Revisin de Mtodos espectroscpicos y elaboracin de curva estndar de protena.

Bentez Hernndez Daniela, Casales Velasco Mnica, Robles Enrique, Rodrguez Manzano Anayansi, Senz Roberto Alfredo. Resumen: En esta prctica se realiz la determinacin de protenas por el mtodo de Lowry. Usando tubos de microfuga adicionamos reactivos para tener soluciones a diferentes concentraciones. Utilizando el espectrofotmetro medimos la absorbancia de las soluciones para obtener una curva de calibracin y con ella determinar la concentracin de protenas de nuestra muestra problema. Los reactivos utilizados para preparar las soluciones fueron albmina de suero bovino (BSA), solucin de carbonato-tartratocobre (CTC), dodecilsulfato de sodio 10% (SDS) e hidrxido de sodio 0.8 N (NaOH) y una dilucin del reactivo de Folin-Ciocalteu. Se construy la grfica absorbancia vs. cantidad de protena (g). Con los datos de regresin lineal (R=0.9906) y la alcuota de protena aadida al ensayo, calculamos la concentracin de la protena en las muestras obteniendo 1.078 g/ml y 1.0491g/ml con un 99% de confiabilidad. Introduccin

Cuantificacin de protenas por el mtodo colorimtrico de Lowry. Cuando a un pptido o protena en disolucin bsica se le hace reaccionar con cobre se forma un compuesto colorido por coordinacin entre los nitrgenos del pptido con el ion metlico. En el mtodo de Lowry, el reactivo de FolinCiocalteu (mezcla de fosfomolibdato y fosfotungstato) se aade para incrementar la cantidad de color desarrollado. El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los electrones al complejo fosfomolibdato/fosfotungstato, reaccin que produce una coloracin azul que se lee a 750 nm. Esta reduccin del reactivo de FolinCiocalteu ocurre solamente con los residuos de tirosina y triptfano de la protena.

 La determinacin de protenas con el mtodo de Lowry tiene varias ventajas: es un ensayo 10 a 20 veces ms sensible que la medicin de la absorcin ultravioleta de las protenas (280 nm), es varias veces ms sensible que la deteccin con ninhidrina y 100 veces ms sensible que la reaccin de Biuret. Sin embargo, hay algunas desventajas del mtodo como son que el color vara dependiendo de la protena que se determina y que hay varios reactivos usados en la obtencin de protenas que interfieren con la reaccin. es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia RESULTADOS
TUBO H2O BSA REACTIVO REACTIVO A750nm t e m p e r a t u r I n c u b a r a

1 2 3 4 5 6 7 8 TUBO

450 445 440 435 430 425 420 415 H2O

(1mg/ml) 5 10 15 20 25 30 35 BSA (1mg/ml) 25 50

A 500 500 500 500 500 500 500 500 REACTIVO A 500 500

B 250 250 250 250 250 250 250 250 REACTIVO B 250 250

0 0.061 0.189 0.242 0.270 0.371 0.446 0.276 A750nm

9 10

425 400

0.206 0.387

Cantidad de Protena (g) 26.9633 52.4563

Concentracin de la Protena (g/ml) 1.0784 1.0491

Ejemplo

de

clculo.

DISCUSIN Como se puede observar en la grfica las absorbancias de las muestras problema se encuentran dentro de la curva patrn en la cual se obtuvo una R= 0.9906. La absorbancia del tubo 8 fue descartada al momento de realizar la curva, ya que al momento de graficar, ste punto quedaba fuera de la curva, error que se puede atribuir a un manejo inadecuado de los instrumentos al momento de tomar la muestra y preparar las soluciones, ya

que debido a la falta de material se tuvieron que reutilizar las puntas de las micropipetas (una punta para cada reactivo). Se debe tomar en cuenta que las celdas se reutilizaron para algunas de las muestras, lo cual influye en la lectura de la absorbancia, ya que cabe la posibilidad de que estn contaminadas al no ser correctamente lavadas. Es importante manejar adecuadamente las micropipetas dependiendo de su capacidad volumtrica, para no cometer errores en el experimento y/o descalibrarlas.

Conclusiones:

Gracias al mtodo espectrofotomtrico, al manejo adecuado de micropipetas y a los clculos realizados, sabemos la cantidad de protena (albmina de suero bovino) presente en las disoluciones realizadas. Bibliografa: *Qumica Analtica Cualitativa . Fernando Burriel Marti, Siro Arribas Jimeno. Decimaoctava edicin. Editorial Paraninfo. Pp. 349. Espaa

*Material de apoyo para estudiantes de bioqumica experiemental. Dra. Sobeida Snchez Nieto http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MATERIALAPOYOANTECEDE NTES_22427.pdf