura 2.7, onde se pode verificar que a
expresso de MONOD (eq. 11) somente se aplica para valores relativamente baixos
de S, menores ou iguais a K
S
. Acima deste, onde a inibio pelo substrato se
manifesta, a curva tende para
m
at um certo valor de S, para depois se afastar, a
partir deste valor.

Figura 2.7 - Cintica de inibio pelo substrato (curva A) e sem inibio (-----).
A taxa especfica de crescimento dos microorganismos muitas vezes
acompanhada pela formao de produtos. Essa formao pode estar associada ou
no ao crescimento. Os produtos podem estar solveis na cultura, podem emergir
numa forma gasosa ou ser um componente celular no excretado. Neste caso, h
necessidade de ruptura e extrao nas clulas. Os modelos que representam a
formao de produtos levam em conta este fato.
A formao do produto pode ocorrer de trs formas diferentes, a saber:
31
a) - associada ao crescimento, a qual ocorre quando o produto formado
juntamente com o crescimento celular (metabolito primrio);
b) - dissociada do crescimento, a qual ocorre quando o produto s comea a formar-
se no fim da fase exponencial de crescimento (metabolito secundrio);
c) - cintica mista, a qual ocorre quando o produto comea a se formar ao meio da
fase exponencial de crescimento.
Segundo o modelo de PIRT (1975), o produto est associado ao metabolismo
energtico como catablito da fonte de substrato limitante. Este considera que a
fonte de carbono limitante utilizada para a formao de produto, para a formao
de biomassa e para a manuteno celular. O modelo relaciona a taxa especfica de
consumo de substrato (q
S
) com a taxa especfica de formao de produto (q
P
),
conforme a equao (16).
(16) m Y
Y
Y
q Y q
S
P
S
X
S
P
S
S
P P
+ = = =
O modelo tambm relaciona a formao de produto com o crescimento,
contemplando o fato de que a formao de produto por unidade de tempo funo
da taxa especfica de formao deste produto e da concentrao da biomassa, como
apresentado na equao na equao (17).
(17) X q
dt
dP
p
=
O modelo de LUEDEKING & PIRET (2000) um modelo muito til, pois
relaciona todas as situaes reais. Ele baseado na equao (18):
(18) X
dt
dX
dt
dP
+ =
onde a constante associada ao crescimento e a constante no associada ao
crescimento e sim com a concentrao de biomassa. Dividindo toda a equao pela
concentrao de biomassa resulta na equao (6).
(19)
1
+ =
dt
dP
X

Quando o crescimento de um ou mais microrganismos estudado, uma
grande quantidade de dados necessrio uma vez que os parmetros de
crescimento (durao da fase lag, velocidade especfica mxima de crescimento e
32
aumento logartmico da populao) so obtidos com boa exatido quando um
nmero suficiente de repeties feito e, desde que, cada repetio contenha um
nmero suficiente e bem distribudo de pontos experimentais. Este problema ainda
maior se o crescimento for estudado em funo de diferentes condies, como
temperatura, pH ou atividade de gua (AUGUSTIN et al., 1999; BEGOT et al., 1996).
O desenvolvimento de modelos na microbiologia requer uma grande
quantidade de dados. Estes dados so geralmente obtidos pelo mtodo de
contagem de colnias por diluio e plaqueamento (AUGUSTIN et al., 1999). Este
mtodo, mesmo exigindo um grande consumo de tempo e no fornecendo
resultados imediatos, tem sido utilizado como um mtodo padro para mtodos
alternativos que vm sendo desenvolvidos como medidas de impedncia,
radiometria e citometria de fluxo.
O crescimento microbiano pode ser acompanhado, em tempo real, atravs da
Densidade tica, um mtodo j estabelecido e chamado de turbidimetria (BEGOT et
al., 1996). A turbidimetria se tornou um mtodo atrativo, devido ao advento de
sistemas turbidimtricos automatizados (AUGUSTIN et al., 1999; BEGOT et al,
1996). A estimativa dos parmetros de crescimento por medidas de absorvncia tem
a vantagem de ser rpido, no destrutivo, barato e relativamente fcil de automatizar
quando comparado com outras tcnicas e, particularmente, quando comparado com
a contagem de viveis clssica (DALGAARD & KOUTSOUMANIS, 2001).
A avaliao do crescimento de fungos pela medida da taxa de extenso das
hifas, normalmente chamada de taxa de crescimento radial, expressa em
m
/h,
provavelmente, a medida mais simples e direta, mas no necessariamente
representa a verdadeira natureza do crescimento do fungo. Contrariamente s
bactrias, que se reproduzem por cissiparidade e cujo crescimento normalmente
ocorre apenas na superfcie de meios slidos ou de forma homognea atravs de
um meio lquido, as hifas produzidas pelos fungos podem penetrar no meio slido
em trs dimenses (GIBSON & HOCKING, 1997). Entretanto, este mtodo tem sido
utilizado para quantificar o crescimento de fungos, como o relatado por MOLINA &
GIANUZZI (1999), que estudaram o efeito da combinao de temperatura e de
concentraes de cido propinico no crescimento de Aspergillus parasiticus atravs
de medidas do dimetro da colnia.
Segundo LANGVAD (1999), o crescimento de fungos filamentosos em cultura
lquida pode ser medido atravs do aumento do peso seco de culturas realizadas em
33
frascos erlenmeyers estacionrios ou agitados. O autor observou uma relao linear,
entre a absorbncia (lida a 630 nm) e o peso seco, similar para diferentes fungos
com um coeficiente angular de 4,2 mg/mL de peso seco por unidade de
absorbncia.

