recombinacin y evolucin 10 UNIDAD omo estudiamos en la Unidad 9 y resumimos en la ilustracin 10.1, los genes codificadores de protenas no son los nicos depsitos de la herencia y, de hecho, representan (cindonos al ser humano) menos del dos por ciento del ADN total de una clula. Existen al menos dos capas adicionales de infor- macin, relacionadas con aquellos genes cuyo produc- to final es solo ARN y con las protenas que rodean y se adhieren al ADN, que alteran el comportamiento de los genes codificadores e intervienen de manera decisiva a menudo a travs de cdigos crpticos y mecanis- mos desconocidos en el desarrollo del organismo, en la herencia y en muchas enfermedades. El genoma, pues, dista de ser un texto esttico que se transmite de generacin en generacin. Antes bien, semeja un sistema operativo que guarda trazas de viejos cdigos ya obsoletos, vestigios de virus y archi- vos temporales no borrados. El ADN se replica para transmitirse a las clulas hijas, duplicando de paso todas las secuencias parsitas y, a menudo, cometien- do errores (mutaciones). Alteraciones y aadidos que no solo representan la fuente de la que se nutre el pro- ceso evolutivo, sino que han dado pie a numerosas aplicaciones prcticas, desde mdicas a poli- cacas. Tras el estudio de la Unidad, el alumno podr alcanzar los siguientes objetivos: 1. Describir el proceso de replicacin del ADN y resolver ejercicios prcticos referentes al mismo, reconociendo las peculiaridades de procariotas y eucariotas. 2. Explicar el concepto de mutacin, clasificar las mutaciones, identificar los agentes mut- genicos y reconocer las mutaciones como fuente de variabilidad gentica. 3. Relacionar los conocimientos sobre el ADN y su funcionamiento con las posibilidades de intervenir sobre esta macromolcula, explicando la necesidad de evaluar los aspectos ti- cos en la investigacin en el campo de la bioingeniera. 4. Analizar ejemplos sencillos de manipulacin gentica en agricultura y en medicina y valo- rar la importancia del estudio del genoma humano y del de otras especies. 5. Opinar razonadamente en debates relacionados con la ingeniera gentica. C Ilustracin 10.1 Actualmente predomina una visin de la actividad gnica de los eucariotas ms elaborada que el sencillo esquema deriva- do directamente del dogma central de la Biologa molecular. 293 1. REPLICACIN DEL ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .294 1.1. Caractersticas de la replicacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .295 1.2. Replicacin del ADN en bacterias y en eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .298 1.3. Mutaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .301 2. REPRODUCCIN DE VIRUS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .306 3. PROCESOS PARASEXUALES EN BACTERIAS. ENDOSPORAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .309 4. INGENIERA GENTICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .311 4.1. Aplicaciones mdicas y farmacolgicas de la ingeniera gentica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .315 4.2. Otras aplicaciones de la ingeniera gentica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .317 5. LA VARIABILIDAD GENTICA Y LA SELECCIN NATURAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .320 5.1. La teora sinttica de la evolucin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .320 5.2. El estudio de los orgenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .321 N D I C E D E C ON T E N I D OS 294 1. Replicacin del ADN La divisin celular o mitosis es el punto culminante en la vida de una clula. Pero su puesta en marcha requie- re la llegada a buen trmino de varios procesos. El ms notorio es la duplicacin fiel de los cromosomas, aunque es necesaria, asimis mo, la duplicacin de las dems macromolculas y orgnulos que, de lo contrario, disminui- ran en cada divisin. Todos estos acontecimientos tienen lugar en la interfase que, junto con la mitosis, confor- man el llamado ciclo celular (vase la ilustracin 10.2). Inicialmente se supuso que la duplicacin de los cromosomas se da al comienzo de la mitosis, pero el adve- nimiento de la tcnica de marcaje por autorradiografa (descrita en la Unidad 1) permiti constatar que en reali- dad tiene lugar durante la interfase, mucho antes de que los cromosomas se puedan visualizar con un microsco- pio ptico. Esta parte de la interfase se denomin fase S (S por sntesis). El intervalo en el ciclo celular entre el final de la mitosis y el principio de la fase S se llam fase G 1 (G del ingls gap, que significa lapso), y el inter- valo entre el final de la fase S y el inicio de la mitosis se denomin fase G 2 . A la mitosis, junto con la citocinesis, se la encuadr en la fase M. La duracin de las fases G 1 , S, G 2 y M es muy desigual. A ttulo de ejemplo, las clu- las humanas que proliferan en cultivos tardan unas 24 horas en completar un ciclo, de las cuales 9 corresponden a la fase G 1 , 10 a la fase S, 4,5 a la G 2 y 0,5 a la M. Las fases G 1 y G 2 son mucho ms que meros perodos de descanso entre las fases S y M. De hecho, la fase G 1 es quiz la ms activa, y en ella tiene lugar la mayor parte de la sntesis de ARN y protenas que estudiamos en la Unidad 9. Su duracin depende de las condiciones externas y de seales procedentes de otras clulas. En realidad, la progresin a travs del ciclo celular est altamente regulada mediante protenas denominadas cina- sas dependientes de ciclina (Cdk), que solo se activan si se asocian con diferentes ciclinas (vase, de nuevo, la ilustracin 10.2); su irreversible degradacin en los proteasomas es lo que impulsa el ciclo en un solo sentido. A su vez, la accin de las Cdk depende de puntos de control que retrasan la entrada en la siguiente fase del ciclo si la fase previa no se ha completado satisfactoriamente (por ejemplo, si los cromosomas no se han dupli- cado por completo) o si el ADN ha sido daado por radiaciones o agentes qumicos, dando tiempo a la actuacin de sistemas reparadores. El mal funcionamiento de estos mecanismos de control puede llevar a la proliferacin de clulas anmalas y a la aparicin de cncer, lo que subraya la trascendental importancia del correcto trans- currir de todas las etapas del ciclo. Ilustracin 10.2 Izquierda: Etapas del ciclo celular de una clula con 2n = 2 (por claridad, no se muestra la descondensacin de los cromosomas en la interfase ni la envoltura nuclear). Derecha: Mecanismos de control del ciclo celular, ilustrados mediante un brazo que gira activando las protenas que ponen en marcha los diferentes procesos y que se detiene si se interponen ciertas barreras o puntos de control. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD 295 1.1. Caractersticas de la replicacin Si las condiciones extra e intracelulares son propicias, si todos los puntos de control han dado el visto bueno, la clula podr ingresar en la fase S y duplicar sus cromoso - mas. Desde su descubrimiento por Flemming en 1882 descrito en la Unidad 8, el mecanismo de este proceso ha sido siempre objeto de vivos debates. El propio Flemming supuso que los cromosomas experimentaban una escisin longitudinal, disolvin dose por completo al trmino de la mitosis para reconstituirse al comienzo de un nuevo ciclo celu- lar. Tras averiguarse que los cromosomas estn formados esencialmente por ADN el foco de inters se desplaz hacia esta molcula, y suscit numerosos interrogantes estruc- turales y bioqumicos acerca de la replicacin del ADN: A. La replicacin es conservativa, semiconservativa o dispersiva? En un principio se propuso que el proceso transcurrira en dos etapas. La molcula generara, en primer lugar, una especie de negativo de la misma, de modo similar a como el lector puede obtener un molde de su mano presionndola sobre una plancha de esca- yola; a continuacin se empleara el negativo para la sntesis de la nueva molcula, por un procedimiento equivalente al de verter cera lquida en el molde de escayola para obtener una imagen positiva de la mano. Sin embargo, el modelo de la doble hlice de Watson y Crick sugera que el hipottico ciclo de replicacin poda abreviarse un paso, porque cada molcula de ADN portaba ya su propio negativo: si se separaban las dos cadenas, cada una de ellas podra servir de molde para que la maquinaria celular sintetizara una copia idntica de la otra ensamblando los nucletidos comple mentarios y produjera dos molculas de ADN donde antes haba solo una. Este modelo de replicacin fue bautizado como se miconservativo, porque cada molcula de ADN hija con- servaba una de las dos cadenas originales (es decir, la mitad de la molcula madre). Pareca el modelo ms lgico, pero los bilogos estaban escarmentados de dar por supuestas ideas de sentido comn que luego resul- taban ser incorrectas. De hecho, podan concebirse dos alternativas verosmiles a ese modo de replicacin (vase la ilustracin 10.3): el meca nismo conservativo, en el que las dos hebras recin sintetizadas formaran una doble hlice enteramente nueva (en tanto que la original permanecera intacta), y el dispersivo, en el que la molcula madre se rompera en fragmentos antes de copiarse, repartindose las piezas originales y las nuevas entre las dos hijas. Interesaba, por tanto, hallar algn modo de decidir cul alternativa era la correcta. Los estadounidenses Matthew Stanley Meselson (n. 1930) y Franklin William Stahl (n. 1929) publicaron en 1958 un elegante experimento que daba por zanjada la cuestin. Estos bilogos moleculares utilizaron la bacte- ria intestinal Escherichia coli, con cuyo ADN resultaba relativamente fcil trabajar. En primer lugar tuvieron que idear un mtodo para poder distinguir el ADN original de las nuevas cadenas elaboradas a partir de los nutrien- tes que consumiesen las bacterias. Sometieron, pues, el cultivo bacteriano a una dieta rica en 15 N, un istopo pesado del nitrgeno que se fijaba en las bases nitrogenadas, de manera que al cabo de catorce generaciones el ADN bacteriano era ms denso de lo habitual. A continuacin transfirieron las bacterias a un medio que tena solo el istopo ligero, 14 N, y cada veinte minu- tos el tiempo necesario para que apareciera una nueva generacin bacteria na extrajeron muestras del culti- vo. La densidad del ADN de la primera generacin (sealado en la ilustracin 10.4 como hbrido) revela ba que contena 14 N y 15 N en la misma proporcin. Es decir, cada bacteria haba heredado la mitad de la molcula de ADN de su progenitora, y la otra mitad la haba sintetizado a partir de componentes del medio, en contra de lo predicho por la hiptesis conservativa. En la siguiente generacin aparecieron molculas de ADN hbrido y de Ilustracin 10.3 Tres posibles modelos de replica- cin del ADN. La molcula original se representa en azul, y la recin sintetizada en rojo. 296 ADN con solo 14 N, lo que permita descartar el modelo dispersivo. La hiptesis semiconservativa era la nica com- patible con los resultados experimentales; conclusin que fue corroborada poco despus, mediante experimen- tos diferentes, en clulas eucariotas. B. La replicacin es unidireccional o bidireccional? La confirmacin del modelo de replicacin no acab con las incgnitas, porque eran posibles varios mecanis- mos moleculares que daran como resultado la replicacin semiconservativa del ADN. Por ejemplo, las dos hebras nuevas podan originarse en diferentes puntos del ADN inicial, creciendo cada una en una direccin. Otra posibilidad es que ambas cadenas tuviesen el mismo origen y creciesen a partir de l en un solo sentido; en el frente de avance habra una horquilla de replicacin, una estructura en forma de Y originada en el lugar donde se abre la doble hlice parental. Por ltimo, se podran copiar ambas hebras en dos horquillas de replicacin, que avanzaran en sentidos opuestos a partir de un nico origen (vase la ilustracin 10.5). Ilustracin 10.4 Experimento de Meselson y Stahl. Para comparar la densidad del ADN de distintas generaciones de bacterias lo dejaban flotar en una solucin de cloruro de cesio ms denso que la sal comn a la que ultracentrifugaban, creando un gradiente de densidad: las molculas ms densas se situaban al fondo del tubo. Bajo la luz ultravioleta el ADN apareca como una banda oscura, que pudieron fotogra- fiar con una cmara especial mientras el tubo giraba an en la ultracentrfuga. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD 1. Cmo se habran distribuido las bandas de ADN en los tubos de centrfuga de la ilustracin 10.4 si la replicacin fuese, en realidad, conservativa? 2. Al repetir el experimento de Meselson y Stahl con bacterias tradas del imaginario planeta Tatooine, el ADN de la primera generacin apareca como una sola banda hbrida; en las siguientes generaciones apareca tambin una sola banda, pero de densidad cada vez menor. A qu conclusiones permite llegar esta experiencia? A c t i v i d a d e s 297 Aunque se conocen ejemplos de plsmidos bacterianos o virus cuyo ADN se repli- ca segn los dos primeros mecanismos, la evidencia disponible sugiere que la terce- ra alternativa (es decir, la replicacin bidireccional) es la utilizada por la inmensa mayora de las clulas procariotas y eucariotas. Se ha observado tambin que los orgenes de la replicacin no son puntos aleatorios de la molcula de ADN; por el contrario, han de poseer ciertos rasgos por ejemplo, secuencias cortas repetidas reconocibles por protenas especficas que, a su vez, reclutan las enzimas responsa- bles del proceso. C. En qu sentido progresa la sntesis de ADN? La ilustracin 10.5 parece insinuar que, a medida que la horquilla de replicacin se desplaza de uno a otro extremo de la molcula de ADN, las dos hebras hijas cre - cen de forma continua, usando la energa de la hidrlisis del grupo pirofosforilo termi- nal para aadir el nucletido siguiente a cada cadena. Como indica la ilustracin 10.6, ello requerira que una de las cadenas creciese en sentido 5 3 y la otra en senti- do 3 5, dado que las dos hlices de ADN tienen orientacin antiparalela. Sin embargo, nunca se ha descubierto una enzima que catalice la polimerizacin de nucletidos en sentido 3 5. Ahora bien, si la replicacin transcurre siempre en sentido 5 3, cmo pueden producirse las dos cadenas a la vez? El problema fue resuelto por el bilogo molecu- lar japons Reiji Okazaki (1930-1975) en 1968. Okazaki descubri que una cadena puede crecer de forma continua en sentido 5 3, persiguiendo a la horquilla de replicacin en su movimien- to. Dicha hebra se llam cadena adelantada. La otra, la conocida como cadena retrasada, debe sintetizarse en sentido contrario al de avance de la horquilla de replicacin, por lo que inevitablemente tiene que hacerlo en forma de cortas piezas (de unos miles de nucletidos de longitud en bacterias, y de pocos centenares en eucariotas) llamadas fragmentos de Okazaki: el desplazamiento de la hor quilla de replicacin pone al descubierto el sitio en donde se inicia la sntesis de cada uno de tales fragmentos, que crecen hasta toparse con el formado inmediata- mente antes (vase la ilustracin 10.7). Posterio-rmente, estos fragmentos se unen entre s. Ilustracin 10.5 Mecanismos de replicacin del ADN compa- tibles con el modelo semiconservativo. Para mayor claridad, las dos cadenas de la doble hlice no aparecen enrolladas entre s. Ilustracin 10.7 Sntesis de la cadena retrasada mediante la formacin de fragmentos de Okazaki. Ilustracin 10.6 La sntesis de ADN podra transcurrir, en principio, por incorporacin de nucletidos al extremo 3 o al 5 de una cadena en crecimiento; en realidad, solo se ha observado la primera alternativa. 298 1.2. Replicacin del ADN en bacterias y en eucariotas La bsqueda de enzimas capaces de sintetizar ADN se inici en 1955. Un discpulo de Ochoa, el bioqumico estadounidense Arthur Kornberg (n. 1918), aisl y caracteriz en Escherichia coli una enzima hoy conocida como polimerasa I del ADN (abreviada mente, ADN pol I). Se trata de una polimerasa de ADN dirigida por ADN, o sea, agrega desoxirribonucletidos utilizando como molde ADN. Sin embargo, poco despus de su descubrimiento se comprob que no es la enzima adecuada para la replicacin del cromosoma bacteriano. Se han descubierto en Escherichia coli otras cuatro polimerasas del ADN, de las cuales la ms importante es la ADN pol III as como por lo menos veinte protenas diferentes ms, cada una con una tarea especfica. El conjunto se denomina repli- soma o replicasa del ADN. El replisoma de las bacterias La polimerasa del ADN quiz recuerde a la polimerasa del ARN que intervena en la transcripcin: ambas poli- merizan en sentido 5 3 y requieren un molde de ADN; la formacin de enlaces fosfodister est favorecida en los dos casos por la hidrlisis posterior del pirofosfato, debida a la enzima pirofosfatasa. No obstante, existen tambin notables diferencias entre ambas: La polimerasa del ADN engarza desoxirribonucletidos, no ribonucletidos. La polimerasa del ADN lee las dos hebras de la doble hlice, no una sola. La polimerasa del ADN presenta actividad exonucleasa en sentido 3 5, es decir, elimina el ltimo nucle- tido incorporado si no es complementario. Esta ca pacidad para corregir errores falta en la polimerasa del ARN, razn por la cual la tasa de error en la transcripcin es mayor que en la replicacin. La polimerasa del ADN es incapaz de desenrollar el ADN y separar las dos cadenas que deben copiarse. La polimerasa del ARN, en cambio, s lo hace. Ni la ADNpol III ni ninguna otra polimerasa del ADN es capaz de iniciar la sntesis; tan solo puede alar- gar una cadena (un polinucletido) ya existente. La complejidad enzimtica del replisoma (vase la ilustracin 10.8) refleja precisamente la necesidad de solu- cionar los problemas de desenrollamiento, iniciacin y sntesis discontinua en la hebra retrasada. El proceso incluye varios acontecimientos: 1) Unas protenas iniciadoras se unen a la regin de origen del cromosoma, identifi cada como oriC, y separan las hebras de ADN gracias a la energa de hidrlisis de ATP. El complejo protena-ADN se une a dos anillos llamados helicasas, que des enrollan el ADN en ambos sentidos y crean dos horquillas de replicacin. 2) Numerosas protenas SSB (del ingls single-stranded DNA binding, unin a ADN de una sola cadena) se asocian a las cadenas de ADN separadas por la helicasa e impiden que se vuelvan a unir, permitiendo as la actuacin de la polimerasa. 3) La separacin de las hebras en la horquilla de replicacin crea tensiones tras sta, que pueden originar super- enrollamientos; la girasa del ADN, enzima perteneciente a las llamadas topoisomerasas del tipo II, es la encargada de relajarlas. 4) Para que la polimerasa del ADN pueda actuar es necesario un cebador, esto es, una corta cadena a cuyo extremo 3 pueda aadir nucletidos. El cebador (primer, en ingls) es un oligonucletido de ARN, no de ADN, y se sintetiza por una enzima llamada primasa, que se asocia a la helicasa formando un primosoma. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD 299 5) En cada horquilla, la ADN pol III cataliza la sntesis continua de la cadena adelantada y, simultneamente, de un fragmento de Okazaki a partir de un cebador. Para evitar que la ADN pol III se disocie del ADN, incluye subunidades en forma de rosquilla llamadas abrazaderas deslizantes. La abrazadera que se desliza por la cadena adelantada permanece asociada a la ADN pol III durante un largo tiempo. Pero la abrazadera de la hebra retrasada se libera al alcanzar el extremo 5 del fragmento de Okazaki precedente, y otra abrazadera se ensambla al comienzo del siguiente cebador gracias a un complejo de carga y a la energa del ATP. 6) Una vez formado cada fragmento de Okazaki, la ADN pol I elimina los ribonucletidos del cebador gracias a que posee actividad exonucleasa 5 3 (adems de la tpica actividad exonucleasa 3 5) y los reemplaza por los correspondientes desoxirribonucletidos gracias a su actividad polimerizadora. 7) Tras la eliminacin del cebador y el relleno del hueco con ADN, an queda una mella entre el extremo 3 de cada nuevo fragmento de ADN y el extremo 5 del anterior. La ligasa del ADN forma un enlace fosfodister que sella dicho hueco. Ilustracin 10.8 Principales tipos de protenas que actan en la horquilla de replicacin de las bacterias (falta aadir la piro- fosfatasa, citada en la ilustracin 10.5). Obsrvese que el ADN se pliega sobre la cadena retrasada para permitir que una sola molcula de ADN pol III, con dos subunidades catalticas, sintetice a la vez las hebras adelantada y retrasada. 300 8) Cuando las dos horquillas de replicacin generadas en oriC se acercan al extremo opuesto del cromosoma circular de Escherichia coli tropiezan con la secuencia Ter (de terminador) que detiene su avance. Finalmente quedan dos cromosomas circulares encadenados, que son separados por una topoisomerasa del tipo II. La replicacin del cromosoma bacteriano est asocia da a la membrana plasmtica: la secuencia oriC es secuestrada por un complejo formado por dos replisomas (vase la ilustracin 10.9) anclados a la membrana en el centro de la clula; tras duplicarse, los dos puntos oriC se desplazan a extremos opuestos y arrastran as cada cromosoma a su correspondiente clula hija. Replicacin en eucariotas La replicacin del ADN en eucariotas es similar a la que se da en bacterias, aunque hay algunas diferencias. Para empezar, mientras que las bacterias pueden repli- car su ADN continuamente, comenzando un nuevo ciclo de replicacin incluso antes de finalizar el anterior, en los eucariotas el ADN solo se replica durante la fase S del ciclo celular. Adems, el cromosoma eucariota tiene varios orgenes de replicacin (no uno solo, como las bacterias): desde cada uno de ellos se desplazan dos horquillas, formando una burbuja de replicacin. Las polimerasas del ADN al menos quince son tambin distintas a las procariotas; alguna de ellas, como la pol , tienen actividad primasa adems de polimerizadora. Ms llamativo es un problema que afecta al cromoso - ma eucaritico por el hecho de ser lineal: la hebra retra - sada tiende a acortarse en cada generacin celular (vase la ilustracin 10.11). La contrariedad se mitiga Ilustracin10.9 En la replicacin del cromosoma bacteriano no es el replisoma el que avanza a lo largo de cada horquilla, sino que ambos replisomas permanecen juntos y anclados a la membrana y es el ADN el que avanza a su travs. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD Ilustracin 10.10 Replicacin de una molcula de ADN eucariota a partir de varios orgenes. 301 gracias a los telmeros, ubicados en los extremos de los cromo somas y formados por la repeticin hasta miles de veces de cortas secuencias de nucletidos. Cada vez que una clula somtica se divide pier de entre 50 y 100 nucletidos de los telmeros; tras muchas generaciones celulares se habrn agotado las secuencias telomri- cas y el cromosoma perder informacin gentica importante, lo que podra estar relacionado con el envejeci- miento celular. Las clulas de la lnea germinal, en cambio, poseen una enzima llamada telomerasa capaz de reparar los extremos de los cromosomas. Lo destacable de esta enzima es que sintetiza ADN utilizando ARN como molde (al revs que la transcripcin), razn por la cual se dice que es una transcriptasa inversa o retrotranscriptasa. 1.3. Mutaciones Pese a su elevada fidelidad en el proceso de copia, las polimerasas del ADN cometen errores ocasionalmente. Por trmino medio, uno de cada 10 000 nucletidos incorporados por la ADNpol III es incorrecto (por ejemplo, se aparea una dG con una dT). A estos errores espontneos hay que aadir las lesiones del ADN introducidas por: Ilustracin 10.11 Izquierda: Acortamiento del extremo de un cromosoma. Derecha: Replicacin del telmero del protozoo Tetrahymena (con la secuencia repetida GGGTTG) mediante la telomerasa. 3. Una de las hebras de un ADN tiene la composicin: A = 25 %, G = 24 %, C = 18 % y T = 33 %. Qu composi- cin tendr el ADN total obtenido mediante su replicacin? 4. Al centrifugar el ADN de una bacteria mutante cuya ligasa es defectuosa se obtienen dos bandas, una de alta y otra de baja masa molecular. Explica este resultado. 5. La horquilla de replicacin avanza a un ritmo de unos 1 000 nucletidos por segundo en bacterias, pero de solo 50 por segundo en eucariotas. A qu se deber? 6. El ADN de Escherichia coli tiene unos 4 millones de pares de bases. Cunto tarda en replicarse? Cmo, enton- ces, pueden dividirse las clulas cada 20 minutos? 7. Un cromosoma humano medio tiene unos 150 millones de pares de bases. Cunto tardara en duplicarse con un nico origen de replicacin? Saca conclusiones. A c t i v i d a d e s 302 Agentes ambientales, entre los que cabe destacar: Calor, que hidroliza los enlaces N-glucosdicos entre las bases pricas y la deso xirribosa (cada clu- la humana pierde alrededor de 5 000 bases pricas diarias). Radiaciones ionizantes, como rayos X, gamma o partculas subatmicas de alta energa emitidas en desintegraciones radiactivas. Portan la suficiente energa como para arrancar electrones de tomos que, a su vez, ionizan otros tomos cerca nos. Como resultado, pueden llegar a romper las hebras del ADN. Radiacin ultravioleta (UV), la nica radiacin no ionizan- te capaz de inducir alteraciones en el ADN porque es absorbida por los anillos de las bases pirimidnicas (timina y citosina). Si al lado de una base pirimidnica que ha absorbido ra diacin UV se halla otra base pirimidnica, entre ambas se forma un doble enlace: un dmero de piri- midina (vase la ilustracin 10.12). Carcingenos qumicos (esto es, sustancias que inducen cncer debido al dao que causan al ADN de determina- dos genes oncogenes que regulan la proliferacin celular) y otras sustancias txicas. Algunos son anlogos a las bases del ADN y se incorporan durante la replica- cin, pero se aparean indebidamente (vase la ilustracin 10.13), mientras que otros modifican qumicamente las bases ya incorporadas (por ejemplo, metilndolas). Subproductos del metabolismo, como las formas reactivas del oxgeno (perxido de hidrgeno, radica- les hidroxilo y superxido) que inevitablemente escapan a la de sactivacin por los peroxisomas. Provocan desde la oxidacin de la desoxirribosa y de las bases nitrogenadas hasta la rotura de las cadenas de ADN. Ilustracin 10.13 La bromodesoxiuridina es anloga a la timidina, pero se aparea con la desoxiguanosina e induce mutaciones. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD Ilustracin 10.12 Formacin de dmeros de pirimidina por accin de la radiacin ultravioleta. 303 Si no se corrigieran, estos cambios podran bloquear la replicacin del ADN y matar a la clula. Afortuna-damente, la clula cuenta con sistemas de reparacin que rastrean continuamente el ADN y reemplazan cualquier nucletido alterado. Buena parte de los errores son corregidos por la actividad exonucleasa 3 5 de la propia polimerasa del ADN. Otros mecanismos dependen de sistemas enzim- ticos que eliminan bases alteradas o secciones de la cadena daadas; en ambos casos, el hueco dejado se rellena usando la hebra no alterada como patrn (vase la ilustracin 10.14). Muchos de estos sistemas de reparacin no cometen errores, pero en otros casos el propio mecanismo reparador genera cam bios en la secuencia del ADN que se propagan a las generaciones celulares siguientes (la sustitucin de un par AT por un par GC que se explica en la ilustracin 10.13 es un ejemplo). Estos cambios heredables en el material gentico, originados bien porque no se repara una lesin, bien porque se repara introduciendo errores, se denominan mutacio- nes. Debido a la eficacia de los sistemas de reparacin la tasa de mutaciones espontneas es baja (en Escherichia coli solo se acumula un error en la replica- cin cada 10 9 pares de bases), pero los agentes fsicos y qumicos ms arriba cita- dos (denominados mutgenos) pueden incrementarla, hablndose entonces de mutaciones inducidas. En los animales se transmiten a la descendencia solo las mutaciones que afectan a las clulas de la lnea germinal (mutaciones germina- les), pero no las mutaciones somticas. Estructuralmente, las mutaciones pueden clasificarse en: 1) Mutaciones puntuales o gnicas, que se producen al cam biar la secuencia de nucletidos de un gen. Pueden deberse a sustituciones de unas bases por otras o a la eliminacin o adicin de algunos nu cletidos. Si afectan a genes que codifican protenas pueden ser: Mutaciones silenciosas, que no alteran la secuencia de aminocidos, bien por que se producen en intro- nes, bien porque dan lugar a codones sinnimos. Mutaciones con sentido errneo, en las que el cambio de una base origina un cambio en un aminoci- do y, en consecuencia, una protena alterada. Por ejemplo, la sustitucin de una dT por una dA en el 17 nucletido del gen HBB humano provoca que un codn GAG del ARNm cambie a GUG y el sexto amino- cido de la cadena de la hemoglobina sea valina en lugar de glutamato; esto origina una protena an- mala (la hemoglobina S) responsable de la anemia falciforme. Mutaciones sin sentido, si un codn se convierte en codn de terminacin y la traduccin acaba antes de lo previsto, produciendo una protena acortada. Mutaciones por corrimiento del marco de lectura (vase la ilustracin 9.25), como en el gen ABO humano: la supresin de un nucletido origina una protena con los aminocidos cambiados y, por tanto, no funcional (tipo sanguneo O). 2) Mutaciones cromosmicas, que suponen variaciones en la secuencia de genes de uno o varios cromoso- mas. Son ejemplos las deleciones, las inversiones, las duplicaciones y las translocaciones, explicadas en la ilustracin 10.15. Muchas enfermedades humanas, incluyendo algunos tipos de cncer, tienen su origen en anomalas cromosmicas de esta clase. A menudo alteran el correcto apareamiento de los cromosomas durante la meiosis, disminuyendo mucho la fertilidad. Ilustracin10.14 Reparacin de lesiones en el ADN (dmeros de pirimidina, por ejemplo) por eliminacin de varios nucletidos. 304 3) Mutaciones genmicas, si afectan al nmero de cromosomas. Segn el nivel de ploida celular (el nmero de juegos de n cromosomas homlogos) tendremos: A) Euploida, cuando el nivel de ploida es un nmero entero. Normalmente dicho nmero es 2 para las clu- las somticas (diploida), pero puede variar: En la poliploida el nivel de ploida es mayor de 2. Son ejemplos la triploida, en la que la clula posee 3n cromosomas, o la tetraploida (4n). En los seres humanos son generalmente incompatibles con la vida extrauterina, pero en plantas son muy corrientes; el trigo, por ejemplo, es hexaploide (6n). En la haploida o monoploida solo hay un juego de cromosomas (n). B) Aneuploida, si el nivel de ploida no es un nmero entero. Dicho en otros trminos, cambia el nmero de uno o unos pocos tipos de cromosomas: Se habla de nulisoma cuando falta una pareja de cromosomas homlogos. La monosoma es la presencia de un nico cromosoma de una pareja. En la especie humana es cono- cido el sndrome de Turner, correspondiente a mujeres que solo tienen un cromosoma X (se simboli- za por 45,X o por 45,X0, donde el nmero a la izquierda de la coma indica el total de cromosomas). La trisoma implica la posesin de un cromosoma extra. La ms conocida en humanos es la trisoma en el cromosoma 21 (simbolizada por 47,+21), causante del sndrome de Down. Son tambin importantes el sndrome de Klinefelter, correspondiente a varones con dos cromosomas X y uno Y (47,XXY), y el sn- drome duplo Y (varones con la constitucin cromosmica 47,XYY). Ilustracin 10.15 Algunas mutaciones cromosmicas. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD 8. Tiene sentido la distincin entre mutaciones somticas y germinales en las plan tas o en los microorganismos eucariotas (como los protozoos)? Disctelo. 9. Un tipo corriente de mutacin espontnea es la prdida del grupo amino (desaminacin) de la citosina y su sus- titucin por un grupo cetona, lo que ocurre unas cien veces al da en cada clula. En qu base se transforma la citosina? 10. Qu consecuencias tendra el que el ADN contuviese uracilo en lugar de timina? 