Method o Logie

Chapitre 8 :
Mthodes dtudes
PCEM1 - Anne universitaire 2007/2008
Facult de Mdecine de Grenoble (UJ F) - Tous droits rservs.
Professeur J ol LUNARDI
Biochimie et Biologie molculaire
Chapitre 8. Mthodes dtudes
Chapitre 8. Mthodes dtudes
I. Mthodes et outils gnraux dtudes molculaires
II. Hybridation molculaire
III. Clonage dADN
IV. Amplification de lADN
V. Squenage de lADN
VI. Modifier le matriel gntique des cellules eucaryotes
VII. Mthodes dtude de lexpression des gnes
VIII. Bioinformatique
I. Mthodes et outils gnraux
dtudes molculaires
I. Mthodes et outils gnraux dtudes molculaires
1. Extraction et purification du matriel gntique
- matriel prsent dans les virus, les bactries et les cellules
- ARN = ARNm, ARNt, ARNr, ARNsn, ARNsc
- sensibilit aux RNAses
- spcificit tissulaire des ARNm(ADNc)
- quantification par mesure de labsorption 260 nm
- ADN des cellules eucaryotes animales = ADN nuclaire + ADNmit
- source : sang, tissus (biopsies), cultures cellulaires
- chez lhomme (2 x 3 10
9
) x 660 / 6,02 10
23
6-7 10
-12
gramme /cellule
1 ml de sang 5-6 10
6
leucocytes soit 30 10
-6
g dADN
Principales tapes de la purification
des acides nucliques
prlvement biologique
lyse des cellules nucles
dgradation des protines
extraction des acides nucliques
prcipitation de lADN
- lyse par dtergents
- traitement mcanique
- traitement par la protinase K
- solvants organiques
- agents chaotropiques
- fixation par interaction de charges
- alcools
Principales tapes de la purification des acides nucliques
2. Des outils enzymatiques pour
tudier l ADN
Colle
atgctaATC tgat
(endonuclases, DNAses)
(ligases)
(polymrases)
(polymrases, kinases)
(polymrases)
2. Des outils enzymatiques pour tudier l ADN
2.1. Couper
- coupures franches
- coupures cohsives
5 ---GTTAAC---
---CAATTG---5
5 ---GTT AAC---
---CAA TTG---5
Hpa I
5 ---GAATTC---
---CTTAAG---5
Eco RI 5 ---G AATTC---
---CTTAA G---5
a. Enzymes de restriction
- squences spcifiques de reconnaissance ( 4 8 bases, palindromes)
- origine bactrienne : Eco RI = Escherichia coli type R souche I
b. Endonuclases
- DNAse I : - ADN double ou simple brin
- nuclase S1: - ADN simple brin
- RNAse A (ARN), H (hybrides ARN/ADN)
c. Exonuclases : 5 3 ou 3 5
2.2. Copier
activit des polymrases : 5 3
ADN polymrases :
- produit : ADN
- matrice : ADN simple brin + amorce ARN ou ADN
- activit 3 -5 et 5 -3 exonuclases : + / -
- polymrases modifies, thermostables (PCR)
ARN polymrases :
- produit : ARN
- matrice : ADN simple brin
ADN polymrase ARN dpendante (rverse transcriptase) :
- produit : ADN
- matrice : ARN + amorce
2.3. Coller
5 ---AGGTCG-OH Pi- CGTCCA--
---TCCAGC-Pi OH-GCAGGT--5
ligase + ATP
5 ---AGGTCGCGTCCA--
---TCCAGCGCAGGT--5
Les ligases catalysent la formation dune liaison phosphodiester entre un
5 phosphate et un 3-OH de 2 brins adjacents
2.4. Marquer
groupes marqueurs : isotopes (
32
P,
33
P,
35
S), fluorophores, biotinylation ...
