_______________________________________________________________ NORMA RAMAL NRIAL 065: 08

INICIADORES LCTICOS. MTODOS DE ENSAYO

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Esta Norma es Obligatoria 1. Edicin: Ao: 2008

Ministerio de la Industria Alimenticia. Centro Nacional de Inspeccin de la Calidad. Avenida Independencia Km 3. Cerro. Ciudad de la Habana Telfonos: 6411452 6 411731 6 414848 Fax: 6427166 e mail ileana@cnica.cu

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Prefacio
EL Centro Nacional de Inspeccin de la Calidad (CNICA), es el Organismo Ramal de Normalizacin que representa al Ministerio de la Industria Alimenticia ante sus Empresas y la Oficina Nacional de Normalizacin. La elaboracin de las Normas Ramales y otros documentos se realiza generalmente a travs de los Comits Tcnicos de Normalizacin Ramales. Su aprobacin es competencia del Centro Nacional de Inspeccin de la Calidad y se basa en las evidencias del consenso.
Esta Norma Ramal: Ha sido elaborada por el Comit Tcnico de Normalizacin Ramal correspondiente a la Unin Lctea en el que estn representadas las siguientes Instituciones: Ministerio de la Industria Alimenticia MINAL Centro Nacional de Inspeccin de la Calidad CNICA Instituto Nacional de Higiene de los Alimentos INHA Centro Nacional de Higiene de los Alimentos-- CNHA-IMV Instituto de Investigaciones de la Industria Alimenticia IIIA Ministerio de Comercio Interior- MINCIN Unin Lctea y sus Empresas Productoras- MINAL Laboratorio de Cuba Control S A Instituto de Investigaciones en Normalizacin- ININ Oficina Nacional de Normalizacin- ONN

Esta norma sustituye a la NRIAL 085: 1988 Cultivos lcticos. Mtodos de ensayo

NRIAL, 2008
Todos los derechos reservados. A menos que se especifique, ninguna parte de esta publicacin podr ser reproducida o utilizada en alguna forma o por medios electrnicos o mecnicos, incluyendo las fotocopias, fotografas, sin el permiso escrito previo de: Centro Nacional de Inspeccin de la Calidad -CNICA Ave. Independencia Km. 3 Cerro. Ciudad de La Habana. Cuba.

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INICIADORES LCTICOS. MTODOS DE ENSAYO

1. Objeto Esta norma establece los mtodos de ensayo para los cultivos bacterianos iniciadores de productos lcticos fermentados activos liofilizados. 2. Referencias normativas La siguiente norma contiene definiciones que al ser citadas en este texto, constituyen disposiciones de esta norma ramal. Las ediciones indicadas estaban en vigencia en el momento de esta publicacin. Como toda norma est sujeta a revisin, se recomienda a aquellos que realicen acuerdos sobre la base de ella que analicen la conveniencia de usar las ediciones ms recientes de las normas citadas seguidamente. NC/ISO 3696: 2003 Agua para uso en anlisis de laboratorio. Especificaciones y mtodos de ensayo. NC/ISO 6887-1: 2002 Microbiologa de alimentos de consumo humano y animal. Preparacin de la muestra de ensayo, la suspensin inicial y las diluciones decimales para pruebas microbiolgicas. Parte 1- Reglas generales para la preparacin de la suspensin inicial y las diluciones decimales. POE 0.01: 2002 MINAL. UNILAC Sanitizacin de los cuartos de siembra, equipos y medios de trabajo. Banco de cepas IIIA. ISO 7218: 96 Microbiologa de los alimentos y del forraje. Lineamientos generales para los exmenes microbiolgicos. NC/ISO 4833: 2002 Microbiologa de alimentos de consumo humano y animal. Gua general para la enumeracin de microorganismos. Tcnica de placa vertida a 30 C. 3. Definiciones Todas las determinaciones analticas establecidas en esta norma tienen que realizarse por duplicado, excepto la microscopa, y calcularse el promedio de sus resultados, los cuales no han de diferir en ms de lo establecido para cada uno de estos mtodos. Los medios de medicin utilizados tienen que estar verificados y aptos para su uso. Morfologa celular: Conjunto de caracteres que dan informacin acerca de la estructura del microorganismo en cuestin, su tamao y forma. Caractersticas poblacionales: Mayor o menor concentracin celular de la preparacin microscpica. El nmero de cadenas, diplococos o bacilos, permite una idea aproximada de la concentracin y el equilibrio de las especies, de la presencia eventual de organismos extraos al cultivo y de una posible disminucin debido a la presencia de agentes inhibidores. En el caso de los cultivos termfilos, incluye la relacin existente entre los bacilos y los cocos. 2

