Metode de izolare i obinere a culturilor pure

Share

Cultura pur reprezint o biomas de celule rezultate prin reproducere dintr-o singur celul aflat ntr-un mediu nutritiv steril, cu volum limitat. Cultura pur este considerat i colonia care se formeaz ca rezultat al izolrii unei celule sau a unei uniti formatoare de colonii, atunci cnd aceasta este localizat pe un mediu nutritiv solid. Puritatea unei culturi se poate obine i prin repicare, deci prin transfer de celule din eprubeta ce conine cultura pur, n alt vas cu mediu de cultur steril. n practica de laborator se cunosc numeroase metode prin care se poate realiza separarea unei singure celule din microbiota eterogen a mediilor naturale. Metodele cunoscute i practicate n laborator n scopul izolrii culturilor pure pot fi clasificate n metode fizicomecanice i metode biologice.

Metode fizice de izolare i obinere a culturilor pure

Metode prin rspndire se folosesc pe scar larg, fiind uor de executat, avnd ca principiu rspndirea celulelor din medii naturale unde acestea se afl n numr mare, prin diluare n medii lichide sau prin diseminare mecanic pe suprafaa mediilor sterile. Metode scarificate. n placa Petri se repartizeaz un mediu de cultur adecvat, de exemplu MMA/BCA i dup

solidificarea mediului, cu firul metalic se recolteaz celule din mediul natural i se execut trasri pe suprafaa mediului, astfel nct diversele celule rmn distanate ntre ele. Prin termostatare 48-72 ore, din colonia care corespunde microorganismului ce trebuie izolat, se face repicare ntr-o eprubet cu mediu solid nclinat i astfel se obine o cultur pur. Metoda n strii este similar, n schimb drept suprafa de rspndire se folosete mediul nclinat din 2-3 eprubete, prin transferul de celule din mediul natural, prin realizarea de striuri, n mod succesiv. Aceste metode se folosesc i n cazul n care o cultur pur este contaminat cu microorganisme strine n perioada de pstrare a culturii i aceasta trebuie s fie salvat. Metoda cultural Koch este folosit n special pentru izolarea de drojdii. Ca mediu de rspndire se folosete MMA repartizat n 3 eprubete, fluidificat i meninut la 40C. Din mediul natural, de exemplu un must n fermentaie, se recolteaz o ans care se introduce succesiv n cele 3 eprubete, cu agitare, care s asigure desprinderea celulelor. Dup inoculare i uniformizare, coninutul fiecrei eprubete se repartizeaz n cte o plac Petri prin solidificare celulele rmn fixate n gel i prin multiplicare vor forma colonii izolate. n funcie de densitatea celulelor recoltate iniial n placa a 2-a sau a 3-a coloniile sunt suficient de distanate (se prefer o distan de circa 2 cm), pentru a putea face izolarea din colonia adecvat a culturii pure, prin repicare n eprubet cu MMA. Metode prin diluare. n prima etap, din mediul natural se execut diluii decimale n ser fiziologic steril, astfel

nct numrul de celule ntr-o micropictur din ultima diluie s fie redus. Metoda Lindner se folosete pentru izolarea de drojdii fermentative. Din diluia convenabil, cu ajutorul unei penie topografice se plaseaz aprox. 9 picturi pe suprafaa unei lamele sterile. Lamela se amplaseaz cu picturile n jos pe o lam cu excavaie i se studiaz la microscop fiecare pictur. Se noteaz cu un marker conturul picturii n care se afl o singur celul. Se desprinde lamela i cu ajutorul unei benzi sterile de hrtie se absoarbe pictura notat. Odat cu lichidul se adsoarbe i celula de izolat, apoi banda se introduce ntro eprubet cu mult lichid. Celula va da prin reproducere o cultur pur. Dei este meticuloas, metoda propus de Lindner este o metod precis, deoarece se face sub control microscopic. Metoda Naumov este folosit pentru izolarea culturilor pure de mucegaiuri. Dintr-o diluie convenabil se aplic distanat micropicturi peste care se adaug picturi de mediu MMA fluidificat (42C) i dup 3-8 zile se selecteaz din pictura cu o singur colonie cultura pur dorit. O metod simplificat pentru separarea sporilor fungici const n inundarea unei plci cu MMA cu 1-2 cm3 din diluia convenabil. Sporii care au rmas ataai de mediu vor da colonii izolate. n general mucegaiurile nu ridic probleme la izolare deoarece cresc sub form de colonii mari pe diverse alimente i pentru obinerea n cultur pur se face repicarea de spori situai n centrul coloniei.

