FACTORES AMBIENTALES QUE INFLUYEN EN EL DESARROLLO DE Sporothrix schenckii EN HUAUCHINANGO, PUEBLA, MXICO.

Ricardo MUNGUA PREZ, Mara del Carmen VELZQUEZ ESCOBAR, Raymundo ROSAS QUIJANO, Lourdes GUERRERO ONTIVEROS, y Alejandra Paula ESPINOSA TEXIS Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiolgicas, Instituto de Ciencias, Posgrado en Ciencias Ambientales. Universidad Autnoma de Puebla. Apartado Postal # 1622. FAX 2332010 ext 25. espinosatex@yahoo.com Palabras clave: Sporothrix schenckii, esporotricosis, micosis RESUMEN La temperatura, humedad relativa, el pH ligeramente cido y la presencia de algunos oligoelementos afectan el desarrollo fngico, sin embargo no existen estudios en Mxico que apoyen esta hiptesis para Sporothrix schenckii. El objetivo fue determinar los factores ambientales que permiten el desarrollo de S. schenckii en el suelo del municipio de Huauchinango, Puebla. Para el aislamiento del hongo se recolectaron 100 muestras de suelo asociado a rosales, maz, pino y plantas silvestres, pesando un gramo para realizar 3 diluciones (1:10, 1:100, 1:1000) con agua estril, sembrando cada dilucin por triplicado en agar mycosel e incubando a 28C por 30 das. Se midi el pH del suelo de cada muestra y se cuantific la concentracin de Ca2+, Fe3+ y Mg2+, registrando la temperatura y la precipitacin pluvial. Se obtuvieron 3 aislamientos de S. schenckii. El pH del suelo 2+ oscil en el rango de 5.9 a 7.0. La concentracin para Ca fue de 9.3 Meq/100g, para Fe3+ 17.2 mg/kg y para Mg2+ 2.1 Meq/100g. La temperatura promedio fue de 16.4C y la precipitacin pluvial de 2300 mm3. El pH de las muestras de suelo de las que se aisl al hongo fue cercano a la neutralidad. El desarrollo de S. schenckii fue independiente de la concentracin de los oligoelementos. La temperatura templada y la alta precipitacin pluvial favorecieron el crecimiento de S. schenckii. En suelo del municipio de Huauchinango se aisl S. schenckii, sugiriendo que podra ser la fuente de infeccin de los casos de esporotricosis. INTRODUCCIN La mayor parte de las especies fngicas son cosmopolitas aunque algunas de ellas tienen una distribucin geogrfica restringida y especfica. Los hongos se encuentran ampliamente distribuidos, viven en cualquier sitio que presente materia orgnica, humedad, y temperatura comprendida entre 4 y 60C. Pueden vivir en climas ecuatoriales, tropicales, subtropicales, templados y an en los fros, siempre que la temperatura no sea menor a 0 C, desde el nivel del mar hasta altitudes de ms de 4000 metros, en donde se encuentran los ltimos vestigios de vegetacin, pueden desarrollarse en lugares hmedos, en sitios semidesrticos y an en desrticos en pocas de ligera humedad en los suelos (Herrera, 2004).