11. Una clula del esporofito de una planta tiene 12 cromosomas. Cuntos tendr un individuo monosmico, un tri- smico, un nulismico, un triploide y un tetraploide? A c t i v i d a d e s 305 Los mecanismos de reparacin ms arriba descritos dependen de la existencia de una hebra intacta que sirva como molde para restablecer el estado original de la hebra daada. Pero qu ocurre cuando la lesin afecta a ambas hebras? En tal caso la c lula podra obtener la informa- cin requerida para una reparacin precisa de un cromosoma homlogo distinto. Este mecanismo de reparacin se conoce como recombinacin homloga o general, y es el mismo que causa el intercambio de frag- mentos de cromosomas homlogos durante la meiosis. El proceso se esquematiza en la ilustracin 10.16. Los adjetivos homloga y general evocan la posibilidad de recombi- naciones no ho mlogas o especficas, que desplazan secuencias con- cretas de nucletidos llamadas elementos genticos mviles entre lugares no homlogos del genoma. La idea de su existencia se remonta a los trabajos de la citloga estadounidense Barbara McClintock (1902- 1992) sobre la coloracin de las hojas de maz en 1948. Su tamao osci- la entre unos pocos centenares y decenas de miles de nucletidos, y se han encontrado prcti camente en todas las clulas. Los ms estudiados son los transposones, que cifran una enzima llamada transposasa capaz de cortar los dos extremos del transposn e insertarlo en un nuevo lugar del ADN. En el proceso pueden desplazar o reordenar secuencias vecinas del ADN, causando mutaciones. Una fraccin significativa del ADN humano consta de secuencias repetitivas relacionadas con trans- posones que han saltado una y otra vez, dejando una copia en el lugar de partida: forman parte del denominado ADN chatarra, que no tiene una funcin aparente. En el otro extremo, la trans posicin permite que un mamfero pueda producir millones de genes de inmunoglobulinas mediante la recombinacin de unos centenares de segmentos gnicos disemi nados por el genoma durante la maduracin de los linfocitos B (vase la Unidad 4). Algunos elementos genticos han llevado an ms lejos su movilidad. No solo pueden saltar de un cromosoma a otro, sino incluso pasar de clu- la en clula a travs del medio extracelular, para lo cual empaquetan su cido nucleico en el interior de estructuras protenicas sintetizadas por la clula a la que abandonan. Se trata de los virus. Ilustracin 10.16 Reparacin de una lesin en la doble hlice por recombina- cin homloga. En la meiosis no existe el corte inicial, que es generado por una endonucleasa. R e c u e r d a La replicacin del ADN es semiconservativa y se inicia en regiones especiales llamadas orgenes. La mayora de los cromosomas tienen orgenes bidireccionales. La polimerasa del ADN sintetiza en sentido 5 3, por lo que aunque en una de las hebras (la adelantada) la sntesis sea continua, en la otra (la retrasada) es discontinua, formndose fragmentos de Okazaki que se unen posteriormente. La fidelidad de la replicacin depende de la actividad correctora de la polimerasa y de sistemas de reparacin de errores, que tambin eliminan las lesiones introducidas por mutgenos. Una alteracin no reparada o mal reparada puede dar lugar a una mutacin, que puede afectar a la estructura de un gen (mutacin puntual), a la de un cromosoma (cromosmica) o al nmero de cromosomas (genmica). 306 2. Reproduccin de virus Como mencionamos en la Unidad 5, los virus son estructuras acelulares que inducen en las clulas husped la sntesis de nuevos virus idnticos a los origina- les. La reproduccin vrica vara en funcin del tipo de virus y, consecuentemente, de la clula husped, aunque presentan una serie de etapas comunes: 1) Fase de fijacin o adsorcin. Algunos componentes de la cpsida o de la cubierta lipoprotenica de los virus se fijan a determinadas glucoprotenas o lipo- protenas de la membrana de la clula hospedadora. En los virus vegetales no se han encontrado receptores de este tipo. 2) Fase de penetracin. Tras el primer contacto el virus pe netra en la clula, lo que puede ocurrir de varias formas: Los bacterifagos, con la ayuda de una lisozima, realizan un pequeo orificio en la pared bacteriana y a travs de l inyectan su ADN mediante la contraccin de su cola. La cpsida queda vaca en el exterior de la bacteria. Los virus desprovistos de envoltura membranosa penetran enteros, directamente (perforando la membra- na por accin de hidrolasas) o por endocitosis. Los virus con envoltura pueden pasar directamente al interior despus de que su membrana y la de la clu- la hospedadora se hayan fusionado. En otras ocasiones es todo el virus, incluida su membrana, el que se introduce en la clula; en este caso se forma una vescula endoctica que se fusiona con un lisosoma, momento en el que el virus aprovecha para escapar al citoplasma. 3) Fase de eclipse. Tras la penetracin, o al tiempo que esta, tiene lugar la denudacin, que es la eliminacin total o parcial de las cubiertas protenicas del virus, de modo que el cido nucleico desnudo, o asociado a alguna enzima implicada en su expresin, quede expuesto (como vimos en la Unidad 4, en esta fase pueden actuar algunos componentes del sistema inmunitario de la clula husped, que reconocen como extrao al virus y lo degradan). Si la clula no ha logrado bloquear el virus, se produce la asimilacin del cido nucleico vrico por el material gentico de la clula husped, replicndose y trascribindose ambos simultneamente. Esta fase es de duracin variable y termina con la sntesis de los ARNm necesarios para la sntesis de las protenas que participan en la multiplicacin del virus. 4) Fase de multiplicacin. En esta fase se sintetizan las protenas de la cpsida y las que participan en el ensamblaje de los distintos componentes del virus (los ribosomas y el resto de la maquinaria, as como la materia prima necesaria, proceden de la clula husped). Los cidos nucleicos y las protenas recin sinteti- zadas se acoplan para producir nuevos viriones. 5) Fase de liberacin. Es la etapa final de la infeccin. Las nuevas partculas vricas, a la vez que se sintetizan, se liberan de la clula husped y pueden infectar otras clulas iniciando un nuevo ciclo. La liberacin vara en funcin del tipo de virus: Los virus sin envoltura salen directamente por exocitosis (vase la Unidad 3) o bien perforando la mem- brana con enzimas lticas. Los virus con envoltura se rodean de una porcin de membrana plasmtica de la clula husped, que va a constituir la cubierta lipoprotenica del nuevo virus, y se separa de la clula por gemacin. El ciclo reproductivo de los virus tiene una duracin muy variable (5 o 6 horas en el virus de la gripe, varios das el virus del sarampin), lo que nos permite distinguir dos modalidades de ciclo infeccioso: REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD Ilustracin 10.17 Fijacin de un fago T4 a una bacteria. Imagen obtenida con el MET. 307 A) Ciclo ltico. En este caso la fase de eclipse es muy breve y el cido nucleico del virus se transcribe inmedia- tamente para formar, en primer lugar, las protenas tempranas responsables de la replicacin, posteriormen- te las protenas tardas encargadas de la sntesis de los componentes de la cpsida y, finalmente, las enzi- mas lticas involucradas en la liberacin de los viriones. El ciclo finaliza con la lisis de la clula y los virus res- ponsables se llaman virulentos (un ejemplo es el virus de la Influenza). B) Ciclo lisognico. Descrito por primera vez en bacterifagos por el bilogo y mdico francs Andr Lwoff (1902-1994). En este caso, el ADN vrico no se multiplica inmediatamente y est en estado latente por un periodo de tiempo ms o menos largo. En este caso, el ADN vrico presenta en los extremos terminales de su genoma unas secuencias llamadas repeticiones terminales largas (LTR, por las siglas del ingls long ter- minal repeats) que contienen regiones que promueven y potencian la integracin del genoma vrico en un lugar especfico del ADN bacteriano. A este virus insertado se le denomina provirus o virus atenuado. En otros casos, el cido nucleico vrico permanece en el citoplasma en forma de plsmido. La clula prosigue sus funciones vitales sin que el virus se manifieste; cuando el ADN bacteriano se duplica lo hace tam bin el ADN vrico, de modo que el genoma del virus pasa a las clulas hijas. Esta situacin se puede prolongar durante muchas generaciones celulares hasta que una alteracin de las condiciones ambientales pro- voca la activacin del ADN vrico y se completan las restantes fases de ciclo infeccioso. Un ejemplo de ciclo liso- gnico lo hallamos en algunos tipos de virus del herpes que producen lesiones cutneas siempre en el mismo lugar; estos virus persisten en forma lisognica hasta que una irradiacin solar muy intensa o un acceso de fie- bre los activa y entran en ciclo ltico, dando lugar a las llamadas calenturas. Tambin los bacterifagos y algu- nos virus animales llevan a cabo este ciclo. Replicacin y traduccin vrica Los virus con ADN duplican su cido nucleico por medio de mecanismos y herramientas similares a los emplea- dos por las clulas para replicar su material gentico. La replicacin del ADN viral es generalmente semiconservativa. Ilustracin 10.19 Ciclo ltico y lisognico de Lwoff. Ilustracin 10.18 Ciclo reproductivo del fago T4 en Escherichia coli: 1) fago libre, 2) adsorcin, 3) el genoma viral penetra en la bacteria husped, 4) el genoma bacteriano es destruido y el viral se replica y se transcribe, 5) traduccin del ARNm viral y formacin de las pro- tenas vricas, 6) ensamblaje de los virus y 7) lisis bacteriana y liberacin de los virus. 308 Los virus con ARN duplican el material gentico sin necesidad de pasar por ADN, actuando cada cadena de ARN como molde para la sntesis de su complementaria. La excepcin la constituyen los retrovirus: su ARN sinte- tiza un ADN bicatenario, que ser vir posteriormente de molde para la sntesis de nuevos ejemplares de ARN vrico. La traduccin de los ARNm vricos se lleva a cabo utilizando toda la maquinaria de la clula husped. El nico requerimiento, en los virus de clulas eucariticas, es que los ARNm vricos han de ser monocistrnicos, dando como resultado una nica protena porque, como ya vimos en la Unidad 9, los ribosomas eucariticos son inca- paces de iniciar la traduccin en el interior de un transcrito policistrnico (no pueden terminar la lectura de un ARNm en una seal de terminacin y reiniciar la traduccin en una seal de iniciacin contigua para comenzar con la sntesis de otro polipptido). REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD Ciclo de un retrovirus (el VIH) El VIH fue descubierto y relacionado con el SIDA por el mdico francs Luc Montagnier (n. 1932) en 1983. El virin del VIH presenta una estructura dife- rente a la de otros retrovirus (vase la ilustracin 5.12). Tiene forma esfrica y posee dos copias de ARN monocatenario positivo (es decir, su secuencia es como la del ARN mensajero correspondiente) rodeadas por una nucleocpsi- da en forma cnica, envuelta, a su vez, por una bicapa lipdica que aunque pro- ceda de una clula husped tiene protenas vricas. Dentro de la nucleocpsi- da se encuentran algunas enzimas como la transcriptasa inversa, una inte- grasa y una proteasa. Las clulas que el VIH invade son esencialmente los linfocitos TCD4 + (vase la Unidad 4) especialmente los de los ganglios linfticos. Las etapas de la repli- cacin del VIH son: La fijacin. Se produce el reconocimiento mutuo y acoplamiento de la protena gp120 de la envoltura del virin con el receptor CD4 de los lin- focitos (tambin de los macrfagos). La penetracin. Tras el reconocimiento, la envoltura lipdica del virin se fusiona con la membrana celular y el resto de los componentes vira- les pasan al citoplasma. Tiene lugar la denudacin y el ARN vrico y transcriptasa inversa quedan libres en el citoplasma. La transcripcin inversa. La transcriptasa inversa sintetiza una cadena de ADN complementario al ARN vri- co. Posteriormente, las dos molculas sintetizadas se asocian para formar una cadena de ADN bicatenario que pasa al ncleo y se inserta, con ayuda de la integrasa, en el ADN de la clula husped. El ADN vrico se transcribe por los mecanismos