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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD ALTA DIRECCIN Jefe Csar Cabezas Sanchz Subjefe Marco Bartolo Marchena RGANOS DE LNEA Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin Director General Oscar Aquino Vivanco Centro Nacional de Control de Calidad Director General Ruben Tabuchi Matsumoto Centro Nacional de Productos Biolgicos Director General Alberto Valle Vera Centro Nacional de Salud Intercultural Director General Oswaldo Salaverry Garca Centro Nacional de Salud Ocupacional y Proteccin del Ambiente para la Salud Director General Estela Ospina Salinas Centro Nacional de Salud Pblica Director General Mximo Espinoza Silva RGANOS DE ASESORAMIENTO Oficina General de Asesora Tcnica Director General Pedro Valencia Vzquez Oficina General de Asesora Jurdica Marita Mercado Zavaleta Oficina General de Investigacin y Transferencia Tecnolgia Director General Gabriela Minaya Martnez RGANOS DE APOYO Oficina General de Administracin Directora (e) General Elizabeth Ojeda Alegra Oficina General de Informacin y Sistemas Directora General Javier Vargas Herrera
COMIT EDITOR INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PRESIDENTE Csar Cabezas Snchez MIEMBROS Zuo Burstein Alva Rosario Belleza Zamora Daniel Crdenas Rojas Flor Fuentes Paredes Lucio Huamn Espino Oswaldo Salaverry Garca Diana Vergara Nuez Liliana Vigil Romero Secretaria Bertha Huarez Sosa
LIMA, 2013
Zurita Macalup, Susana Procedimientos de laboratorio : manual : laboratorios locales I : laboratorios locales II / Elaborado por Susana Zurita Macalup. Lima: Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2013. 554 p. : il., tab. ; 20.5 x 29.5 cm. 1. MANUALES DE LABORATORIO 2. EXPOSICIN A AGENTES BIOLGICOS 3. ESTERILIZACIN 4. MANEJO DE ESPECMENES 5. PER I. II. Per. Ministerio de Salud Instituto Nacional de Salud (Per)
ISBN: 978-612-310-018-6 Hecho el Depsito Legal en la Biblioteca Nacional del Per N. 2013-06495 1era edicin (dic, 1999) 2da edicin (mayo, 2013) 2000 ejemplares Ministerio de Salud, 2013 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per Telfono: (511) 431-0410 Telefax: (511) 315-6600 anexo 2669 Pgina web: www.minsa.gob.pe Instituto Nacional de Salud, 2013 Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima, Per Telfono: (511) 748-1111 Pgina web: www.ins.gob.pe Publicacin aprobada con: - Resolucin Viceministerial 011 - 99 - SA - DGSP - Resolucin Viceministerial 290 - 99 - J - OPD / INS La versin electrnica de este documento se encuentra disponible en forma gratuita en la pgina web www.ins.gob.pe Se autoriza su reproduccin total o parcial, siempre y cuando se cite la fuente.
Presentacin
l Instituto Nacional de Salud, tiene como uno de sus fines el que la poblacin del pas cuente con diagnsticos de laboratorio de calidad. Una de las ms importantes estrategias para este fin es fortalecer la red de laboratorios.
Para enfocar la atencin de pacientes en los servicios de salud, es importante considerar los aspectos epidemiolgicos, clnicos y de laboratorio, que permitan valorar ms adecuadamente tanto el diagnstico como el tratamiento. Es necesario contar con procedimientos de laboratorio estandarizados en todos los niveles de atencin y, en particular, en el primer nivel de atencin, que es donde se da el primer contacto de la poblacin con los servicios de salud. El Instituto Nacional de Salud, en cumplimiento de una de sus funciones de fortalecer las capacidades de diagnstico para el control y prevencin de riesgos y daos asociados a enfermedades transmisibles y no transmisibles, saca a luz la segunda edicin del Manual Procedimientos de Laboratorio para el primer nivel de atencin. Este Manual contiene los procedimientos ms comunes utilizados en un laboratorio bsico, e incluye una descripcin simple y amigable de los pasos a dar desde la obtencin de las muestras biolgicas (sangre, orina, esputo, secreciones, etc.), as como los procedimientos de laboratorio de microbiologa bsica, hematologa y otros, con datos actualizados frente a la versin que saliera en el ao 1999. Es de esperar que el desarrollo de nuevas tcnicas de laboratorio, y las sugerencias de los usuarios de este Manual, obliguen a versiones ms actualizadas, para lo cual el INS siempre estar disponible.
ndice
Procedimientos generales de laboratorio Uso,cuidados y mantenimiento preventivo de equipos y materiales de laboratorios Sangre 11 47
77
Esputo
175
Orina
207
Parasitologa y micologa
241
Secreciones
323
Bacteriologa
341
Bioqumica sangunea
381
Serologa
401
Red de laboratorios
449
Anexos
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CAPTULO
Captulo I
PROCEDIMIENTOS DE BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es un conjunto de procedimientos tcnicos que se debe practicar diariamente y que no debe olvidar el personal de laboratorio. Los procedimientos de bioseguridad tienen por finalidad: PROTEGER Al personal de laboratorio contra la exposicin innecesaria e injustificada a microorganismos infecciosos. EVITAR La contaminacin de las muestras que puede echar a perder el trabajo del laboratorista con resultados falsos. MANTENER Los microorganismos infecciosos dentro del ambiente del laboratorio.
Los microorganismos infectantes se clasifican por grupos de riesgo, dependiendo de: - - La capacidad infectante del microorganismo. Los modos de transmisin (por ejemplo: aerosoles). Si son prevenibles por medio de inmunizacin (vacuna contra la hepatitis B, fiebre amarilla, etc.). Si se dispone de medidas eficaces para el tratamiento contra el microorganismo infectante (por ejemplo: uso de antibiticos).
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Procedimientos de Laboratorio
GRUPO DE RIESGO
MICROORGANISMO
Acanthamoeba, Bacillus subtilis, B. cereus, Escherichia coli cepa K12 BACTERIAS, CHLAMYDIAS, MYCOPLASMAS Y RICKETTSIAS Actinobacillus spp. Actinomadura pelletieri, Actynomices spp Bacillus cereus. Bacteroides spp. Bartonella spp. Bordetella pertussis (V). B. parapertussis. B. bronchiseptica, Borrelia spp. Campylobacter spp. Cardiobacterium hominis. Chlamydia pneumoniae, C. psittaci (cepas no aviares), C. trachomatis. Clostridium botulinum (T), C. chauvoei, C. difficile, C. haemolyticum, C. histolyticum, C. novui, C. perfringes, C. septicum, C. sordelli, C. tetani (T, V) Corynebacterium diphtheriae (T,V), C. minutissium, C. pseudotuberculosis, Edwardsiella tarda, Ehrlichia spp. Eikenella corrodens, Enterobacter spp. Enterococcus spp Erysipelothrix rusiopathiae Escherichia coli (excepto las cepas no patgenas) Flavobacterium spp. Francisella tularensis (tipo B). F. novocida Fusobacterium spp. Gardnerella vaginalis. Haemophilus spp. Helicobacter pylori Klebsiella spp., Legionella spp., Leptospira interrogans Listeria monocytogenes Mycobacterium spp. (excepto Mycobacterium tuberculosis), M. bovis (no BCG), M. africanum, M. leprae, M. microti y M. ulcerans Mycoplasma spp., N. gonorrhoeae, N. meningitidis (V), Nocardia asteroides, N. brasiliensis, N. farcinica, Pasteurella spp.Peptostreptococcus spp. Plesiomonas shigueloides, Porphyromonas spp. Prevotella spp. Proteus spp. Providencia spp., Pseudomonas aeruginosas, Pseudomonas spp., Rhodococcus equi, Rickettsia spp. Salmonella parathyphi A, B, C (V). Salmonella spp. (excepto S. typhi), Serpulina spp. Shigella boydii, S. Dysenteriae (excepto tipo 1). S. flexneri, S. sonnei, S. aeurus Streptobacillus moniliformis, Streptococcus spp. Treponerma carateum, T. pallidum, T. vinventii Ureaplasma ereaplasma urealyticum, Vibrio cholerae, V. para haemolyticus, V. vulnificus, Vibrio spp. Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis HONGOS Aspergillus fumigatus (A) Candida albicans (A), Candida spp. Cryptococcus neoformans (A), Emmonsia parva. Epidermophyton floccosum (A) Fonsecaea spp. Madurella spp. Microsporum spp. (A). Penicillium mameffei (A) Scedosporium apiospermun, S. proloficans. Sporothrix schenckii. Trichophyton spp. A: posible efecto alrgico VIRUS Adenoviridae: Adenovirus Adenoviridae: Adenovirus Arenaviridae: complejos virales LCM - Lassa: virus de la coriomeningitis linfoctica (cepas no neurotrpicas), virus Mopeia, otros complejos virales LCM - Lassa. Complejos virales Tacaribe: otros complejos virales Tacaribe. Astroviridae Bunyaviridae: virus Bunyamwera V de la encefalitis de California, virus Germiston, v. Bhanja virus Hantavirus V Puumala , v Prospect Hill, otros hantavirus Nairovirus, virus Hazara, Flebovirus virus de los flebotomos V Toscana. Otros bunyavirus de patogenicidad conocida. Caliciviridae: Virus Norwalk. Otros Caliciviridae Coronaviridae Herpesviridae: Citomegalovirus Virus Epstein - Barr Herpes simplex virus tipos 1 y 2 Herpes varicella - zoster Virus linfotrpico humano B (HBLV - HHV6) Herpes virus humano 7, Herpes virus humano 8. Orthomyxoviridae: Virus de la influenza tipos A, B y C Ortomixovirus transmitidos por garrapatas: Virus Dhori y Thogoto. Papovaviridae: virus BK y JC, virus del papiloma humano. Paramyxoviridae: virus del sarampin, virus de las paperas. virus de la enfermedad de Newcastle virus de la parainfluenza tipos 1 a 4 virus respiratorio sincitial Parvoviridae: Parvovirus humano (B 19) Picornaviridae: virus de la conjuntivitis hemorrgica (AHC). Virus coxsackie. Echo virus de la hepatitis A (enterovirus humano tipo 72), Poliovirus, Rinovirus. Poxviridae: Buffalopox virus, Cowpox virus Elephantpox virus. Virus del ndulo de los ordeadores Molluscum contagiosum, Orf virus Rabbitpox virus (g) Vaccinia virus, Yatapox virus (Tana & Yaba) Reoviridae: Coltivirus, Rotavirus humanos, Orbivirus Reovirus, Rhabdoviridae: virus de la estomatitis vesicular Togaviridae: Alfavirus, virus Bebaru,virus Onyong nyong, Virus del ro Ross, virus del bosque Semliki, Virus Sindbis. Otros alfavirus conocidos Rubivirus (rubela), Toroviridae. PARSITOS Protozoos: Acanthamoeba castellani, Babesia microti, Babesia divergens. Balantidium coli, cryptosporidium spp. E. histolytica. Giardia lamblia, Leishmania spp. (excepto L brasiliensis y L donovani), Naegleria fowleri, Plasmodium spp. Humano y smico (excepto P. falciparum), Pneumocystis carinii, Sarcocystis suihominis, Toxoplasma gondii, T. spiralis, Trypanosoma brucei brucei, T. brucei gambiense Helmintos: Nemtodos Ancylostoma duodenale, Angiostrogylus spp, Ascaris lumbricoides (A), A. suum (A) Brugia spp. Capillaria philippinensis, Drancunculus medinensis, Loa loa, Mansonella ozzardi, Necator americanus, Onchocerca volvulus, Strongyloides spp., Toxocara canis, Trichinella spp., Trichuris trichiura, Wuchereria brancofti Cstodos: Hymenolepis diminuta, H. nana, Taenia saginata. Tremtodos: Clonorchis sinensis, C. viverrini, F. heptica, F. gigantica, Fasciolopsis buski Opisthorchis spp, Paragonimus westermani, Schistosoma haematobium, S. intercalatum, S. japonicum, S. mansoni, S. mekongi
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
GRUPO DE RIESGO
MICROORGANISMO