Los factores ambientales determinan el desarrollo celular fngico, interviniendo factores tanto fsicos, qumicos como biolgicos. Entre los factores fisicoqumicos se encuentran la composicin qumica y naturaleza del substrato, pH, aireacin, luz, humedad, temperatura ambiental, altitud, precipitacin pluvial y factores nutricionales (Szaniszlo, 1985) entre otros (Guzmn, 2004; Rodrguez del Valle, 1983; Betancourt, 1985). Los factores biolgicos incluyen las relaciones que se establecen con otros organismos tales como el antagonismo, parasitismo y simbiosis. En su nicho ecolgico los hongos estn en constante lucha para poder subsistir, desarrollando estrategias y mecanismos adecuados para convivir y/o competir con otros microorganismos. Los hongos saprfitos o de vida libre estn en constante lucha con las condiciones del medio ambiente para su sobrevivencia: la humedad, los cambios bruscos de temperatura, el agotamiento de nutrientes, la contaminacin y competencia con otros microorganismos presentes en su entorno. En los hongos parsitos, las condiciones ambientales son prcticamente constantes. La disponibilidad de agua, temperatura adecuada, pH ptimo, oxigenacin apropiada, tolerancia al dixido de carbono y nutrientes disponibles, son los factores bsicos que encuentra el hongo para establecerse, pero sorteando los mecanismos de defensa del husped. Los hongos ya sea de manera natural o inducida por determinadas condiciones ambientales y nutricionales producen enzimas cuya funcin primordial es permitir utilizar los diversos nutrientes del medio. La produccin de enzimas, toxinas, molculas o mecanismos particulares que alteren el equilibrio celular del hospedero, les va ha permitir a estos organismos establecerse, invadir y diseminarse. (Howard 1993) Varias especies de hongos requieren algunos oligoelementos para su desarrollo tales como calcio, hierro, boro, zinc magnesio o manganeso, los que generalmente estn asociados a sistemas enzimticos. (Griffin 1981). La humedad, medida a travs de la precipitacin pluvial, es un factor importante para el desarrollo fngico (Guzmn 1994). Algunos hongos son capaces de crecer en un espectro amplio de pH del cual dependen para tomar caminos alternos de diferenciacin morfolgica (Stewart, 1989). Los cambios de pH podran modificar la biosntesis de la pared celular del hongo, por la alteracin de componentes celulares que podran estar directamente involucrados con el citoesqueleto. Rodrguez Del Valle y cols., demostraron el predominio de estructuras levaduriformes a un pH inicial de 8 y de estructuras miceliales a valores de pH inferiores a 5, por lo que el pH es un parmetro que posiblemente regula la expresin gnica que muy probablemente determina la morfologa celular. Los padecimientos micticos son causados por hongos que normalmente residen en el medio ambiente y que habitan los suelos o la vegetacin de manera saprfita. El hongo dimrfico S. schenckii es el agente etiolgico de la esporotricosis, que es una micosis subcutnea, de evolucin subaguda o crnica, que generalmente se adquiere por inoculacin traumtica con S. schenckii. Ocasionalmente esta micosis puede ser adquirida por inhalacin, en cuyo caso podr desarrollarse a nivel pulmonar. La forma clnica ms frecuente es la linfangtica, la cual inicia en una o dos semanas en el sitio de inoculacin como una ppula que se transforma 2

en un pequeo ndulo mvil y duro. Este ndulo tiende a reblandecerse y ulcerarse, formando un chancro. Finalmente sta lesin tiende a la cicatrizacin. Posteriormente los vasos linfticos se inflaman y aparecen lesiones nodulares ascendentes a lo largo de la va linftica. Algunas lesiones pueden secretar material purulento (Fig. 1). En adultos la localizacin ms comn son las extremidades inferiores, y en nios es ms frecuente en cara.

Figura 1. Chancro esporotricsico localizado en pie La esporotricosis es rara en Europa, frecuente en Asia, frica, Oceana y Amrica. El Salvador, Uruguay, Colombia, Venezuela, Mxico y Brasil presentan alta incidencia, y los que reportan menor frecuencia son: Chile, Argentina, Ecuador y Panam. En nuestro pas, el reporte de casos clnicos es tan frecuente que es la micosis subcutnea que ocupa el primer lugar en incidencia, presentndose en forma espordica en todo el pas o en zonas de endemia bien limitadas y localizadas. Aunque se presenta en toda la Repblica Mexicana, los estados con mayor frecuencia son Guanajuato, Jalisco, Puebla, Michoacn, Oaxaca, Nuevo Len, Guerrero, Hidalgo, Veracruz y el Distrito Federal. S. schenckii generalmente habita en climas templados y hmedos con un promedio de temperatura de 20 a 25 C y humedad relativa superior a 90% (Tabla I). TABLA I. Condiciones favorables para el desarrollo de Sporothrix schenckii.
Temperatura PH Precipitacin pluvial Altitud Clima msnm: metros sobre el nivel del mar 20-27 C < 6.0 (ligeramente cido) 500-1000 mm3/ao 1000-1500 msnm Templado, hmedo, clido tropical