normales de la clula y forma un ARNm complejo, constituido por una sucesin de intrones y exones, que debe ser procesado. Este ARNm sale del ncleo por los poros nucleares. Una vez en el citoplasma el ARNm vrico es traducido utilizando toda la maquinaria de la clula infectada y se sintetizan protenas vricas no funcionales que han de ser procesadas por las proteasas especficas del VIH. Las protenas vricas ya funcionales se ensamblan, junto con los ARN provirales previamente sintetizados, y forman la cpsida y sus componentes internos. El ltimo paso es la gemacin, cuando los nucleoides vricos se aproximan a la membrana plasmtica, se forma una vescula que termina por desprenderse (exocitosis) formando un nuevo virin o partcula infectante. Ilustracin 10.20 Ciclo reproductor del VIH. 309 3. Procesos parasexuales en bacterias. Endosporas Como revela la ilustracin 10.9, las bacterias se multiplican asexualmente por biparticin, de forma que cada clula bacteriana da lugar a dos clulas hijas idnticas. Este tipo de divisin tiene el inconveniente de que todos los descendientes son genticamente idnticos, salvo la variabilidad introducida por mutaciones. No obstante, las bacterias han desarrollado unos procesos parasexuales que, mediante mecanismos de recombinacin, les ase- guran cierto grado de variabilidad gentica. Bsicamente, estos procesos implican el transporte de un frag- mento de ADN procedente de una bacteria donadora a otra recepto- ra (de la misma especie o de una especie distinta). Una vez dentro de la bacteria receptora, el fragmento lineal de cromosoma recibido se empareja con la parte homloga del ADN de la clula receptora y lo sustituye. De esta forma, la bacteria resultante contiene informacin gentica de dos individuos distintos, aunque con contribuciones des- iguales. En funcin del mecanismo de transporte del ADN, los proce- sos parasexuales se clasifican en: 1) Transformacin. En este proceso descubierto por Griffith (vase la ilustracin 9.7) no hay agente transportador: el ADN proceden- te de una bacteria muerta es captada por otra bacteria, denomi- nada competente, que sintetiza una protena especfica llamada factor de competencia. Una vez dentro de la clula, si el ADN exgeno presenta segmentos homlogos con el ADN de la clula receptora, se puede producir la recombinacin. La transformacin solo se da, y con peculiaridades especficas, en algunas cepas de gneros como Streptococcus, Haemophilus y Bacillus. 2) Transduccin. Es el proceso ms frecuente. Implica la transferencia de ADN de una bacteria a otra por medio de un agente transportador o vector, que puede ser un fago atenuado o, en ocasiones, un plsmido. El pri- mer caso tiene lugar cuando el ADN de un profago se separa del cromosoma bacteriano, arrastrando de forma accidental unos pocos genes bacterianos. Estos fragmentos de ADN bacteriano podrn pasar a una nueva bacteria infectada y, si este ADN exgeno es complementario con el de la bacteria, habr emparejamiento y recombinacin entre ambas cadenas de ADN. 3) Conjugacin. La conjugacin permite el paso de grandes porciones de genoma de una bacteria a otra. La capacidad de una bacteria para funcionar como donadora o receptora est determinada genticamente: en una poblacin de bacterias las hay dadoras, las F + o fertilidad + , y otras aceptoras, las F
o fertilidad
. Las primeras poseen un fragmento de ADN
con el factor F que puede localizarse en un plsmido (bacterias F + ) o bien estar integrado en el cromosoma bacteriano (bacterias Hfr, de sus siglas en ingls high frequency of recombination, alta frecuencia de recombinacin). Una clula F + puede convertirse en Hfr y viceversa, sim- plemente incorporando o liberando el factor F al cromosoma bacteriano. La conjugacin se realiza mediante los pili presentes nicamente en las bacterias donadoras (en el factor F se encuentran, entre otros, los genes Ilustracin 10.21 Esquema de los procesos parasexuales de bacterias. Ilustracin 10.22 Conjugacin bacteriana mediante pili. Imagen obtenida por microscopa electrnica. 310 para su formacin). Se forma un tubo de conjugacin, a travs del cual se va a transferir parte de genoma de la bacteria donadora a la receptora. En el caso de las bacterias F + , de forma simultnea a la transferencia se produce la rotura de una de las dos cadenas del plsmido con el factor F (la otra permanece cerrada y se replica); posteriormente, la cadena abierta pasa de la clula F + a la F
. Cuando la transferencia finaliza, se
rompe el contacto entre las clulas. Al final de la conjugacin se obtienen dos bacterias F + una porque con- serva el factor F y la otra porque la ha recibido. En el caso de bacterias Hfr, el proceso de transferencia es similar al de los plsmidos, pero, en este caso la clula donadora puede transmitir a la clula receptora, ade- ms del factor F, parte de su genoma. Los procesos parasexuales confieren variabilidad gentica a las bacterias porque, junto con los caracteres genticos que estn codificados en el factor F, se transfieren otros genes como, por ejemplo, los que proporcio- nan resistencia a los antibiticos. Formas de resistencia: endosporas bacterianas Algunas especies de bacterias Gram positivas (principalmente de los gneros Bacillus, Clostridium, Sporosarcina y Thermoactinomyces, que se encuentran habitualmente en el suelo), disponen de una serie de estrategias adaptativas cuando se ven sometidas a privacin de nutrientes, especialmen- te carbono y nitrgeno, en su medio ambiente, y experimentan una serie de cambios internos que conducen a la produccin de unas estructuras especia- les llamadas endosporas, que son sumamente resistentes al calor, a la desecacin, a los cidos y desinfectantes qumicos, a las radiaciones Las endosporas pueden verse fcilmente en el microscopio ptico, previa tincin con colorantes bsicos como el azul de metileno. El microscopio elec- trnico permite observar mltiples capas que, de fuera a dentro, son: el exos- porium, una fina capa externa de naturaleza protenica; la cubierta de la espora, tambin protenica y muy resistente a las toxinas y, en ocasiones, con enzimas involucradas en la germinacin; la corteza (capa de peptidoglucano con uniones laxas), y, en el ncleo de la endospora, el protoplasto, que pre- senta una pared bacteriana y el resto de los componentes tpicos de la clula vegetativa: membrana plasmtica, citoplasma El protoplasto est parcialmente deshidratado (tiene solo de un 10 a un 30 por ciento del contenido de agua de la clula vegetativa) y su pH es inferior a lo normal. Presenta, adems, un alto contenido en Ca 2+ y una sustancia tpica de las endosporas, el cido dipicolnico, que se une al Ca 2+ formando dipicolinato clcico; este compuesto aumenta la resistencia de la espora al calor y a los agentes oxidantes. Tambin hay gran cantidad de protenas especficas de las endosporas, las pequeas protenas solubles en cido de la espora (SASP, del ingls small acid-soluble proteins), que protegen al ADN bacteriano de la radiacin ultravioleta y sirven como fuente de carbono y energa en el desarrollo de la clula vegetativa a partir de la endospora. La endospora es metablicamente inerte y puede mantenerse en este estado durante mucho tiempo, incluso aos. Su reactivacin tiene lugar cuando las condiciones son favorables; un aumento de temperatura es la seal apropiada, tras lo cual se degrada el dipicolinato clcico, los componentes de la corteza y las SASP, y la endos- pora se hidrata activndose el metabolismo celular. Finalmente, la clula surge de la cubierta rota de la espora y contina su crecimiento vegetativo hasta que vuelve a detectar seales del entorno que desencadenan nueva- mente la formacin de la endospora. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD Ilustracin 10.23 Imagen superior: endosporas de Clostridium tetani en posicin terminal. Imagen inferior: germinacin de la endospora; se observa la rotura de las cubiertas y la sali- da de la bacteria. 311 4. Ingeniera gentica En la Unidad 7 vimos que la biotecnologa tradicional abarca procedimientos cientficos y tcnicos usados por organismos vivos para transformar ciertas materias, con la finalidad de obtener algn producto o servicio til para el ser humano sin que, en ningn caso, se interfiera en el proceso. Sin embargo, la biotecnologa actual se cir- cunscribe esencialmente a la ingeniera gentica, que manipula el material gentico de los organismos para lograr productos especficos utilizando para ello distintas tcnicas: A. Tcnicas de ADN recombinante La ingeniera gentica utiliza las denominadas enzimas de restriccin o restrictasas, unas endonucleasas que escinden el ADN en puntos concretos para, de esta manera, obtener los segmentos que nos interese. La mayora de las restrictasas actan sobre secuencias palindrmicas, es decir, capicas: Las flechas indican el punto de corte. Vemos que tras el corte queda un oligonucletido (en el ejemplo forma- do por un solo nucletido) en cada uno de los lados, que son complementarios, estos extremos se llaman cohe- sivos y facilitan la unin entre distintos fragmentos cortados por la misma restrictasa. R e c u e r d a Los virus se multiplican utilizando toda la maquinaria de la clula husped. Pueden reproducirse siguiendo el ciclo ltico (se forman gran nmero de viriones que rpidamente salen de la clula husped) o el ciclo lisognico (el material gentico del virus se integra en el genoma de la clula husped y se replica con l). El virus del SIDA presenta la transcriptasa inversa, que forma ADN tomando como molde el ARN. Los procesos parasexuales confieren a las bacterias variabilidad gentica y son la transformacin, la conjugacin y la transduccin. Algunas bacterias forman estructuras de resistencia denominadas endosporas. 12. Razona por qu los virus pueden causar la muerte de la clula hospedadora. 13 Qu componentes bsicos ha de presentar el genoma de un virus animal para poder formar nuevos viriones? Razona la respuesta. 14. Algunos virus estn relacionados con la produccin de tumores. Qu papel juega el virus en la oncognesis (indicacin: repsese la Unidad 4)? 15. Por qu se denomina transcriptasa inversa a la enzima de los retrovirus? 16. Explica cmo puede una bacteria hacerse resistente a un antibitico. 17. Los procesos parasexuales son formas de reproduccin? Razona la respuesta. 18. Pueden existir mecanismos de recombinacin en virus? Razona la respuesta. 