BACTERIAS, CHLAMYDIAS Y RICKETTSIAS Bacillus anthracis, Brucella spp., Burkholderia mallei, B. Pseudomallei, Chlamydia psittaci (cepas aviares) Coxiella burnetii, Escherichia coli (cepas verocitotxicas como O157:H7 uO103, Francisella tularensis tipo A, Mycobacterium tuberculosis, M.africanum, M. bovis (excepto la cepa BCG), M. leprae, M. Microti, M. ulcerans, Rickettsia akari, R. canada,R.montana, R. conorii, R. mooseri, R. prowazekii, R. rickettsii, R.Tsutsugamushi, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae (tipo 1), Yersinia pestis. HONGOS Blastomyces dermatitidis, Cladophialophora bantiana, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum. Paracoccidioides brasiliensis. VIRUS Arenaviridae: complejos virales LCM-Lassa: virus de la coriomeningitis linfoctica (cepas neurotrpicas). Complejos virales Tacaribe: virus Flexal Bunyaviridae: virus Oropouche, virus de la encefalitis de California, virus Belgrade, virus sin nombre (Muerto Canyon), Hantavirus virus, Hantaan (fiebre hemorrgica de Corea), virus Seoul, Flebovirus, virus de la fiebre del valle Rift. Caliciviridae: virus de la hepatitis E. Flaviviridae: virus de la encefalitis del valle Murray, virus de la encefalitis de las garrapatas de Europa Central, virus Absettarov virus Hanzalova Virus Hypr, virus Kumlinge virus del Dengue tipos 1-4 virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis G, virus de la encefalitis B japonesa, virus del bosque de Kyasamur, virus del mal de Louping, virus Omsk, virus Powassan, virus Rocio, virus de la encefalitis de primavera-verano rusa, virus de la encefalitis de St. Louis virus Wesselsbron, virus del Nilo occidental virus de la fiebre amarilla. Hepadnaviridae: virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis D. Herpesviridae: Herpesvirus simiae (virus B) Poxviridae: Monkeypox virus Retroviridae: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de las leucemias humanas de clulas T (HTLV) tipos 1 y 2, virus S1V. Rhabdoviridae: virus de la rabia. Togaviridae: Alfavirus virus de la encefalomielitis equina americana oriental,virus de la encefalomielitis equina americana occidental, virus Chikungunya, virus Everglades, virus Mayaro, virus Mucambo , virus Ndumu, virus Tonate, virus de la encefalomielitis equina venezolana, virus no clasificados Virus de la hepatitis todava no identificados. Agentes no clasificados asociados a encefalopatas espongiformes transmisibles: enfermedad de Creutzfeldt Jakob, variante de la enfermedad de Creutz-feldt - Jakob (CJD), encefalopata spongiforme bovina (BSE) y otras TSE de origen animal afines, sndrome de Gerstmann Strussler-Scheinker Kuru. PARSITOS Echinococcus granulosus (*), E. multiocularis (*), E. vogeli (*), Leishmania brasiliensis (*), L. donovani (*), Plasmodium falciparum (*), Taenia solium (*), Trypanosoma brucei rhodesiense (*), T. cruzi. (*): normalmente no infecciosos a travs del aire BACTERIAS, CHLAMYDIAS, MYCOPLASMAS Y RICKETTSIAS Ninguno HONGOS Ninguno
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PARSITOS Ninguno VIRUS Arenaviridae: complejos virales LCM-Lassa: virus de Lassa. Complejos virales Tacaribe: virus Junn, virus Machupo, virus Sabia, virus Guaranito. Bunyaviridae: Nairovirus, Virus de la fiebre hemorrgica de Crimea/Congo. Filoviridae: virus Marbug, virus Ebola. Flaviviridae: virus Kyasanur. Poxiviridae: Variola (major & minor), virus (variola virus), virus no clasificados Morbilivirus equino.
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Procedimientos de Laboratorio
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
El laboratorio debe mantenerse limpio y aseado, retirando cualquier material que no tenga relacin con el trabajo. Los pisos deben limpiarse con soluciones desinfectantes. No se debe barrer el piso en seco, ni encerar.
La mesa de trabajo se descontaminar al terminar la jornada laboral y en caso de derramamiento de sustancias peligrosas.
El desempolvado debe ser hecho con una tela limpia, saturada con desinfectante y exprimida. No hacerlo con un plumero.
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Procedimientos de Laboratorio
Cuando no se disponga de ventilacin mecnica, las ventanas podrn abrirse y deben estar provistas de mosquiteros. Se deben eliminar tragaluces y claraboyas. Deber haber un programa de lucha contra insectos y roedores.
b. Del Personal
En la zona de trabajo del laboratorio no se permitir al personal comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicarse cosmticos.
En el laboratorio se utilizarn batas, uniformes u otras prendas apropiadas. Esta ropa no se llevar fuera del laboratorio, es decir, no se llevar a las oficinas, bibliotecas, salas de personal, cafeteras, etc.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
Las personas que tengan cabello largo deben protegerse con gorro o mantenerlo amarrado hacia atrs. El cabello largo es peligroso cerca al fuego del mechero, incluso puede contaminarse con muestras clnicas y puede ser un riesgo cerca de los equipos. Asimismo, se deben quitar los brazaletes o collares largos antes de comenzar a trabajar.
Fuera de la zona de trabajo deben existir espacios para guardar la ropa de calle y los objetos personales, as como para comer y beber.
Todo personal del laboratorio debe recibir inmunizacin protectora, segn la naturaleza de sus funciones, contra ttanos, difteria, hepatitis viral B, rabia, etc.
Se debe usar guantes en todos los trabajos con riesgo de contacto accidental directo con sangre, material infeccioso o animales infectados.
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Procedimientos de Laboratorio
No se utiliza pipetas para aspirar con la boca ("pipetear"), se deben usar propipetas, pipetas automticas u otro equipo adecuado.
No se pasa la lengua por las etiquetas, ni se deben colocar los materiales en la boca.
El personal del laboratorio se lavar las manos antes y despus de haber manipulado material o animales, as como al retirarse del laboratorio.
Es necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos de sustancias. Se debe usar gafas, viseras u otro elemento de seguridad.
Durante el trabajo se mantendrn cerradas las puertas del laboratorio, no se permitir la entrada de nios en las zonas de trabajo del laboratorio.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I Para manipular lquidos no se usarn jeringas ni agujas hipodrmicas. Se debe usar pipetas automticas, propipetas u otros.
Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados se descotaminarn antes de eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a usar. Se introducirn en bolsas de recoleccin de residuos slidos diferenciados por colores (residuos biocontaminados: color rojo; residuos qumicos: color amarillo; residuos comunes: color negro) que se anudarn para esterilizarse en autoclave o incinerarse fuera del laboratorio. Si es necesario desplazar las bolsas a otro lugar para proceder a la descontaminacin, se colocarn en recipientes de fondo slido, que se puedan cerrar antes de sacarlas del laboratorio. Por el sistema de desage solo se deben eliminar los microorganismos infecciosos o reactivos qumicos previamente descontaminados, neutralizados o inactivados.
Limpiar peridicamente los congeladores y las refrigeradoras en los cuales se almacenan los cultivos o los sueros y retirar los frascos y tubos rotos. Usar mascarilla y guantes de jebe durante su limpieza.
Todos los accidentes y exposiciones reales o potenciales a material infeccioso se notificarn inmediatamente al jefe del laboratorio. Se debe hacer un informe escrito de tales accidentes (ver Anexos).
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Procedimientos de Laboratorio
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
Al cabo de una hora podr efectuarse la descontaminacin, para ello se usar ropa protectora y proteccin para las vas respiratorias.
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Procedimientos de Laboratorio
Impide la salida de estos aerosoles a la atmsfera del laboratorio y por lo tanto su inhalacin por el personal. No impiden las salpicaduras y no son eficaces contra los riesgos qumicos. Estas cmaras de seguridad biolgica se utilizan en los siguientes casos: En los procedimientos con grandes posibilidades de producir aerosoles, con riesgo de infeccin transmitida por el aire. Por ejemplo en la trituracin, el mezclado, las agitaciones o mezclas enrgicas, o la apertura de envases con material infeccioso. Cuando se manejan concentraciones elevadas o grandes cantidades de material infeccioso.
c. Autoclaves
Se usan para esterilizar el material contaminado.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
Esterilizar
Significa eliminar de un objeto o de una sustancia todos los virus, bacterias y esporas. En consecuencia, el material de laboratorio que se ha esterilizado queda libre de microorganismos vivos. Desinfeccin Se realiza mediante productos qumicos que matan todos los virus y bacterias, pero no las esporas.
OBJETIVOS
Preparar los materiales para la recoleccin de muestras (deben estar estriles placas Petri, tubos, etc.). Desinfectar los materiales contaminados. Preparar los materiales que se emplean en los cultivos bacterianos (placas Petri, pipetas Pasteur, tubos, etc.).
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Procedimientos de Laboratorio
CALOR HMEDO
La esterilizacin por vapor (autoclave) es el procedimiento de eleccin para el instrumental mdico de uso repetido. Las autoclaves y las ollas a presin deben funcionar a 121 C (250 F) durante un mnimo de 20 minutos. Esta temperatura equivale a una presin de 1 atmsfera por encima de la presin atmosfrica (010,325 newtons/m2).
a. Olla de presin
Un tipo de autoclave barato es la olla a presin corriente, convenientemente modificada (OMS/UNICEF). Las ollas de presin son cacerolas amplias, construidas para cocinar alimentos con gran rapidez empleando vapor a presin. En laboratorios pequeos se usan para esterilizar los utensilios con que se recolectan las muestras.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
PROCEDIMIENTO
1. 2. Llenar con agua el fondo de la olla. Colocar los materiales que se van a esterilizar en la canastilla, que se sostendr arriba del nivel del agua por medio de un soporte.
3. Los utensilios envueltos se debern poner en posicin vertical, nunca en posicin horizontal.
b. Autoclave
PREPARACIN DE MATERIALES PARA LA ESTERILIZACIN EN AUTOCLAVE
MATERIAL DE VIDRIO
Los tubos de muestras, las placas Petri, etc.; se envolvern en papel Kraft y se atarn con cordeles.
PIPETAS PASTEUR
Se colocarn en tubos amplios y largos, que se taponarn inmediatamente despus. Tambin se pueden envolver con varias hojas de papel Kraft.
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Procedimientos de Laboratorio
c. Ebullicin
Este procedimiento solo se debe usar cuando no hay otra alternativa. Usar un recipiente especial para esterilizar por ebullicin, o si no una cacerola.