2.8. Consideraes sobre modelagem e simulao de
processos fermentativos
Historicamente o desenvolvimento e a otimizao de processos fermentativos
e de suas operaes de preparo da matria-prima e de recuperao de produtos
tm sido executados em bases empricas, sem maiores preocupaes em utilizar,
como ferramenta bsica, o conhecimento dos fenmenos envolvidos no processo
em estudo. Neste cenrio tecnolgico enquadram-se de forma geral as usinas de
acar e lcool, que pela existncia de um mercado cativo e do apoio
governamental conseguido desde a implantao do Programa Nacional do lcool
teve, por muitas dcadas, garantida a rentabilidade econmica dos seus
empreendimentos, sem grandes incentivos para aprimorar a tecnologia instalada nas
suas unidades industriais.
A globalizao da economia e a busca sistemtica de uma melhora da
qualidade dos produtos levaram as indstrias nacionais a procurar aprimorar seus
processos produtivos, visando fundamentalmente garantir a sobrevivncia e a
margem de lucro dos seus empreendimentos. Atualmente o mtodo emprico est
sendo substitudo por mtodos mais cientficos utilizando conhecimentos e
tecnologias mais modernas, j consagradas em outras reas do conhecimento
humano. Neste contexto destaca-se o emprego das tcnicas de modelagem
matemtica e de simulao dos processos industriais que, alm de serem um passo
importante para o conhecimento profundo dos processos em questo, permitem
tambm a otimizao das suas condies operacionais, visando aumentar sua
rentabilidade econmica. Estas ferramentas permitem que, uma vez obtido e
ajustado um sistema de equaes matemticas que melhor representa o conjunto de
fenmenos fsicos, qumicos e biolgicos que regem o processo, obtm-se
informaes fundamentais para o seu projeto e a sua operao, sem necessidade
de recorrer a exaustivos testes de laboratrio e/ou planta piloto. tambm atravs
do desenvolvimento e teste de um modelo matemtico ajustado ao processo que se
torna possvel definir a melhor estratgia de controle a ser empregado, utilizando a
instrumentao existente na indstria, complementada pelos contnuos avanos na
34
rea de automao disponveis no mercado. Entretanto, apesar dos novos
instrumentos permitirem a medida on-line das variveis de processo, a estratgia de
controle a ser desenvolvida dever incorporar, via de regra, um algoritmo capaz de
estimar estados no medidos, principalmente quando se tratar de processos
fermentativos, cuja instrumentao , ainda hoje, pouco desenvolvida.
Apesar de a engenharia bioqumica compreender diferentes tipos de
processos, englobando transporte de calor e massa e recuperao de produtos,
incluindo vrios constituintes e fenmenos dominantes, a pesquisa em modelagem
matemtica reportada na literatura tcnica especializada refere-se basicamente s
reaes biolgicas e, recentemente, s reaes que ocorrem no interior das clulas.
Dessa forma, a modelagem matemtica de processos fermentativos pode ser
definida como a tentativa de representar, atravs de equaes matemticas, os
balanos de massa para cada componente no biorreator, associados s complexas
transformaes bioqumicas que ocorrem no processo e s velocidades com que
essas transformaes se processam. Em razo da complexidade do processo real
(que envolve leis fsico-qumicas, bioqumicas e genticas), somada s limitaes
matemticas, os modelos so baseados, geralmente, na idealidade e, em geral,
fornecem uma representao de apenas algumas das propriedades do processo. A
formulao de modelo matemtico deve, possuir um comprometimento entre grau de
complexidade razovel e soluo (esforo computacional) economicamente
desejvel. Por sua vez, a simulao do processo corresponde sua anlise (por
exemplo, sua otimizao) atravs da utilizao do modelo matemtico proposto.
Do ponto de vista da engenharia bioqumica, o desenvolvimento da
modelagem matemtica dos processos fermentativos permite atingir, entre outro, os
seguintes objetivos: organizar informaes desconexas a respeito dos fenmenos
biolgicos num conjunto coerente; pensar (e calcular) logicamente a respeito de
quais componentes e interaes so importantes num sistema complexo; descobrir
novas estratgias para explicar o comportamento das clulas submetidas a
determinados ambientes; corrigir falhas eventualmente existentes no entendimento
convencionado de determinados fenmenos e, finalmente, entender as
caractersticas qualitativamente essenciais de determinados processos.
O objetivo principal da modelagem matemtica e simulao, como ferramenta
do desenvolvimento tecnolgico de processos fermentativos, prever o
comportamento dinmico e estacionrio do processo, inclusive em condies no
35
testadas empiricamente, possibilitando a determinao das condies operacionais
economicamente timas do sistema, auxiliando no projeto e ajuste de algoritmos de
controle, no qual o modelo matemtico formulado passa a ser parte integrante do
mesmo.
Os processos fermentativos incorporam uma srie de caractersticas que os
diferenciam dos processos qumicos, o que pode explicar as dificuldades
encontradas na formulao de modelos matemticos que representem
adequadamente estes processos, ao contrrio do que ocorre com os processos
qumicos convencionais. Entre essas caractersticas podem ser citadas as seguintes:
baixas concentraes e baixas velocidades de reao, como resultado da utilizao
de um meio diludo; complexidade da mistura reagente e capacidade do sistema
(clulas microbianas) de sintetizar seu prprio catalisador; conhecimento insuficiente
de vrios dos fenmenos limitantes das velocidades de produo e falta de sensores
para automao on-line; problemas de esterilidade, segurana e eventualmente da
toxicidade dos processos fermentativos.
Modelos matemticos uma ferramenta til para a otimizao da produo e
aumento de escala de biorreatores, devido quantidade de informaes
quantitativas sobre o rendimento e produtividade da biomassa e produtos. Tambm
desempenham um papel importante na sntese e projeto de sistemas de controle,
alm de poderem ser utilizados em simulao do processo.
BONOMI e SCHMIDELL, (2001) definem a modelagem matemtica de
processos fermentativos como a tentativa de representar, atravs de equaes
matemticas, os balanos de massa para cada componente do biorreator,
associados s complexas transformaes bioqumicas que ocorrem no processo e
s velocidades com que essas transformaes se processam. VOLESKI e
VOTRUBA, (1992) mencionam que, devido complexidade dos processos reais
(que envolve leis fsico-qumicas, bioqumicas e genticas), somada s limitaes
matemticas, os modelos so baseados na idealidade, e em geral fornecem uma
representao fiel de apenas algumas propriedades do processo. Segundo os
autores, a formulao do modelo deve possuir um comprometimento entre grau de
complexidade e soluo economicamente desejvel (esforo computacional).
Logicamente, a descrio completa de todas as vias e interaes metablicas
que ocorrem em um processo biolgico seria uma tarefa impossvel (OHBA, 1998).
Segundo SINCLAIR e KRISTIANSEN, (1987); em um modelo para fermentao
36
devem ser considerados somente aspectos relevantes nos quais se tem interesse.
Dessa maneira, um modelo seria uma srie de relaes entre as variveis de
interesse de um sistema em estudo.
O objetivo da modelagem matemtica de um processo fermentativo ,
portanto, organizar informaes desconexas sobre os eventos em um conjunto
coerente, identificar quais sistemas e interaes so relevantes em um sistema,
descobrir novas estratgias que permitam descrever o comportamento do processo
em determinadas condies e entender as caractersticas qualitativamente
importantes para o processo (BAILEY, 1998).
Vrios autores apresentam classificaes para os diversos tipos de modelos
comumente usados em engenharia bioqumica. Iniciaremos essa classificao pela
definio de dois grandes grupos de modelos matemticos de processos
fermentativos: modelos fenomenolgicos, modelos entrada-sada (caixa-preta).
Na abordagem fenomenolgica, o desenvolvimento do modelo conduzido
pelos aspectos relevantes do processo e pelos chamados princpios fundamentais.
Tais modelos tendem a apresentar boa capacidade de extrapolao. No entanto, o
conhecimento necessrio para um sistema especfico muitas vezes no disponvel.
Conseqentemente, o esforo maior nesse tipo de abordagem dedicado
identificao correta dos mecanismos relevantes ao processo, o que pode consumir
muito tempo (VAN CAN et al., 1996).
Os modelos fenomenolgicos para processos fermentativos so constitudos
por equaes de balano ou de conservao (de massa, de energia ou de
quantidade de movimento os chamados princpios fundamentais), equaes de
velocidade (expresses cinticas que descrevem a gerao ou consumo de
espcies dentro do sistema) e equaes termodinmicas, que relacionam
propriedades termodinmicas do sistema (presso, temperatura, densidade,
concentrao) As equaes cinticas so denominadas modelos cinticos (BONOMI
e SCHMIDELL, 2001).
Os modelos cinticos de processos fermentativos podem ser classificados
quanto ao nmero de componentes usados na representao celular em dois
tipos (BONOMI e SCHMIDELL, 2001), a saber:
37
a) - Modelos no estruturados: o microrganismo visto como uma espcie
reagente simples, possivelmente com uma composio qumica fixa, sem considerar
variaes nos componentes intracelulares;
b) - Modelos estruturados: as clulas so descritas com maiores detalhes,
considerando, por exemplo, componentes intracelulares, permitindo descrever o
estado das clulas e sua adaptao s mudanas do meio ambiente.
Quanto heterogeneidade da populao microbiana, os modelos cinticos
podem ser classificados em (BONOMI e SCHMIDELL, 2001):
a) - Modelos no segregados: a populao considerada homognea, isto ,
todas as clulas apresentam o mesmo comportamento;
b) - Modelos segregados: as clulas so consideradas discretas, como indivduos
de uma populao heterognea, com distribuio de idade, de tamanho e de
propriedades celulares.
Equaes cinticas conforme j indicado anteriormente, na construo
das equaes cinticas que reside toda a dificuldade e, portanto, toda a arte da
formulao dos modelos fenomenolgicos dos processos fermentativos. So as
equaes cinticas que indicam como as variveis de estado do processo em
estudo interferem nas velocidades de crescimento e morte celular, de gerao de
produtos metablicos e de consumo de substrato.
Para formular os modelos cinticos, a partir de dados experimentais,
necessrio executar trs etapas bsicas, a saber: (i) Tratamento dos dados
experimentais; (ii) Calculo das velocidades especficas e (iii) Identificao dos
fenmenos.
Nessa etapa busca-se definir os principais fenmenos que interferem no
processo produtivo em anlise: limitaes e inibies por substratos, principalmente
no que se refere existncia e ao nmero de substratos limitantes e/ou inibidores,
tipo de produto gerado - existncia ou no de associao com o crescimento, entre
outros.
O Quadro 2.1 apresenta os modelos cinticos mais empregados para
representar os fenmenos comumente identificados em processos fermentativos,
alguns dos quais j foram abordados (capitulo 7, pginas 142-144 in SCHIMIDELL et
al, 2001).

