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Juan Francisco Snchez R., Mara Elena Tejeda R., Wolfhard Koch, Jos Luis Alfredo Mora G., Rubn Marroqun S., Vicente Hernndez A., Valentn Islas P., Elizabeth Guadalupe Snchez G., Alfredo De Len V. Validacin de mtodos analticos no cuantitativos Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, vol. 41, nm. 2, abril-junio, 2010, pp. 15-24, Asociacin Farmacutica Mexicana, A.C. Mxico
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=57914151003

Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, ISSN (Versin impresa): 1870-0195 rmcf@afmac.org.mx Asociacin Farmacutica Mexicana, A.C. Mxico

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Revisin Bibliogrca

Validacin de mtodos analticos no cuantitativos

Validation of nonquantitative analytical methods
Juan Francisco Snchez R.1, Mara Elena Tejeda R.1, Wolfhard Koch1, Jos Luis Alfredo Mora G.3, Rubn Marroqun S.4, Vicente Hernndez A.3, Valentn Islas P.2, Elizabeth Guadalupe Snchez G.3, Alfredo De Len V.5 de Qumica Computacional FES Zaragoza UNAM de Farmacologa FES Zaragoza UNAM 3Laboratorio de Investigacin Farmacutica FES Zaragoza UNAM 4Laboratorio de Inmunologa FES Zaragoza UNAM 5Carrera de Psicologa FES Zaragoza UNAM
2Laboratorio 1Laboratorio

Resumen En las ciencias farmacuticas es bien conocida la metodologa para validar mtodos analticos cuantitativos, sin embargo no es muy abundante la informacin sobre la metodologa a seguir para validar un mtodo analtico cualitativo o no cuantitativo. En este artculo se describen los aspectos importantes sobre los mtodos de anlisis cualitativos, se denen los principales parmetros de calidad y se describe una metodologa de trabajo, soportada matemticamente, para validar un mtodo analtico no cuantitativo. Abstract In pharmaceutical sciences the methodology to validate quantitative analytical methods is well-known, however the information to validate a qualitative analytical method is not abundant. This paper describes the methods of qualitative analyses; the main parameters of quality and a methodology to validate an analytical method nonquantitative are described. Palabras clave: validacin de mtodos analticos no cuantitativos, Validacin, Metodologa estadstica para validacin. Correspondencia M en C Juan Francisco Snchez Ruiz Laboratorio de Qumica Computacional FES Zaragoza UNAM Av. Guelatao 66 Col. Ejrcito de Oriente CP 09230 Mxico D.F. Tel. 5757 4555 e-mail: jforbital@yahoo.com.mx Keywords: validation of qualitative analytical methods, Validation, Statistical methodology for validation.

Fecha de recepcin: 26 de enero de 2010 Fecha de recepcin de modificaciones: 5 de abril de 2010 Fecha de aceptacin: 14 de abril de 2010

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Volumen 41 Nmero 2 Abril - Junio 2010

Introduccin
La mayora de los mtodos analticos no cuantitativos identifican la presencia o ausencia de un determinado sustrato, el cual puede ser un metabolito, una propiedad o una sustancia que es de inters para el diagnstico qumico, mdico, clnico, psicolgico, judicial, administrativo, etc. El sustrato puede (o no) ser extrado cuantitativamente de una muestra, de una determinada matriz (un tejido, un fluido, un medicamento, un instrumento de evaluacin etc.)1 Los mtodos analticos no cuantitativos tienen como fundamento una reaccin o interaccin conocida de cualquier tipo (qumica, fsica, fisicoqumica, etc.) del reactivo o reactivos con el sustrato, generando una respuesta detectable mediante algn sistema fsico, qumico, fisicoqumico, ptico, sensorial, etc. (respuesta analtica)1,2. Un reactivo es algn tipo de agente (sustancia, instrumento de evaluacin etc), que genera en un determinado sustrato una respuesta analtica conocida, detectable y medible no necesariamente de manera cuantitativa3. Es importante mencionar que el resultado de prueba est en funcin no slo de la selectividad de la reaccin o interaccin del reactivo o reactivos con el sustrato, sino que tambin depende de3,4: La presencia o ausencia fsica del sustrato a determinar. El nivel al que se interese identificarlo. El lmite mnimo de deteccin. Los valores mximos permitidos, que en muchos casos corresponden a valores determinados por la legislacin vigente. En la mayora de los mtodos analticos no cuantitativos la respuesta analtica es dicotmica y como respuesta analtica se tiene1,2: Resultado Positivo. Ocurre cuando se considera que est presente en la matriz de estudio una cantidad mnima detectable del sustrato de inters y por ello ha ocurrido una respuesta analtica. Resultado Negativo. Ocurre cuando se considera que no est presente en la matriz de estudio el sustrato de inters o se encuentra en una cantidad inferior a la mnima detectable y por ello no ha ocurrido una respuesta analtica. De manera general, la validacin de un mtodo analtico presenta dos etapas bien definidas, las cuales son complementarias e indisolubles: a) La ejecucin analtica, la cual considera protocolos especficos de realizacin, mismos que son indispensables para recopilar los datos generados por el proceso de medicin y