PROCEDIMIENTO
1. Llenar con agua el fondo de la olla.
2. Colocar los materiales que se van a esterilizar en la canastilla, que se sostendr arriba del nivel del agua por medio de un soporte. 3. Los utensilios envueltos se debern poner en posicin vertical, nunca en posicin horizontal. 4. Colocar los utensilios metlicos (pinzas, etc.) en el recipiente cuando el agua est hirviendo. 5. Hervir durante 20 minutos los utensilios para colectar muestras.
Los hornos domsticos corrientes constituyen un buen recurso para la esterilizacin por calor seco.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
PROCEDIMIENTO
1. Preparar el material para esterilizar, del mismo modo que para el procedimiento de autoclave.
2. Los tapones de algodn no debern ser demasiados gruesos, de modo que pueda entrar el aire. Levantar ligeramente las tapas de los estuches metlicos y disponer de modo que miren a la parte posterior del horno. 3. El tiempo de esterilizacin es de 2 horas a 170 C (340 F). 4. Apagar el horno. Esperar a que la temperatura descienda hasta 40 C. Abrir la puerta del horno. Cerrar las tapas de los estuches metlicos. Sacar los materiales estriles. 5. El papel empleado para envolverlos deber haber tomado un color marrn oscuro. Si el color del papel es amarillo plido indicar que el horno no se ha calentado lo suficiente; si el papel se ha ennegrecido indicar que el horno se ha calentado demasiado.
b. Flameado
Este procedimiento solo se deber utilizar con utensilios metlicos como pinzas y bistures. No es conveniente para uso general.
PROCEDIMIENTO
1. Colocar los utensilios en una bandeja metlica.
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Procedimientos de Laboratorio
3. Durante el flameado, inclinar la bandeja de un lado a otro. 4. Calentar las asas bacterianas en la llama de un mechero Bunsen o de alcohol, hasta que el asa se ponga al rojo vivo.
PRINCIPIOS GENERALES
1.
La mayora de los desinfectantes qumicos tienen efectos txicos, por lo que se utilizarn guantes, delantal y proteccin ocular, al diluir desinfectantes a granel.
2. En la prctica, los desinfectantes qumicos no son confiables porque pueden quedar inactivados por la sangre o por cualquier otra materia orgnica. Tambin pueden perder rpidamente potencia si se guardan en un sitio caluroso. 3. En el caso de instrumentos punzantes o cortantes, solo debe utilizarse como ltimo recurso, cuando no se pueda recurrir a la esterilizacin, asegurando que se limpie minuciosamente el instrumental antes de sumergido en el desinfectante qumico.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
Se deterioran Las soluciones deben estar preparadas recientemente, la descomposicin rpida puede ser un problema importante en las ciudades de clima clido. Son corrosivas Corroen el acero, que contiene nquel, cromo, hierro y otros materiales oxidables. Las soluciones no deben prepararse en recipientes metlicos, ya que estos se corroen rpidamente. El contacto no debe durar ms de 30 minutos e ir seguido de un enjuague y secado minucioso. CLORAMINA (TOSILCLORAMIDA SDICA, CLORAMINA T)
Es ms estable que el hipoclorito sdico. Sin embargo, debe protegerse de la humedad, la luz y el calor excesivo.
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Procedimientos de Laboratorio
El alcohol etlico (etanol) y el alcohol isoproplico tienen propiedades desinfectantes semejantes. Son eficaces para formas vegetativas de bacterias, mycobacterias, hongos y virus, luego de algunos minutos de contacto. No son eficaces contra esporas bacterianas. Para conseguir la mxima eficacia, deben usarse en una concentracin de 70% (70 mL de alcohol absoluto y 30 mL de agua destilada). El etanol puede emplearse en su forma desnaturalizada, que puede ser ms barata.
YODOPOLIVIDONA Es un compuesto que lleva yodo. No debe usarse sobre aluminio y cobre. Puede usarse diluida al 2,5% (una parte de solucin al 10% y tres partes de agua hervida). La inmersin durante 15 minutos en una solucin al 2,5% permite hacer una desinfeccin intensiva del material limpio. Las soluciones diluidas (2,5%) para sumergir el instrumental deben renovarse todos los das.
FORMALDEHDO (FORMOL, FORMALINA) Las preparaciones comerciales de formaldehdo (formol, formalina) contienen un 35 - 40% de formaldehdo, un 10% de metanol y agua. Deben usarse en dilucin 1: 10 (la solucin final contiene 3,5 - 4% de formaldehdo). Esta solucin diluida destruye las formas vegetativas de bacterias, los hongos y los virus en 30 minutos y las esporas bacterianas al cabo de 3 horas. Despus de la inmersin, enjuagar bien todo el material antes volver a utilizarlo. La solucin y los vapores que emite son txicos e irritantes lo que limita su uso como desinfectante.
GLUTARAL (GLUTARALDEHDO) Se comercializa en forma de solucin acuosa al 2% que hay que "activar" antes de usar, aadiendo polvo o lquido de glutaral que se mezcla con la solucin acuosa y que la hacen alcalina. Una vez activada la solucin, no se debe guardar ms de 2 semanas. Si se enturbia, habr que desecharla.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
Como solucin activada, destruye las formas vegetativas de bacterias, los hongos y los virus en 30 minutos. Para destruir las esporas se precisa 10 horas de inmersin.
El glutaral se considera actualmente un producto txico, irritante. Debe evitarse el contacto con la piel, los ojos y las vas respiratorias.
PERXIDO DE HIDRGENO (AGUA OXIGENADA) La inmersin de material limpio en una solucin al 6% proporciona una desinfeccin intensiva en 30 minutos. Se prepara a partir de una solucin estabilizada al 30% (una parte de solucin estabilizada al 30% y cuatro partes de agua hervida). El perxido de hidrgeno no debe usarse en un ambiente caluroso. Tiene poder corrosivo, no debe usarse con objetos de cobre, aluminio, zinc o latn.
Si se usa alcohol hay que frotar la superficie varias veces porque el producto se evapora.
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Procedimientos de Laboratorio
(b) Situaciones "sucias": Por ejemplo: salpicaduras de sangre, instrumental sucio. La cantidad de cloro disponible que se precisa en las soluciones usadas para la desinfeccin intensiva depende de la cantidad de materia orgnica presente, ya que esta (por ejemplo: la sangre y la pus) inactiva el cloro. Los lquidos blanqueadores de uso domstico suelen tener un 5% de cloro disponible. La leja de sosa tiene cerca de un 5% de cloro disponible. La leja concentrada tiene cerca de un 15% de cloro disponible.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
Esterilizacin por vapor a presin durante 20 minutos o ms: 121 C (250 F) a 1 atmsfera adicional. Esterilizacin por calor seco: 2 horas a 170 C (340 F).
En horno elctrico
DESINFECCIN INTENSIVA
Inactiva (mata) todos los virus y bacterias, pero no las esporas.
En cacerola Hipoclorito sdico al 0,5% Cloramina al 2% Alcohol etlico al 70% Alcohol isoproplico al 70% Yodopolividona al 2,5% Formaldehdo al 5% Glutaral al 2% Perxido de hidrgeno al 6%
ATENCIN! En la prctica y sobre el terreno, la desinfeccin intensiva con productos qumicos no es confiable.
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Procedimientos de Laboratorio
No existe una clasificacin universalmente aceptada de los residuos segn su peligrosidad; sin embargo, desde el punto de vista general, los residuos sanitarios, incluyendo los que se generan en un laboratorio de microbiologa pueden agruparse en residuos biocontaminados, especiales y comunes. Una clasificacin aceptable puede ser: Clase A: residuos biocontaminados Tipo A 1: atencin al paciente. Instrumentos y materiales utilizados en la toma de muestra de sangre, tejidos y otros.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
Tipo A 2: material biolgico. Tipo A 3: sangre humana y productos derivados. Tipo A 4: quirrgicos y anatomopatolgicos. Tipo A 5: animales contaminados. Clase B: residuos especiales Tipo B 1: qumicos peligrosos. Tipo B 2: farmacuticos Tipo B 3: radioactivos Clase C: residuos comunes Similares a los domsticos. Incluye a los generados en administracin como: cartn, papel, material de oficina, basura orgnica, etc. Para fines de manejo y tratamiento de residuos infecciosos, material capaz de producir una enfermedad infecciosa, estos se clasifican en: lquidos, slidos y objetos punzantes - cortantes.
Residuos lquidos La sangre, lquidos orgnicos, secreciones y otros pueden eliminarse directamente por el desage con agua abundante. Los lquidos infecciosos que se generan en el laboratorio como sobrenadantes de los cultivos, se aconseja recogerlos en un recipiente que contenga una solucin de hipoclorito sdico recin preparada. Luego pueden ser eliminados por los desages. No obstante, muchos laboratorios someten a los residuos lquidos, sangre incluida a un tratamiento en el autoclave.
Residuos slidos Las formas ms frecuentes de tratamiento de los residuos slidos son la incineracin y esterilizacin por autoclave. La incineracin, es una actividad cada vez ms restringida, debido a la contaminacin que origina en las zonas urbanas donde estn implantados. Se aconseja transferir los residuos a empresas autorizadas para su eliminacin.
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Procedimientos de Laboratorio
Las muestras examinadas en el laboratorio (heces, sangre, pus, esputo, orina, etc.) frecuentemente son infectantes. La esterilizacin en autoclave es la forma ms comn de tratar este tipo de residuos. Se debe asegurar que el ciclo del autoclave permita la esterilizacin en toda la masa de los residuos. Los procedimientos para materiales limpios no sirven para el tratamiento de los desechos, siendo aconsejable prolongar el tiempo y aumentar la presin del proceso de autoclavado (Ejemplo: material de vidrio contaminado autoclavado por una hora a 121 C y 1,5 atmsferas de presin). La utilizacin de indicadores qumicos y el tratamiento trmico no siempre asegura el control de la eficacia. Para evitar una falsa seguridad; alternativamente se debe considerar el control riguroso sistemtico en cada proceso (por ejemplo: registros de presin y temperatura) y el mantenimiento apropiado del autoclave.
Residuos slidos Constituyen un claro riesgo de inoculacin accidental de microorganismos. Todos estos materiales deben ser colocados en recipientes especficos que sean resistentes a la puncin y con cierre seguro, para posteriormente depositarlos en los recipientes rgidos destinados a los residuos slidos.
Para fines de manejo y tratamiento de residuos qumicos ( agentes qumicos) considerada como la segunda fuente de riesgo de exposicin de las personas que trabajan en laboratorio, se debe contar con un procedimiento para el tratamiento de residuos qumicos como: - - - - - - - - - cidos inorgnicos. Bases inorgnicas, sales bsicas y disoluciones bsicas. Azida de sodio. Aldehdos, cetonas y disolventes orgnicos. Bromuro de etidio. Colorantes utilizados en las tinciones de Gram, Giemsa, Papanicolau, Auramina, Naranja de acridina. Metales pesados, mercurio y compuestos organomercuriales. Residuos radiactivos
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
3. Cortar en el metal una abertura amplia o ventanilla (V) abajo del nivel que ocupa la rejilla. 4. Conseguir una tapa suelta (T) para el barril.
b. Procedimiento de incineracin
1. Al terminar el trabajo de cada maana y cada tarde colocar en la rejilla del incinerador todas las cajas usadas con heces y esputo. El barril metlico deber estar firmemente cerrado (por medio de la tapa y la ventanilla) excepto durante la incineracin.