marquage aux extrmits
- extrmit 3 -OH : terminal transfrase
- extrmit 5 - Pi : ATP-
32
P & T4-kinase
Pi-GATC-------------------CAGTCA
CTAG-------------------GTCAGT-Pi
5
5
Adnosine-Pi-Pi-Pi*
(ATP) Pi*-Pi-Pi-Adnosine
kinase
kinase
marquage interne par amorage alatoire (randompriming)
5
5
+amorces
+ADN pol
+dNTP
5
5
5
5
3. Sparation de fragments dADN
3. Sparation de fragments dADN
3.1. lectrophorse sur gel (agarose, acrylamide)
distance de migration
taille
(mm)
taille en pb (chelle logarithmique)
200
300
400
tmoins
+
-
dpot
tablette de gel
tmoins
+
-
cathode (-) anode (+)
ADN (-)
(400 pb)
(300 pb)
(200 pb)
(100 pb)
lectrophorse en champ puls
bromure d thidium
(molcule intercalante fluorescente)
UV
visualisation de l ADN
- utilisation de molcules fluorescentes
- coloration chimiques
- autoradiographie
3.2. Electrophorse capillaire
3.3. Chromatographie liquide haute pression (HPLC)
Chromatographie liquide-solide en phase rverse utilisant une forte pression
(cf cours protines )
DHPLC : HPLC en conditions dnaturantes
1. sondes molculaires et hybridation
- sonde : squence d ADN complmentaire de la squence cible
- hybridation : association de 2 squences d acides nucliques sous
forme simple brin sur la base de leur complmentarit
5 caggtagtcatctgattactgacatgg
gtccatcagtagataatgactgtacc 5
5 caggtagggatactgaactgacatgg
gtccatccctatgacttgactgtacc 5
5 tcatctgatt-
5 tcatctgatt-
5 tcatctgatt-
5 tcatctgatt- 5 tcatctgatt-
5 tcatctgatt-
5 tcatctgatt-
95C
5 caggtagtcatctgattactgacatgg
5 tcatctgatt-
- Types de sondes
- sonde gnomique : fragment obtenu par coupure de lADN gnomique
- sonde ADNc : sonde ADN obtenue par transcription rverse
d un ARNmmessager (= squence codante)
- sonde oligonuclotides : ADN (ou ARN) simple brin de 18 50 nuclotides
synthtis chimiquement
- Obtention dun ADNc
?
2. Hybridation sur support : Southern blot (ADN), northern blot (ARN)
III. Le clonage
III. Le clonage
obtenir une population de bactries, de cellules ou dorganismes qui
contiendront le mme matriel gntique
population homogne de cellules identiques (population clonale)
organisme vivant identique un organisme dorigine
III. Le clonage
clonage pour amplifier et conserver une squence dADN
1. prparation de linsert cloner et du vecteur
2. intgration-ligation de l insert dans le vecteur
3. transformation de l hte par le vecteur recombin
4. slection des htes recombinants
les plasmides
1. Vecteurs
origine de rplication
gne de rsistance
un antibiotique
site de clonage
multiple
gne de
slection (lac Z)
cosmides, phages, yac et bac, vecteurs viraux
2. Intgration, transformation et
slection dun vecteur
recombinant
2. Intgration, transformation et slection dun vecteur recombinant
coupure du vecteur et de lADN
intgrer avec le mme enzyme
de restriction
ligation des extrmits libres du
vecteur et de linsert
plasmide recombinant chimre
contenant linsert dADN
plasmide natif
recircularis
2.1. Intgration
2.2. Transformation et slection des bactries htes
milieu nutritif
+ ampicilline
+ Xgal
colonie bleue: vecteur seul colonie blanche: vecteur recombin
chromosome chromosome
insert
bactrie avec plasmide natif recircularis bactrie avec plasmide recombinant
les plasmides sont introduits dans les bactries : la transformation
les bactries ayant intgr un plasmide sont slectionnes grce aux 2 gnes de slection
prsents dans le vecteur (ex choisi : gne de rsistance lampicilline et gne permettant
lexpression de la -galactosidase)
3. Les banques d ADN
3. Les banques d ADN
banque gnomique
- obtenue en intgrant des fragments d ADN gnomique dans des vecteurs.