b) La elaboracin de clculos matemticos efectuados con los datos de la ejecucin analtica y que derivan en resultados que dan soporte y confirman mediante el suministro de evidencia objetiva, que el mtodo analtico cumple los requisitos para el uso o aplicacin especfica prevista. En este trabajo se hace una propuesta metodolgica, sustentada en bases conceptuales matemticas, que permite llegar a conclusiones cientficamente vlidas requeridas para validar un mtodo analtico no cuantitativo, sin que se vean afectados estos resultados por el protocolo especfico requerido para la ejecucin analtica.

Mtodos
Los mtodos analticos no cuantitativos son finalmente mtodos dicotmicos de diagnstico y la respuesta analtica es dicotmica. En este trabajo, la metodologa para probar Homogeneidad o Selectividad del mtodo analtico es la descrita como Integracin de Tablas de Contingencia. Bajo las Hiptesis de existencia de Homogeneidad 5,6,7,8 o Selectividad del mtodo analtico, las diferencias encontradas entre las frecuencias ob ser vadas y las esperadas son debidas exclusivamente a la variacin muestral, es decir son eventos ocasionados por el proceso de muestreo y no a otra condicin que implique diferencia de comportamiento, por ello se us como estadstica de prueba la Xi2:
Xi2=

(Oij Eij) Eij i=1 j=1

Con (r-1) (c-1) grados de libertad. Para determinar la Sensibilidad, Especificidad, Valor Predictivo y Confiabilidad Diagnstica, se sigue la metodologa estadstica no paramtrica, especficamente la estadstica bayesiana1,5,6,7,8, ya que permite calcular probabilidades condicionales determinando la probabilidad de ocurrencia de algn evento y se fundamenta en la regla de multiplicacin para las probabilidades cuando los eventos no son independientes:
P(Ei A) = P(A)P(Ei A) P(Ei A) = P(Ei)P(A Ei)

Entonces:

P(Ei A) = P(A)P(Ei A) = P(Ei)P(A Ei) P(A)P(Ei A) = P(Ei)P(A Ei) P(Ei A) = P(Ei)P(A Ei) P(A)

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El mtodo usado para determinar la Regla de Decisin, necesaria para definir si un parmetro es estadsticamente significativo, fue el de los Fundamentos Probabilsticos de la Teora del Contras te de las Hiptesis Estadsticas desarrollada por Karl Pearson y Von Neymann5,6,7,8, el cual consiste en definir la regin de rechazo de resultados donde la probabilidad de que estos se presenten bajo la suposicin de que la hiptesis nula es verdadera, es muy remota. En todos los casos la probabilidad de cometer Error Tipo I se llama Nivel de Significan cia o Alfa, mien tras que Beta es la probabilidad de cometer Error Tipo II. La confianza es tadstica consiste en definir el nivel de significancia deseado para rechazar o no una hip tesis estadstica 5,6,7,8. Como los dos tipos de errores no son complementarios y no es posible minimizar ambos, se controla con un nivel de significancia pequeo (5%) la probabilidad de cometer Error tipo I. En todos los casos se considera el 95% de confianza estadstica como lmite para la regla de decisin.

las especificaciones establecidas en los manuales de operacin. Por lo anterior, dependiendo del tipo de instrumento a utilizar, se verificarn los diferentes componentes del mismo, la adecuada disposicin, manipulacin y almacenamiento de sustratos y reactivos, la fecha de caducidad, la ausencia o presencia de contaminacin en los mismos deben ser verificadas9.