19. Qu diferencia bsica existe entre una espora eucaritica y una endospora? A c t i v i d a d e s 312 Las enzimas de restriccin permiten obtener ADN recombinante in vitro y producir mltiples copias de un determinado gen (proceso deno- minado clonacin). Para ello se ha de aislar el gen e introducirlo en un organismo (por ejemplo, una bacteria) usando un vector adecuado; la clula lo integra en su material gentico y, a partir de ese momento, cada vez que se reproduzca se obtiene una nueva copia del gen. Dichos vectores son molculas de ADN que se replican indepen- dientemente (o bien se integran en el genoma del husped) y poseen algn rasgo (marcador) que permite que sean fcilmente detectables, presentando dianas nicas para, al menos, una enzima de restriccin. Los principales vectores utilizados en ingeniera gentica son: Plsmidos, relativamente pequeos, que suelen llevar genes de resistencia especficos a uno o ms antibiticos y varios sitios de unin para las restrictasas. Virus. Anlogamente a lo que ocurre en la naturaleza, el ADN se introduce dentro de la cpsida. Suelen tener varios lugares de unin para las endonucleasas. Csmidos, de origen artificial. Se asemejan a plsmidos y se comportan como tales en las clulas, pero son ms grandes (lo que permite transportar muchos genes). Los YAC (del ingls yeast artificial chromosomes, cromosomas artificiales de levaduras), que contienen todos los elementos necesarios para la replicacin autnoma de un cromosoma (origen de replicacin, centrmeros y telmeros). Con los YAC se pueden insertar y clonar molculas de ADN de cientos de miles de bases. Se usan cuando se han de clonar genomas muy grandes, como en el caso humano. Los principales pasos de la clonacin son: 1) Aislamiento del ADN que queremos clonar (ADN pasajero) y seleccin del vector mediante enzimas de res- triccin. Ambos deben presentar extremos cohesivos. 2) Unin del fragmento de ADN al vector por la ligasa del ADN. Esta enzima establece los enlaces fosfodister y se obtienen molculas hbridas o recombinantes. 3) Introduccin del recombinante en la clula hospedadora. Este proceso es muy variable, en funcin de la clu- la hospedadora. Puede ocurrir por transformacin, transferencia, conjugacin (gracias a los pili), fusin de pro- toplastos que posteriormente se dividen, microinyeccin 4) Localizacin de las clulas que han captado las molculas recombinadas. Este es el paso ms laborioso y donde juega un papel importante los marcadores presentes en el vector, ya sean determinados genes (por ejemplo, los que confieren resistencia a un antibitico especfico , como se muestra la ilustracin 10.26) Ilustracin 10.25 Introduccin del plsmido recombinante en la clula husped. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD Ilustracin 10.24 Obtencin de un plsmido recombinante. 313 o sondas marcadas radiactivamente (una sonda es una molcula de ADN de cadena sencilla y complemen- taria del ADN que nos interesa localizar). 5) Por ltimo, se ha de determinar si la informacin gentica aportada por las molculas recombinantes se man- tiene de forma estable. El objetivo final es la obtencin de al menos una colonia (clon) de clulas que lleven el recombinante, en cuyo caso, se ha logrado clonar, aislar, el ADN pasajero. Las bacterias eran los organismos que comnmente se usa- ban en los comienzos de la ingeniera gentica. Hoy en da, como veremos en el siguiente epgrafe, la manipulacin se extiende a todo tipo de organismos incluidos los animales y las plantas. B. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Las tcnicas del ADN recombinante tienen varios inconvenientes, como son su lentitud, la necesidad de efec- tuarse en un ser vivo y la escasa cantidad de ADN recombinante que se obtiene. La conocida como reaccin en cadena de la polimerasa de ADN (PCR, de polymerase chain reaction) ha venido a solventar estas dificultades, al permitir generar, en pocas horas, 100000 millones de molculas idnticas a partir de una sola molcula de ADN. Esta tcnica exige la sntesis previa de unos oligonucletidos especficos que hibriden con el principio y el final del fragmento que se desea amplificar, actuando como ADN cebador (primer). La PCR consta de varios pasos: 1. Se incuba en un tubo de ensayo la muestra de ADN con la enzima polimerasa, trifosfatos de nuclesido y los dos oligonucletidos cebadores. 2. Se calienta el tubo a 94 C durante 5 minutos; las dos hebras de ADN se separan. 3. Se reduce la temperatura a unos 60 C durante 1 minuto; los cebadores se unen. 4. La temperatura se incrementa a 72 C durante 5 minutos, para que acte la polimerasa y se formen las cadenas complementarias. 5. Se sube la temperatura a 94 C durante 20 segundos, suficientes para separar la cadena recin sintetiza- da del molde original. Ilustracin 10.26 Seleccin de colonias recombinantes: en un medio nutritivo al que se le ha aadido un determinado antibitico se hacen crecer bacterias no transformadas y bacterias transformadas (tienen el gen que confiere resistencia al antibitico). Solo estas ltimas crecen y forman colonias; las no transformadas mueren. 314 Las cadenas sencillas generadas entran en sucesivos nuevos ciclos (pasos 1 al 5); tras 30 a 60 ciclos el ADN original se ha amplificado millones de veces. La PCR se ha convertido en una tcnica indispensable en una gran variedad de aplicaciones: como mtodo de diagnstico en clnica, en medicina forense para determinar si una muestra orgnica pertenece o no a un individuo o en paleontologa molecular (secuencias de organismos extinguidos cuyo ADN se ha conservado se pueden ampli- ficar, secuenciar y comparar con especies contemporneas). C. Huella gentica Uno de los aspectos ms impactantes y populares de la ingeniera gentica es la iden- tificacin de la huella gentica o perfilado del ADN, utilizado en exmenes forenses para la identificacin de personas y pruebas de paternidad a partir de una pequea muestra orgnica (sangre, semen, pelos). La base cientfica de la huella gentica se halla en la existencia de regiones no codifi- cantes del ADN llamadas minisatlites o VNTR (siglas de variable number of tandem repeats, nmero variable de repeticiones en tndem) repartidas por todo el genoma humano. Una repeticin en tndem es una secuencia corta de ADN que se repite conse- cutivamente en un locus cromosmico especfico. El nmero exacto de repeticiones vara entre individuos y, por lo tanto, la longitud de las VNTR. Para obtener estas regiones se utilizan tcnicas del ADN recombinante usando restric- tasas. Tambin se puede utilizar la PCR si el tamao de la muestra es muy pequea; los Ilustracin 10.27 Esquema del primer ciclo de la PCR. Este ciclo se repite hasta obtener el nmero de copias deseado. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD Ilustracin 10.28 Perfilado correspondiente a una familia; de izquierda a derecha patrones de la madre (M), del hijo (H) y del padre (P). Obsrvese que el patrn del hijo es combina- cin de los patrones de los padres. 315 fragmentos obtenidos se separan por electroforesis (vase la ilustracin 1.13). La utilizacin de sondas radiacti- vas permite la localizacin de los VNTR. El anlisis de un locus VNTR mediante hibridacin suele mostrar un patrn de dos bandas, uno heredado del padre y otra de la madre. Puede darse un patrn de una sola banda, si el tamao de las dos bandas es el mismo o muy similar. Habitualmente, los perfiles de un solo locus VNTR de individuos no relacionados entre s son dife- rentes; no obstante, es posible que dos personas tengan el mismo perfil en uno o dos loci, aunque las posibilida- des de coincidencia disminuyen drsticamente a medida que se incrementa el nmero de loci comparados. Cuando se usan los perfiles de ADN con fines medicolegales, se analizan generalmente de 4 a 6 loci VNTR diferentes. 4.1. Aplicaciones mdicas y farmacolgicas de la ingeniera gentica Las tcnicas que acabamos de ver son una pequea muestra de las herramientas de la ingeniera gentica. De su enorme potencial prctico en Medicina y Farmacologa dan cuenta los siguientes ejemplos: A. Terapia gnica Consiste en la localizacin de genes defectuosos capaces por tanto de provocar enfermedades y sustituir- los por genes sin anomalas. La clula a la que se le ha introducido un gen en forma artificial se conoce como clu- la transgnica, y al gen involucrado se denomina transgen. Esta tcnica tambin permite detectar enfermedades potenciales e iniciar un tratamiento preventivo (como, por ejemplo, algunas enfermedades cardacas) que evite que la enfermedad se desarrolle. A travs de sondas gnicas se rastrea el ADN en busca de los genes defectuosos res- ponsables de enfermedades genticas graves, para sustituirlos o bien comenzar un tratamiento preventivo. La terapia gnica se puede realizar en clulas somticas, con lo cual solo se modifi- ca el individuo sobre el que se acta, y en las clulas germinales (espermatozoides y vu- los, aunque no se aplica en humanos por razones ticas), lo que origina un cambio per- manente de todo el organismo y en las siguientes generaciones. La terapia gnica se utiliza para el trata- miento de algunos tipos de cnceres y de enfermedades sanguneas, hepticas y pul- monares. Esta tcnica puede ser realizada tanto ex vivo como in vivo. El primer caso consiste en el tratamiento in vitro de las clu- las o tejidos de un individuo afectado o de un donante, a las que se les transfiere, con distintos vectores, el gen teraputico; las clulas o tejidos modificados son posteriormente injertados en la persona afectada. En cambio, la metodologa in vivo se emplea cuando las clulas afectadas no pueden ser cultivadas o reemplazadas; en este caso, se manejan tcnicas de ADN recom- binante. En ambos casos, se usan como vectores virus (retrovirus o adenovirus) o liposomas (vase la Unidad 2), y la transferencia se realiza por endocitosis mediada por receptor o, en clulas superficiales, por pistola gni- ca (vase la ilustracin 10.30). Ilustracin 10.29 Terapia ex vivo utilizada para el tratamiento de la Inmunodeficiencia severa com- binada. El gen ADA es imprescindible para la formacin de clulas T y NK a par- tir de las clulas madre. Sin este gen, las clulas no se desarrollan, no crecen y tampoco proliferan. Los afectados estn indefensos frente a la ms leve infeccin y se ven obligados a vivir en el interior de una burbuja estril bajo un estricto con- trol. La terapia gnica puede paliar este problema. 