- reprsente tout le matriel gntique
banque ADNc :
- obtenue en intgrant des fragments d ADNc dans des vecteurs
- ne reprsente que l ADN exprim dans les cellules partie desquelles l ARNm
a t extrait
IV. Amplifier lADN
IV. Amplifier lADN
1. Amplification par clonage
2. Amplification PCR : polymerase
chain reaction
2. Amplification PCR : polymerase chain reaction
(amplification enzymatique en chane par ADN polymrase thermostable)
dNTP
oligonuclotides amorces
ADN amplifier
Taq polymrase
94C
dnaturation
56C
amorage
72C
extension
ncycles
facteur damplification : 2
n
2. Amplification PCR :
polymerase chain reaction
5 --agttacttaatgctgatcgtacgtcgatcg-----gatcgatcgtcgatcgatcgtagctgct--
--tcaatgaattacgactagcatgcagctagc-----ctagctagcagctagctagcatcgacga-- 5
94
ctagctagcatcgacga-- 5
5 --agttacttaatgctga
ctagctagcagctagctagcatcgacga-- 5
5 --agttacttaatgctgatcgtacgtcgatcg
- par PCR temps rel o lamplification est mesure chaque
cycle grce un marqueur fluorescent qui s incorpore dans le
double brin form
- par utilisation dun standard interne
amplification partir dARN : RT-PCR
ARNm ADNc
RT PCR
quantification : dtermination du nombre de copies cibles initiales
x n cycles A = A
0
x (1+E)
n
avec 0 < E < 1
dtermination de E (efficacit)
+
Dtection des remaniements du gne MLH1 impliqus dans le
cancer du colon par QMPSF (Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments)
- extraction de lADN du patient et dun tmoin sain
- amplification PCR simultane des exons 1 9 dune part et 10 19 dautre part avec
marquage fluorescent des exons amplifis par PCR
- sparation et comparaison entre patient ( --- ) et tmoin ( --- ) des fragments amplifis
taille des
fragments
amplifis
200 pb 250 pb
300 pb
exon 1 exon 2 exon 4 exon 8 exon 6 exon 13 exon 9 exon 7 exon 5
MLH1
19 exons
allle normal
allle mut : dltion de lexon 8
V. Squencer lADN
V. Squencer lADN
1. Mthode enzymatique (aux di-doxynuclotides) de Sanger
- matrice ADN
- ADN polymrase
- dNTP & ddNTP (didoxy-NTP)
H
dATP
ddATP
agcatcgtactacgat 5
+ amorce
5 aatgctgatcgatgctatggctagctagctatcgatcgtatcgtatcgtagcatgatgcta
sparation des 2 brins
dATP + 1% ddATP
dCTP + 1% ddCTP
dGTP + 1% ddGTP
dTTP + 1% ddTTP
+ ADN polymrase
+
tagcatcgtactacgat 5
tagcatcgtactacgat 5
sparation par lectrophorse
des fragments gnrs lors de
la raction de squenage
c
a
t
a
g
c
a
t
5
lumire
dtecteur de
fluorescence
visualisation des fragments
portant un ddNTP fluorescent
lectrophorgramme de squence
atagcatcgtactacgat 5
atagcatcgtactacgat 5
catagcatcgtactacgat 5
catagcatcgtactacgat 5
gcatagcatcgtactacgat 5
gcatagcatcgtactacgat 5
2. Mthode chimique de Maxam et Gilbert
3. Squenage par hybridation : puces de re-squenage
4. Pyro-squenage
VI. Modifier le matriel gntique
des cellules eucaryotes
VI. Modifier le matriel gntique des cellules eucaryotes
2. Transfert ex vivo et in vivo de matriel gntique
transfection, vecteurs de transfection , marqueurs de slection
(gnes de rsistance aux antibiotiques, thymidine kinase,
dihydrofolate rductase)
1. Mutagnse
injection
virus
transformation
biolistique
transgne
Modification des cellules germinales ou des cellules somatiques
modification de
toutes les cellules
de l organisme
modification dune cellule
ou dun clone cellulaire
modification dune
partie des cellules
de lorganisme y
compris au niveau
des gonades
(animal chimre)
VII. Mthodes dtude de
lexpression des gnes
VII. Mthodes dtude de lexpression des gnes
2. Analyse dynamique de la transcription
longation in vitro (aprs isolement des noyaux) et en prsence dUTP
32
P
de la transcription initie in vivo
- la quantit dUTP incorpore = (f) vitesse de transcription
(f) ARN pol fonctionnelles
1. Analyse qualitative et quantitative des transcrits
northern blot : - taille du transcrit
- intermdiaires de maturation
- estimation semi-quantitative
RT-PCR : quantification
3. Analyse des lments de
rgulation de la transcription
traitement par la DNAse
et lectrophorse
analyse par lectrophorse
des complexes ADN/protines
3. Analyse des lments de rgulation de la transcription
3.1. analyse de linteraction entre facteurs protiques trans et squences ADN cis
+
facteurs de
transcription
squence dADN
foot-printing
retardement sur gel
zone dinteraction
fragments d ADN contenant
des squences rgulatrices potentielles
intgration de la construction dans un vecteur, transfection cellulaire et
mesure de lexpression du gne reporter dans la cellule modifie
expression du gne = (f) protine = (f) ARNm) = (f) rle de la squence teste
3.2. Caractrisation de squences rgulatrices
5
5
promoteur
squences rgulatrices ?