II. Selectividad o independencia estadstica El concepto de Selectividad ha sido objeto de una redefinicin por parte de la IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry). La Selectividad tiene una importancia particular como parmetro de calidad de un mtodo analtico y, por lo tanto, tambin debe validarse1,9,10.
La IUPAC, en sus ltimas recomendaciones [IUPAC 2001]8 ha definido la Selectividad como la extensin en la que un mtodo puede utilizarse para determinar analitos particulares en mezclas o matrices sin interferencias de otros componentes con un comportamiento similar 10. Por lo tanto, la Selectividad debe indicar hasta qu punto otras interferencias presentes en la muestra afectan de manera evidente el resultado del mtodo analtico9,10. En un mtodo analtico, la Selectividad se evala aplicando la prueba al mismo nmero de mues tras o testigos verdaderos positivos y de testigos verdaderos negativos, investigando el comportamiento del mtodo analtico en 2 poblaciones diferentes: los testigos positivos verdaderos y en los testigos negativos ver daderos5,6,10. Es posible evaluar la Selectividad de un mtodo analtico mediante la estimacin de la Homogeneidad de poblaciones, es decir, conocer si existe un comportamiento semejante de la caracterstica de inters en las poblaciones estudiadas. Se denotan las poblaciones de estudio como: B1 B2 B3 B4......Bc En cada una de ellas nos interesa conocer el comportamiento de una caracterstica A dividida en r cate goras, entonces, nos encontramos ante la necesidad de agrupar correctamente en una matriz las ob servaciones derivadas de las poblaciones de estudio, por tanto podemos construir una tabla de contingencia que contemple las poblaciones con el criterio de clasificacin dado por la variable de inters7 (Tabla 1): Donde B1, B2, B3.......Bc son las Poblaciones de estudio A1, A 2, A 3.......A r corresponden a los criterios de clasificacin de la variable de inters

Resultados y discusin
Para validar un mtodo analtico no cuantitativo es necesario compararlo contra una caracterstica de referencia exacta. El procedimiento consiste en aplicar la prueba de diagnstico en el mismo nmero de muestras o testigos verdaderos positivos que presenten la caracterstica a estudiar y en testigos verdaderos negativos ausentes de la caracterstica. Una condicin bsica de origen es que la caracterstica que detecte el mtodo analtico sea evaluada de manera positiva o negativa de manera inequvoca me d iante otra prueba de referencia, por evidencias clnicas, fsicas o qumicas1,2,3,4. Para validar un mtodo analtico no cuantitativo se deben evaluar los siguientes parmetros: I. Adecuabilidad II. Homogeneidad o Selectividad III. Sensibilidad IV. Especificidad V. Valor Predictivo VI. Confiabilidad Diagnstica VII. Lmite de Deteccin

I. Adecuabilidad El correcto funcionamiento de cualquier mtodo analtico depender en gran medida de que dicho mtodo se comporte correctamente. Por lo tanto la Adecuabilidad del Mtodo Analtico9 debe ser el primer paso a seguir en la validacin de un mtodo analtico no cuantitativo.
La Adecuabilidad del Mtodo Analtico consiste en corroborar que los componentes y reactivos involucrados en la obtencin de datos funcionen apropiadamente, es decir, los reactivos o partes del equipo que puedan afectar la determinacin, cubran

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Tabla 1. Poblaciones Estudiadas
A1 P11 B1 P12 P32 . . . . . B2 P13 B3

A2 A3 . . . . .

P21 P31 . . . . .

P22

P23 P33 . . . . .

P2c P3c . . . . .

P1c

Bc

Oi =

j=1

Oij

Oj=

i=1

Oij
c

O = el nmero total de individuos N. O=

i=1

j= 1

Oij =

i=1

Oj Oi = j= 1

Ar

Pr1

Pr2

Pr3

Prc

Oij = el nmero de individuos de la muestra con la i-sima categora de A y la j-sima de B. En este caso hay que recalcar que los valores O.j estn fijos de antemano y representan el tamao de muestra de cada poblacin. Por tanto la Hiptesis de Homogeneidad matemticamente converge en una estadstica de prueba 5,6,7,8: Xi2=

Sea Pij la proporcin de individuos de la jsima poblacin que presentan la i-sima categora de la varia ble A. Luego entonces Pij puede ser visto como la probabilidad de clasificar a un individuo extrado de la j-sima poblacin en la i-sima ca tegora de la variable A, ya que5,6,7,8:
i=1