NRIAL 065:08 Nota: Para la preparacin de soluciones y medios de cultivo y en la manipulacin en la ejecucin de los diferentes mtodos se tendrn en cuenta los requisitos establecidos en: NC/ISO 3696, NC/ISO 6887-1, POE 0.01 y ISO 7218. 4. Determinacin de la viabilidad de los cultivos lcticos liofilizados.

4.1 Objetivos y alcance. Este mtodo se establece para determinar la cantidad de clulas viables despus del proceso de liofilizacin. La tcnica es aplicable a cualquier tipo de cultivo donde se desea conocer la cantidad de clulas viables. 4.2. Fundamento del mtodo: El presente mtodo se fundamenta en la capacidad de las clulas viables para reproducirse en un medio slido que contenga los nutrientes indispensables para su metabolismo. 4.3 Medios de cultivos y reactivos. Agar para conteo total en placas. Vase NC/ISO 4833: 02. Agar de Man. Rogosa y Sharpe (M.R.S.). Composicin Extracto de levadura 4,0 g Dextrosa 20,0 g Tween 80 1 mL Fosfato cido dipotsico 2,0 g Citrato triamonio 2,0 g Sulfato de magnesio. 7 0,2 g H2 0 Sulfato de manganeso. 4 0,05 g H2 0 Acetato de sodio . 3 H20 5,0 g Extracto de carne 8,0 g Agar 10,0 g pH 6,2 Peptona 10,0 g Agar para lactobacilos AOAC como alternativa al agar M.R.S. Composicin Leche pasterizada 15,0 g Extracto de levadura 5,0 g Dextrosa 10,0 g Jugo de tomate (100 mL) 5,0 g Fosfato monobsico de 2,0 g potasio Tween 80 1,0 g

NRIAL 065:08 Agua para dilucin Composicin Peptona Cloruro de sodio Na2 HPO4 . 12 H2 O KH2 PO4 Agua destilada pH 10.0 g 5.0 g 9.0 g 1.5 g 1000 mL 7.0 2

4.4 Aparatos, utensilios y medios de medicin. Placas Petri de 90-100 mm de dimetro. Incubadora regulada a la temperatura ptima del cultivo analizado. Tubos de cultivo de (16 x 150) mm o bulbos de 20 mL de capacidad. Pipetas de 1 mL, graduadas en 0,1 mL, estriles. Contador de colonias. 4.5 Procedimiento. 4.5.1 Preparacin de la porcin de ensayo: El cultivo liofilizado a evaluar se destapa cuidadosamente muy cerca de la llama del mechero a fin de evitar la entrada de aire contaminado y se disuelve aadiendo 9 mL de agua para dilucin estril en el bulbo de cultivo liofilizado; se agita evitando la formacin de espuma, constituyendo la dilucin 10-1 . 4.5.2 Siembra: Se realizan diluciones seriadas del cultivo en agua de dilucin. Se toma 1 mL de las diluciones 10-3 a la 10-8 y se aaden 15 mL de medio de cultivo previamente fundido y mantenido a la temperatura de 43C. Para la evaluacin de los cultivos mesfilos se utiliza agar para conteo total en placas con adicin de 1 % de leche estril (al 10 % de slidos), mientras que para los cultivos termfilos se utiliza el agar MRS, agar AOAC o en su defecto el agar para conteo en placas con adicin de 1 % de leche estril (al 10 % de slidos). Se procede a mezclar la porcin de ensayo con el medio de cultivo mediante movimientos rotatorios suaves durante 5 a 10 s. Se colocan las placas petri sobre una superficie nivelada durante 10 min para permitir la solidificacin del medio. Las placas se incuban a la temperatura ptima del cultivo, se incuban durante 48-72 h. Se utiliza una placa control ambiental y otra de control del medio por cada serie de placas sembradas. Debe prestarse especial atencin a la rotulacin de las placas que identifiquen la dilucin empleada en su inoculacin. 4.5.3 Conteo de colonias. Transcurrido el tiempo de incubacin se cuentan las colonias de cada placa, utilizando un contador de colonias. Se escogen las placas cuyo nmero de colonias oscilan entre 15 y 300. 4