2. Incinerar una vez por semana o ms frecuentemente, si es necesario. Llenar el fondo del barril con papeles, palos, virutas, etc. 3. Quitar la tapa. Encender el fuego y alimentarlo hasta que todos los materiales infectados se encuentren reducidos a cenizas. Estas cenizas no son peligrosas y se pueden arrojar al basurero.
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Procedimientos de Laboratorio
ENTIERRO DE DESECHOS
1. Abrir una fosa de 4 a 5 metros de profundidad y de 1 a 2 metros de ancho.
2. Fabricar una tapa que se ajuste con firmeza a la boca de la fosa. Es conveniente reforzar el borde de la boca de la fosa con un revestimiento de ladrillos o piedras. 3. Dos veces al da arrojar en la fosa las cajas usadas con heces, esputo u otras materias infectadas. Colocar inmediatamente la tapa en su lugar. 4. Una vez por semana cubrir los desechos con una capa de hojas secas (de 10 centmetros de espesor, aproximadamente). Si es posible, en vez de hojas secas depositar una capa de cal viva por semana.
LOS
RECIPIENTES
NO
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
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Procedimientos de Laboratorio
2. Hervir los recipientes de esputo, durante 30 minutos, en agua que contenga polvos para lavar en solucin fuerte (cristales de carbonato sdico), a razn de 60 mL por cada litro de agua.
2. Luego, enjuagar.
2. A continuacin, llenarlos con: 3. Una solucin de leja comercial al 10%, o Una solucin de fenol al 2%.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
Remojar en detergente.
solucin
2. Los tubos con sangre que han permanecido varios das a temperatura ambiente, donde los microorganismos se pueden multiplicar, se debern: Llenar con una solucin de leja comercial al 10%. Dejar en reposo durante 12 horas. Enjuagar y limpiar enseguida.
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Procedimientos de Laboratorio
TRANSPORTE DE DESECHOS
PRINCIPIOS GENERALES a. Transporte de desechos infecciosos
Los recipientes para desechar los residuos de riesgo deben ser rgidos, impermeables, resistentes a cidos, lcalis y de cierre hermtico. El transporte del material contaminado del laboratorio al rea de auto clavado o incineracin, lo realiza el personal tcnico que cuente con los medios adecuados y equipo de proteccin personal. Las bolsas de color rojo rotuladas como Riesgo Biolgico Material Contaminado son autoclavadas y eliminadas con la basura o incineradas. Los recipientes con residuos nunca se apilan o se colocan en zonas elevadas, tanto durante su almacenamiento intermedio (no debe superar las 24 horas) como durante el transporte. Si los residuos son punzantes o cortantes debe utilizarse recipientes rgidos resistentes a la perforacin cuyo volumen no supere los 2 L y que contengan desinfectante. Los residuos biocontaminados y especiales se transportan en los propios recipientes en los que se depositan. No se recomiendan recipientes de un volumen superior a los 60 L. No se transportan a la vez residuos de riesgo junto con residuos comunes.
Debe evitarse originar aerosoles durante el transporte de los residuos biolgicos, en especial aquellos que contengan patgenos cuya va de transmisin sea la area. Los recipientes que los contengan se manipulan sin hacer movimientos bruscos. No es apropiada la utilizacin de escaleras para el transporte de los residuos de Biocontaminados. Las bolsas de recoleccin de residuos slidos se deben de diferenciar por
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo I
colores: residuos biocontaminados: color rojo; residuos qumicos: color amarillo; residuos comunes: color negro. Estas bolsas deben ser de polietileno de 7,5 de espesor, con una capacidad del 20 % superior al volumen del recipiente que la contiene.
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CAPTULO
II
Captulo II
II
a. El sistema de soporte
Consiste en: El pie. El bastidor.
El revlver (cambiador de objetivos). La platina. La platina mecnica, que imprime un movimiento lento y regulado al porta objeto.
b. El sistema de aumento
LOS OBJETIVOS El poder de aumento de cada objetivo se indica por un nmero grabado en la manga de la lente: El objetivo l0x aumenta 10 veces. Su distancia de operacin es de 5 - 6 mm.
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Procedimientos de Laboratorio
El objetivo 40x aumenta 40 veces. Su distancia de operacin es de 0,5 - 1,5 mm. El objetivo 100x aumenta 100 veces. Su distancia de operacin es de 0,15 - 0,20 mm.
El objetivo de l00x generalmente se encuentra marcado con un anillo rojo para indicar que se debe usar con aceite de inmersin. Cuanto mayor sea el poder de resolucin del objetivo, ms clara ser la imagen.
EL OCULAR El poder de aumento se encuentra marcado en el ocular: Un ocular 4x aumenta 4 veces la imagen que produce el objetivo.
Un ocular l0x aumenta la imagen 10 veces. Para calcular el aumento total de la imagen del objeto que se observa, se multiplica el poder de aumento del objetivo por el del ocular. El poder de aumento de los microscopios, utilizados en los laboratorios mdicos oscila entre 50 y 1 000.
c. El sistema de iluminacin
LA FUENTE LUMINOSA Luz elctrica Puede proporcionarla un foco contenido en el microscopio por debajo de la platina o mediante un foco exterior colocado frente al microscopio.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo II
Luz del da El microscopio nunca se debe utilizar ni debe permanecer bajo la luz directa del sol. Deber estar bien iluminado, pero se usar una luz amortiguada. Si la luz del sol es excesivamente brillante, se colocar frente al microscopio una botella de vidrio claro, llena de agua, para reducir la intensidad de la luz.
II
EL ESPEJO El espejo refleja los rayos de la fuente luminosa sobre el objeto. Tiene una superficie plana y otra cncava. El lado cncavo constituye un condensador de escaso poder.
EL CONDENSADOR Lleva los rayos luminosos a un foco comn sobre el objeto que se habr de examinar. Se encuentra colocado entre el espejo y la platina. Se puede elevar (iluminacin mxima) y bajar (iluminacin mnima). Se debe centrar y ajustar adecuadamente.
EL DIAFRAGMA Se encuentra dentro del condensador, se utiliza .para reducir o ampliar el ngulo, y, por lo tanto, tambin la cantidad de luz que entra en el condensador.
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Procedimientos de Laboratorio
FILTROS En algunos microscopios se ajustan filtros de colores (por ejemplo: azules) debajo del condensador.
2. EL TORNILLO MICROMTRICO DE AVANCE LENTO Hace que el objetivo se desplace ms lentamente. Se emplea para conseguir un enfoque perfecto del objeto.
3. EL TORNILLO DE AJUSTE DEL CONDENSADOR Se utiliza para elevar el condensador y aumentar la iluminacin o descenderlo y reducir la iluminacin.
4. LOS TORNILLOS PARA CENTRAR EL CONDENSADOR Puede haber tres tornillos colocados alrededor del condensador. Se usan para centrar el condensador exactamente en relacin con el objetivo.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo II 5.
EL ELEVADOR DEL DIAFRAGMA IRIS Es un pequeo elevador que se encuentra fijo al condensador. Se puede mover para cerrar o abrir el diafragma, reduciendo o aumentando as el ngulo y la intensidad de la luz.
II
6.
REGULADORES DE LA PLATINA MECNICA Se usa para desplazar el portaobjeto sobre la platina. Un tornillo lo desplaza hacia atrs y hacia delante. Otro tornillo lo desplaza a la izquierda o la derecha.
MATERIALES
Trapo de lino fino. Papel lente o papel absorbente tipo pauelo descartable. Tambin una piel de gamuza o trapo del tipo que no desprenda pelusa. Un frasco pequeo de xilol (o tolueno). Una pequea pera de goma o pincel fino.
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Procedimientos de Laboratorio
OBJETIVOS DE INMERSIN EN ACEITE Deben limpiarse despus de su uso con papel especial para lentes o papel absorbente, humedecido con tolueno o xilol para .eliminar el aceite de inmersin. Por ningn motivo la lente de inmersin quedar sin limpiarse, en caso contrario el aceite se secara y ocasionara la inutilizacin del objetivo. Al terminar la jornada diaria de trabajo, antes de guardar el microscopio, quitar el polvo de los objetivos arrojndoles aire con la pera de goma. Si es necesario, limpiar el polvo remanente usando el pincel fino.
Limpiar la superficie superior de la lente (en la que se aplica el ojo) con un trapo suave o papel de seda. Limpiar la superficie inferior de la lente (dentro del tubo del microscopio) con el pincel fino.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo II
II
PRECAUCIONES ADICIONALES
EN CLIMAS CLIDOS Y SECOS
El problema principal es el polvo. Las partculas finas penetran en las roscas de los tornillos y debajo de las lentes. Se puede evitar tomando en cuenta lo siguiente: Mientras no se use, conservar el microscopio bajo una cubierta de material plstico a prueba de aire. Limpiar el microscopio con aplicaciones de aire de la pera de goma. Limpiar las lentes con una brocha especial o un pincel fino.
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Procedimientos de Laboratorio
EN LOS LABORATORIOS QUE NO CUENTAN CON ELECTRICIDAD Colocar junto al microscopio una bolsa de 15 - 20 cm de dimetro, con no menos de 250 g de gel de slice azul (que indica humedad al tomar un color rojizo). Cuando el silicagel se torne rosado se debe cambiar por otro o calentar hasta que se tome azul para su reutilizacin.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo II
ATENCIN!
Nunca debe limpiar las lentes de los objetivos o los oculares del microscopio con etanol. Nunca debe sumergir los objetivos del microscopio en xilol o etanol, pues se aflojaran. Nunca debe emplear papel ordinario o algodn para limpiar las lentes. Nunca debe tocar los objetivos con los dedos. Nunca debe limpiar los soportes o la platina con xilol. Nunca debe limpiar las lentes internas de los oculares o los objetivos con trapo o papel (esto desprendera la capa antirreflejante); utilizar solamente un pincel fino. Nunca debe dejar el microscopio sin los oculares, a menos que se taponen los orificios. Nunca debe guardar el microscopio en estuches de madera cerrados si la regin es clida y hmeda. Nunca debe dejar el microscopio con aceite de inmersin en el objetivo. Nunca debe llevar el microscopio cogindolo por el bastidor con una mano; utilizar ambas, una en el pie y la otra en el bastidor
II
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Procedimientos de Laboratorio
EL AUTOCLAVE
El vapor de agua a presin constituye el procedimiento ms eficaz de esterilizacin del material de laboratorio.
TIPOS DE AUTOCLAVES
Autoclave de desplazamiento por gravedad. Autoclave de vaco. Autoclave de olla a presin.
2. CANASTA Es una canasta amplia de alambre donde se ponen los utensilios que se esterilizarn.
3. SOPORTE DE CANASTA Se encuentra en el fondo del autoclave y sostiene la canasta por encima del nivel del agua.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo II 4. DRENAJE
5. TAPA La tapa cubre y cierra hermticamente la caldera; se ajusta mediante una arandela de goma.
II
6. SUJETADORES DE LA TAPA Estos sujetadores, junto con la arandela de goma, cierran hermticamente la tapa e impiden que escape el vapor.
7. VLVULA DE SALIDA DEL AIRE Esta vlvula, que se encuentra en la parte superior de la caldera o en la tapa, se emplea para dejar que salga el aire cuando empieza el agua a calentarse.
8. VLVULA DE SEGURIDAD Se halla en la parte superior de la caldera o en la tapa, y deja escapar el vapor cuando la presin se eleva demasiado, evitando as que ocurra una explosin.