Pij = 1 j= 1

i=1 j=1

(Oij Eij)2 Eij

Como el nmero de elementos de las poblaciones estudiadas est fijo de antemano, los subtotales por columna de la tabla anterior representan los individuos de la poblacin que se muestrearon y fueron causa de estudio. En este caso la Hiptesis de inters es llamada Hiptesis de Homogeneidad. Si el compor ta mien to de la variable A es igual en cada una de las poblaciones consideradas, esto se traduce en: P 11 = P 12 = P 13 = P 14 = ... = P 1c P 21 = P 22 = P 23 = P 24 = ... = P 2c P 31 = P 32 = P 33 = P 34 = ... = P 3c Pr1 = Pr 2 = Pr 3 = Pr4 = ... = Prc Si eij representa el nmero esperado de individuos de la j-sima poblacin en la i-sima categora de A, bajo la Hiptesis de Homogeneidad queda como5,6,7,8: eij = (Pi ) (O j ) Y se estima como: Eij = (Oi ) (O j) O

La cual se distribuye como una Xi2 con (r-1)(c-1) grados de libertad y con niveles conocidos de confianza estadstica. Ba jo la Hiptesis de Homogeneidad, las diferencias encontradas entre las frecuencias observadas y las esperadas son debidas exclusivamente a la variacin muestral, es decir son eventos ocasionados por el proceso de muestreo y no a otra condicin que implique diferencia de comportamiento o correlacin, segn el caso. Es de esperarse que si el mtodo analtico tiene un adecuado comportamiento, las diferencias entre las frecuencias observadas y las esperadas deban ser grandes ya que los resultados en los testigos positivos verdaderos deben ser diferentes a los encontrados en los testigos negativos verdaderos. Por lo tanto se espera que para un nivel determinado de confianza estadstica 5,6,7,8 (95%): Xi2calculada > Xi2 de tablas En este caso podemos asegurar que bajo las condiciones de trabajo realizadas, el mtodo analtico tiene una Selectividad tal que su respuesta analtica permite diferenciar de manera estadsticamente significativa los testigos positivos verdaderos de los testigos negativos verdaderos. En caso contrario, si: Xi2calculada Xi2 de tablas Es posible concluir que para el nivel de confianza que se ha seleccionado (95%), el mtodo ana ltico carece de Selectividad

Si Oij es el nmero de individuos de todas las poblaciones estudiadas que cayeron en la i-sima catego ra de A, entonces:

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ya que su respuesta analtica NO permite diferenciar de manera estadsticamente significativa los testigos positivos verdaderos de los testigos negativos ver daderos. Procedimiento para determinar la Selectividad de un Mtodo Analtico: a) Tabular los datos de la siguiente manera (E) Nmero de ensayos realizados con testigos positivos verdaderos _____________ (A) Nmero de ensayos Positivos con testigos positivos verdaderos ______________ (C) Nmero de ensayos Negativos con testigos positivos verdaderos _____________ (F) Nmero de ensayos realizados con testigos negativos verdaderos _____________ (B) Nmero de ensayos Positivos con testigos negativos verdaderos ______________ (D) Nmero de ensayos Negativos con testigos negativos verdaderos _____________ b) Con los datos anteriores, colocarlos en las casillas de la Tabla 2 de acuerdo con el orden especificado
Valor de la Caracterstica Presente A Ausente B

e) Calcular los siguientes ndices = (A*)2 A esperado (C*)2 Cesperado = (B*)2 Besperado (D*)2 Desperado

f) Determinar la 2 calculada: 2 calculada = + + + g) Buscar el valor de 2 de Tablas al 95% de confianza con 1 grado de libertad (r=1, c=1) 2 (r 1) (c 1) = 0.95

h) Regla de decisin Si Xi2 calculada > Xi2 de tablas se concluye que bajo las condiciones de trabajo realizadas, el mtodo analtico tiene una Selectividad tal que su respuesta analtica permite diferenciar de manera estadsticamente significativa los testigos positivos verdaderos de los testigos negativos verdaderos. De lo contrario Si Xi2calculada Xi2 de tablas Es posible concluir que para el nivel de confianza que se ha seleccionado (95%), el mtodo analtico carece de Selectividad ya que su respuesta analtica NO permite dife renciar de manera estadsticamente significativa los testigos positivos verdaderos de los testigos negativos ver daderos.

Tabla 2

Resultado de la Prueba Positivo Negativo

E=A+C

F=B+D

I = A+B+C+D

H=C+D

G=A+B

c) Calcular los siguientes valores A esperado= Cesperado= ExG I ExH I Besperado= Desperado= FxG I FxH I