38
Quadro 2.1 Modelos cinticos no estruturados, descritos na literatura, para representao de
diversos fenmenos identificados em processos fermentativos
(1) Crescimento num nico substrato limitante:
S K
S
S
m
X
+
=

MONOD (11)
n n
S
n
m
X
S K
S
+
=

MOSER (13)
S X K
S
S
m
X
+
=

CONTOIS (14)
(2) Morte celular:

d d
K =


SINCLAIR; KRISTIANSEN (20)
(3) Crescimento num nico substrato limitante e inibidor:
i
S
a
X
K
S
S K
S
2
+ +
=

ANDREWS (21)
n
i
S
a
X
K
S
S
K

+ +
=
1

WU et al. (22)
(4) Crescimento com mltiplo substrato limitante (uso preferencial de S
1
):
i
S
m
S
m
X
K
S
S K
S
S K
S
2
1
2 2
2 2
1 1
1 1
+ +
+
+
=

DUNN ET et al. (23)
(5) Crescimento com mltiplo substrato limitante (uso simultneo de S
1
e S
2
):
( )( )
2 2 1 1
2 1
S K S K
S S
S S
m
X
+ +
=

MEGEE et al. (24)

+
+
+
+ =
3 3
3
2 2
2 2
1 1
1 1
0
S K
S
S K
S
S K
S
S S S
X




TSAO; HANSON (25)
(6) Consumo do substrato limitante para manuteno:
S X
S
X
S
m
Y
+ =
1


PIRT (26)
Fonte: capitulo 7, pginas 142-144 in SCHIMIDELL et al, 2001
39
Quadro 2.1 Modelos cinticos no estruturados, descritos na literatura, para representao de
diversos fenmenos identificados em processos fermentativos (cont.)
* *
*
max
1
S S K
S S
m
Y
S S X
S
X
S
+

+ + =


ZENG; DECKWER (27)
(7) Produo de produto metablico associado e no associado ao crescimento:
S K
S
S
m
X P
+
+ =

LUEDEKING; PIRT (28)
(8) Produo de produto metablico inibitrio:
P K
K
S K
S
P
P
S
m
X
+ +
=

P K
K
S K
S
P
P
S
m
P
+ +
=
'
'
'
'

(29)

AIBA; SHODA


(30)
P K
S
m
X
P
e
S K
S

+
=

P K
S
m
P
P
e
S K
S
'
'
'

+
=

(31)

AIBA et al

(32)

+
=
m S
m
X
P
P
S K
S
1

+
=
'
1
'
'
m S
m
P
P
P
S K
S

(33)


GHOSE; TYAGI

(34)
Fonte: capitulo 7, pginas 142-144 in SCHIMIDELL et al, 2001

Em relao abordagem estruturada, BIZUKOJC e LEDAKOWICZ, (2003)
descrevem dois tipos de modelos que podem ser aplicados para descrever o
crescimento microbiano. So eles os modelos intracelularmente estruturados, onde
se formulam expresses cinticas para as reaes intracelulares dos mecanismos
metablicos bsicos e os modelos morfologicamente estruturados, nos quais a
biomassa dividida em subsees ou compartimentos de variadas funes e
propriedades bioqumicas. Nos modelos morfologicamente estruturados, as
dimenses das clulas podem ser consideradas.
40
Na abordagem caixa-preta, o desenvolvimento do modelo est relacionado
com observaes do comportamento dos dados medidos do sistema a ser
modelado. A principal vantagem dessa estratgia o fato de ser possvel a
obteno, em um perodo curto de tempo, de um modelo matemtico preciso sem
que seja necessrio um conhecimento detalhado do processo. No entanto, a
principal desvantagem dessa abordagem a impossibilidade de realizar
extrapolaes, sendo necessrio que os experimentos cubram todo o domnio de
aplicao do modelo para evitar tal problema. O principal exemplo de modelos do
tipo entrada-sada so as redes neurais artificiais (VAN CAN et al., 1997).
Resumidamente, as redes neurais artificiais so funes que estimam relaes
entrada sada de um dado sistema. So, portanto, mais uma ferramenta a ser
utilizada em modelagem de processos. Sua caracterstica mais interessante que
no dependem de um modelo matemtico que relacione as entradas e sadas de
um processo. Elas aprendem essa relao partir de um treinamento semelhante
ao aprendizado de um crebro humano. Em funo de suas caractersticas, a rede
neural pode ser aplicada em casos que apresentam fortes no-linearidades,
situaes nas quais em geral mais difcil obter modelos fenomenolgicos.
Na modelagem hbrida, h a combinao das equaes de princpios
fundamentais com uma ou mais redes neurais artificiais. Nesse caso, as redes
neurais artificiais atuam como estimadoras de parmetros ou variveis no
conhecidas. Assim, a rede pode ser treinada para estimar parmetros do modelo
fenomenolgico ou substituir equaes deste como, por exemplo, equaes de
velocidade de reao e de velocidade de crescimento celular (TONIN, 2005).
Existem diferentes tipos de modelos matemticos para microrganismos
filamentosos descritos na literatura. Normalmente, os modelos envolvem a taxa
especfica de crescimento () como uma funo da concentrao de substrato (S),
produto (P) e biomassa (X). Os modelos descrevem a converso de substratos em
produtos atravs das concentraes conhecidas dos metablitos. Em muitos
processos, a formao do produto est relacionada com o crescimento da biomassa
atravs da equao de LuedekingPiret ou suas modificaes.
Crescimento e formao de produtos de fungos filamentosos esto
associados num processo complexo e no completamente esclarecido. A estrutura
multicelular do miclio, a heterogeneidade morfolgica e diferenas no comprimento
da hifa ao longo da fermentao fazem com que se torne difcil construir modelos
41
matemticos para fermentaes de fungos. Levando-se em conta estas variaes no
estado da biomassa, caractersticas estruturais devem ser adicionadas nos modelos
de crescimento e formao de produto (PAPAGIANNI, 2004).
A modelagem matemtica e simulao por computador so ferramentas de
extrema importncia para se entender o funcionamento dos biorreatores. Essas
tambm so bastante teis no estudo de aumento de escala dos mesmos.
A modelagem dos biorreatores que operam com fungos filamentosos
bastante complexa, porm necessria. Para que essa tecnologia de produo de
lacase possa ser utilizada industrialmente, vrios fatores devem ser analisados j
que uma desestabilizao do leito em um biorreator industrial inaceitvel, devido
ao custo que esse fenmeno pode causar.
O estudo de todos os fatores que podem interferir na estabilidade do
biorreator pode ser facilitado atravs da modelagem do mesmo, o que permite,
atravs de simulaes por computador, verificar o comportamento desses em
diferentes condies de operao sem que novos ensaios em escala de bancada
sejam realizados.














42
Captulo 3
Materiais & Mtodos


Como procedimento metodolgico foi realizado uma investigao bibliogrfica
mais detalhada sobre o tema com o objetivo de esclarecer aspectos do objeto em
estudo, a modelagem e simulao de um biorreator. Assim, para a implementao
do projeto ser utilizado o mtodo de abordagem dedutiva, que para LAKATOS,
(1985) seria: partindo das teorias e leis na maioria das vezes predizem a ocorrncia
dos fenmenos particulares, ou seja, a modelagem de biorreatores bastante
complexa e de extrema importncia para o estudo de aumento de escala. O
desenvolvimento de um modelo que possibilite a representao real do
comportamento destes reatores fundamental para que se possam determinar as
condies de operao do reator industrialmente para que este efeito no ocorra,
pois seria uma situao inaceitvel em um biorreator industrial, devido aos custos
que esse fenmeno causaria.
3.1. Materiais e equipamentos utilizados
A linhagem do fungo para realizao do trabalho ser o fungo da podrido
branca da madeira, Trametes versicolor (CCT 4521) liofilizado, obtido junto
Fundao Andr Tosello em Campinas/SP.
Armazena-se a cultura a 4 C e mensalmente transfere-se para uma nova
placa. Faz-se a transferncia atravs de um pequeno corte (com uma ala
previamente estril) do meio slido juntamente com o fungo crescido para uma nova
placa de crescimento, o meio de cultura o meio agar-batata-dextrose (BDA) e sua
composio glicose 2,0% (p/v), agar 1,5% (p/v) e caldo de batata cozida 20,0%
(v/v) com pH 6,0 0,2 e temperatura ambiente (28 C). Para a obteno de esporos
as culturas foram crescidas por cinco dias a 37 C, no escuro. Utiliza-se este meio
de manuteno nos ensaios de produo enzimtica. O fungo crescido em placa de
Petri durante cinco dias mostrado na Figura 3.1.
O biorreator New Brunswick Scientific (modelo Bioflo 2000), com dorna de
vidro de borossilicato (Figura 3.2), capacidade nominal total de 14 L e tampa de ao
43
inox (Figura 3.3), tem sua agitao garantida por um rotor composto por dois
impelidores do tipo Rushton com aerao superficial. Para medir oxignio dissolvido
durante o cultivo, o biorreator possui um eletrodo de vidro esterilizvel (Ingold model
465-90, Mettler-Toledo, Alphaville-Barueri, Brazil) e um eletrodo polarogrfico
autoclavvel (Ingold model 531, Mettler-Toledo, Alphaville-Barueri, Brasil).