316 Las tcnicas de terapia gnica tambin permiten introducir genes suicidas en clulas tumorales (estos genes cifran para una enzima que es capaz de modificar una sustancia no txica, convirtindola en un metabolito txico que lleva a la muerte de la clula tumoral). Asimismo, es posible incluir en el tumor o en el organismo genes de sustancias inmunoestimulantes como la interleucina 2, que potencial- mente protegen de distintos tipos de cncer y de sus recidivas. La sntesis de las denominadas bombas biolgicas, que actan como proyectiles letales contra las clulas tumorales, es otro ejemplo de terapia gnica; en este caso se fabrican inmunotoxinas uniendo toxinas muy letales (como la diftrica o la ricina) a anticuerpos monoclonales especficos de carcinomas (vase la ilustracin 4.35). Igualmente, mediante terapia gnica ex vivo se pueden elaborar vacunas a partir de las propias clulas tumorales de un enfermo. B. Tcnicas de diagnstico Hasta ahora, para el diagnstico prenatal preciso de posibles anomalas cromosmicas se sola realizar un anlisis del cariotipo, lo que requera un periodo de cultivo de varias semanas. Actualmente se pueden diagnos- ticar rpidamente estas alteraciones (en 24 horas) utilizando una tcnica mixta de QF-PCR (quantitative fluores- cence polymerase chain reaction). Gracias a la PCR obtenemos gran cantidad de muestras, y la inmunofluores- cencia nos permite cuantificarlas. La PCR, la QF-PCR y la secuenciacin se usan para el diagnstico molecular, que consiste en la determi- nacin de cambios en la secuencia o en la expresin de genes crticos en el cncer (por ejemplo, para localizar algunas translocaciones relacionadas con leucemias agudas). Estas tcnicas son muy sensibles, lo que permite realizar un diagnstico preciso incluso antes de que el cncer se manifieste clnicamente o determinar la presen- cia de enfermedades residuales en pacientes en remisin clnica. C. Aplicaciones farmacuticas En la actualidad, se emplea la tecnologa del ADN recombinante con fines comerciales; por ejemplo, se pro- duce insulina humana a partir de la levadura Saccharomyces cerevisae, por clonacin del gen correspondiente. Tambin con estas tcnicas se elaboran vacunas, como la de la hepatitis B (la mayora de los factores antigni- cos son protenas, y por ello se clona el gen adecuado). Terapia gnica antisentido Hasta el momento hemos estudiado un tipo de terapia gnica en la que se pretende que un gen concreto se exprese, por lo que se introduce el ADN de dicho gen en sentido 53. Este tipo de terapia gnica se llama sentido (sense en ingls). Pero tambin se puede llevar a cabo un tipo de terapia gnica llamada antisentido (antisense), cuyo objetivo es justo el contrario: la inhibicin de la expresin de un gen especfico, o sea, la prdida de la funcin ejercida por la protena que codifica el gen alterado. En este caso se sintetiza un oligonucletido de ADN en sentido 35 (la cade- na complementaria o antisentido de determinado ARNm). Se estn realizando ensayos muy problemticos con esta tcnica en el tratamiento enfermedades vinculadas a una actividad gentica anormal, como algunos cnceres. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD Ilustracin 10.30 Pistola gnica utilizada para introducir en ratones una vacuna gentica contra el Alzheimer. El ADN se une a partculas de oro coloidal de 1 m de dimetro y luego son disparadas a gran veloci- dad hacia las clulas que se desea modificar. 317 4.2. Otras aplicaciones de la ingeniera gentica A. Aplicaciones en agricultura Mediante ingeniera gentica han podido modificarse las caractersticas de gran n mero de plantas para hacerlas ms tiles para el ser humano: son las llamadas plantas transgnicas. Las tcnicas utilizadas se clasifican en: 1) Tcnicas indirectas, entre las que cabe destacar la transformacin de clulas mediada por Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria presenta en su citoplasma un plsmido Ti (tumor inducing, inductor del tumor) que incluye una zona T-ADN con genes oncognicos (onc). De forma natural, esta bacteria puede penetrar a travs de tejidos lesionados en algunas dicotiled neas. Seguidamente establece contacto directo con las clu- las vegetales y les transfiere el plsmido Ti, que se integrar en el material gentico de la clula vegetal. Los genes onc provocan la formacin de un tumor o agalla. La ingeniera gentica usa este proceso para transmitir genes forneos: del plsmido Ti se eliminan los genes causantes de tumores y se sustituyen por los que interese clonar; despus, el nuevo plsmido se inserta en la bacteria que, a su vez, se introduce en las clulas vegetales de un cultivo; stas ltimas se desarrollarn en una planta con caractersticas nuevas y sin la enfermedad. De esta manera se ha introducido, por ejem- plo, el gen Bt de la bacteria Bacillus thuringiensis, que codifica para una toxina insecticida, en el algodn, las patatas, el maz 2) Tcnicas directas. Comprenden la fusin de protoplasmas (unin de los genomas de dos clulas vegetales, incluso de especies diferentes, para dar lugar a un hbrido), la transferencia directa de genes (mediante lipo- somas, electroporacin, microinyeccin) y la seleccin de mutantes con algn rasgo especialmente interesante. Entre los caracteres transfe- ridos destacan: Resistencia a herbicidas, a virus y a insectos, como el caso antes cita- do de la toxina producida por algunas cepas de Bacillus thuringiensis que impiden el desarrollo de las larvas de muchos insectos sobre las plantas transgnicas que portan el gen responsable (como el maz que se cultiva en Espaa). Ilustracin 10.31 Transferencia de genes utilizando el plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Ilustracin 10.32 El arroz de la imagen incorpora dos protenas huma- nas, lactoferrina y lisozima, usadas en el tratamiento de la diarrea aguda del lactante (actualmente en fase de experimentacin). 318 Incremento del rendimiento fotosinttico mediante la transferencia de los genes implicados en la ruta foto- sinttica de plantas C4 (ms eficaces en el proceso). Retraso en la maduracin de tomates por insercin de un gen antisentido. Sntesis de productos de inters comercial, como el interfern usado en el tratamiento de las hepatitis B y C (obtenido en arroz y tabaco transgnicos) y la vacuna contra el clera producida por patatas trans- gnicas. Actualmente se evalan muchos de estos productos para su empleo en la alimentacin humana. Obtencin de plantas capaces de fijar nitrgeno atmosfrico (por transferencia de los genes que codifican para la nitrogenasa), gracias a lo cual podran crecer sin necesidad de abonos nitrogenados. B. Aplicaciones en ganadera Las tcnicas de ingeniera gentica tambin se aplican a los anima- les y se obtienen animales transgnicos con distintas finalidades: Produccin de protenas teraputicas. En este caso, adems del gen codificante, se ha de introducir en las clulas husped, la secuencia promotora que permite que ese gen se exprese sola- mente en unas determinadas clulas. Mediante esta tecnologa se ha producido en la leche de oveja la -antitripsina, una protena humana que se emplea para curar el edema pulmonar. La misma tcnica se ha utilizado para obtener en la leche de cerdos la pro- tena C humana, que controla la coagulacin sangunea y es necesaria para los hemoflicos. Obtencin de rganos compatibles con los humanos (por inoculacin de genes humanos, por ejemplo, en cerdos) a fin de usarlos para xenotransplantes. Clonacin de individuos. Como hemos mencionado con anterioridad, clonar, en el mbito de la ingeniera gentica, es aislar y multiplicar en un tubo de ensayo un determinado gen o, en general, un fragmento de ADN. Sin embargo, es frecuente aplicar este trmino a la obtencin de uno o varios individuos a partir de una clula somtica o de un ncleo de otro individuo, de modo que los individuos clonados sean idnticos o casi idnticos al original. En ganadera, esta tcnica tiene como finalidad el conseguir y mantener anima- les con unas determinadas caractersticas: mayor produccin crnica, incremento del volumen de leche Son peligrosos los organismos transgnicos? Un transgnico (u organismo modificado genticamente, OMG) es un organismo vivo portador de material gentico perteneciente a especies no emparentadas y transferido a l mediante ingeniera gentica. La biotecnologa aplicada a los seres vivos presenta una serie de aspectos positivos, algunos de los cuales ya conocemos y otros los intuimos (por ejemplo, sintetizar plantas comestibles que puedan cultivarse en terrenos pobres y en climas muy duros, lo que contribuira a paliar el hambre en el mundo). Sin embargo, son muchas las voces que se levantan en contra de la utilizacin de estas tcnicas, especialmente en la produccin de productos alimentarios, afirmando que existen una serie de riesgos (mayores en especies vegetales, porque se dispersan ms fcilmente) como es, por ejemplo, la posibilidad de que los OMG puedan combinarse con especies silvestres e incluso transmitirse de forma imprevisible a otros organismos relacionados (contaminacin gentica), la aparicin de nuevas alergias o de nuevos txicos Es imprescindible un debate sereno y argumentado cientficamente para valorar tales riesgos. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD Ilustracin 10.33 A la izquierda, cerdo transgnico con un 20 % menos de cidos grasos. Presenta el hocico y las patas amarillas porque se le ha insertado un gen fluorescente para poder distinguirlo de uno normal. 319 C. Proyecto Genoma Humano El Proyecto Genoma Humano (PGH) es una investigacin internacional en la que participan China, Francia, Alemania, Japn, Reino Unido y, principalmente, Estados Unidos. Consiste en secuenciar todos los pares de bases del ADN humano e identificar los 20 000 a 25 000 genes presentes en l. Se inici oficialmente en 1990 y, aunque estaba previsto concluirlo en quince aos, la colaboracin internacional y los avances tecnolgicos (tanto en las tcnicas de secuenciacin como en informtica) aceleraron la investigacin, y en 2003 finaliz la secuenciacin del genoma humano. El Genoma humano fue declarado Patrimonio de la Humanidad por la UNESCO en 1997. Se ha podido extraer una conclusin inicial: las diferencias de composicin de los exones son relativamente constantes; solo una de cada mil bases difieren de un individuo a otro (unos tres millones de letras), y muchas discrepancias son irrelevantes. El objetivo inicial del PGH fue no solo secuenciar los 3 mil millones de pares de bases del genoma humano, sino tambin identificar todos los genes (fase actual del proyecto) y almacenar esta informacin en una base de datos electrnica, el Database of human genome, de libre acceso (actualmente existe otra base de datos, el GenBank, que contiene todos los datos pblicos de secuencias genticas de ADN). Conocer y descifrar el genoma permitir desarrollar nuevas biotecnologas y tratamientos mediante terapia gnica de casi todas las enfermedades con un origen gentico como, por ejemplo, algunos tipos de cncer o la enfermedad de Alzheimer. Por ltimo, en un plano ms terico, cabe sealar que el anlisis del genoma humano y su comparacin con el de otros organismos ha abierto un fascinante camino en el estudio de la evolucin. En muchos casos, preguntas que permanecan sin respuesta han podido ser contestadas; pero tambin se han planteado nuevos interrogantes. 20. En los vectores utilizados actualmente se introduce un fragmento de ADN, denominado polilinker, provisto de varias dianas nicas para diferentes enzimas de restriccin. Qu objetivo persigue esta prctica? 21 Por qu se debe estudiar la estabilidad del ADN recombinante en el husped? 22. Para determinar la paternidad de un nio se realizan los perfiles de determinados loci de VNRT. La imagen representa las bandas obtenidas (M- madre, H- hijo, P1- padre 1, P2 padre 2). Quin es el padre? 23. Qu ventajas tiene el uso de liposomas como sistema de transferencia gnica? Qu proble- mas puede tener la endocitosis mediada por receptor como sistema de transferencia gnica? 