9. INSTRUMENTOS INDICADORES DE LA TEMPERATURA O DE LA PRESIN Se encuentran en la parte superior de la caldera o en la tapa. La temperatura se indica en grados Celsius (C).
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Procedimientos de Laboratorio
2. Introducir en el autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar. El material y los objetos que se han de esterilizar deben agruparse sin apretarlos de modo que el vapor pueda circular sin dificultad y que pueda salir fcilmente. Las bolsas de plstico estarn abiertas para que el vapor penetre en su contenido.
3. Cerrar la tapa del autoclave, cerciorndose que la arandela de goma se encuentre en su surco. Entornillar a niveles iguales los sujetadores de la tapa.
4.
5.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo II
6. Vigilar la vlvula de salida del aire hasta que aparezca un chorro de vapor, que se har uniforme y continuo en 3 - 4 minutos. Esto indicar que todo el aire se ha expulsado del autoclave.
II
7 .
8.
Observar el indicador, cuando llegue a 121C se deber regular el calor para conservarlo y empezar a medir un tiempo mnimo de 20 minutos para material de vidrio y un tiempo de 30 minutos para recipientes que contengan material infectado (esputo, pus, etc.).
9.
10. Cuando la temperatura descienda a menos de 100C abrir la vlvula de salida del aire para igualar las presiones dentro y fuera del autoclave.
11. Cuando cese el silbido aflojar los sujetadores de la tapa y quitarla. Dejar enfriar el autoclave y, a continuacin, retirar la canasta con los materiales estriles.
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Procedimientos de Laboratorio
ATENCIN!
1. No maniobrar el dispositovo de derenaje ni la vlvula de salida del aire mientras se est efectuando el calentamiento a presin.
2. No hacer un calentamiento demasiado rpido para aumentar la presin una vez que la vvula de salida se ha cerrado. 3. No permitir que el autoclave se enfri durante demasiado tiempo. Si el aprato se deja varias horas sin abrir la vvula de salida, se forma un vaco y los materiales estriles se pueden romper. 4. No permitir que los operadorees no lleven guantes y viseras para proteger los brazos, las manos, la cara y el cuello cuando abran la autoclave, incluso cuando la temperatura del contenido haya bajado a 80C.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo II
BALANZAS
La sensibilidad de una balanza es la masa ms pequea que esa balanza puede pesar con precisin.
II
TIPOS DE BALANZAS
a. Balanza abierta de dos platillos
Tiene dos platillos. Puede usar pesas separadas o tener una varilla graduada en la que se coloca una pesa corrediza. Se emplea para pesar cantidades grandes (hasta varios kilos). Su sensibilidad es de 0,5 g (500 mg).
b. Balanza analtica
Pesa cantidades pequeas (0,001 a 410 g, dependiendo del modelo) o cuando se requiere gran precisin, por ejemplo: 3,88 g, 0,200 g. Su sensibilidad es de 0,5 mg - 0,1 mg, dependiendo del modelo de la balanza. Para usar correctamente la balanza analtica se deben seguir las siguientes instrucciones: Mantener conectado el equipo durante el da de trabajo a 220 v.
l.
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Procedimientos de Laboratorio
3. Seleccionar la unidad de pesaje con la tecla Mode/Off. 4. Colocar soporte o papel para pesar, sobre la plataforma del equipo. 5. 6. 7 . Presionar nuevamente la tecla Zero/On, para volver a cero la pantalla. Colocar el (los) elemento (s) a pesar sobre el soporte colocado en la plataforma. Para hacer la lectura del peso, esperar que el indicador de estabilidad indique (0000) y se visualice en la pantalla.
8. Retirar el material pesado de la plataforma del equipo. 9. Apagar el equipo presionando momentneamente la tecla Mode/Off
l.
2. En el platillo derecho colocar las pesas equivalentes al peso del papel ms el de la cantidad de sustancia que va a pesar.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo II
3. Leer la etiqueta de la sustancia: 4. Antes de retirar el recipiente de la alacena. Mientras se pesa la sustancia. Despus de pesar la sustancia. Rotular la sustancia pesada
II
CENTRFUGAS
La fuerza centrfuga hace que un cuerpo se ponga en movimiento circular a gran velocidad, de este modo las partculas que hay en los lquidos se colocan en el fondo de los tubos de centrifugaci6n y se forman los sedimentos centrifugados. Estos sedimentos pueden contener, segn el lquido centrifugado: clulas sanguneas, huevos de parsitos, clulas de los conductos urinarios, etc.
2. CABEZAL FIJO AL EJE Est provisto de cubetas para sostener los tubos de centrifugacin.
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Procedimientos de Laboratorio
5. CONTADOR DE REVOLUCIONES Tiene una aguja que indica la velocidad en revoluciones por minuto.
TIPOS DE CENTRFUGAS
a. Centrfuga manual
Gira por medio de un manubrio. Contiene de 2 a 4 tubos. Se usa para examinar sedimentos en la orina y para concentrar ciertos parsitos en las heces.
b. Centrfugas elctricas
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MINISTERIO DE S LUD
II
CABEZAL OBLICUO Sostiene los tubos en un ngulo de 45, durante la centrifugacin. Es til en los ensayos de aglutinacin para determinar grupos sanguneos por el mtodo del tubo de ensayo.
Si solo se va a centrifugar un tubo que contenga lquido, equilibrarlo con un tubo idntico lleno de agua. 2. Encender el motor y aumentar gradualmente la velocidad girando con lentitud la perilla hasta lograr la velocidad deseada.
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Procedimientos de Laboratorio
3. Detener la centrfuga gradualmente, algunos modelos tienen frenos. 4. Retirar los tubos lentamente y con cuidado.
ATENCIN!
No abrir la centrfuga hasta que se haya detenido completamente. No reducir la velocidada de la centrfuga con la mano Consevar la centrfuga limpia. Enjuagar las cubetas despus de su uso. Limpiar todos los residuos del material centrifugado,etc.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo II
INCUBADORA
Est provista de un calentador que nos permite obtener temperaturas entre 25 a 100 C. Es controlada mediante un termmetro.
II
Para incubar bacterias y otros organismos, se usa una temperatura constante. Para su buen uso se debe seguir las recomendaciones del fabricante.
ATENCIN!
Es importante medir todos los das la temperatura de la incubadora y anotarla en una hoja adecuada para este fin, donde se consigne: la fecha, hora y firma del usuario. Esta medida nos asegura un control diario del buen funcionamiento del sistema.
POTENCIMETRO
Es un equipo que se usa para medir la diferencia de potencial entre dos puntos. Se utiliza en el laboratorio para medir el pH de las soluciones. Consta de un conductor de seccin uniforme por el cual circula una corriente continua, la diferencia de potencial entre dos puntos cualesquiera es proporcional a la distancia entre ellos.
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Procedimientos de Laboratorio
ESPECTROFOTMETRO
La espectrofotometra, se basa en la propiedad de ciertas sustancias que tienen color propio, o pueden dar lugar a productos finales coloreados con ciertas reacciones qumicas. De esta manera, la intensidad del color puede utilizarse para medir la concentracin de dicha sustancia. El espectrofotmetro consta de las siguientes partes:
FUENTE DE LUZ Cuando se trabaja con luz visible y ultravioleta, se emplea un foco con filamento de tungsteno. Habitualmente se trata de una lmpara de bajo voltaje constante o de una batera.
DISPOSITIVO DE MONOCROMIA Suelen emplearse filtros de luz de vidrio coloreado o de gelatina coloreada con sustancias adecuadas, entre dos placas de vidrio. Los filtros de vidrio o gelatina coloreada transmiten la luz entre lmites bastantes amplios de longitudes de onda. Este hecho hace que no pueda utilizarse cuando se requiere trabajar con longitudes de onda ms precisas.
PORTAMUESTRAS Pueden ser tubos de ensayo redondos o cubetas de paredes planas. Se emplea generalmente tubos redondos, por su menor costo.
CONTROL DE SENSIBILIDAD Se utiliza una hendidura variable o un diafragma iris para modificar la cantidad de luz que llega al elemento fotosensible.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo II
DETECTORES FOTOSENSIBLES Son fotoceldas de capa interpuesta, formadas por una placa metlica sobre la cual se deposita un semiconductor. El voltaje que produce la fotocelda de capa interpuesta es proporcional a la cantidad de luz que llega y se mide directamente.
II
UN APARATO DE LECTURA O REGISTRO, GALVANMETRO CALIBRADO EN UNIDADES DE ABSORBANCIA O GRAFICADOR Para los anlisis qumicos habituales, suelen preferirse los instrumentos basados en fotoceldas con capa interpuesta, pues su mantenimiento no es costoso. Para manejar adecuadamente la instalacin, contribuir al mantenimiento del sistema, se requiere seguir las instrucciones del fabricante. Es preciso, asimismo, conocimientos de qumica.
AGLUTINOSCOPIO
Se utiliza en la prueba serolgica para el diagnstico de brucelosis. Est compuesto de un estuche de madera de 48 x 33 x 12 cm. Lleva en su parte anterior un tubo fluorescente de 15 vatios o un foco de 25 vatios, que permite iluminar oblicuamente la mezcla de suero antgeno. Tanto el interior como el exterior est pintado de color negro mate. Est provisto de una tapa de vidrio para evitar una evaporacin demasiada rpida de la mezcla de suero.
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Procedimientos de Laboratorio
HEMOGLOBINMETRO DE SAHLI
Es un equipo que mide la hemoglobina por comparacin visual, el principio que la sustenta es que la sangre se diluye en una solucin cida y la hemoglobina se transforma en hematina cida. El color de la solucin de ensayo se compara con el de un cristal de referencia. Consta de un tubo especialmente calibrado que contiene solucin cida. La mezcla de la sangre y el cido producir un color castao pardusco. Este tubo calibrado se coloca en el hemoglobinmetro y se compara con el color del tubo patrn de referencia. Es un instrumento de fcil manejo pero no es til para calcular con precisin la hemoglobina, porque no todas las formas de la hemoglobina circulante se transforman en hematina cida y la comparacin de colores a simple vista no es exacta.
ROTADOR
Es un agitador rotatorio de 180 ciclos por minuto, que describe un crculo de 2 cm de dimetro en un plano horizontal. Se utiliza en la prueba de VDRL. Sobre la plataforma rotatoria se encuentran dos placas de vidrio con anillos de cermica que limitan superficies de 14 mm de dimetro. A la izquierda de la plataforma se ve un contador que registra el nmero
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo II de vueltas.
MATERIAL DE VIDRIO
II
2. Eliminar la leja lavando el material a chorro de agua, enseguida dejar en solucin saturada de detergente durante 30 minutos.
3. Lavar con cepillo (cepillar 4 veces), enjuagar con agua de cao y luego con agua destilada.
4. Escurra los materiales (vasos, matraces, probetas), con las bocas hacia abajo en una canastilla de alambre y cubrir con tela delgada. 5. El material limpio y seco se deber guardar en una alacena para protegerlo del polvo. Es mejor taponar los utensilios de vidrio con algodn no absorbente, o cubrir la boca con pequeas tapas hechas de papel Kraft.
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Procedimientos de Laboratorio
l.
2. Sumergir los materiales de vidrio sin usar en esta solucin por 24 horas. 3. Enjuagar dos veces con agua corriente y una vez con agua desmineralizada. Por ltimo, secarlos.