NRIAL 065:08 4.5.4 Expresin de los resultados. Segn NC/ISO 4833: 02 en el acpite 10.1.1 Se reportan los resultados como nmero de bacterias viables por mL de cultivo. 5. Determinacin de la morfologa celular y de las caractersticas poblacionales de los cultivos lcticos activos.( morfologa y relacin) 5.1 Objetivo y alcance. Este mtodo establece un procedimiento para evaluar la morfologa celular, as como las propiedades poblacionales de los cultivos lcticos activos, mediante la observacin microscpica de un frotis coloreado. 5.2 Fundamento del mtodo. Este examen se basa en la propiedad que tienen muchos compuestos coloreados de combinarse con los constituyentes bioqumicos de las clulas muertas, facilitando as su observacin al microscopio. 5.3 Reactivos. 5.3.1. Tincin de Levine y Black Azul de metileno Alcohol (95) 0,6 g 100 mL

Preparacin: Se agita la mezcla y se deja reposar por 24 h en frasco mbar, filtrar y guardar en recipiente hermtico. En este colorante libre de cido y agua se ofrece la ventaja de que el colorante tiene afinidad por la bacteria y no por la casena de la leche, permitindose una ptima observacin. 5.4 Aparatos, utensilios y medios de medicin. Microscopio Lmpara para microscopio (si el microscopio lo requiere). Asa de platino o de nquel-cromo. Mechero de gas o alcohol. Frasco gotero. Portaobjetos 76 x 26 mm Cubeta especial para tinciones. Pinza recta de diseccin o mordaza.

NRIAL 065:08 5.5 Procedimiento. 5.5.1 Preparacin de la porcin de ensayo. Se parte de un cultivo preparado a la temperatura ptima de incubacin y enfriado de 6 a 8C durante 18 a 24 h. No es necesario agitar el cultivo par tomar la muestra. Si se desea conservar el cultivo, la muestra debe ser tomada en el cuarto de siembra, manipulando cerca de la llama y flameando la boca del erlenmeyer que contiene el cultivo. 5.5.2 Determinacin Se esteriliza el alambre del asa, ponindolo verticalmente a la llama del mechero hasta que se ponga rojo en toda su longitud. El asa estril se enfra ponindola en contacto con la pared interna del recipiente que contiene el cultivo. Se toma una pequea gota de la masa interna del cultivo y se deposita en el portaobjeto limpio y seco. Se extiende con el asa hasta obtener una capa delgada de muestra. Se deja secar la extensin y se fija pasndola tres veces a travs de la llama del mechero. Se cubre la extensin con una solucin de azul de metileno (Levine y Black) durante 30 s, se escurre, se lava nuevamente hasta que el agua no arrastre ms colorante y se deja secar. Sobre la preparacin seca se coloca una gota de aceite de inmersin y se observa al microscopio utilizando el objetivo de inmersin. Se observa la forma y el tamao de las clulas, la definicin de sus bordes, la presencia de algunas formas celulares ajenas al cultivo, el grado de adsorcin del colorante y el nivel de poblacin celular. En los cultivos mesfilos: observar que no haya dao celular de la pared, ni aumento de tamao del microorganismo, ni clulas atpicas. En los cultivos termfilos: establecer la relacin entre cocos y bacilos por conteo y promedio de cada tipo de clula en varios campos del microscopio, y controlar los aspectos celulares descritos para los cultivos mesfilos. 5.5.3 Expresin de los resultados. La morfologa celular se reporta como buena, regular o mala, de acuerdo a la aparicin de deformaciones celulares, indefinicin de los bordes u otros daos. Se explicar en cada caso la forma y agrupacin de las bacterias del cultivo, as como la presencia de artefactos o microorganismos ajenos al cultivo.