24. Recientemente se ha sintetizado un gen capaz de detener la multiplicacin del virus VIH (SIDA), y se ha insertado en clulas humanas infectadas. El resultado fue exitoso: el virus detuvo su propagacin e incluso aument la longevidad de los linfocitos T H . Qu tipo de terapia se ha aplicado en este caso? 25. El plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens ha de ser desactivado y se le ha de incorporar un gen que confiere resistencia a determinados antibiticos, adems del que interese obte- ner, antes de ser insertado en una clula vegetal. Por qu? A c t i v i d a d e s 320 5. La variabilidad gentica y la seleccin natural Se afirma en ocasiones que el gran problema de la teora de la evolucin de Darwin era la ausencia de un mecanismo que explicara el origen de la variacin necesaria para el proceso de seleccin natural (vase la Unidad 1), y que el problema qued resuelto en 1900, tras el redescubrimiento de las leyes de Mendel. Sin embargo, las primeras tres dcadas de gentica mendeliana no contribuyeron a reforzar el darwinismo; al con- trario, personajes como de Vries o Morgan consideraban que el carcter discreto de la variabilidad de los carac- teres mendelianos probaba que el proceso evolutivo no se ajustaba al cambio gradual descrito por Darwin. La aparicin de nuevas especies se debera a las macromutaciones propuestas por de Vries (vase el epgrafe 3 de la Unidad 8), y la seleccin natural se limitara a eliminar mutaciones nocivas. 5.1. La teora sinttica de la evolucin Probablemente una de las causas del rechazo que encontr el darwinismo entre estos mutacionistas fue que, para ellos, el individuo mutante era ms importante que la poblacin a la que perteneca; pero la esencia de la revolucin darwiniana estribaba, precisamente, en el planteamiento opuesto: para Darwin la evolucin era el proceso mediante el cual la variacin entre los individuos de una poblacin se convierte en variacin entre poblaciones y, de ah, en variacin entre especies. Por ello el resurgir del neodarwinismo el darwinismo des- provisto de la herencia de los caracteres adquiridos, tal y como lo desarroll Weismann solo fue posible cuan- do se adopt definitiva mente el pensamiento poblacional, lo que ocurri durante los aos 1930-1950 en tres dis- ciplinas: la gentica, la sistemtica y la paleontologa. Su confluencia motiv el nombre de teora sinttica que, en adelante, se dara al neodarwinismo. La gentica, en particular, permiti identificar las fuentes de la variabilidad sobre la que acta la seleccin natural. En ltimo trmino toda la variacin gentica procede de la mutacin, entendida en su sentido moderno tal y como se ha definido en esta mis ma Unidad y no como la conceba de Vries. Las mutaciones son el ori- gen de los diferentes alelos de cada gen. En una poblacin, los individuos pueden presentar diversas combina- ciones de alelos; si algunos de estos genotipos determinan que sus portadores tengan mayor eficacia biolgi- ca que otros individuos de la poblacin, entonces las frecuencias de los alelos presentes en dichos genotipos aumentarn en la poblacin generacin tras generacin, hasta convertirse en genes exclusivos. Si esa sustitu- cin de unos alelos por otros ms aptos afecta a un gran nmero de genes, la poblacin podra acabar teniendo una constitucin gentica muy distinta de la inicial, hasta el punto de que los individuos que la constituyen no podran cruzarse y tener descendencia frtil con los de otras poblaciones: habra nacido una nueva especie. Sin embargo, la evolucin no puede limitarse a cambios en las frecuencias de genes que ya existen. A lo largo de la historia evolutiva se han ido asignando nuevas fun ciones a los repertorios bioqumicos de los organismos. Esto es, han debido fabricarse nuevos genes, cosa que puede ocurrir por una doble va: Un gen se duplica accidentalmente, y la copia extra se inserta en una nueva ubicacin de los cromoso- mas (gracias a un transposn). Como solo se necesita una copia para producir la protena original, la copia suplementaria puede mutar sin restricciones y originar un gen capaz de cifrar una protena con fun- ciones novedosas. Un ARNm puede copiarse hacia atrs gracias a la transcriptasa inversa, para dar una secuencia de ADN que se inserta en un cromosoma. Este fenmeno, la retrotransposicin, produce genes ya proce- sados, esto es, sin intrones. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD 321 A menudo, no obstante, la copia del gen est daada y no es funcional, convirtindose en un pseudogen. Se conocen en la actualidad ms de 19 000 pseudogenes en la especie humana, en vivo contraste con los 20 000 a 25 000 genes codificantes de protenas. De hecho, da la impresin de que en los organismos pluricelulares solo un peque o porcentaje del material gentico total alberga copias nicas de genes funcionales. La imagen del genoma que ahora tenemos es la de un microcosmos de secuencias de ADN agitado por conflictos mortales, poblado de parsitos omnipresentes, a menudo silenciosos, de los que se ignora si son a veces tiles, y de algu- nos raros genes que seran como los que describa la gentica clsica. 5.2. El estudio de los orgenes En el transcurso de la evolucin algunas partes del genoma cambiarn ms fcilmente que otras. Un pseu- dogen, por ejemplo, puede acumular mutaciones sin lmite, incluidas las alteraciones que resultaran deletreas para un gen normal. Por lo tanto, la comparacin de este tipo de secuencias en dos especies nos indicar cun- tas mutaciones se han sucedido desde que divergieron a partir de un antepasado comn y, si se conoce el ritmo al que se producen las mutaciones, nos permitir estimar el tiempo transcurrido. Esta suerte de reloj molecular ha permitido averiguar que el comn ancestro a humanos y chimpancs vivi hace unos cinco millones de aos. En cambio, un gen que cifre una molcula de ARNr o de una protena esencial altamente optimizada no puede alterarse fcilmente: si se produce un error, la clula afectada generalmente es eliminada. Por tanto, estos genes se conservarn en buena medida a lo largo de la evolucin, y su anlisis permitir determinar las relaciones de parentesco entre los organismos ms alejados en el rbol evolutivo. A finales de los aos 70 del siglo XX, el microbilogo estadounidense Carl Richard Woese (n. 1928) abord la tarea de reconstruir el rbol filogentico universal comparando secuencias de ARNr. A tenor del cuadro resul- tante, los primeros descendientes del ltimo antepasado comn universal (LUCA, de last universal common ancestor) dieron lugar a dos grupos de procariotas: las bacterias y las arqueas; ms tarde, a partir de stas lti- mas surgieron los primitivos eucariotas. Uno de stos fagocit bacterias rojas que haban perdido su fotosistema, de manera que los electrones fluan en sentido contrario al indicado en la ilustracin 7.24 (esto es, con el NADH Ilustracin 10.34 rbol filogentico universal obtenido tras comparar secuencias de ARNr de muchas especies. El color es conforme al sistema de tres dominios de Woese. 322 como dador, no como aceptor), cayendo hasta el O 2 : las bacterias, capaces ahora de obtener energa por res- piracin, no fueron digeridas por el eucariota primitivo, sino que establecieron con l una relacin simbitica de mutuo beneficio y se transformaron en mitocondrias. En un proceso similar, los cloroplastos derivaron de ciano- bacterias retenidas por una clula eucaritica que ya era portadora de mitocondrias. En realidad, la idea haba sido sugerida una dcada antes por la biloga estadounidense Lynn Margulis (n. 1938) con el nombre de teora de la endosimbiosis en serie. La teora explica por qu mitocondrias y cloroplas- tos se rodean de una doble membrana (la exterior derivara de la membrana plasmtica del eucariota ancestral) y por qu poseen ADN y ribosomas similares a los bacterianos. Innumerables anlisis genticos han dejado esca- so margen para dudar de la veracidad de esta teora, y han deparado nuevas sorpresas. As, el cloroplasto de las algas verdes y rojas (encuadradas en el reino de las Plantas) es el resultado de un nico proceso de endosim- biosis con una cianobacteria, pero las restantes algas (Cromistas y ciertos Protozoos) se han originado median- te varios procesos de endosimbiosis secundaria, cuando una clula engulla algas completas: esto explicara la existencia de tres o cuatro membranas en sus cloroplastos. Incluso se ha querido explicar el origen del ncleo de las clulas eucariticas mediante la endosimbiosis de una arquea y una proteobacteria (del grupo al que perte- necen las bacterias rojas), tal y como muestra la ilustracin 10.36. En los ltimos tiempos el esquema de Woese est siendo sometido a profundas revisiones. Para investigado- res como Cavalier-Smith los eucariotas y las arqueas no son dos dominios independientes, sino dos grupos que surgieron paralelamente a partir de bacterias que remplazaron los peptidglucanos de la pared celular por gluco- protenas con enlaces N-glucosdicos, como refleja la ilustracin 5.6; el sistema de membranas internas (envol- tura nuclear incluida) y el citoesqueleto tendran un origen esencialmente autgeno (esto es, no ligado a endo- simbiosis) y posibilitaran la fagocitosis, esencial para la posterior ingestin de los antecesores de las mitocon- drias y los cloroplastos. Y los eucariotas que carecen de mitocondrias no seran reminiscencias del tiempo en que an no haba ocurrido la endosimbiosis, como sugera Woese (vase la ilustracin 10.34), sino organismos modernos que las habran perdido secundariamente. Cul es, entonces, el origen de las bacterias de las que parecen proceder los restantes seres vivos? Los datos se vuelven confusos a medida que nos remontamos en el tiempo, pero mltiples indicios hablan de una poca en la que los precursores de las bacterias carecan de ADN. En su lugar posean ARN, que no solo alma- cenaba informacin gentica, sino que desempeaba el papel que hoy ejercen las protenas; esto es, la catlisis Ilustracin 10.35 Supuesto origen de los euglenozoos por una doble endosimbiosis. REPLICACIN DEL ADN, RECOMBINACIN Y EVOLUCIN 10 UNIDAD 323 enzimtica. El reciente descubrimiento de ribozimas es un punto a favor de este mundo de ARN que precedi al mundo de ADN y protenas actual. Ms all de esa poca remota entraramos en los escurridizos terrenos del origen de la vida a partir de mate- ria inanimada. Pero, a pesar del profundo impacto que su comprensin tendra en la Biologa y en el conocimien- to humano del mundo natural, poco es lo que podramos decir hoy por hoy en un libro como este, salvo especu- lar. Ha llegado, pues, el momento de poner el punto final. Ilustracin 10.36 Hiptesis de la sintrofia, que pretende explicar el origen de los eucariotas por medio de dos endosimbiosis basadas en el intercambio de productos metablicos: los desechos de unos son los nutrientes de otros. R e c u e r d a La ingeniera gentica comprende una serie de tcnicas y procedimientos, como el ADN recombinante, las sondas gnicas, la reaccin en cadena de la polimerasa y la huella gentica, que permiten modificar los organismos. La ingeniera gentica tiene aplicaciones en medicina, agricultura y ganadera, mediante la obtencin de individuos recombinantes o transgnicos. Tambin ha permitido profundizar en el estudio de la evolucin a escala celular y molecular, incrementando notablemente nuestros conocimientos sobre el origen de las especies.