Uso de HPLC para evaluar la concentracin de licopeno en guayaba mnimamente procesada

Luis Alejandro Taborda Andrade1, Juan Carlos Clavijo Salinas2

Curso de Qumica de Productos Naturales Maestra en Ingeniera Agroindustrial Facultad de Ingeniera y Administracin Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira Presentado el16 de diciembre de 2012

Resumen
La guayaba es una fruta extica colombiana caracterizada por sus bondades nutricionales, en especial por su contenido de vitamina C y carotenoides; no obstante, la concentracin de estos componentes se puede ver afectada por procesos como la transformacin de la fruta fresca en pulpas. En este trabajo se emplearon los conocimientos adquiridos sobre la tcnica de cromatografa lquida de alta eficiencia para evaluar la concentracin de carotenoides en guayaba fresca y pulpa de guayaba. Se encontr que hay un aumento en la concentracin de licopeno en la guayaba cuando se transforma en pulpa, siendo la cromatografa lquida de alta eficiencia una tcnica confiable para este tipo de estudios.

1. Introduccin
La produccin de Guayaba en Colombia reviste gran importancia para la economa del pas. Segn el Ministerio de Agricultura en el 2010 fueron sembradas 12.351 Hectreas las cuales produjeron en el mismo ao 126.479 Toneladas, generando un rendimiento del 10,2% (Ton/Ha). Los principales departamentos productores de guayaba en el pas, segn la misma fuente son: Santander, Meta, Boyac y Valle con una cuota del 32, 14, 11 y 10% respectivamente. Siendo el Valle un departamento importante en el panorama nacional en la produccin de este importante producto frutcola, se justifica que en centros de Investigacin locales como la Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira se desarrollen investigaciones que luzcan principalmente la prospeccin comercial y agroindustrial de la sumatoria de componentes como nutrientes y dems metabolitos secundarios. Lo anterior debido a que segn se ha reportado, La guayaba (Psidium guajava L.) es considerada una fruta altamente nutritiva, por su elevado contenido de acido ascrbico (50-300 mg/100g de peso fresco (Thaipong et al., 2006). Igualmente, se han reportado diversos carotenoides en guayaba, tales como fitoflueno, B-caroteno, B-criptoxantina, Gcaroteno, licopeno, rubixantina, criptoflavina, lutena y neocromo (Mercadante et al., 1999).

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El objetivo de este trabajo fue evaluar el mtodo de HPLC para medir la concentracin de licopeno en guayaba fresca y mnimamente procesada.

2. Materiales y Mtodos
2.1. Procesamiento de guayaba Como materia prima se utiliz una variedad ICA de guayaba (Psidum guajava L.) tipo Pera, para evaluar la concentracin de licopeno en dos presentaciones de guayaba: en freso y pulpa, las cuales fueron obtenidas con los siguientes procedimientos: Los frutos de guayaba se lavaron con agua para eliminar materiales extraos y se desinfectaron con hipoclorito de sodio (50 ppm), sumergiendo las frutas por 5 minutos. Luego las guayabas se cortaron en cuartos y se escaldaron con agua a 902C por 10 minutos. En este punto se separ el material clasificado como producto fresco. El material restante fue despulpado utilizando un tamiz de 2 mm de dimetro, para obtener la presentacin mnimamente procesada, correspondiente a la pulpa de guayaba. Ambos materiales fueron liofilizados y almacenados en refrigeracin hasta la realizacin de los experimentos. De cada presentacin de guayaba se tomaron muestras para dos repeticiones, como se muestra en la tabla 1. Tabla 1. Muestras de dos presentaciones de guayaba tomadas para el experimento
Repeticin 1 (g) Guayaba fresca Pulpa de guayaba 1.0066 1.0281 Repeticin 2 (g) 1.0252 1.0191

2.2. Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia (HPLC) Se utiliz un equipo de Cromatografa Liquida de Alta Eficiencia (HPLC), marca Shimadzu, el cual consta de las siguientes unidades, con sus respectivas referencias: Desgasificador DGU 20As Bomba LC 20AD Automuestreador (PDA) SIL 20A HT Indice de Refraccion RID 10 Detector UV-VIS Diode Array Detector de arreglo de diodos SPD 10 Horno de columna CTO 20 Columna Tracer Extrasil ODS2 5ugm 25 x 0,46 cm Precolumna ODS y termostatizada a 40C

La tcnica fue desarrollada teniendo en cuenta las siguientes condiciones: Flujo: 1,6 ml Modo: Isocrtico Temperatura: 40,1 +- 0,4 C Presin: 6,3 +- 0,1 MPa Fase Mvil: Acetonitrilo/Metanol (70:30) Longitud de onda: licopeno 472 nm