Metode de izolare cu ajutorul micromanipulatorului. Este o metod precis i se realizeaz cu ajutorul unui aparat prevzut cu tuburi capilare cu care se poate face selecia celulelor dorite din preparate studiate la microscop. Cu ajutorul micromanipulatorului se poate face recoltarea de ascospori din celule ascogene i este folosit n dirijarea proceselor de fuziunea protoplatilor, pentru conjugare etc.

Metode biologice de obinere a culturilor pure

Metodele biologice sunt foarte diverse i se bazeaz pe proprieti fiziologice ale microorganismelor de izolat care s se diferenieze clar de cele ale microorganismelor nsoitoare din acelai biotop. Uneori prin aceste metode se face izolarea unui grup cu caractere taxonomice apropiate i apoi se face izolarea de culturi pure prin tehnici de rspndire sau prin folosirea mediilor selective. O metod biologic clasic este metoda Burri prin care se face separarea microorganismelor n funcie de necesarul de oxigen pentru cretere. Dintr-un mediu natural se face inocularea n BCA termostatat la 42C i dup uniformizare acesta se introduce ntr-un tub de sticl prevzut la un capt cu dop de cauciuc. Prin rcire celulele sunt imobilizate n gel i prin termostatare n funcie de accesul oxigenului din aer, n zona tubului prevzut cu dop de cauciuc se vor dezvolta bacterii anaerobe, intermediar bacterii microaerofile, iar n stratul

de mediu la care aerul a ptruns prin dopul de vat al tubului, bacterii aerobe. Prin metode biologice pot fi selectate bacteriile sporogene din medii naturale pe baza termorezistenei deosebite a endosporilor. De exemplu, Bacillus subtilis se poate izola din infuzie de fn, deoarece endosporii rezist la fierbere, n timp ce alte bacterii sunt distruse i prin germinare trec n forme vegetative i care prin nmulire prin sciziune rmn asociate formnd n 24 ore un voal cutat. Numeroase metode de izolare se bazeaz pe introducerea n medii de cultur a unor substane chimice cu efect inhibitor asupra microorganismelor de care trebuie separat cultura dorit. De exemplu, prin introducerea de 0,02% actidion are loc inhibarea dezvoltrii drojdiilor aflate n amestec cu bacterii. Metoda este folosit pentru izolarea unor bacterii ce pot produce contaminarea drojdiilor folosite sub form de culturi pure n industriile fermentative.

Importana practic a culturilor pure

Izolarea i obinerea culturilor pure , cunoaterea cineticii de cretere prezint o importan practic deosebit n urmtoarele domenii:

Identificarea, selecionarea i mbuntirea proprietilor de biosintez

Culturile pure sunt folosite pentru studiul proprietilor morfologie i fiziologice, n scopul identificrii, caracterizrii i stabilirii domeniului de utilizare a culturii. Sub form de culturi pure microorganismele pot fi supuse unor tratamente fizico-chimice prin care se pot induce modificri genetice la nivelul acizilor nucleici, cu obinerea de culturi mutante, din rndul crora se face din nou selecia tulpinilor performante.

Obinerea culturilor starter n procese fermentative industriale

Pornind de la cultura pur, n biotehnologii alimentare prin cultivarea n medii adecvate se obine cantitatea necesar de inocul/maia folosit drept cultur starter a procesului fermentativ. Inoculul reprezint un mediu nutritiv steril n care s-au nmulit celule aparinnd unei culturi pure, aflat n etapa final a creterii exponeniale. Cantitatea de inocul trebuie astfel calculat nct prin introducerea sa n mediul fermentativ steril, concentraia n celule s asigure declanarea rapid a procesului. n funcie de specificul biotehnologic este obligatorie asigurarea continuitii n transfer pentru aprovizionarea cu inocul activ, la perioada solicitat de producie. Utilizarea culturilor pure n biotehnologii alimentare (la fabricarea berii, alcoolului, vinului, produse lactate acide, panificaie etc.) permite obinerea unor produse cu calitate constant.