Figura 3.1 Trametes versicolor aps 5 dias de crescimento em placa de Petri.
Uma sonda de temperatura foi acoplada internamente ao biorreator. O
contedo da dorna aquecido com auxlio de uma manta eltrica localizada na base
do biorreator e o controle ocorre por meio do resfriamento com circulao de gua
na serpentina de refrigerao localizada em seu interior.
A retirada de amostras foi realizada por uma sada prpria composta por uma
mangueira de silicone e em sua extremidade est conectado um amostrador.

Figura 3.2 Tampa superior de ao inox do biorreator BioFlo 2000 Fermentor (New Brunswick).
44

Figura 3.3 Dorna de vidro do biorreator BioFlo 2000 Fermentor

3.2. Metodologia empregada
A primeira fase da pesquisa realizada neste trabalho considerou a
fermentao em erlenmeyer. Variou-se a concentrao inicial de extrato de malte,
adicionaram-se os indutores e empregou-se a estratgia da limitao por carbono.
Para cada experincia, determinou-se a protena total, o valor de pH do meio de
cultura, atividade da lacase, concentrao de extrato de malte e concentrao final
de biomassa para cada fermentao, em um total de trs.
As fermentaes foram realizadas em erlenmeyer de 500 mL contendo 250
mL de meio de cultura. Eles foram introduzidos em uma cmara de incubao a
28C com agitao orbital de 180 rpm durante 12 dias.
A segunda fase da pesquisa realizada neste trabalho considerou a
fermentao em biorreator. A fermentao foi realizada em um biorreator da New
Brunswick modelo BioFlo 2000 Fermentor (Figura 3.4) com volume nominal de
14000 mL e de trabalho de 7000 mL operando em batelada. O biorreator est
equipado com sistema de controle de temperatura que opera na faixa de 5 C a 50
C. A temperatura de fermentao foi mantida em 28 C. O biorreator possui
agitao mecnica com velocidade varivel entre 50 a 1000 rpm e que foi mantido a
140 rpm e o pH com range de 2 a 12 onde foi mantido em 6,0 atravs de controle
45
automtico por bombas peristlticas por adio automtica das solues de
hidrxido de sdio (NaOH) a 1 M e cido fosfrico (H
3
PO
4
) a 1 M. A aerao foi
realizada por injeo contnua de ar comprimido filtrado atravs de um micro filtro
estril com porosidade de 0,22 m com vazo controlada por um rotmetro na qual a
taxa de vazo de ar ser mantido a 1,2 SLPM (litros cbicos standard por minuto) e
a concentrao de oxignio dissolvido ser controlado por meio de um controlador
DO com range de 0 a 200 %.

Figura 3.4 - Biorreator BioFlo 2000 Fermentor (New Brunswick).
Para a preparao do inculo, faz-se uma cultura de Trametes versicolor
crescida durante cinco dias em placas de petri em meio BDA. Adicionaram-se 10,0
mL do meio de cultura especfico (MPL) em placa de petri. Com uma ala de
inoculao previamente estril, remove-se o miclio crescido no meio BDA e
suspende-se no meio lquido. Transfere-se a suspenso de miclios da placa para
um erlenmeyer, a fim de obter-se uma suspenso concentrada de miclios, o
inculo. Usar determinaes de massa seca, para determinar a concentrao da
suspenso. Filtra-se 8,0 mL desta suspenso de miclios em filtro Millipore com
membrana estril (ME 25/21 ST, 0.45 m 47,0 mm), coloca-se a membrana
filtrante em lmpada de infravermelho durante 2 horas para secagem. Determina-se
a concentrao da suspenso e calcula-se o volume de inculo necessrio para se
obter uma concentrao inicial de 100 mg/L de miclios. Para se garantir a
homogeneidade da suspenso, foram realizados testes preliminares, fazendo-se
vrias rplicas da mesma suspenso e os respectivos pesos secos. Foi utilizado
este mtodo de inoculao nas experincias deste trabalho dos meios de cultura
especficos utilizados (MPL).
O meio de cultivo para fermentao em erlenmeyer na primeira fase do
trabalho foi constitudo de extrato de malte com variao iniciais de concentraes.

46
O meio de cultura especfico (MPL1) sem limitao de carbono para
fermentao em erlenmeyer e biorreator foi constitudo por extrato de malte
0,9 % (p/v), Tween-80 0,10 % (p/v), sulfato de cobre II pentahidratado
0,0005 % (p/v), o-toluidina 0,4 mmol.L
-1
e 5 g. L
-1
de etanol.
O meio de cultura especfico (MPL2) com limitao de carbono para
fermentao em erlenmeyer e biorreator foi constitudo por extrato de malte
0,2 % (p/v), Tween-80 0,10 % (p/v), sulfato de cobre II pentahidratado
0,0005 % (p/v), o-toluidina 0,4 mmol.L
-1
e 5 g. L
-1
de etanol.
A determinao do consumo de substrato (extrato de malte) pelo
mtodo de DNS foi feita quantificando a reduo do cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS)
por reao com os aucares redutores, o que se detecta por mudana de cor, ou
seja, por variaes da absorbncia no visvel (=540 nm) (MILLER, 1959).
A 1,0 mL de amostra devidamente diluda adicionou-se 1,0 mL de reagente de
DNS. Agita-se e aquece a mistura em banho-maria durante cinco minutos. Aps este
tempo, coloca-se o tubo contendo a mistura em banho gelado. Adiciona-se 10,0 mL
de gua destilada, agita-se o tubo e leva-se a absorbncia a 540 nm.
Para a realizao da curva de calibrao procede-se do mesmo modo,
substituindo a amostra por solues de extrato de malte de concentrao conhecida
(0,10 g/L a 1,00 g/L).
A determinao da atividade enzimtica de lacase no meio fermentado
feita atravs da oxidao da siringaldazina pela enzima. Adiciona-se 0,50 mL de
extrato enzimtico em 2,20 mL de tampo fosfato de potssio anidro (100 mM; pH
6,5) com siringaldazina (0,216 mM) em que deve estar previamente termostatizados
a 30C durante 10 min., tendo um volume final de 3,0 mL.
A atividade de lacase determinada atravs da taxa de formao do produto
da oxidao da siringaldazina pela enzima em espectrofotmetro (UV/VIS) a 530 nm
de absorbncia. O radical ction da siringaldazina possui um coeficiente de extino
molar () a 530 nm de 36000 M
-1
cm
-1
. Uma unidade de lacase corresponde
quantidade de enzima existente que oxida 1 mol de substrato por minuto. Para a
converso de Abs/s em U/L efetua-se o seguinte clculo atravs da equao (35).
(35)
10 . f . 60 . Abs

6
dil

=
L
U

onde:
47
Abs: valor medido no espectrofotmetro
60: converso de segundo para minuto
f
dil
: fator de diluio da amostra
10
6
: converso de L para L
: coeficiente de extino molar (M
-1
cm
-1
)