III. Sensibilidad y especicidad No es posible afirmar que un mtodo analtico no cuantitativo sea bueno slo porque pueda di f e r enciar las poblaciones de testigos positivos verdaderos y de los testigos negativos verdaderos, es decir que tenga una adecuada Selectividad. Para que un mtodo analtico no cuantitativo se consi dere validado es necesario adems, que genere de manera correcta respuestas analticas positivas y respuestas analticas negativas. Por lo tanto la Sensibilidad y la Especificidad son dos caractersticas importantes para validar en mtodo analtico.
Para una adecuada comprensin del fenmeno se debe construir una tabla de contingencia como se aprecia en la Tabla 3. A = Verdaderos Positivos B = Falsos Positivos C = Falsos Negativos D = Verdaderos Negativos

d) Realizar las siguientes operaciones A A esperado =___________ B B esperado =___________ C C esperado =___________ D D esperado =___________ = A* = B* = C* = D*

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Tabla 3

Resultado de la Prueba Negativo Positivo

Valor de la Caracterstica Presente A Ausente B

VPP=

A A+B

A+C

B+D

A+B+C+D

C+D

A+B

La Sensibilidad 5,6 es la probabilidad de que la respuesta analtica (y por ende la prueba) resulte positiva cuando en la muestra estudiada est realmente presente el sustrato de inters diagnstico en los lmites de deteccin o por arriba de ellos: Sensibilidad= A A+C

En trminos de individuos y enfermedades5,6 el Valor Predictivo Positivo es la probabilidad de estar enfermo o tener una propiedad de inters, si se obtiene un resultado positivo en la prueba. El Valor Predictivo Positivo representa la proporcin de pacientes o personas con un resultado positivo en la prueba que resultaron estar enfermos. Para que el Valor Predictivo Positivo de un mtodo analtico sea estadsticamente vlido se debe cumplir la siguiente regla de decisin5,6,8: Si VPP < 0.95 el mtodo analtico no tiene buen Valor Predictivo Positivo. Si VPP 0.95 el mtodo analtico tiene buen Valor Predictivo Positivo.

La Especicidad 5,6 es la probabilidad de que la respuesta analtica (y por ende la prueba) resulte negativa debido a que en la muestra estudiada NO existe fsicamente el sustrato o sustancia de inters diagnstico o se encuentra por debajo de los lmites de deteccin: Especicidad= D D+B

V. Valor predictivo negativo de un mtodo analtico Es la probabilidad de que el sustrato de inters diagnstico est fsicamente ausente o en cantidad inferior a la mnima detectable cuando la prueba result negativa 5,6 . El Valor Predictivo Negativo puede estimarse como5,6:
VPN= D C+D

En trminos de individuos y enfermedades5,6 la Sensibilidad es la probabilidad de identificar a los enfermos o a los individuos que tienen la caracterstica de inters y se estima como la probabilidad de que la prueba resulte Positiva cuando el individuo realmente est enfermo o tiene la caracterstica de inters. La Especificidad 5,6 es la probabilidad de identificar a las personas sanas y se estima como la probabilidad de que la prueba resulte negativa cuando el individuo est realmente sano. Para que la Sensibilidad y la Especificidad de un mtodo analtico sean estadsticamente vlidas se debe cumplir la siguiente regla de decisin5,6,8: Si la Sensibilidad < 0.95 el mtodo analtico no tiene buena Sensibilidad. Si la Sensibilidad 0.95 el mtodo analtico tiene buena Sensibilidad. Si la Especificidad < 0.95 el mtodo analtico no tiene buena Especificidad. Si la Especificidad 0.95 el mtodo analtico tiene buena Especificidad.

En trminos de individuos y enfermedades5,6 el Valor Predictivo Negativo es la probabilidad de que un sujeto con un resultado negativo en la prueba est realmente sano y representa el nmero de verdaderos negativos del total de pacientes con un resultado negativo en la prueba. Si VPN < 0.95 el mtodo analtico no tiene buen Valor Predictivo Negativo. Si VPN 0.95 el mtodo analtico tiene buen Valor Predictivo Negativo.

IV. Valor predictivo positivo de un mtodo analtico Es la probabilidad de que el sustrato de inters diagnstico est fsicamente presente o en la cantidad mnima detectable cuando la prueba result positiva 5,6. El Valor Predictivo Positivo puede estimarse como5,6:

VI. Conabilidad diagnstica La validacin de un Mtodo Analtico no Cuantitativo tiene su punto culminante en la determinacin de la Confiabilidad Diagnstica 5,6,7,8 (C.D.) que es la probabilidad de que en una serie de muestras a doble ciego, se detecte correctamente el metabolito, reactivo o sustancia de inters diagnstico debido a que ocurri una adecuada reaccin o interaccin del reac tivo o reactivos con el sustrato generando una respuesta analtica positiva.
La Confiabilidad Diagnstica se determina de la siguiente manera 5,6,8 (Tabla 4):