Algunos autores (Lavalle, 1979; rodrguez et al 1983; Rippon 1988) consideran una temperatura ptima para el desarrollo del hongo de 27-29C y humedad relativa del 92-100%; y Mackinnon et al (1969) indican una humedad relativa del 90% y una temperatura de 15 a 20 C. Este hongo habita suelo y plantas, sin embargo aparentemente es ms fcil aislarlo de suelo. S. schenckii vive en musgo, hojas, ramas de plantas espinosas secas o frescas, espinas, paja, pasto, madera, juncos, bugambilias, dalias, zacate, claveles, caf, etc. y suelo asociado a estas plantas. En los campesinos es posible que la enfermedad se inicie por traumatismo, con instrumentos de labranza como azadones, picos, palas, machetes, etc. La transmisin zoontica ha sido descrita, en algunas ocasiones se ha aislado el hongo de animales a partir de pelo, pezuas, dientes, uas, etc. Los animales que ms frecuentemente se han relacionado con la esporotricosis son los roedores: ratas, ratones, ardillas y armadillos; aunque tambin se reportan casos que inician por piquetes de insectos, mordedura de reptiles, etc. En el laboratorio la infeccin puede adquirirse de manera accidental. S. schenckii es un hongo dimrfico que exhibe una fase filamentosa y una fase levaduriforme; ambas fases pueden ser obtenidas en el laboratorio cuando el hongo se cultiva a 25 C y 37C respectivamente (Rippon, 1990). En fase filamentosa el hongo crece rpidamente en agar dextrosa Sabouraud y agar dextrosa Sabouraud con antibiticos (mycosel) a 28o C; las colonias filamentosas del hongo frecuentemente son visibles a partir del tercer da. Al principio son colonias pequeas, blancas, carentes de micelio areo; despus son hmedas, rugosas, membranosas y con el tiempo se presenta micelio areo; el color del hongo vara de blanco, crema a negro, por sectores o en todo el cultivo. (Fig. 3a). La morfologa microscpica de los cultivos se caracteriza por filamentos finos, ramificados, tabicados, hialinos; hifas de 1 a 3 m de dimetro, portadores de conidios pirifirmes, ovoides, triangulares o esfricos (3 a 5 micras), algunos conidios nacen directamente del tallo de la hifa (radulosporas) y otros nacen agrupados de manera simpodial en el pice de un conidiforo (Fig. 3b). Cuando los conidios se desprenden, se hacen ms gruesas, de forma triangular y son agrupaciones de estas a las que le atribuyen la formacin de pigmento de la colonia (melanoide). En algunos medios puede inducirse la formacin de estos conidios triangulares pigmentados de tipo simpodial en agrupacin tpica de flor de durazno o flor de margarita. Cuando Sporothrix schenckii se siembra en medios enriquecidos como agar infusin cerebro corazn (BHI) y/o gelosa sangre y se incuba a 37C, puede estimularse su crecimiento agregndole 5% de CO2, se desarrollan colonias de crecimiento rpido de 3 a 5 das de aspecto grisceo, blandas, cremosas, blanco amarillentas, ligeramente acuminadas, de consistencia suave y cremosa, bastante similares a las colonias bacterianas, (Fig. 4a). Al examen microscpico se observan levaduras alargadas o en gemacin, las levaduras pueden ser: simples, ovoides, esfricas, uni o bigemantes, que miden en promedio de 2 a 4 x 3 a 6 micras. Esta morfologa en las levaduras raramente se observa en los tejidos (Fig. 4b). 4