A determinao da protena total pelo mtodo de Folin-Lowry baseia-se
na reao do biureto das protenas com o cobre, em condies fortemente
alcalinas, com a formao de um complexo entre o cobre e os aminocidos
aromticos das protenas, o qual reduzido a um heteropolmero azul, por adio do
cido fosfomolibdicofosfotngstico. Desta reao resulta a colorao azul intensa
(Haris & Angal, 1989) que pode ser quantificada espectrofotometricamente a
750 nm. Este mtodo sensvel a concentraes de protena acima de 0,25 mg/mL.
Nesta anlise foram utilizados os seguintes reagentes stock: (i)- soluo A
[1,0% m/v de sulfato de cobre (CuSO
4
.5H
2
O)]; (ii)- soluo B [2,0% m/v de tartarato
de sdio potssio]; (iii)- soluo C [0,2M de hidrxido de sdio] e (iv)- soluo D
[4,0% m/v de carbonato de sdio].
A 49,0 mL do reagente C adicionam-se 49,0 mL do reagente D, 1,0 mL do
reagente A e 1,0 mL do reagente B. Estes formam o reagente F, a soluo cobre -
alcalina extempornea.
O reagente E obtido por adio de 10,0 mL do reagente Folin-Ciocalteau a
10,0 mL de gua. A 0,50 mL de amostra, adicionaram-se 2,5 mL de reagente E
deixando reagir durante 10 minutos. Em seguida, adicionaram-se 0,25 mL de
reagente F ficando 30 minutos a reagir. A protena total foi determinada pela
converso da absorvncia a 750 nm contra um branco (0,5 mL de tampo da
amostra em lugar da prpria amostra) pela reta de calibrao respectiva.
Para a realizao da curva de calibrao procedeu-se do mesmo modo,
substituindo a amostra por solues de protena (BSA) de concentrao conhecida.
Determinao da concentrao celular por biomassa seca A
determinao da concentrao celular (C) ser realizada pelo mtodo de massa
seca de acordo com BARUQUE e RAMOS, (2000).
48
As amostras em triplicatas de 50 mL retiradas do biorreator sero filtradas em
filtro Millipore com membrana filtrante de 0,45 com 47,00 mm. O filtrado
contendo o precipitado mido ser lavado por trs vezes com gua e levados
estufa a 80 C por 48 horas, colocados em dessecador at atingir a temperatura
ambiente e massa (m) constante. A concentrao celular C em g ser calculada pela
relao entre a massa de cada membrana dessecada (descontando-se as massas
da prpria membrana) e o volume V em L de amostra filtrada conforme equao
(36). Esse mtodo quantifica todas as clulas e indicado para meios com altas
concentraes celulares e para fungos filamentosos.
(36)
V
m
C =

A determinao de parmetros cinticos foi feita com base nas
velocidades especficas de crescimento e de gerao de produtos necessrios para
identificar o comportamento cintico da populao microbiana. O clculo das
velocidades especficas de crescimento e produo o primeiro passo para uma
boa formulao e ajuste de um modelo matemtico de processos fermentativos. Sua
importncia reside fundamentalmente na obteno de estimativas preliminares dos
parmetros por meio de simplificaes e linearizaes do modelo a serem usadas,
posteriormente, como ponto de partida nas metodologias para ajuste de parmetros.
Foi utilizado o mtodo geomtrico que pode ser empregada para o clculo da
velocidade especfica de crescimento (SCHIMIDELL et al., 2001).
A determinao dos parmetros cinticos da fermentao em erlenmeyer foi
necessria, pois a biomassa no pode ser mensurada diretamente ao longo do
tempo no biorreator, esse fungo cresce em agregados (pellets) quando se encontra
em meio lquido, pelo qual as culturas no so homogneas.
A partir dos valores mdios para cada concentrao de substrato e da cintica de
Monod, representada pela equao (11), para o crescimento microbiano, obtm-se
KS pela da regresso linear, que relaciona o inverso da velocidade especfica de
crescimento (1/x), com o inverso da concentrao de substrato (1/S), representada
pela equao (37). Esta metodologia conhecida como o grfico de Lineweaver-
Burk, onde o coeficiente angular igual a (KS / m) e o coeficiente linear a (1/ m).
(37)
1 1 1
max max

+

=
S
K
S
X

49
Para o modelamento matemtico atravs dos modelos da fermentao em
erlenmeyer foram utilizados os parmetros de crescimento estimados com dados
experimentais. Para determinar os parmetros em erlenmeyer, foi ajustado o modelo
de crescimento descrito por Mitchell (Mitchell et al., 2000) para crescimento de
fungos filamentos em fermentaes semi-slidas. Os parmetros de crescimento da
biomassa foram determinados de acordo com as equaes (38a) e (38b), no qual
so consideradas duas fases de crescimento. A primeira, uma fase exponencial, que
descrita pela equao de Monod (38a) e a segunda, uma fase de desacelerao
no crescimento, que representada pela equao Mitchell (38b). Para o consumo
de substrato e produo da enzima foram utilizadas as equaes 39 e 40,
respectivamente. A produo de lacase foi considerada como sendo parcialmente
associada ao crescimento, e foi empregado o modelo de Luedeking e Piret
(Luedeking & Piret, 2000).

(38a) t t para
a
max
<

+
= X
S Ks
S
dt
dX

( ) (38b) t t para
a
) ( max

+
=

X Le
S Ks
S
dt
dX
a
t t K

(39)
1
dt
dX
Y dt
dS
S X
=
(40) X + =
dt
dX
dt
dP

50
Captulo 4
Resultados Obtidos

4.1 Produo de lacase em erlenmeyer

No presente trabalho foram estudadas diferentes condies da produo de
lacase por Trametes versicolor em erlenmeyer como mostra a figura 4.1 com a
finalidade de obter os parmetros cinticos necessrios para a produo em
biorreator.

Figura 4.1 Produo de lacase por Trametes versicolor em erlenmeyer.

Verificou-se o efeito da concentrao da fonte de carbono como mostra a
figura 4.2 na produo de lacase por Trametes versicolor utilizando diferentes
concentraes iniciais de extrato de malte.

Figura 4.2 Atividade de lacase produzida em erlenmeyer por Trametes versicolor com
variaes das concentraes iniciais de extrato de malte.
51
A figura 4.3 mostra o consumo de extrato de malte do meio de cultura durante
a produo de lacase por Trametes versicolor em diferentes concentraes iniciais
de extrato de malte.

Figura 4.3 Consumo de extrato de malte durante a produo de lacase por Trametes
versicolor com variaes das concentraes iniciais de extrato de malte.


Os valores de concentrao de protena total do meio de cultura durante a
produo de lacase com diferentes concentraes iniciais de extrato de malte so
apresentados no grfico da figura 4.4.

Figura 4.4 Evoluo da protena total do meio de cultura durante a produo de lacase por
Trametes versicolor com variaes das concentraes iniciais de extrato de malte.

52
A variao do pH do meio de cultura para as diferentes concentraes de
extrato de malte apresentada na figura 4.5. O perfil da variao do pH mostra que
existem dois comportamentos distintos para as diferentes concentraes de extrato
de malte testadas.

Figura 4.5 Variao do pH do meio de cultura durante a produo de lacase por Trametes
versicolor com variaes das concentraes iniciais de extrato de malte.

A figura 4.6 apresenta, para os ensaios realizados, a mxima atividade da
lacase seu respectivo valor de pH e a biomassa final para as diferentes
concentraes de extrato de malte avaliadas.

Figura 4.6 Mxima atividade de lacase, biomassa final de Trametes versicolor e pH do meio de
cultura com variaes das concentraes iniciais de extrato de malte.
53
As tabelas 4.1, 4.2 e 4.3 apresentam os resultados experimentais obtidos das
fermentaes realizadas erlenmeyer utilizando o meio de cultura especfico (MPL1)
definido no item 3.2 captulo 3 para produo de lacase por Trametes versicolor em
cultura submersa descontinua sem limitao de carbono.