NRIAL 065:08 Las caractersticas poblacionales se expresarn como: muy poblado, medianamente poblado o poco poblado de acuerdo a la concentracin celular observada. En los cultivos mesfilos se dar una idea aproximada de la relacin entre diplococos y cadenas de cocos, as como de la longitud de estas y la uniformidad del tamao de las clulas. En los cultivos termfilos se reportar el estado celular y la relacin en que se encuentran los cocos y los bacilos en el cultivo. 6. Determinacin del tiempo de coagulacin.

6.1 Objetivos y alcance: Este mtodo establece el procedimiento para evaluar de forma indirecta la actividad de un cultivo lctico activo. 6.2 Fundamento del mtodo: El mtodo se basa en la capaci dad de las bacterias lcticas en ptimas condiciones, de producir cido lctico a partir de la lactosa, provocando la coagulacin de la leche que no contenga inhibidores. 6.3 Aparatos, utensilios y medios de medicin. Pipetas de 1 ml graduadas en 0.1 mL, estriles. Incubadora termorregulable a la temperatura ptima de cada cultivo. 6.4 Procedimiento

6.4.1 Preparacin de la muestra de ensayo: Para este anlisis se parte de la resiembra precedente de un cultivo que cumpla con las especificaciones establecidas para el cultivo de que se trate y que no tenga ms de 48 h de almacenado en refrigeracin. Se toma la muestra de la parte centro interna del cultivo a analizar. 6.4.2 Determinacin. Se inocula 1 mL de cultivo a analizar en un erlenmeyer que contiene 100 mL de leche descremada exenta de inhibidores, esterilizada a 121 (1,1 kgf / cm2 ) por 15 min y refrescada a la temperatura ptima del cultivo. Se agita teniendo cuidado de no formar espuma y de no mojar el tapn del erlenmeyer y se incuba a la temperatura ptima del cultivo hasta que se produzca la coagulacin de la leche. Se determina el tiempo que transcurre desde el inicio de la incubacin hasta la coagulacin. 6.4.3 Expresin de los resultados. Se expresa en horas el tiempo requerido por el cult ivo para producir la coagulacin de la leche. 7

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7.

Determinacin del diacetilo. Mtodo de OMeara.

7.1 Objetivo y alcance: Este mtodo tiene por objeto establecer el procedimiento para evaluar la capacidad aromatizante de los cultivos mesfilos activos. 7.2 Fundamento del mtodo: El mtodo se basa en la medicin del diacetilo ms acetona por la adicin de una solucin fuertemente alcalina mediante la reaccin diacetilo-creatina con el desarrollo de una coloracin rojo-naranja. 7.3 Reactivos Solucin de Hidrxido de sodio o potasio al 40% Creatina p.a. 7.4 Aparatos, utensilios y medios de medicin Tubos de ensayo de 20 x 180 mm Pipetas de 1 mL graduadas en 0,1 mL. 7.5 Procedimiento 7.5.1 Preparacin de la muestra: Para este anlisis se utilizan cultivos de 14 a16 h de incubacin a 22C recin coagulados y enfriados de 4 a 6C, no menos de 3 h. 7.5.2 Determinacin A 1 mL de la muestra se le aade creatina contenida en la punta de una esptula fina y 1 mL de la solucin de hidrxido de sodio o potasio al 40%. Se agita vigorosamente tratando de favorecer la aereacin. Se deja en reposo hasta la aparicin de un anillo rojizo en la superficie en un lapso no mayor de 30 min. 7.5.3 Expresin de los resultados Se expresa mediante cruces el espesor del anillo en la superficie de reaccin en un tiempo de 30 min. Anillo de 1 mm de espesor + Anillo de 2 mm de espesor ++ Anillo de 3 mm de espesor +++ Si no aparece el anillo al cabo de los 30 min la reaccin se reporta como negativa. 8. Determinacin de la acidez 8.1 Objetivo y alcance: Este mtodo tiene como objeto establecer un procedimiento para determinar la acidez producida por los cultivos lcticos activos. 8