MATERIALES Y MTODOS Para el aislamiento de S. schenckii a partir de suelo, se tom la muestra con una pequea pala, perfectamente limpia, a partir de la capa superficial de la tierra eliminando la materia orgnica presente; se colect aproximadamente 100 g, se guard en una bolsa de plstico debidamente etiquetada: fecha, nmero, lugar de recoleccin y tipo de planta al que estaba asociado este suelo. Se pes 1 g de suelo y se suspendi en 9 mL de agua estril, se dej reposar y se realizaron las siguientes diluciones 1:10, 1:100, 1:1000; se sembr 0.5 mL de cada dilucin en agar dextrosa Sabouraud (ADS); los cultivos se incubaron por 30 das a 28 C y se revisaron diariamente. De las colonias sugestivas a ser S. schenckii, se realizaron resiembras hasta obtener colonias libres de hongos y/o bacterias contaminantes (Mackinnon, 1969; Espinosa, 2002). Identificacin fenotpica de los aislados: Para estudiar la morfologa macroscpica micelial, los aislados se sembraron en ADS, se incubaron por 7 das a 28o C, y se registraron las caractersticas de las colonias: aspecto, consistencia, pigmentacin de la colonia, crecimiento, bordes. Se realizaron microcultivos observndose y registrndose las caractersticas microscpicas del hongo, como son: forma, tamao y disposicin de los conidos, presencia o ausencia de agregacin micelial. Para observar la morfologa de la fase levaduriforme, se sembr un fragmento de micelio en agar y caldo BHI; se incub por 5 das a 37 o C y al final de este periodo se registraron las caractersticas de las colonias; mediante un examen directo se observ la reversin a levadura. El pH del suelo se midi directamente con un potencimetro, de cada muestra estudiada de cada municipio y se sac un promedio. La determinacin de calcio, hierro y magnesio se realiz por la metodologa de valoracin por E.D.T.A. y Absorcin Atmica. (NOM. AS-32-1998, NOM. AS-201998 SEMARNAP)

Figura 2 Municipio de Huauchinango, Puebla.

RESULTADOS De las 100 muestras de suelo estudiadas del municipio de Huauchinango (Fig. 2) se obtuvieron 3 aislamientos de Sporothrix schenckii: 1 a partir de suelo asociado a una planta silvestre, 1 de suelo asociado a rosal y 1 de suelo asociado a pino (Figs. 3 y 4), (Tabla 2). El pH del suelo oscil en el rango de 5.9 a 7.0 (Tabla 3). 2+ La concentracin promedio de oligoelementos fue de 9.3 Meq/100g para Ca , 3+ 17.2 mg/kg para Fe y 2.1 Meq/100g para Mg2+(Tabla 4). La temperatura promedio fue de 16.4C, mientras la precipitacin pluvial alcanz el valor de 2300 mm3.

Figura 3. S. schenckii. a) Colonias plegadas, de color beige con sectores color caf y b) Conidios ovoides en disposicin simpodial.

Figura 4. Morfologa de Sporothrix schenckii en Fase Levaduriforme. a) Colonia a los 7 das de incubacin a 37C crecida en BHI y b) Levaduras caractersticas formadas en calco BHI.

TABLA 2. Aislamiento de Sporothrix schenckii a partir de suelo. Nmero de Nmero de Suelo asociado Aislamientos Municipio Dilucin muestra a: de Sporothrix schenckii HUAUCHINANGO 13 Pino 1 1:1000 HUAUCHINANGO 33 Rosal 1 1:1000 HUAUCHINANGO 50 Planta 1 1:1000 silvestre Total de muestras 3
Fuente: Laboratorio de micologa mdica CICM-ICUAP.

TABLA 3. Valores de pH de las muestras de suelo de donde aislamientos de Sporothrix schenckii. Nmero de Municipio Tipo de planta muestra asociada al suelo HUAUCHINANGO 13 Pino HUAUCHINANGO 33 Rosal HUAUCHINANGO 50 Planta silvestre
Fuente: Laboratorio de micologa mdica CICM-ICUAP.