TABELA 4.1 - Comportamento temporal da concentrao de biomassa (X),
consumo de substrato (S) e atividade de lacase (P) em fermentao (F1)
sem limitao de carbono.
tempo
[dia]
X
[g/L]
S
[g/L]
P
[U/L]
1 0,100 9,000 0,000
2 0,192 8,891 0,269
3 0,213 7,397 108,854
4 0,584 6,860 225,000
5 0,889 6,172 361,000
6 1,164 6,059 493,000
7 1,229 5,411 469,000
8 1,317 4,225 381,000
9 1,341 2,989 283,000
10 1,373 1,450 208,000
11 1,429 0,762 155,000
12 1,431 0,310 75,000


TABELA 4.2 - Comportamento temporal da concentrao de biomassa (X),
consumo de substrato (S) e atividade de lacase (P) em fermentao (F2)
sem limitao de carbono.
tempo
[dia]
X
[g/L]
S
[g/L]
P
[U/L]
1 0,100 9,000 0,000
2 0,110 8,409 0,967
3 0,211 7,201 76,897
4 0,367 6,963 100,000
5 0,865 6,738 209,000
6 1,187 6,675 376,000
7 1,209 5,675 394,000
8 1,293 3,213 375,000
9 1,397 2,188 292,000
10 1,377 1,176 156,000
11 1,455 0,338 124,000
12 1,512 0,275 100,000






54

TABELA 4.3 - Comportamento temporal da concentrao de biomassa (X),
consumo de substrato (S) e atividade de lacase (P) em fermentao (F3)
sem limitao de carbono.
tempo
[dia]
X
[g/L]
S
[g/L]
P
[U/L]
1 0,100 9,000 0,000
2 0,090 8,680 0,008
3 0,161 7,900 64,432
4 0,512 6,770 104,987
5 0,843 6,190 265,000
6 1,176 5,780 285,000
7 1,205 5,340 374,000
8 1,283 4,670 355,000
9 1,367 2,950 246,000
10 1,447 1,010 200,000
11 1,439 0,430 130,000
12 1,451 0,340 120,000

Os dados experimentais apresentados nas tabelas 4.1, 4.2 e 4.3 foram
convertidos para os respectivos valores mdios e apresentados na tabela 4.4, a
partir da qual foi construda a figura 4.8.

TABELA 4.4 Valores mdios do comportamento temporal da
concentrao de biomassa (X), consumo de substrato (S) e atividade de
lacase (P) em fermentao (FM) sem limitao de carbono.
tempo
[dia]
X
[g/L]
S
[g/L]
P
[U/L]
1 0,100 9,000 0,000
2 0,131 8,660 0,415
3 0,195 7,499 83,394
4 0,488 6,864 143,329
5 0,866 6,367 278,333
6 1,176 6,171 384,667
7 1,214 5,475 412,333
8 1,298 4,036 370,333
9 1,368 2,709 273,667
10 1,399 1,212 188,000
11 1,441 0,510 136,333
12 1,465 0,308 98,333


55

Figura 4.8 Valores mdios dos dados experimentais para o cultivo de Trametes versicolor em
erlenmeyer sem limitao de carbono. (X) biomassa e (S) substrato.


As tabelas 4.5, 4.6 e 4.7 apresentam os resultados experimentais obtidos das
fermentaes realizadas erlenmeyer utilizando o meio de cultura especfico (MPL2)
definido no item 3.2 captulo 3 para produo de lacase por Trametes versicolor em
cultura submersa descontinua com limitao de carbono.

TABELA 4.5 - Comportamento temporal da concentrao de biomassa
(X), consumo de substrato (S) e atividade de lacase (P) em fermentao
(F4) com limitao de carbono.
tempo
[dia]
X
[g/L]
S
[g/L]
P
[U/L]
1 0,100 2,000 0,000
2 0,152 1,968 0,016
3 0,214 1,908 0,875
4 0,299 1,695 134,000
5 0,593 1,568 306,000
6 0,689 1,414 590,000
7 0,705 1,095 625,000
8 0,780 0,653 646,000
9 0,914 0,426 676,000
10 0,980 0,137 401,000
11 1,016 0,085 241,000
12 1,116 0,015 189,000

56



TABELA 4.6 - Comportamento temporal da concentrao de biomassa
(X), consumo de substrato (S) e atividade de lacase (P) em fermentao
(F5) com limitao de carbono.
tempo
[dia]
X
[g/L]
S
[g/L]
P
[U/L]
1 0,100 2,000 0,000
2 0,117 1,872 0,032
3 0,111 1,771 0,987
4 0,467 1,612 186,000
5 0,565 1,437 374,000
6 0,684 1,247 407,000
7 0,731 1,006 601,000
8 0,804 0,564 585,000
9 0,880 0,369 573,000
10 0,986 0,187 469,000
11 0,968 0,115 305,000
12 1,078 0,067 276,000




TABELA 4.7 - Comportamento temporal da concentrao de biomassa
(X), consumo de substrato (S) e atividade de lacase (P) em fermentao
(F6) com limitao de carbono.
tempo
[dia]
X
[g/L]
S
[g/L]
P
[U/L]
1 0,100 2,000 0,000
2 0,100 1,950 0,012
3 0,174 1,860 0,739
4 0,334 1,690 237,000
5 0,546 1,530 415,000
6 0,662 1,290 498,000
7 0,750 0,964 598,000
8 0,783 0,665 545,000
9 0,893 0,388 501,000
10 0,964 0,132 498,000
11 1,009 0,017 327,000
12 1,106 0,009 254,000



57
Os dados experimentais apresentados nas tabelas 4.5, 4.6 e 4.7 foram
convertidos para os respectivos valores mdios e apresentados na tabela 4.8, a
partir da qual foi construda a figura 4.9.

TABELA 4.8 Valores mdios do comportamento temporal da
concentrao de biomassa (X), consumo de substrato (S) e atividade de
lacase (P) em fermentao (FM) com limitao de carbono.
tempo
[dia]
X
[g/L]
S
[g/L]
P
[U/L]
1 0,100 2,000 0,000
2 0,123 1,930 0,020
3 0,166 1,846 0,867
4 0,367 1,666 185,667
5 0,568 1,512 365,000
6 0,678 1,317 498,333
7 0,729 1,022 608,000
8 0,789 0,627 592,000
9 0,896 0,394 583,333
10 0,976 0,152 456,000
11 0,998 0,072 291,000
12 1,100 0,030 239,667


Figura 4.9 Valores mdios dos dados experimentais para o cultivo de Trametes versicolor em
erlenmeyer com limitao de carbono. (X) biomassa e (S) substrato.


58
A determinao de parmetros cinticos foi feita com base no
procedimento apresentado no sub-item 3,2 do captulo Materiais e Mtodos. As
velocidades especficas foram calculadas e apresentadas na figura 4.10.. Foi
utilizado o mtodo geomtrico no clculo da velocidade especfica de crescimento
(SCHIMIDELL et al., 2001).

Figura 4.10 - Valores de calculados a partir dos X mdio

A partir dos valores mdios para cada concentrao de substrato e da cintica
de Monod, representada pela equao (11), para o crescimento microbiano, obtm-
se K
S
pela da regresso linear, que relaciona o inverso da velocidade especfica de
crescimento (1/
x
), com o inverso da concentrao de substrato (1/S), como mostra
a figura 4.11.

Figura 4.11 Determinao de K
S
.
59
Os coeficientes angulares e lineares foram determinados com o uso do
programa Microsoft Excel. Os valores estimados para K
S
e
m
esto representados
na tabela 4.9.
4.2 Modelamento matemtico da produo de lacase em erlenmeyer

Para o modelamento matemtico atravs dos modelos da fermentao em
erlenmeyer foram utilizados os parmetros de crescimento estimados com dados
experimentais. Para determinar os parmetros em erlenmeyer, foi ajustado o modelo
de crescimento descrito por Mitchell (Mitchell et al., 2000) para crescimento de
fungos filamentos em fermentaes semi-slidas. Os parmetros de crescimento da
biomassa foram determinados de acordo com as equaes (38a) e (38b), no qual
so consideradas duas fases de crescimento. A primeira, uma fase exponencial, que
descrita pela equao de Monod (38a) e a segunda, uma fase de desacelerao
no crescimento, que representada pela equao Mitchell (38b). Para o consumo
de substrato e produo da enzima foram utilizadas as equaes 39 e 40,
respectivamente. A produo de lacase foi considerada como sendo parcialmente
associada ao crescimento, e foi empregado o modelo de Luedeking e Piret
(Luedeking & Piret, 2000).

(38a) t t para
a
max
<

+
= X
S Ks
S
dt
dX

( ) (38b) t t para
a
) ( max

+
=

X Le
S Ks
S
dt
dX
a
t t K

(39)
1
dt
dX
Y dt
dS
S X
=
(40) X + =
dt
dX
dt
dP





60

TABELA 4.9 Parmetros cinticos estimados.
Parmetros cinticos


Valores

max
(dia
-1
)

0,34030

Ks (g/L)

0,39185

Y
X/S
(g/g)

1,8920

L

1,53751

k (dia
-1
)

0,035291627

(U/ g biomassa)

0,596818279

(U/ g biomassa. dia)

66,8123597

t
a
(dia)

2


4.3 Produo de lacase em biorreator
As fermentaes no biorreator figuras 4.12 e 4.13 foram realizadas com base
nas fermentaes experimentais em erlenmeyer que foi descrito no item 4.1 nesse
captulo. Nestas fermentaes analisou-se o efeito da concentrao inicial de extrato
de malte e o efeito do pH do meio na atividade da lacase.