2. Enjuagar cada lmina con agua de cao. 3. Limpiar una a una, con un trapo suave, que no desprenda pelusa. Colocarlas separadas, sobre una hoja de filtro de papel, una a una. Dejarlas secar. Luego, juntarlas en grupos de 10 o 20 y envolverlas con hojas de papel.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo II
II
2. Enjuagar con agua de cao y lavar con solucin saturada de detergente. 3. Enjuagar cada una detenidamente con el chorro de agua del cao. Secar las pipetas de vidrio Pyrex en el horno de aire seco a 60 C y las de vidrio ordinario en la incubadora a 37 C o al aire.
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Procedimientos de Laboratorio
l. Remojarlos en una solucin de detergente ms un desinfectante: 3 m L de detergente de uso domstico en 200 mL de agua y 15 mL de leja. Dejarlos en remojo durante 2 - 3 horas, movindolos suavemente de vez en cuando. 2. Enjuagar cuatro veces el recipiente donde estn los cubreobjetos con agua de cao, agitndolo suavemente. 3. Lavar por ltimo con agua desmineralizada. 4. Escurrir los cubreobjetos, colocndolos cuidadosamente de punta sobre una pieza de gasa doblada. 5. 6. Secarlos en el horno de aire caliente a 60 C. Conservarlos en una placa Petri pequea. Utilizar una pinza para sacarlos.
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MINISTERIO DE S LUD
CAPTULO
III
SANGRE
PROCEDIMIENTOS PARA LA ESTERILIZACIN........ 79 RECIPIENTES PARA TOMA DE MUESTRAS............. 80 Principios generales................................................. 80 FRASCOS Y TUBOS PARA RECOLECTAR MUESTRAS DE SANGRE............................................ 82 Para obtener sangre sin anticoagulante................... 82 Para obtener sangre con anticoagulante.................. 82 OBTENCIN DE SANGRE VENOSA.......................... 83 Principios generales.................................................83 Sangre coagulada.................................................... 84 Sangre anticoagulada...............................................84 Materiales................................................................. 85 Mtodo de obtencin................................................85 OBTENCIN DE GOTA GRUESA................................ 90 Materiales................................................................ 90 Mtodo de obtencin................................................90 OBTENCIN DE SANGRE CAPILAR.......................... 93 Mtodo de obtencin................................................93 PREPARACIN DE EXTENSIONES DE SANGRE.....94 Principios generales.................................................94 Materiales.................................................................94 Mtodo de obtencin................................................94 Preparacin de la extensin.....................................95 TINCIN DE EXTENSIONES DE SANGRE................. 99 Principios generales................................................. 99 Tincin de Leishman................................................ 99 Tincin de Giemsa.................................................. 101 Tincin de Wright.................................................... 103 Resultados.............................................................. 104 LAS CLULAS SANGUNEAS.................................. 105 Tipos de clulas sanguneas.................................. 105 ESTUDIO DE LAS CLULAS SANGUNEAS............................................................. 106 HEMOGRAMA COMPLETO........................................ 106 Principios generales............................................... 106 Materiales............................................................... 107 Mtodo.................................................................... 107 Resultados anormales............................................ 110 Examen de los leucocitos....................................... 112 Descripcin de los tipos de leucocitos.................... 114 Clulas anormales.................................................. 117 GLBULOS ROJOS O ERITROCITOS ANORMALES.............................................................. 120 Principios generales............................................... 120 Alteraciones estructurales en el tamao................ 121 Alteraciones estructurales en la forma................... 122 Alteraciones cromticas......................................... 123 Inclusiones anormales............................................ 124 RECUENTO DEL NMERO DE LEUCOCITOS O GLBULOS BLANCOS........................................... 125 Principios generales............................................... 125 Materiales............................................................... 125 Mtodo.................................................................... 126 Mtodo de recuento................................................ 128 RECUENTO DEL NMERO DE ERITROCITOS O GLBULOS ROJOS............................................... 129 Principios generales............................................... 129 Materiales............................................................... 130 Mtodo.................................................................... 130 Procedimiento de recuento..................................... 132 HEMATOCRITO.......................................................... 134 Principios generales............................................... 134 Mtodo de microescala.......................................... 134 HEMOGLOBINA: CLCULO DE LA CIANOMETAHEMOGLOBINA.............................. 139 MTODO FOTOMTRICO......................................... 139 Principios generales............................................... 139 Materiales............................................................... 139 Calibracin del colorimetro..................................... 140 Mtodo fotomtrico de la cianometahemoglobina.. 142 TIEMPO DE SANGRA............................................... 145 MTODO DE DUKE.................................................... 145 Principios generales............................................... 145 Materiales............................................................... 145 Mtodo.................................................................... 145 Resultados.............................................................. 147 TIEMPO DE COAGULACIN DE LA SANGRE COMPLETA................................................................. 148 MTODO DE LEE Y WHITE....................................... 148 Principios generales............................................... 148 Materiales............................................................... 148 Mtodo.................................................................... 148 Resultados.............................................................. 150 TIPIFICACIN DE GRUPOS SANGUNEOS y RH.... 151 Principios generales............................................... 151 CLASIFICACIN DE LOS GRUPOS A, B, y O POR MEDIO DE ANTISUEROS.................................. 152 Principios generales............................................... 152 Mtodo del portaobjetos......................................... 153 Mtodo del tubo de ensayo.................................... 157 CLASIFICACIN DEL GRUPO RHESUS (Rh)........... 161 Principios generales............................................... 161 Mtodo del portaobjetos......................................... 161 Mtodo del tubo de ensayo.................................... 165 COMPATIBILIDAD SANGUNEA............................... 167 Principios generales............................................... 167 Materiales............................................................... 167 Mtodo.................................................................... 167 Resultados.............................................................. 169 VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN LOS ERITROCITOS............................................................ 170 Principios generales............................................... 170 Mtodos.................................................................. 171 Mtodo de Westergren........................................... 171 Mtodo de Wintrobe............................................... 173
Captulo III
Sangre
III
2. Introducir en el autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar. El material y los objetos que se han de esterilizar deben agruparse sin apretarlos de modo que el vapor pueda circular sin dificultad y que pueda salir fcilmente. Las bolsas de plstico estarn abiertas para que el vapor penetre en su contenido.
3. Cerrar la tapa del autoclave, cerciorndose que la arandela de goma se encuentre en su surco. Entornillar a niveles iguales los sujetadores de la tapa.
4.
5.
79
Procedimientos de Laboratorio
Los recipientes deben ser fuertes y no permitir fugas cuando la tapa o el tapn estn correctamente aplicados.
Deben estar correctamente rotulados para facilitar la identificacin en el laboratorio. Rotular el frasco o el tubo con el nombre o cdigo que identifique al paciente, as como la fecha de la toma de muestra. No debe rotularse la tapa.
80
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III Los formularios de peticin de examen de la muestra no se envolvern alrededor de los recipientes sino que se colocarn por separado, de preferencia en sobres plsticos.
Sangre
III
En las muestras que se sospeche la presencia de microorganismos infectantes, por ejemplo, el virus de hepatitis B o el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) deben estar identificados en el recipiente y en el formulario de examen con una etiqueta especial "Peligro de infeccin" o Sustancia infecciosa.
Para evitar fugas o derramamientos accidentales se debe usar recipientes secundarios como bandejas, o cajas, equipados con gradillas de modo que estn en posicin vertical los recipientes que contienen las muestras.
Los recipientes secundarios pueden ser de metal o de plstico. Se deben descontaminar con regularidad, por autoclave o con desinfectantes qumicos.
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Procedimientos de Laboratorio
82
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
PRINCIPIOS GENERALES
Un adulto que pesa 60 kilos tiene aproximadamente 4,5 litros de sangre. Por lo tanto, no existe peligro si se llenan dos o ms tubos de ensayo de 10 mL para el estudio de su sangre. Se debe explicar esto a los pacientes que muestren temor al extraer sangre venosa.
III
mL
La sangre venosa se extrae de una vena del brazo por medio de una aguja y una jeringa.
Es importante considerar toda muestra como sospechosa de VIH u otra enfermedad que puede ser transmitida por la sangre.
83
Procedimientos de Laboratorio
SANGRE COAGULADA
Cuando la sangre se coloca en un tubo de vidrio se solidifica en 5 - 10 minutos formando un cogulo. Se separa en dos componentes: El suero, un lquido amarillo. El cogulo, una masa slida de color rojo.
SANGRE ANTICOAGULADA
Si se aade a la sangre un anticoagulante especial tan pronto como se extraiga, se evitar que se coagule y seguir siendo lquida. La sangre tratada con un anticoagulante se separa en dos componentes: El plasma, un lquido amarillo. Las clulas sanguneas, que se sedimentan y forman: una capa delgada de leucocitos y un precipitado de eritrocitos.
84
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
MATERIALES
Etanol al 70% para desinfectar la piel. Una ligadura hecha con un tubo de goma de 2 - 5 mm de calibre. Agujas estriles con calibre de 20, 19, 18. En nios menores de cinco aos se usan agujas de calibre 23 o 25. Jeringas estriles con capacidad para 2,5, 10 o 20 mL de acuerdo con el examen solicitado. Verificar que la desembocadura de cada jeringa se ajuste adecuadamente a la entrada de las agujas. Tambin se pueden utilizar jeringas descartables con sus respectivas agujas, provenientes de sus envases originales. Frascos y tubos para recolectar muestras de sangre. Rtulos para los frascos o tubos. Preparar y rotular el frasco o el tubo adecuado, que usar para el examen correspondiente. Un depsito de metal que contenga leja u otro desinfectante para colocar el material utilizado.
Algodn.
III
MTODO DE OBTENCIN
Leer con cuidado la orden de examen del paciente y decidir la cantidad de sangre que se necesitar.
85
Procedimientos de Laboratorio
2. Si el paciente se encuentra en cama, extender el brazo del paciente en una posicin descansada.
3.
El sitio ms adecuado es la vena que se encuentra en el pliegue anterior del codo, en el punto donde es ms gruesa y visible.
USO DE LA JERINGA
4. Colocar la aguja en la jeringa, tocando slo la base de la aguja. Asegurarse que la aguja y la jeringa no estn obstruidas.
APLICAR LA LIGADURA
5. Aplicar la ligadura por encima del punto ubicado para la extraccin de la sangre. 6. Con la mano derecha colocar, firmemente, la ligadura alrededor del brazo del paciente, y sujetar los extremos.
86
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III 7 . Con la mano izquierda tirar de un extremo cruzndolo y a continuacin introducir este extremo por debajo de la parte principal de la ligadura.
Sangre
III
Se deber ajustar, slo lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y dilatar la vena, sin apretarla tanto que reduzca el paso de sangre por las arterias.
8. Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatacin de las venas.
9. Con el dedo ndice de la mano izquierda palpar la vena en que se introducir la aguja.
87
Procedimientos de Laboratorio
10. Desinfectar la piel con una pieza de algodn embebido en etanol al 70%.
11. Tomar la jeringa con la mano derecha, colocando la yema del dedo ndice sobre la base de la aguja.
12. Colocar la aguja sobre la vena, con el bisel hacia arriba. Introducir la aguja en el centro de la vena, sin dudar. Nunca intentar punzar una vena por un lado.
