Introduccin.

La tincin de Gram es una tcnica diferencial comnmente empleada en el diagnstico microbiolgico, fue descubierta por Hans Christian Gram (imagen 1.) en 1884. La mayor parte de las muestras sometidas a examen cuando se sospecha infeccin bacteriana deben ser extendidas en frotis sobre laminillas de vidrio, teidas y examinadas en el microscopio. Los reactivos empleados en la tincin de Gram son el cristal violeta (colorante bsico), lugol (mordiente), alcohol cetona (decolorante) y safranina (colorante de contraste). - Las bacterias Gram-positivas aparecen de color azul oscuro despus de teidas con el colorante y lavadas con alcohol (staphylococcus, streptoccoccus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, etc). - Las bacterias Gram-negativas, no toman el colorante y aparecen de color rojo o anaranjado (E. coli, salmonella, shigella, Proteus, Klebsiella, Pseudomonas, etc). Imagen 1. Hans Christian Gram (1853 1938).

El cristal violeta sirve como colorante bsico unindose a la pared celular bacteriana, con ayuda del mordiente (lugol) que refuerza la unin del colorante. Las bacterias Gram positivas debido a la estructura y composicin bioqumica de su pared celular, retienen el complejo cristal violeta-lugol y aun despus del tratamiento con el decolorante conserva el colorante bsico, por lo que se observan de color prpura o violeta al microscopio. Las bacterias Gram negativas pierden el colorante bsico cuando son tratadas con el decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido lipdico de la pared celular (lo que aumenta la permeabilidad celular), dando como resultado la prdida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias decoloradas captan entonces el colorante de contraste, razn por la cual estas bacterias se observan de color rojo al microscopio.

Desarrollo: Fijar un Frotis. Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra.

Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano. Tincin. Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C. Enjuague. Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo... La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1% . Mordiente. Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijacin en las bacterias.. Decoloracin. Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Lavado y secado.

Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. Tincin de contraste. Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. Nuevo enjuague. Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

Fuentes: http://www.slideshare.net/Mardj/prctica-2-tincin-de-gram http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram http://www.esacademic.com/dic.nsf/es_mediclopedia/20605/tinci%C3%B3n