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Resultado de la Prueba TT+ Positivo Negativo

Valor de la Caracterstica Presente G + A

Tabla 4

Ausente GA+B

A+C

B+D

A+B+C+D

C+D

una respuesta analtica positiva dada la ausencia de sustrato es tal que B tiende a cero (B 0), como la probabilidad de ocurrencia de una respuesta analtica negativa dada la presencia fsica de sustrato en cantidades superiores a las detectables tambin es mnima, entonces C tiende a cero (C 0) y la Confiabilidad Diagnstica es:
P (G |T )=
+ +

P (T |G )P (G ) + + P (T |G )P (G ) + P (T |G )P (G )
+ +

A = Verdaderos Positivos B = Falsos Positivos C = Falsos Negativos D = Verdaderos Negativos Sea P (G |T ) la probabilidad de que en una muestra a doble ciego tomada al azar, se detecte correctamente el metabolito, reactivo o sustancia de inters diagnstico debido a que ocurri una respuesta analtica positiva, entonces: P (G |T )= P (T |G )= P (G )=
+ + + + + + + +

P (G |T )=

A A+0 A A+0 A A A A A+D A A+0 A+0+0+D A A+D

A+0 A+0+0+D 0 0+D A A A A 0+D A+0+0+D A A+D A+D A

P (G |T )=

= (0)(0)

P (T |G )P (G ) + + + + P (T |G )P (G ) + P (T |G )P (G ) A A+C A+C

P (G |T )= 1

Por lo tanto: lim P (G |T )1

B 0 C 0
+ +

A+B+C+D
-

P (T |G )= P (G )=
-

B B+D

B+D A+B+C+D
A A+C A+B+C+D B B+D B+D A+B+C+D

Luego entonces cuando la probabilidad de ocurrencia de falsos positivos y negativos tiende a cero o es cero, P (G +| T+) se convierte en la Confiabilidad Diagnstica, y sta tiende a uno o es uno, luego entonces existe la confianza suficiente para detectar correctamente el sustrato de inters diagnstico en una muestra desconocida y tomada al azar cuando ocurra una respuesta positiva de la prueba. La regla de decisin para determinar la Conf iabilidad Diagnstica que detecta correctamente el sustrato de inters (C.D.) o P (G+| T+) es7,8: Si P (G +| T+)< 0.95 el mtodo analtico no tiene buena Confiabilidad Diagnstica para detectar correctamente el sustrato de inters. Si P (G+| T+) 0.95 el mtodo analtico tiene buena Confiabilidad Diagnstica para detectar correctamente el sustrato de inters.

P (G |T )=

A+C A A+C A+C A+B+C+D

En trminos de individuos y enfermedades la Confiabilidad Diagnstica es la probabilidad de que en un individuo tomado al azar se tenga la enfermedad dado que la prueba result positiva. Si la reaccin o interaccin del reactivo o reactivos con el sustrato son lo suficientemente selectivas para detectar correctamente la presencia o ausencia del sustrato durante las pruebas con testigos verdaderos positivos y testigos verdaderos negativos, la probabilidad de ocurrencia de falsos positivos o falsos negativos ser mnima. Luego entonces la probabilidad de ocurrencia de

Procedimiento para determinar la Conf iabilidad Diagnstica de un Mtodo Analtico no Cuantitativo: a) Realizar el mtodo analtico a doble ciego, en al menos 20 testigos positivos verdaderos y en al menos 20 testigos negativos verdaderos y tabular los datos de la siguiente manera

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Volumen 41 Nmero 2 Abril - Junio 2010 (E) Nmero de ensayos realizados con testigos positivos verdaderos (G+) __________ (A) Nmero de ensayos Positivos con testigos positivos verdaderos ______________ (C) Nmero de ensayos Negativos con testigos positivos verdaderos _____________ (F) Nmero de ensayos realizados con testigos negativos verdaderos (G-)____________ (B) Nmero de ensayos Positivos con testigos negativos verdaderos ______________ (D) Nmero de ensayos Negativos con testigos negativos verdaderos _____________ b) Con los datos anteriores, colocarlos en las casillas de la Tabla 5 de acuerdo con el orden especificado:
Tabla 5