se obtuvo PH 5.9 7.0 7.0

Tabla 4 Concentracin de Ca2+, Fe3+ y Mg2+ obtenida de las muestras de suelo de los aislados de Sporothrix schenckii. Ca 2+ Meq/100g Fe3+mq/Kg Mg2+ Meq/100g 9.3 17.2 2.1 DISCUSIN Dentro de la diversidad climtica del estado de Puebla existen regiones que cumplen con las condiciones ambientales de temperatura, humedad y altitud, siendo estas similares a las indicadas por algunos autores (Rippon, 1990), que favorecen el desarrollo de S. schenckii y probablemente el aislamiento del agente etiolgico de la esporotricosis. Aunque no hay reportes de la enfermedad en el municipio estudiado, se sabe que S. schenckii ha sido aislado de este (Espinosa et al. 2002). Sin embargo la presencia del hongo no necesariamente implica la existencia de infeccin ya que es necesario entre otros factores, que las cepas sean patgenas, que el nmero de partculas infectantes sea elevada y que la respuesta inmunolgica del hospedero sea deficiente (Travassos, 1989). Se ha observado que el pH ligeramente cido, el clima templado-hmedo y una altitud de 1000-1500 msnm permiten el crecimiento del hongo dimrfico S. schenckii, (Espinosa, 2002). Los resultados obtenidos en este trabajo confirman que S. schenckii puede ser aislado a pH ligeramente cido, pero tambin a pH 7.0 Espinosa, 2002 reporta que temperaturas de 20-25 oC favorecen el crecimiento de S. schenckii mientras que en este estudio la temperatura promedio fue de 16.4 oC. Esto podra ser una explicacin a la baja frecuencia de aislamientos obtenidos. 7

La mayora de los autores reportan valores de altitud ptimos para el crecimiento de Sporothrix en un rango de 1000 a 1500 msnm. Sin embargo, la altitud promedio de Huauchinango es de 1840 msnm confirmando las afirmaciones hechas por Herrera y Ulloa, cuyo rango de altitud oscila de cero a 4000 msnm.(Herrera y Ulloa, 2004). Respecto a la determinacin de calcio, hierro y magnesio los resultados obtenidos no presentaron diferencia significativa entre el total de las muestras de suelo analizadas. Dado que in vitro se requieren concentraciones mnimas de estos oligoelementos, suponemos que la concentracin detectada de estos fue suficiente para permitir el desarrollo de S. schenckii. En general, las condiciones ambientales de Huauchinango permitieron el desarrollo de Sporothrix schenckii en suelo, sugiriendo que podra ser la fuente de infeccin de los casos de esporotricosis que se presentan en esta regin. AGRADECIMIENTOS Proyecto No 12/G/NAT/05 financiado por la Vicerrectora de Investigacin y Estudios de Posgrado de la Benemrita Universidad Autnoma de Puebla. REFERENCIAS Betancourt S., Torres-Bauza L. J., Rodrguez-del Valle N. 1985. Molecular y cellular events during the yeast to mycelium transition in Sporothrix schenckii. J Med Vet Mycol 23: 207-218. Espinosa Texis A. P. Esporotricosis. Epidemiologa. En: Actualidades en Micologa Mdica. Luis J. Mndez Tovar, Rubn Lpez Martnez y Francisca Hernndez Hernndez editores. UNAM. Mxico. 2002. 177-186. Griffin D.H. Fungal physiology. John Wiley & Sons., Inc New York USA 1981. Guzmn, G. Observaciones sobre la ecologa de los Hongos, en especial de los micromicetos. En: Actualidades en Micologa Mdica. Luis J. Mndez Tovar, Rubn Lpez Martnez y Francisca Hernndez Hernndez editores. UNAM. Mxico. 2002. 69-86. Herrera, T. y M. Ulloa. El Reino de los Hongos. Micologa Bsica y Aplicada. UNAM-FCE. Mxico, D.F. 2004. Howard DH. Nutrition, physiology, and metabolism of zoopathogenic fungi. Growth Jonhn Wiley & Sons. USA 1993 Lavalle P., 1979. Esporotricosis en: Desarrollo y estado actual de la Micologa Mdica en Mxico. Ed. Simpsio sintex. pp. 115-138. Mackinnon J.E., Conti D.J, Gezuele, E, Civila E y Da Luz S. 1969. Isolation of Sporothrix schenckii from nature and considerations on its patogenicity and ecology. Sabouradia 7:38-45. Rippon J.W. Medical Mycology W.B. Sauders Company. Philadelphia. 1988; 325-352 Rodrguez del Valle N., Rosario N., Torres-Blasini. Effects of pH, temperatura, aeration and carbon source on the development of the

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