Se utiliz como solucin extractora una mezcla de hexano, acetona y etanol, en porcentajes volumtricos de 50, 25 y 25% respectivamente. Se adicion 25 ml de esta solucin a cada muestra, en vasos de precipitados de 50 ml y se cubrieron con papel aluminio. Posteriormente se agit a 350 rpm durante 15 minutos, cubriendo los vasos con una caja de cartn para evitar la fotodegradacin de los compuestos a analizar. Luego se agregaron 10 ml de agua destilada a cada vaso y se dej reposar durante 10 minutos, con el fin de provocar una separacin de fases. La fase hidrofbica en la parte superior corresponde a una mezcla de hexano y el extracto de inters, mientras que la fase hidroflica corresponde a una mezcla de agua, acetona y etanol. De la fase hidrofbica de cada vaso, se tomaron y filtraron (Nylon 0.22um) muestras para llenar los viales que posteriormente se introdujeron al equipo de Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia (HPLC), ubicndolos en orden del menos concentrado al ms concentrado. De cada uno de estos viales, el automuestreador del HPLC toma 10 ul para inyectarlos en el equipo. Como fase mvil en el equipo de HPLC, se utiliz una mezcla de acetonitrilo y etanol, con porcentajes volumtricos de 70 y 30% respectivamente.

3. Resultados y Discusiones
Se observ que el rea bajo la curva en el cromatograma, con deteccin para licopeno, es mayor para la pulpa de guayaba que para la guayaba fresca. Esto se puede apreciar en la figura 1 a y b.

Figura 1a. Cromatograma - Guayaba fresca

Figura 1b. Cromatograma - Pulpa de guayaba

La informacin arrojada por el software se resume en la tabla 2.

Parmetro Longitud de onda licopeno (nm) Tiempo de retencin (min) Altura de pico rea bajo la curva

Guayaba fresca 472 10.949 4967.6 169082.3

Pulpa de guayaba 472 11.538 20832.4 644703.4

Los datos de altura y rea estn si unidades debido a que eso se define con la curva de calibracin del compuesto puro. No obstante, dado que la concentracin de un compuesto es directamente proporcional al rea bajo la curva, las operaciones matemticas entre reas bajo la curva tambin sern proporcionales a las operaciones matemticas entre concentraciones. As es posible establecer una relacin de incremento en la concentracin de licopeno en guayaba cuando sta es transformada en pulpa, as:

De este modo, se puede estimar que el incremento en la concentracin de licopeno en guayaba, por causa de la transformacin en pulpa es aproximadamente 2.8 veces. Este resultado concuerda con los resultados de otros autores: Ordez-Santos y Vzquez-Riascos, 2010, reportaron que debido a la transformacin de guayabas enteras en pulpa, se produca un incremento en la concentracin de carotenoides del 77.5% Una hiptesis del posible incremento de licopeno durante la produccin de pulpa de guayaba, es el incremento en el licopeno libre a partir del licopeno ligado a protenas, porque puede ser debido parcialmente a la destruccin de la membrana celular por la homogenizacin y el procesamiento trmico, conllevando a la escisin de los complejos protena-carotenoide, mejorando por lo tanto la extractabilidad de los carotenoides (Nguyen y Schwartz, 1999). Sin embargo, el tratamiento trmico podra estimular la transformacin de algunos carotenoides en licopeno. El Fitoeno sufre una serie de reacciones de insaturacin que crean nuevos dobles enlaces y extienden el cromforo en dos dobles enlaces conjugados; el producto final es el licopeno, producido por los intermediarios del fitoflueno, G caroteno y neurosporeno (Odrizola-Serrano et al., 2009)

4. Conclusiones
En este trabajo se emple la tcnica de cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC) para evaluar la concentracin de licopeno en guayaba fresca y procesada, encontrando que su concentracin se incrementa cuando la guayaba es transformada en pulpa. La explicacin del aumento de la concentracin del licopeno se asocia con la destruccin de las paredes celulares de los tejidos vegetales y con la transformacin de otros carotenoides por accin del calor.

5. Agradecimientos
Los autores presentan su agradecimiento a la ingeniera Andrea Melissa Vsquez por su tiempo y disposicin para orientar la realizacin de los experimentos. Igualmente al profesor Luis Eduardo Ordoez, coordinador del Laboratorio de Frutas y Hortalizas, por permitir el acceso a los equipos y facilitar las muestras, materiales y reactivos para este trabajo.

6. Referencias
Ordoez-Santos L., Vzquez-Riascos A. Effect of processing and storage time on the vitamin C and lycopene contents of nectar of pink guava ( Psidium guajava L.). Archivos Latinoamericanos de Nutricin Vol. 60 N 3, 2010. Nguyen ML & Schwartz SJ. Lycopene: Chemical and biological properties. Food Technol. 1999;53(2), 3845. Odriozola-Serrano I, Soliva-Fortuny R, Hernndez-Jover T & Martn-Belloso O. Carotenoid and phenolic profile of tomato juices processed by high intensity pulsed electric fields compared with conventional thermal treatments. Food Chem. 2009;112, 258-266.