NRIAL 065:08 8.2 Fundamento del mtodo: El mtodo se basa en la neutralizacin de las funci ones cidas del producto mediante la adicin de una base en presencia de un indicador cromtico, cuyo cambio de color evidencia el punto final de la reaccin. 8.3 Reactivos Solucin de hidrxido de sodio 0,1 N Solucin alcohlica de fenolftalena al 1 % 8.4 Aparatos y utensilios Balanza tcnica con precisin de 0,1 g Bureta de 25 mL graduada en 0,1 mL Beakers de 100 a 200 mL 8.5 Procedimiento 8.5.1 Preparacin de la muestra de ensayo: Para la realizacin de este ensayo se toma una porcin del cultivo que se va a analizar. Esta porcin de cultivo se homogeniza con agitador de vidrio. 8.5.2 Preparacin de la porcin de ensayo: Se pesan 9 g de la muestra tomada segn 12.5.1. con un error mximo de 0,1 g. Se aaden 9 mL de agua destilada y 3 a 5 gotas de fenolftalena. Se mezcla bien, logrando la disolucin de los grumos de la leche coagulada con la ayuda de un agitador de vidrio. 8.5.3 Determinacin Se valora con la solucin de hidrxido de sodio 0,1 N hasta que el color rosa tenue perdure al menos durante 30 s. 8.6 Expresin de los resultados 8.6.1 Mtodo para los clculos La acidez de la muestra expresada en cido lctico, se obtiene multiplicando los mililitros de la solucin de hidrxido de sodio 0,1 N gastados por el factor 0,1. A= V x 0.1 Si la solucin de hidrxido de sodio no fuera 0,1000 N se aplica la siguiente frmula: A= V. N. 0,09.100 m

NRIAL 065:08 Donde: A: acidez (% de cido lctico) V: Volumen (mL de solucin de hidrxido de sodio consumido) 0,09: Miliequivalente del cido lctico m: masa de la porcin de ensayo (g) 8.6.2 Repetibilidad La repetibilidad de las muestras en paralelo, realizadas por el mismo analista, no ser mayor de 0,1 mL en las valoraciones (0,01 % cido lctico entre dos resultados paralelos). 8.6.3 Aproximacin de los resultados La aproximacin de los resultados se efecta hasta la segunda cifra decimal.

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NRIAL 065:08 BIBLIOGRAFA CONSULTADA ISO/DIS 9232: 2000 Yogurt: Identificacin de las caractersticas de los microorganismos ( Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus salivarius subsp. thermophilus) ISO 7889: 2003 Yogurt. Enumeracin de microorganismos caractersticos. Tcnica de conteo de colonias a 37 C. NRIAL 090: 80 Morfologa y relacin de grmenes Lactobacteriologa. Karl J. Demeter. 1969. OMS. 1971. Normas para el examen de los productos lcteos. Mtodos microbiolgicos y qumicos. Les Levains Lactiques Mesophiles. Une Reney. Le Lait. 50 No. 597 (1980). Les Levains Lactiques Thermophilus. Propectis et comportament en technologie lactiere. Le Lait. IX.487-521 (1980). Lactic acid starters. International Dairy Federation Standard of Identity (IDF) 149. 1991. Bacterias lcticas. Aspectos fundamentales de la tecnologa. H. De Roissant y F. M. Luquet. 1994.

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