d) Con el resultado anterior aplicar la siguiente regla de decisin: Si C.D. o P (G +| T+) < 0.95 el mtodo analtico no tiene buena Confiabilidad Diagnstica para detectar correctamente el sustrato de inters. Si C. D. o P (G +| T+) 0.95 el mtodo analtico tiene buena Confiabilidad Diagnstica para detectar correctamente el sustrato de inters. Existen circunstancias donde es importante asegurarse que en una muestra desconocida y tomada al azar NO exista fsicamente el metabolito o que la sustancia de inters diagnstico se encuentre en una cantidad inferior a la mnima detectable cuando ocurra una respuesta analtica negativa. Tal es el caso de las pruebas para detectar VIH en la sangre para transfusin. En esta situacin, lo que se pretende es conocer la probabilidad de que en una muestra desconocida y tomada al azar ocurra un posible falso negativo, lo que generara una situacin de riesgo. La Confiabilidad Diagnstica de tener un posible fal so negativo (C.D.F.N) o P (G +|T-) en una muestra desconocida y tomada al azar sera: P (G |T )=
+ -

Resultado de la Prueba T T
+ -

Valor de la Caracterstica Presente G + A

Ausente GB A+B=G

Negativo

Positivo

A+C=E

B+D=F

A+B+C+D = I

C+D=H

c) Una vez realizadas las pruebas, es posible simplificar los clculos de la siguiente manera:
A A+C A A+C A+C A+B+C+D A+C A+B+C+D B B+D B+D A+B+C+D

P (T |G )P (G ) + P (T |G )P (G ) + P (T |G )P (G )
+

P (G |T )=

Por lo tanto, la ecuacin anterior queda:

A E A E E I E I B F F I A I A I B I A I A+B I

P (G |T ) =

A A+B

A G

De nueva cuenta si la reaccin o interaccin qumica y/o fsica del reactivo o reactivos con el sustrato fueron lo suficientemente selectivas para detectar correctamente la presencia o ausencia del sustrato durante las pruebas con testigos verdaderos positivos y testigos verdaderos negativos, la probabilidad de ocurrencia de falsos positivos o falsos negativos es mnima, ya que la probabilidad de ocurrencia de una respuesta analtica positiva dada la ausencia de sustrato es pequea ya que B tiende a cero (B 0), como la probabilidad de ocurrencia de una respuesta analtica negativa dada la presencia fsica del sustrato en canti dades superiores a las detectables tambin es mnima, C tien de a cero (C 0), entonces la Confiabilidad Diagnstica para un posible falso negativo sera:
+ +

Luego entonces, una vez realizado en ensayo a doble ciego con testigos positivos verdaderos y testigos negativos verdaderos, la Confiabilidad Diagnstica (C.D.) o P (G+| T+) de un Mtodo Analtico no Cuantitativo ser: A C.D. o P (G |T ) = G
+ +

P (G |T )= P (T |G )=
+

P (T |G )P (G ) + + P (T |G )P (G ) + P (T |G )P (G ) A+C C = A 0 =0

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A+C A P (G )= = A+B+C+D A+D

+

P (T |G )= P (G )=
-

D D D = = =1 B+D 0+D D B+D = A A+D 0 D A+D = 0 D A+D D

A+B+C+D

(A) (C) (F) (B) (D)

Nmero de ensayos Positivos con testigos positivos verdaderos ______________ Nmero de ensayos Negativos con testigos positivos verdaderos _____________ Nmero de ensayos realizados con testigos negativos verdaderos (G-)_________ Nmero de ensayos Positivos con testigos negativos verdaderos ______________ Nmero de ensayos Negativos con testigos negativos verdaderos _____________

P (G |T )=

A+D A A+D 0+1

b) Con los datos anteriores, colocarlos en las casillas de la Tabla 6 de acuerdo con el orden especificado:
Tabla 6

P (G |T )= 0 Por lo tanto:

lim P (G |T ) 0
B 0 C 0

T+ Positivo T-

Resultado de la Prueba Negativo

Valor de la Caracterstica Presente G + A

Ausente GB A+B=G

A+C=E

B+D=F

A+B+C+D = I

C+D=H

Por consecuencia la probabilidad diagnstica de que exista un posible falso negativo en una muestra desconocida y tomada al azar (C.D.F.N) o P (G +| T -) dada una adecuada reaccin o interaccin del reactivo o reactivos con el sustrato tiende a cero o en el mejor de los casos es cero. La regla de decisin para determinar la Confiabilidad Diagnstica de un posible falso negativo (C.D.F.N) o P(G+| T -) en una muestra desconocida y tomada al azar es7,8: Si (C.D.F.N) o P (G +| T - ) < 0.05 el mtodo analtico tiene buena Confiabilidad Diagnstica para detectar un posible falso negativo. Si (C.D.F.N) o P (G +| T - ) 0.05 el mtodo analtico no tiene buena Confiabilidad Diagnstica para detectar un posible falso negativo. Procedimiento para determinar la Confiabilidad Diagnstica de un posible falso negativo (C.D.F.N.) o P (G+| T -) de un Mtodo Analtico no Cuantitativo: a) Realizar el mtodo analtico a doble ciego, en al menos 20 testigos positivos verdaderos y en al menos 20 testigos negativos verdaderos y tabular los datos de la siguiente manera: (E) Nmero de ensayos realizados con testigos positivos verdaderos (G+) __________