Figura 4.12 Produo de lacase por Trametes versicolor em biorreator no 3 dias de fermentao.

61














Figura 4.13 Produo de lacase por Trametes versicolor em biorreator no 7 dias de fermentao.


As tabelas 4.10 e 4.11 apresentam os resultados experimentais obtidos das
fermentaes realizadas erlenmeyer utilizando o meio de cultura especfico (MPL1 e
MPL2) definido no item 3.2 captulo 3 para produo de lacase por Trametes
versicolor em cultura submersa descontinua.


TABELA 4.10 - Comportamento temporal da concentrao de biomassa
(X), consumo de substrato (S) e atividade de lacase (P) em fermentao
(F7) com limitao de carbono.
tempo
[dia]
X
[g/L]
S
[g/L]
P
[U/L]
1 0,1 2,0 0,0
2 0,1 2,0 125,3
3 0,3 1,9 1233,8
4 0,4 1,6 2699,1
5 0,7 1,3 5656,6
6 0,8 1,0 7089,1
7 1,1 0,8 5984,7
8 1,1 0,5 2897,9
9 1,2 0,4 1175,5
10 1,2 0,2 112,2
11 1,2 0,1 32,5
12 1,1 0,1 1,1


62
TABELA 4.11 - Comportamento temporal da concentrao de biomassa
(X), consumo de substrato (S) e atividade de lacase (P) em fermentao
(F8) com limitao de carbono.
tempo
[dia]
X
[g/L]
S
[g/L]
P
[U/L]
1 0,1 9,0 0,0
2 0,1 9,0 132,0
3 0,2 8,0 487,0
4 0,5 6,4 1037,0
5 0,8 5,2 1525,0
6 1,0 3,7 2120,0
7 1,2 2,4 2385,0
8 1,6 1,4 2424,0
9 1,7 0,7 2094,0
10 1,8 0,4 1548,0
11 1,8 0,2 1118,0
12 1,8 0,1 949,0

Com base nos dados experimentais obtidos acerca da fermentao em
biorreator apresentados nas tabelas 4.9 e 4.10, com e sem limitao de carbono, foi
construda as figuras 4.18 e 4.19 que apresentam o comportamento temporal do
consumo de substrato e crescimento microbiano.


Figura 4.18 Fermentao (F7). Dados experimentais para o cultivo de Trametes
versicolor em biorreator com limitao de carbono. (X) biomassa e (S) substrato.
63

Figura 4.19 Fermentao (F8). Dados experimentais para o cultivo de Trametes
versicolor em biorreator sem limitao de carbono. (X) biomassa e (S) substrato.

4.4 Modelagem matemtica da produo de lacase em biorreator
Para realizao da modelamento matemtica em biorreator foi necessrio
realizar experincias em erlenmeyer uma vez que no foi possvel determinar a
concentrao de biomassa ao longo da fermentao em biorreator. Este fungo
quando se encontra em meio lquido apresenta-se como pellets fazendo com que a
cultura no seja homognea onde no permite a determinao direta da
concentrao da biomassa. Foram feitas as fermentaes em doze erlenmeyer,
onde cada erlenmeyer correspondeu a um dia de fermentao, ou seja, cada
erlenmeyer representou a biomassa de um dia de crescimento do fungo. Cada dia,
um erlenmeyer foi retirado do agitador e o meio de cultura foi filtrado em filtro
Millipore com membrana filtrante de 0,45 com 47,00 mm e a biomassa retida no
filtro foi medida por peso seco.
Os modelos da fermentao em biorreator foram baseados nos parmetros
de crescimento estimados a partir das fermentaes em erlenmeyer.
Os parmetros calculados para a fermentao em erlenmeyer foram usados
como constantes nas equaes descritas no modelo do biorreator. Nestas equaes
acrescentou-se o parmetro A que representa a mudana ambiental do erlenmeyer
para o biorreator. O modelo da produo de lacase, do crescimento de biomassa e
64
de consumo de substrato em biorreator est representado pelas equaes 38 e 41-
43. A tabela 4.12 est os valores dos parmetros estimados M; K
1
e K
2
.
(38)
1
dt
dX
Y dt
dS
S X
=
(41) t t para
a
max
<

+
= X
S Ks
S
M
dt
dX

( ) (42) t t para
a
) ( max

+
=

X Le
S Ks
S
M
dt
dX
a
t t K

(43)
2 1
P K e K
dt
dP
X
=





TABELA 4.12 Parmetros cinticos estimados.
Parmetros cinticos


Valores

max
(dia
-1
)

0,172030

Ks (g/L)

0,260695409

Y
X/S
(g/g)

0,18920

L

1,53751

k (dia
-1
)

0,035291627

(U/ g biomassa)

0,596818279

(U/ g biomassa. dia)

66,8123597

t
a
(dia)

2

K
1
(U/g biomassa .dia)

22,81094875

K
2
(dia
-1
)

0,00025

M

0,596818279



65
Captulo 5
Anlise e Discusso dos Resultados
Obtidos


Os resultados experimentais obtidos permitiram ajustar os parmetros a
serem usados no modelo matemtico proposto neste trabalho que foram baseados
em Monod.
Os comportamentos temporais das concentraes de X(t, S(t) e de P(t) foram
simulados no ambiente SIMULINK do aplicativo MATLAB, com base no modelo
proposto neste trabalho.
A figura 5.1 apresenta o diagrama de simulao elaborado com base no
modelo matemtico proposto para a reao de fermentao em erlenmeyer..
S(t)
X(t)
dX(t)/dt
dX(t)/dt
X(t)
X(t)
X(t)
S(t)
S(t)
ta1
1
ta
2
t
simout 3
mi max
0.34
mi X
mi
8.126e-006
Yx/s
-K-
X(t) Mux
X(t)
X
simout
Switch
S(t) Mux
S(t)
S
simout 1
Product
P(t)
P
simout 2
Math
Function
e
u
Lookup Table 1
Lookup Table
Ks
.39185
K1
-K-
K
-K-
Integrator 2
1
s
Integrator 1
1
s
Integrator
1
s
Divide
Clock2
Clock1
Clock
Beta
-K-
Alfa
-K-
-1
-1

Figura 5.1 Diagrama de simulao para a produo de lacase por Trametes versicolor em
erlenmeyer

66
O grfico apresentado na figura 5.2 ilustra o comportamento temporal da
concentrao da Lacase em erlenmeyer obtida experimentalmente em comparao
com aquele calculado computacionalmente com base no modelo matemtico
proposto. Pode-se verificar que o resultado terico obtido est muito prximo do
experimental.
0 2 4 6 8 10 12
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
tempo [dias]
X

(
t
)

[
g
/
L
]


Experimental
Modelo

Figura 5.2 comportamento temporal da concentrao de Lacase em funo do tempo

O grfico apresentado na figura 5.3 ilustra o comportamento temporal da
concentrao de Substrato em erlenmeyer obtida experimentalmente em
comparao com aquele calculado computacionalmente com base no modelo
matemtico proposto. Pode-se verificar que o resultado terico obtido apresenta
comportamento coerente com o experimental apesar de defasado em relao ao
tempo.
0 2 4 6 8 10 12
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
tempo [dias]
S
(
t
)

[
g
/
L
]


Experimental
modelo

Figura 5.3 comportamento temporal da concentrao de Substrato em funo do tempo
67
A figura 5.4 apresenta o diagrama de simulao elaborado com base no
modelo matemtico proposto para a reao de fermentao em bioreator.
S(t)
X(t)
dX(t)/dt
dX(t)/dt
X(t)
X(t)
X(t)
S(t)
S(t)
ta1
1
ta
4
mi max
0.47
mi X
mi
1.159e-005
Yx/s
3
X(t) Mux
X(t)
X
X
Switch
S(t) Mux
S(t)
S
S
Product
P(t)
P
P
Math
Function
e
u
Lookup Table 2
Lookup Table 1
Lookup Table
Ks
.2606
K2
-K-
K1
-K-
K
-K-
Integrator 2
1
s
Integrator 1
1
s
Integrator
1
s
Divide
Clock3
Clock1
Clock
Beta
-K-
Alfa
-K-
-1
-1