gne dintrt
insertion de ces squences devant le promoteur dun gne reporter
gne reporter dont lactivit
est facilement mesurable
promoteur du gne reporter
fragment dADN tester
4. Mthodes d analyse globale
post gnomique
4. Mthodes d analyse globale post gnomique
analyse du transcriptome
analyse du protome
analyse du mtabolome
analyses simultanes du produit
(ARN, protine, activit) de
lexpression dune grande
population de gnes
post gnomique
4.1. Analyse du transcriptome
squences dADN sonde
dpt des sondes correspondant
des milliers de gnes diffrents
chantillon 1
chantillon 2
- Prparation des ARNm
des cellules 1 et 2
- Marquage des ARN
avec 2 fluorophores
hybridation des sondes
et des ARNm
analyse informatise
et quantification des signaux
gne uniquement exprim dans
chantillon 1 (rouge)
gne uniquement exprim
dans chantillon 2 (vert)
gne exprim
dans chantillon 1 & 2
post gnomique
4.2. Analyse du protome
lyse et extraction
protines
lectrophorse 2D
charge
taille
Analyse de la protine
- spectromtrie de masse
- immuno-dtection
- squenage
5. Analyse du rle dun gne
4.2. - utilisation dARN anti-sens et dARN interfrents
- hybride ARNmnormal / ARN anti-sens : traduction
- hybride ARNmnormal / ARNsi : dgradation des ARNm= traduction
4.1. expression / surexpression
Complexe RISC
(Dicer)
Complexe RISC
Principe des ARN interfrents (ARNsi)
4.2. - utilisation dARN anti-sens et dARN interfrents
- hybride ARNmnormal / ARN anti-sens : traduction
- hybride ARNmnormal / ARNsi : dgradation des ARNm= traduction
4.1. expression / surexpression
4.3. invalidation gnique (KO, K-In)
- remplacement du gne cibl par recombinaison homologue dans une cellule
souche embryonnaire par :
- un gne inactiv (KO constitutif, KO conditionnel)
- un gne modifi (KIn)
- animaux chimriques et slection des homozygotes par croisement
souris grise
gne mut
gne sain
blastocyste
a/a; MM
injection de cellules ES
transfectes dans le
blastocyste de lautre
type de souris
4
embryon a/a; MM +A/A; M/m
prparation dun vecteur
contenant le gne dintrt inactiv
gne
normal
M
gne
inactiv
m
1
cellules ES
souris brune
A/A; MM
2
transfection et
slection
de cellules ES
contenant le gne
dintrt inactiv
3
embryon chimre
5
rimplantation
souriceau chimre form
de cellules provenant des
deux souches de souris
6
X. Bioinformatique
X. Bioinformatique
- clonage in silico
- analyse et traitement des squences
- annotation des gnomes
- analyse gntique (lod scores, haplotypage)
- banques de donnes
- squences dADN, ARN, protines
- http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/
- http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/
- http://us.expasy.org/sprot
- gntiques :
- OMIM maladies gntiques: http://www.ncbi.nih.gov/Omim/
- HMDB mutations, http://www.uwcm.ac.uk
- info-biogne : http://www.infobiogen.fr
- ...
- bibliographiques : http://www.ncbi.nih.gov/PubMed/
a
: les exemples numriques et de pathologies sont destins illustrer le cours et permettre une
meilleure intgration des connaissances
- connatre le principe de lextraction de lADN
- savoir pourquoi la nature des prlvements ncessaires ltude peut varier selon que
lon analyse lADN ou lARNm
- savoir dfinir les termes denzyme de restriction, de palindrome, dendonuclase, dexonuclase
- savoir dfinir les diffrents types de polymrases
- savoir quel types de donnes peut on obtenir par llectrophorse des fragments dADN
- connatre le principe de lhybridation et les diffrents types de sondes utilisables
- connatre le principe du clonage laide dun vecteur plasmidique , savoir dfinir ce quest
un banque gnomique, un banque dADNc
- connatre le principe de la PCR et savoir dessiner les 2 amorces ncessaires une
raction de PCR, savoir dfinir ce quest lefficacit dun raction PCR
- connatre le principe de la raction de squenage aux didoxynuclotides
- connatre les principales mthodes danalyse de lARN et des interactions entre ADN et facteurs
de rgulation
- connatre les mthodes danalyse du rle dun gne,
Que faut il retenir
a
:
Mentions lgales
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et la proprit intellectuelle. Tous les droits de reproduction de tout ou partie sont rservs pour les
textes ainsi que pour l'ensemble des documents iconographiques, photographiques, vidos et
sonores.
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public (sous quelque forme ou support que ce soit), mise en rseau, partielles ou totales, sont
strictement rserves luniversit J oseph Fourier de Grenoble.
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de mdecine de lUniversit J oseph Fourier de Grenoble, et non destine une utilisation
collective, gratuite ou payante.
www.medatice-grenoble.fr
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de Mdecine de Grenoble (Universit J oseph Fourier Grenoble 1)
en collaboration avec le Service Commun Audio-Visuel (SCAV) de lUniversit
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