14. Con la mano izquierda tirar hacia atrs el mbolo de la jeringa muy lentamente. Deber entrar sangre en la jeringa. Llenar la jeringa con la cantidad de sangre que necesite.
88
MINISTERIO DE S LUD
Sangre
III
16. Aplicar un pedazo de algodn seco sobre la parte donde se encuentra oculta la punta de la aguja. Sacar la aguja con un movimiento rpido.
17 . Pedir al paciente que presione firmemente el algodn durante 3 minutos, con el brazo extendido. No se recomienda que se flexione el brazo a causa del riesgo que se forme un hematoma.
18. Luego de extrada la sangre venosa, retirar la aguja de la jeringa con el mximo cuidado y depositar la aguja en el recipiente de metal con desinfectante.
19. Llenar los frascos o tubos rotulados con la muestra de sangre. Si estos recipientes contienen anticoagulante, mover varias veces con suavidad y uniformidad el recipiente. No agitar el contenido.
89
Procedimientos de Laboratorio
MATERIALES
Etanol al 70% para desinfectar la piel.
MTODO DE OBTENCIN
90
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III 2. En los nios menores de 6 meses, ubicar el taln o el dedo gordo del pie.
Sangre
III
3. Limpiar el sitio escogido: usar un pedazo de algodn humedecido en etanol, despus pasar un pedazo de algodn seco para retirar los residuos de etanol.
5.
91
Procedimientos de Laboratorio
6. Con la mano derecha tomar un portaobjetos sostenindolo por los bordes. Con la mano izquierda oprimir el dedo para extraer una gota de sangre, que debe caer en el centro del portaobjeto sostenido con la mano derecha.
7 .
Extender la sangre hasta lograr un crculo de aproximadamente 1cm de dimetro y haga que el espesor de la capa sea uniforme, para eso, usar la esquina de un portaobjeto limpio.
8. Las gotas de sangre demasiado gruesas o demasiado delgadas no toman bien la tincin.
92
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
Se usa para realizar los siguientes exmenes de laboratorio: Concentraciones del nmero de eritrocitos. Fracciones de volumen de eritrocitos. Clculo de la cantidad de hemoglobina. Deteccin de parsitos.
III
MTODO DE OBTENCIN
En relacin con la obtencin de sangre capilar ver: "Obtencin de gota gruesa de sangre" hasta el paso 6. Luego proceder a preparar la extensin de sangre.
93
Procedimientos de Laboratorio
Determinar los porcentajes de las distintas clases de leucocitos. Detectar glbulos rojos o blancos anormales. Identificar ciertos parsitos.
MATERIALES
Alcohol. Algodn. Una lanceta estril. Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados.
MTODO DE OBTENCIN
Obtener sangre capilar o venosa. Dejar que la sangre salga libremente. Recoger primero las muestras en que se determinarn las concentraciones de nmero de las clulas sanguneas, si se han solicitado.
94
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
l.
Lavar minuciosamente y limpiar con una pieza de tela suave embebida en una mezcla de etanol y ter.
III
3. Con una sierra pequea marcar diagonalmente hasta cierta profundidad dos esquinas de uno de los extremos del portaobjeto.
4.
b. La extensin
l. Recoger una gota de sangre tocndola ligeramente con una cara del portaobjeto cerca del extremo de este.
95
Procedimientos de Laboratorio
2. Sostener el portaobjeto con una mano. Con la otra mano colocar el borde del portaobjeto que se ha recortado exactamente frente a la gota de la sangre.
3. Desplazar el portaobjeto recortado hacia atrs, hasta que toque la gota de sangre.
4. Dejar que la gota de sangre se extienda por el borde del portaobjeto recortado.
5. Deslizar el portaobjeto recortado hacia el extremo opuesto del portaobjeto que contiene la gota de sangre con un movimiento suave (extender toda la gota de sangre antes de llegar al extremo del portaobjeto).
96
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
3. La extensin no deber ser demasiado larga ni gruesa. 4. La extensin no deber tener espacios vacos, esto se produce cuando se usa portaobjeto con grasa. 5. Marcar la extensin ya seca con el nombre o cdigo del paciente. Escribir stos con un lpiz de grafito en un extremo del portaobjetos cerca a la porcin gruesa de la extensin sangunea.
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Procedimientos de Laboratorio
d. Secado de la extensin
l.
Es importante que la extensin se seque de manera adecuada para conservar su calidad, en especial en climas hmedos.
e. Fijacin de la extensin
Fijar las extensiones con metanol para su conservacin. Envulvanse por separado una vez que estn secas, con hojas de papel blanco.
ATENCIN!
No extraer sangre de: El dedo ndice o el pulgar. Un dedo infectado. La oreja (contiene demasiados monocitos) En caso de usar sangre venosa con anticoagulantes, utilizar solo EDTA(Etilendiamina tetraactico); otros anticoagulantes alteran la morfologa de los leucocitos. No dejar la sangre con anticoagulante en reposo antes de preparar la extensn. En caso de obtener sangre venosa, colocar una gota mediana de sangre, directamente de la aguja de extraccin, y luego seguir los pasos mencionados para la extensin de sangre.
98
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
TINCIN DE LEISHMAN
Es una coloracin especial policromtica utilizada para demostrar la presencia y morfologa de microorganismos en sangre y tejidos, tales como: bartonella, leptospira, etc.
MATERIALES
Dos varillas de vidrio colocadas a travs del fregadero o sobre una cubeta para tincin. Solucin amortiguada tamponada (ver Anexos). Colorante de Leishman (ver Anexos). Una gradilla para secar los portaobjetos. Un cronmetro.
99
Procedimientos de Laboratorio
PROCEDIMIENTO
4.
100
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
5.
Lavar con agua corriente. Dejar caer el chorro de agua en forma suave, empezando por el borde de la lmina inclinada.
III
6. Secar a temperatura ambiente.
7 . Observar en el microscopio con objetivo de menor aumento y luego con objetivo de inmersin.
TINCIN DE GIEMSA
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
l.
101
Procedimientos de Laboratorio
2. Cubrir la extensin de sangre con colorante Giemsa diluido: 1 mL de solucin stock de Giemsa en 9 mL de agua destilada o buffer fosfato (PBS) (ver Anexos).
3.
4.
Lavar con agua corriente. Dejar caer el chorro de agua en forma suave, empezando por el borde de la lmina inclinada.
6.
Observar en el microscopio con objetivo de menor aumento (40x) y luego con objetivo de inmersin (l00x).
102
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
TINCIN DE WRIGHT
MATERIALES
Colorante de Wright (ver Anexos) en un frasco gotero o un cuentagotas. Solucin amortiguada tamponada (ver Anexos).
III
PROCEDIMIENTO
l. Cubrir la extensin de sangre con unas gotas de colorante Wright. Contar las gotas.
2. Dejar actuar en reposo durante 1 2 minutos. 3. Agregar sobre el colorante el mismo nmero de gotas de solucin amortiguada tamponada y mezclar rpidamente, que puede ser hecho soplando suavemente (debe formarse una capa plateada). Dejar reposar la mezcla por 10 minutos.
4.
5. Lavar con agua corriente. Dejar caer el chorro de agua en forma suave, empezando por el borde de la lmina inclinada. 6. Dejar secar a temperatura ambiente.
7. Observar en el microscopio con objetivo de menor aumento (40x) y luego con objetivo de inmersin (l00x).
103
Procedimientos de Laboratorio
RESULTADOS
Cuando el mtodo ha sido aplicado correctamente, se obtienen resultados similares: naranja. prpura. prpura azulado. rojo lila. rojo naranja.
Los eritrocitos se observan de color: Los ncleos se observan de color: Los grnulos basfilos de color: Los grnulos neutrfilos de color: Los grnulos eosinfilos de color:
ATENCIN!
Evitar la formacin de depsitos de colorante. Tienen aspecto de manchas negras y pequeas en las extensiones de sangre. Evitar las tinciones defectuosas, que dan por resultados extensiones demasiado azules, oscuras o rojizas. Evitar portaobjetos alcalinos o solucin amortiguadora alcalina. Producen que el frotis sea demasiado azul. La solucin amortiguadora tamponada que se use debe prepararse al momento de su uso, ya que se acidifica al exponerse al aire. No usar portaobjetos sucios con grasa.
104
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
Concentracin: Aproximadamente 5 x 1012 por litro de sangre (5 000 000 por nmero: mm3 de sangre). Funcin: Los eritrocitos transportan la hemoglobina, esta a su vez se combina con el oxgeno y lo lleva desde los pulmones hasta los tejidos. Llevan el bixido carbnico de los tejidos a los pulmones.
Concentracin Aproximadamente 8 x 109 por litro de sangre (8 000 por mm3 de en nmero: sangre). Funcin: Defensa del organismo contra las infecciones.
c. Plaquetas
Aspecto: Tamao: Fragmentos de clulas de formas variadas (triangulares, estrelladas, ovales), con grnulos. 2 - 5 m.
Concentracin Aproximadamente 300 x 109 por litro de sangre (300 000 por en nmero: mm3 de sangre). Funcin: Son importantes para la coagulacin de la sangre.
105
Procedimientos de Laboratorio
HEMOGRAMA COMPLETO
PRINCIPIOS GENERALES
No todos los leucocitos (glbulos blancos) que circulan en la sangre son idnticos. Hay cinco tipos principales que se diferencian por el tamao, la forma del ncleo y el color de los grnulos del citoplasma. La proporcin o porcentaje de cada tipo de leucocitos es importante para el diagnstico. Esta proporcin o porcentaje se denomina: Frmula leucocitaria. Para trabajar esta frmula se cuentan 100 leucocitos y se anota el nmero que se ha encontrado de cada tipo de ellos. Los valores normales de los distintos leucocitos en su proporcin relativa (Frmula leucocitaria porcentual) y en cifras absolutas por mm3, son:
Valores absolutos (mm3) 4000 - 7000 1500 - 3000 50 - 400 200 - 800 50 - 100
106
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
MATERIALES
Un microscopio con objetivo 40x y un objetivo de l00x. Aceite de inmersin. Una extensin de sangre, coloreada con Giemsa. Un contador especial provisto de teclas, o uno que se haga por medio de frijoles o granos de maz.
MTODO
III
a. Examen de la extensin
l. Examinar la extensin de sangre coloreada con el objetivo de 40x para comprobar si los elementos celulares estn bien distribudos y la tincin es adecuada.
2. Verificar que los glbulos blancos se encuentran uniformemente distribuidos en la extensin: si est mal distribuida es posible que los neutrfilos se hallen agrupados.
3. Verificar que la extensin no sea demasiado gruesa. 4. Si la lmina coloreada, est en buenas condiciones, colocar una gota de aceite de inmersin en la lmina y observar con el objetivo de l00x e iniciar el recuento de leucocitos.
107
Procedimientos de Laboratorio
b. Recuento de leucocitos
l. Iniciar el recuento en la ltima porcin de la extensin, es decir, donde se observe que los eritrocitos comienzan a agruparse y sobreponerse. 2. Examinar una porcin rectangular de la extensin mediante un movimiento ordenado, de un campo a otro, como se indica en la figura. 3. Tomar nota del tipo de leucocito que se observe en cada campo. 4. Contar un total de 100 leucocitos.
c. Procedimientos de recuento
108
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
Los totales de las columnas correspondern al porcentaje de cada tipo de leucocitos. 58 ser 58% 5 ser 5%, etc.