Figura 5.4 Diagrama de simulao para a produo de lacase por Trametes versicolor em bioreator

O grfico apresentado na figura 5.5 ilustra o comportamento temporal da
concentrao da Lacase em erlenmeyer obtida experimentalmente em comparao
com aquele calculado computacionalmente com base no modelo matemtico
proposto. Pode-se verificar que o resultado terico obtido est muito prximo do
experimental.
68
0 2 4 6 8 10 12
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
tempo [dias]
X
(
t
)

[
g
/
L
]


Experimental
Modelo

Figura 5.5 comportamento temporal da concentrao de Lacase em funo do tempo

O grfico apresentado na figura 5.6 ilustra o comportamento temporal da
concentrao de Substrato em erlenmeyer obtida experimentalmente em
comparao com aquele calculado computacionalmente com base no modelo
matemtico proposto. Pode-se verificar que o resultado terico obtido apresenta
comportamento coerente com o experimental.
0 2 4 6 8 10 12
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
tempo [dias]
S
(
t
)

[
g
/
L
]


Experimental
Modelo

. Figura 5.6 comportamento temporal da concentrao de Substrato em funo do tempo




69
5.1. Produo de Lacase em Erlenmeyer - Efeito da
concentrao inicial da fonte de carbono
Para verificar o efeito da fonte de carbono na produo da lacase por T.
versicolor em fermentao descontnua, empregaram-se diferentes concentraes
iniciais de extrato de malte no meio MPL.
A Figura 4.2 mostra o efeito da concentrao inicial de extrato de malte na
produo da lacase. Os resultados mostram que uma produo significativa de
lacase se inicia a partir do quarto dia de cultivo, com atividades variando entre 100 e
500 U/L.
A sua produo foi fortemente dependente da concentrao inicial da fonte de
carbono do meio de cultura. Durante a fase inicial de produo da enzima, que ainda
coincide com a fase de consumo de extrato de malte (para concentraes acima de
2 g/L), a produo de lacase muito baixa no terceiro dia. As maiores atividades de
lacase (entre 600 e 650 U/L) foram obtidas a partir do stimo dia de cultivo, quando
o extrato de malte no estava presente no meio de cultura, ou seja em condies de
limitao por carbono.
As menores atividades de lacase foram detectadas para as maiores
concentraes iniciais (5 e 9 g/L), mostrando que altos nveis de fonte de carbono
reprimem a produo da lacase. Um aumento de quase 2 vezes na atividade da
lacase foi observado quando a concentrao inicial de extrato de malte passou de 9
g/L para 2 e 0,5 g/L.
Os dados de protena total do meio de cultura durante a produo da lacase
em diferentes concentraes iniciais de extrato de malte esto apresentados no
grfico apresentado na figura 4.4. Contrariamente aos resultados obtidos para a
atividade da lacase, maiores quantidades de protena total foram determinadas para
as maiores concentraes de extrato de malte e, alm disso, o perfil da evoluo da
protena total no coincide com o perfil da produo da lacase para uma mesma
concentrao de extrato de malte. Esses resultados indicam que outras protenas
esto a ser sintetizadas durante o cultivo do fungo e no possvel, desta maneira,
fazer uma correlao entre a concentrao de lacase e de protena total no meio de
cultura.

70
5.2. Produo de Lacase em Erlenmeyer - A evoluo do
pH do meio de cultura para as diferentes concentraes
iniciais de fonte de carbono
A evoluo do pH do meio de cultura para as diferentes concentraes de
extrato de malte est apresentado na figura 4.5. O perfil da evoluo do pH mostra
que existem dois comportamentos distintos para as diferentes concentraes de
extrato de malte testadas. Em todos os casos, o pH diminui de aproximadamente 5
at 3, enquanto o fungo consome o extrato de malte e estabiliza assim que termina.
Depois desta estabilizao, inicia-se um novo perodo associado uma subida de
pH, exceto no ensaio com maior concentrao (9 g/L) onde esta somente se esgota
no penltimo dia de fermentao.
Estes resultados indicam claramente uma associao entre a queda do pH do
meio de cultura e o consumo de extrato de malte por T. versicolor, indicando uma
mudana no metabolismo do fungo quando ocorre o consumo total da fonte de
carbono.
De acordo com vrios estudos da literatura, esta queda de pH do meio ocorre
devido sntese de vrios cidos orgnicos como o malnico, o oxlico, o fumrico,
o succnico entre outros. Estes so produzidos atravs do metabolismo primrio dos
basidiomicetos e o posterior aumento do pH indica a mudana para um metabolismo
secundrio alternativo.
A figura 4.6 a seguir apresenta, para cada ensaio, a mxima atividade da
lacase obtida, o respectivo valor de pH e a biomassa final para as diferentes
concentraes de fonte de carbono estudados.
Os resultados mostram que a concentrao final de biomassa, um resultado
direto do crescimento celular e do metabolismo primrio, foi diretamente dependente
da concentrao inicial de fonte de carbono. Verifica-se tambm que a mxima
produo de lacase tambm est claramente associada ao pH do meio.
De fato, existe um sincronismo quando se compara a mxima atividade de
lacase e o respectivo valor de pH, quanto menor o pH, menor a produo de lacase.
Nas experincias com elevadas concentraes de fonte de carbono, onde o fungo
realiza o seu metabolismo primrio, por um maior perodo de tempo, o pH diminui e
provavelmente inibe a produo da lacase.
71
De acordo com a literatura o metabolismo primrio, na ausncia de indutores,
produz pequenas concentraes de lacase e que a produo de enzimas
ligninolticas est associada com o metabolismo secundrio. Portanto, a produo de
lacase em elevadas concentraes parece ser resultado do metabolismo secundrio
do fungo, que no dependente do seu crescimento, mas sim de algum estmulo
externo.




72
Captulo 6

Concluses & Recomendaes


Pelo presente trabalho, pode-se concluir que o fungo Trametes versicolor foi
eficiente para produzir a enzima lacase em concentraes significativas em
erlenmeyer e em biorreator.
A concentrao inicial de extrato de malte foi extremamente importante para a
otimizao da produo da lacase em erlenmeyer. As menores atividades de lacase
foram observadas para as maiores concentraes iniciais de extrato de malte (9 g/L),
mostrando que altos nveis de extrato de malte reprimem a produo da lacase,
enquanto que a limitao por carbono favoreceu a produo enzimtica.
O perfil da evoluo da concentrao de protena total do meio de cultura no
coincide com o perfil da produo da lacase, o que indica que o fungo produz outras
protenas certamente necessrias ao seu desenvolvimento.
A diminuio dos valores do pH durante a produo da lacase est
diretamente relacionada com o consumo de extrato de malte por Trametes versicolor
devido formao de cidos orgnicos pelo fungo.
Os diferentes indutores, tais como o etanol, cobre e o-toluidina testados na
produo da lacase favoreceram a produo da enzima e apresentaram um
aumento na atividade da lacase em condies de limitao por carbono.
A produo da lacase em biorreator apresentou maiores atividades
enzimticas a partir dos dados experimentais obtidos nos ensaios realizados em
erlenmeyer.
Com o controle de pH e limitao de carbono percebeu-se uma significativa
melhora na atividade mxima da lacase.
O valor mximo de atividade de lacase ocorreu quando o pH do meio de
cultura estava controlado e a concentrao inicial de extrato de malte era de 2 g/L;
73

Com o modelamento matemtico da produo da lacase em biorreator foi
possvel determinar os parmetros cinticos da fermentao e estimar o crescimento
da biomassa ao longo do tempo.
Com base nos resultados experimentais, pode-se constatar que a lacase
produzida durante a fase de desacelerao do crescimento da biomassa, ou seja,
durante o metabolismo secundrio do fungo.
A partir dos resultados obtidos neste trabalho, sugere-se a continuidade das
investigaes experimentais, buscando estudar o comportamento da cintica de
produo da lacase por meio do emprego de reatores contnuos agitados
pneumaticamente.
Adicionalmente, recomenda-se o estudo de outros indutores enzimticos para a
produo de lacase, nas mesmas condies estudadas neste trabalho, buscando
otimizar a cintica da reao estudada e assim aumentar a produtividade da mesma.
74
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80
Anexos

Curva de calibrao para o mtodo de DNS de determinao de acares redutores.

Curva de calibrao para o mtodo de Lowry de determinao de protena total.