c) Una vez realizadas las pruebas, es posible simplificar los clculos de la siguiente manera:
C A+C C A+C A+C A+B+C+D A+C A+B+C+D D B+D B+D A+B+C+D

P (G |T )=

Por lo tanto, la ecuacin anterior queda:

C E C E E I E I D F F I C I C I D I C I C+D I C C+D C H

P (G |T ) =

Luego entonces, una vez realizado en ensayo a doble ciego con testigos positivos verdaderos y testigos negativos verdaderos, la Confiabilidad Diagnstica de un posible falso negativo (C.D.F.N.) o P (G+| T -) de un Mtodo Analtico no Cuantitativo ser: (C.D.F.N.) o P (G |T ) =
+ -

C H

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Volumen 41 Nmero 2 Abril - Junio 2010 d) Con el resultado anterior aplicar la siguiente regla de decisin: Si (C.D.F.N) o P (G +| T - ) < 0.05 el mtodo analtico tiene buena Confiabilidad Diagnstica para detectar un posible falso negativo. Si (C.D.F.N) o P (G +| T - ) 0.05 el mtodo analtico no tiene buena Confiabilidad Diagnstica para detectar un posible falso negativo.

Conclusiones
Los mtodos analticos no cuantitativos son mtodos dicotmicos de diagnstico y para validarlos es necesario comparar el resultado contra una ca racterstica de referencia exacta. Un mtodo analtico, f inalmente es una estrategia de identificacin o determinacin, til no slo en la industria farmacutica sino tambin en la investigacin cientfica y clnica o en el laboratorio de anlisis clnicos, y puede equipararse con una tcnica cientfica de diagnstico para estudios epidemiolgicos, sociales y judiciales. Los parmetros mnimos para validar un mtodo analtico no cuantitativo son los siguientes: Adecuabilidad, Homogeneidad o Selectividad, Sensibilidad, Especificidad, Valor Predictivo, Confiabilidad Diagnstica y Lmite de Deteccin. Para todos estos parmetros existe una metodologa estadstica definida y una regla de decisin con una confianza estadstica, que le dan solidez y soporte a los resultados obtenidos del procedimiento analtico de medicin.

VII. Lmite de deteccin Conociendo la Confiabilidad Diagnstica es posible estimar el lmite de deteccin del mtodo analtico diluyendo la muestra de anlisis a concentraciones susceptibles de encontrarse en condiciones de trabajo.
El lmite de deteccin ser la mnima cantidad de sustrato en una muestra, que bajo las condiciones de operacin establecidas, sea capaz de generar una respuesta analtica positiva en el mtodo analtico9. El l m ite de deteccin del Mtodo de Medicin se evala haciendo diluciones sucesivas de concentraciones conocidas de la sustancia de inters, como mnimo por quintuplicado y determinando la respuesta analtica. El lmite de deteccin ser aquella concentracin del sustrato a estudiar donde las respuestas analticas de al menos el 5% de los ensayos sean negativas.

Referencias
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Consideraciones nales Un mtodo analtico, f inalmente es una estrategia de identificacin o determinacin, til no slo en la industria farmacutica sino tambin en la investigacin cientfica y clnica o en el laboratorio de anlisis clnicos, y puede equipararse con una tcnica cientfica de diagnstico para estudios epidemiolgicos, sociales y judiciales.
Los parmetros mnimos propuestos para validar un mtodo analtico no cuantitativo son los siguientes: Adecuabilidad, Homogeneidad o Selectividad, Sensibilidad, Especificidad, Valor Predictivo, Confiabilidad Diagnstica y Lmite de Deteccin. Para todos los parmetros propuestos en este trabajo, se presenta una metodologa estadstica precisa y una regla de decisin con una confianza estadstica definida, que le dan solidez y soporte a los resultados obtenidos del procedimiento analtico de medicin. Mediante el proceso de validacin se determina si el mtodo analtico cumple con el propsito para el cual fue desarrollado, si es lo suficientemente confiable y si los resultados previstos se obtienen dentro de las condiciones prefijadas.

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