Curba de cretere a culturii microbiene

Prin inocularea de celule, aparinnd unei culturi pure, ntr-un mediu nutritiv steril se poate stabili dinamica de cretere prin studiul vitezei de acumulare a biomasei sau prin creterea numrului de celule raportat la unitatea de volum a mediului. n condiiile experimentale, dinamica multiplicrii microorganismelor este bine cunoscut. Procesul evolueaz ntr-o serie de faze succesive.

Fig.3. Curba de multiplicare a microorganismelor 12-faza de repaos (faza lag); 1a-perioada de adaptare; a2-perioada de refacere; 23-faza exponenial; 34-faza staionar;

3b- perioada de spor de cretere negativ; b4-perioada de staionare propriu-zis; 5-faza final de declin. Faza de laten , de cretere zero sau de lag reprezint etapa de timp cnd dup inoculare numrul celulelor rmne neschimbat, sau chiar scade, noile condiii de mediu implic latena induciei acelor enzime necesare pentru adaptarea la mediul nutritiv. Faza de laten apare deci ca o perioad de adaptare la condiiile noi de cultur, n caremicroorganismele viabile din inocul i acumuleaz n celul metabolii i sistemele necesare creterii, n cazul n care aceste componente biochimice le lipseau datorit condiiilor de mediu anterioare inoculrii. n cazul drojdiilor aceast faz poate dura 1-2 ore,durat ce depinde de compoziia mediului i capacitatea de reglare a metabolismului propriu. Faza lag se poate prelungi mult dac inoculul este obinut din culturi vechi sau care s-au pstrat n condiii de refrigerare. n schimb dac la inoculare s-a folosit o cultur viguroas, aflat n faza activ de cretere, n mediul cu o compoziie similar, faza lag este scurt sau poate s fie absent. Faza de multiplicare exponenial sau de cretere logaritmic este caracterizat prin aceea c, dup o scurt perioad (cca. 2 ore) de accelerare a ritmului de cretere, n care multiplicarea se produce cu o vitez progresiv mrit, acest ritm devine constant i caracteristic n anumite condiii de cultur, durata unei generaii fiind minim. Perioada de echilibru poate fi meninut numai att ct nu intervin alterri importante,

pe care creterea le poate provoca n compoziia mediului. De exemplu, numrul de celule de drojdie sau de bacterii i cantitatea de materie vie format crete temporar dup o progresie geometric cu raia 2. Celulele aflate n faza exponenial de multiplicare sunt cele mai potrivite pentru cercetri de genetic i fiziologie. Faza staionar (de maturare) n care numrul celulelor viabile este maxim i rmne constant o perioad de timp. De exemplu, celulele de drojdie nu mai nmuguresc, i mresc volumul i tind spre forma sferic, se rotunjesc. Celulele de microorganisme au n aceast faz caracteristicile morfologice cele mai tipice genului i speciei. Aceast faz poate fi prelungit atunci cnd urmrim pstrarea culturii pure, prin modificarea unor factori care scad viteza de metabolism celular. Faza de declin se caracterizeaz printr-o scdere n progresie geometric n raport cu timpul a numrului de celule vii. Pe msur ce mediul devine mai puin favorabil, celulele vii nu se mai multiplic, dei activitatea lor mai continu un timp dup care mor i intr n autoliz. La sfritul acestei ultime faze se nregistreaz maximum absolut al numrului total de celule formate pe parcursul ntregii evoluii a culturii.

Procedee de conservare a culturilor pure

Sub form de culturi pure sunt pstrate microorganismele aflate n studiu i care prezint proprieti de biosintez remarcabile, culturi ntreinute i

nregistrate n colecii autorizate de microorganisme, denumite micoteci. Dintre tehnicile aplicate pentru conservarea culturilor pure, tehnici bazate pe prelungirea fazei staionare de cretere i evitarea etapei de declin, se cunosc urmtoarele: Repicarea periodic prin transfer de celule din eprubeta cu cultura pur n care mediul nutritiv este epuizat, n eprubeta cu mediu nutritiv steril cu compoziie similar. Intervalul de repicare este dependent de natura culturii, compoziia mediului i temperatura de pstrare. n timp ce bacteriile lactice necesit repicri la intervale de 1-3 sptmni, drojdiile se pot pstra pe MMA 3-6 luni,iar bacteriile sporulate 6-12 luni. Mucegaiurile sunt rezistente la pstrare i chiar dup uscarea mediului, sporii se menin viabili ani de zile. Procedeul de repicare periodic necesit un mare volum de munc, prezint risc de contaminare i este greu de realizat atunci cnd numrul de culturi de ntreinut este mare; Prelungirea intervalului ntre dou repicri prin scderea vitezei de metabolism a celulelor i deci evitarea strii de declin ce poate duce la pierderea culturii se poate realiza prin:

Meninerea culturilor la temperaturi sczute , n condiii de refrigerare sau congelare. Culturile de fungi pstrate la 5C se transfer anual, iar dac pstrarea se face la 16C la interval de 6 luni. Privarea de oxigen. n absena oxigenului din aer,microorganismele aerobe trec n stare latent de via. Pentru drojdii i mucegaiuri, cultura dezvoltat n

mediu solidificat (drept) se acoper cu un strat de ulei de parafin steril. Cnd celulele vii se acoper cu ulei de parafin (sterilizat n prealabil la 170C, 2 ore) procesele metabolice ale fungilor decurg de10 ori mai lent. Reducerea umiditii mediului conduce la trecerea celulelor n stare de anabioz care poate fi meninut timp ndelungat fr a se produce modificri intracelulare, ireversibile. Bacteriile sporogene ale genului Bacillus se pot menine sub form de endospori prin antrenarea culturii n eprubete cu nisip steril i dup evaporarea apei sporii se menin viabili, adsorbii pe nisip, zeci de ani.

Pstrarea culturilor n stare liofilizat.

Este tehnica cea mai utilizat i avantajoas, deoarece prelungete cel mai mult intervalul de conservare a culturilor, fr s produc modificri ale proprietilor lor fiziologice. n cazul mucegaiurilor, o suspensie de spori n lapte degresat se congeleaz rapid la - 25C, apoi are loc uscarea n vacuum timp de trei ore n recipiente de sticl care se nchid ermetic i culturile se pot menine 10 ani. Spori aparinnd genului Aspergillus liofilizai i pstrai astfel la 7C i-au meninut viabilitatea timp de 23 ani. Bacteriile lactice sunt mai sensibile la pstrare comparativ cu fungii.

Colecii de culturi
n lume se cunosc colecii de culturi care n marea lor majoritate cuprind culturi protejate prin brevete; dintre acestea colecia NRRL SUA cunoscut din 1975 cu

acronym ARS cuprinde peste 1000 de tulpini n majoritatea lor de actinomicete i mucegaiuri, CBS Fungus Collection Olanda conine 19300 fungi etc. n cadrul Facultii de tiina i Ingineria Alimentelor, Universitatea Dunrea de Jos din Galai exist o micotec cu acronym MIUG ce include tulpini de drojdii, mucegaiuri, bacterii.

Factori de control ai creterii microorganismelor

Celula microbian avnd o mas redus este puternic influenat de condiiile mediului ambiant i reacioneaz foarte diferit la diferii factori, fie prin adaptare sau n caz contrar, prin dispariie. Astfel creterea microbian este dependent de numeroi factori fizico-chimici i biologici ceea ce a condus n cursul evoluiei la adaptri specifice prin stabilirea de interrelaii ntre microorganisme i mediu. Pentru a nelege modul n care celula microbian reacioneaz la condiiile mediului ambiant, diferii factori au fost mprii n mod arbitrar n trei mari grupe, cu precizarea c, n condiii naturale, bioefectul acestora poate fi cumulativ sau sinergic:

Factori extrinseci sunt factori exogeni, ai mediului natural/industrial: temperatur, umezeal relativ a aerului, concentraia de oxigen, radiaii, factori mecanici, factori chimici etc. Factori intrinseci sunt factori dependeni de natura alimentului care influeneaz creterea i activitatea

culturilor starter dar i natura alterrii specifice a produselor alimentare (compoziia chimic i concentraia n nutrieni, aw, pH, rH, structura anatomic, substane chimice etc.). Factori implicii sunt factori biologici determinai de relaiile ce se pot stabili ntre diferitele grupe de microorganisme care alctuiesc microbiota alimentului respectiv.