Ejemplo:
109
Procedimientos de Laboratorio
RESULTADOS ANORMALES
NEUTROFILIA
Es el aumento de la proporcin de neutrfilos (ms de 7 000) en sus formas inmaduras (abastonados, mielocitos, metamielocitos).
LEUCOCITOSIS
Es el aumento de la cifra total de los leucocitos con cifras superiores a 10 000 o 12 000. Se presenta en infecciones agudas graves.
DESVIACIN A LA IZQUIERDA
Es el aumento de la proporcin de neutrfilos en sus formas inmaduras (abastonados, mielocitos, metamielocitos). Se presenta en infecciones agudas graves.
EOSINOFILIA
Es el aumento de la proporcin de eosinfilos (ms de 400). Ocurre en casos de parasitosis, asma o alergias.
LINFOCITOSIS
Es el aumento de la proporcin de linfocitos (ms de 3 000). Ocurre en casos de infecciones virales (sarampin, etc.) y en ciertas infecciones crnicas (tuberculosis, etc.).
110
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
MONOCITOSIS
Es el aumento de la proporcin de monocitos (ms de 800). Se puede observar en casos de infecciones bacterianas.
NEUTROPENIA
Es la disminucin del nmero de neutrfilos. Puede ocurrir en enfermedades infecciosas graves.
III
Recin nacido 5 500 - 6 500 200 - 400 0 - 100 3 000 - 3 500 300 - 600
1-4aos 3 600 - 4 800 200 - 500 0 - 100 4 400 - 5 400 300 - 600
10 aos 4 500 -5 500 200 -500 0 - 100 4 400 - 4 500 300 - 600
PREDOMINIO DE LINFOCITOS
PREDOMINIO DE NEUTRFILOS
111
Procedimientos de Laboratorio
Caracterstica
Ncleo
Esquema
Forma y tamao
Cromatina
Posicin
Central o excntrica
112
MINISTERIO DE S LUD
Sangre
Caracterstica Color
Citoplasma Incolor, rosceo, azul plido u oscuro Grnulos neutrfilos (N), pequeos, color malva.
Esquema
III
Grnulos eosinfilos (E), grandes, color anaranjado Grnulos basfilos(B), Voluminosos, color morado oscuro
Las vacuolas y nuclolos constituyen reas ovales o redondas, que no se tien o lo hacen dbilmente. Las vacuolas (V) se encuentran en el citoplasma. Los nuclolos (N) se encuentran en el ncleo. EJEMPLO Los neutrfilos polimorfonucleares (P) tienen un ncleo con varios lbulos y grnulos en el citoplasma (de all que tambin se les llama granulocitos). Los linfocitos (L) y los monocitos (M) tienen un ncleo compacto y citoplasma con grnulos o sin ellos.
113
Procedimientos de Laboratorio
Ncleo: Varios lbulos (de 2 a 5), unidos por puentes de cromatina, que tiene el aspecto de una masa uniforme de color morado oscuro. A medida que envejece el leucocito aumenta el nmero de lbulos del ncleo.
114
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
c. Eosinfilos polimorfonucleares
Tamao: 12 - 15 m. Grnulos: Voluminosos, redondos, de color rojo anaranjado, abundantes y agrupados estrechamente. Ncleo: Generalmente consta de dos lbulos. Algunas veces se observa que estos leucocitos se han daado y los grnulos se hallan diseminados en el exterior.
III
d. Basfilos polimorfonucleares
Tamao: 11 - 13 m. Forma: Redonda. Grnulos: Muy voluminosos, redondos, de color morado oscuro, abundantes pero menos estrechamente agrupados que los grnulos de los eosinfilos. Ncleo: Difcil de observar, pues se halla cubierto por los grnulos. En el citoplasma se encuentran escasas vacuolas incoloras y pequeas.
Vacuolas:
e. Linfocitos pequeos
Tamao: 7 - 10 m. Forma: Redonda. Forma: Redonda.
115
Procedimientos de Laboratorio
Ncleo: Citoplasma:
Voluminoso, ocupa la mayor parte de la clula; la cromatina es de color morado oscuro, y densa. La cantidad visible es reducida, de color azul y sin grnulos.
f.
Linfocitos grandes
Tamao: Forma: Grnulos: 10 - 15 m. Redonda o irregular. Escasos, voluminosos y de color rojo oscuro. Ncleo: Oval o redondo puede ocupar un lado de la clula. Citoplasma: Abundante, de color plido.
g. Monocitos
Tamao: 15 - 25 m; son los leucocitos ms grandes. Forma: Irregular. Grnulos: Sumamente pequeos; parecen partculas de polvo; generalmente rojizos. Ncleo: Variable, en forma de rin; la cromatina se dispone en cordones irregulares de color malva plido. Vacuolas: Casi siempre hay vacuolas en el citoplasma.
116
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
117
Procedimientos de Laboratorio
e. Linfocitos atpicos
Se encuentran en infecciones por virus, por ejemplo sarampin, tos ferina. Tambin en casos de tuberculosis y paludismo grave.
118
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
Tamao: 12 18 m. Forma: Irregular. Ncleo: Redondo, excntrico, con nuclolos visibles. Citoplasma: De color ms oscuro que el de los linfocitos grandes; se oscurece a medida que se acerca a la pared de la clula.
f. Mieloblastos
Es el tipo ms joven e inmaduro de todas las clulas de la serie granuloctica. Se observan en pacientes con leucemia. Tamao: Ncleo: 15 - 25 m Grande, redondo, de color malva, cromatina laxa finamente distribuida, plido, presenta de 1 - 5 nuclolos. De color azul oscuro, con un rea clara que no se tie, situada alrededor del ncleo.
III
Citoplasma:
g. Megacariocitos
Son los precursores de las plaquetas de la mdula sea. Tamao: Ncleo: 60 - 100 m. Irregular, denso y con abundantes lbulos.
Citoplasma: Lleno de grnulos pequeos y de plaquetas. La pared celular no est bien definida.
119
Procedimientos de Laboratorio
En algunas enfermedades, principalmente anemias, los glbulos rojos o eritrocitos pueden sufrir anormalidades:
Alteraciones estructurales: En la forma (poiquilocitos) en el tamao (anisocitosis). Alteraciones cromticas: En la concentracin de hemoglobina: (hipercroma, hipocroma, etc.). Inclusiones anormales. Examen de la extensin Los eritrocitos se deben observar antes del extremo donde termina la extensin de sangre (en la parte final del cuerpo y comienzos de la cola), en esta porcin se hallan separados unos de otros y si se tocan no se sobreponen. Glbulos rojos o eritrocitos normales Tamao: 7 - 8 m. Forma: Redonda o ligeramente irregular Color: La periferia se tie de color rosa intenso; el centro lo hace de color rosa plido, o bien es casi incoloro.
120
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
b. Macrocitos (M)
Se observan en anemia macrocticas debido a deficiencia de cido flico o vitamina B 12 Y en ciertos padecimientos hepticos. Tamao: Son eritrocitos grandes, de aproximadamente 9 - 10 m.
c. Anisocitosis
Se observan en anemias de diferentes causas.
Tamao:
Son eritrocitos de diferentes tamaos que se encuentran en la misma sangre; hay eritrocitos de 9 m mezclados con eritrocito s de 6 m.
121
Procedimientos de Laboratorio
b. Esferocitos
Se observan en anemia hemoltica. Tamao: Pequeo (6 m).
c. Eritrocitos anillados
Se observan en anemia drepanoctica, talasemia y otras anemias debido a hemoglobina anmala. Tamao: Forma: Color: 6 - 8 m. Redonda o ligeramente irregular. El centro y la orilla se tien intensamente, pero entre ambos se observa un anillo incoloro.
122
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
Citoplasma:
e. Eritrocitos falciformes
Se observan en las anemias falciformes o drepanoctica y la talasemia falciforme. Forma: Alargada y estrecha con uno o ambos extremos curvos.
123
Procedimientos de Laboratorio
INCLUSIONES ANORMALES
c.
En estos eritrocitos se observa lneas delgadas que adoptan la forma de "8". Siempre que se encuentre con eritrocitos anormales y difciles de identificar enve el frotis al laboratorio de referencia.
124
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
MATERIALES
Una pipeta para sangre, graduada hasta 50 L (0,05 mL o 50 mm3) con tubo de goma. Una pipeta de 1 mL, graduada. Una cmara de recuento de Neubauer, de preferencia con "lnea brillante". Tapar la cmara con la laminilla de vidrio especial que la acompaa. Lquido para dilucin: solucin de Turk
125
Procedimientos de Laboratorio
MTODO
1. Trasladar 0,95 mL del lquido para dilucin de leucocitos en un frasco pequeo con la pipeta de 1 mL.
2. Con la pipeta para sangre aspirar sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,05 mL. Si la sangre es venosa asegurarse que se mezcle completamente invirtiendo el frasco que contiene la sangre y el anticoagulante varias veces durante un minuto, luego aspirar con la pipeta.
3. Limpiar el exterior de la pipeta que contiene la sangre, con papel absorbente. Asegurarse que la sangre contine en el mismo nivel.
4. Depositar la sangre en el frasco que contiene el lquido para dilucin. La dilucin de esta sangre ser de 1 x 20.
126
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
6.
7 .
Montar la laminilla de vidrio en la cmara para recuento, presionndola cuidadosamente para colocarla en su sitio. Si se ha montado adecuadamente, entre las dos superficies de vidrio se observan unas bandas de color, llamadas "anillos de Newton".
III
8.
Con una pipeta pasteur llenar la cmara de recuento, slo el rea cuadriculada.
9. Si el lquido se derrama en el canal que se encuentra entre las dos cmaras, la operacin se debe repetir: retirar y limpiar la laminilla de vidrio; limpiar tambin la cmara para recuento y llenarla con otra gota. 10. Dejar reposar la cmara por 3 minutos, para que las clulas se asienten. 11. Colocar la cmara en la platina del microscopio. Con el objetivo de 10x enfocar el rea cuadriculada de la cmara y con el objetivo de 40x contar los leucocitos.
127
Procedimientos de Laboratorio
MTODO DE RECUENTO
Contar los leucocitos en un rea de 4 mm2 utilizando los cuadros numerados 1, 3, 7 y 9, se debe incluir en el recuento los leucocitos que se observan sobre las lneas de cada cuadro revisado.
2. Notificar el resultado como el nmero de leucocitos que hay en 1 mm3 de sangre sin diluir. Ejemplo: En los cuatro cuadros se cuentan 188 clulas. Resultado que se notifica: 9 400 leucocitos/mm3 de sangre.
128
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
El recuento del nmero de eritrocitos o glbulos rojos se expresa por mm3 (milmetro cbico). La sangre se deposita en un lquido para diluir eritrocitos. Luego, se cuentan los eritrocitos en una cmara de recuento, por medio del microscopio, y se calcula el nmero que existe por mm3 de sangre. Es importante conocer el nmero de eritrocitos o glbulos rojos. Se halla concentraciones bajas: en pacientes con anemia causada por prdida de eritrocitos o hemlisis. Y concentraciones elevadas: en pacientes con deshidratacin o con policitemia, etc.
129
Procedimientos de Laboratorio
MATERIALES
Una pipeta para sangre, hasta 0,02 mL (20 mm3 o 20 m) con tubo de goma y boquilla. Una pipeta de 5 mL, graduada. Una cmara de recuento de Neubauer. Liquido para dilucin: solucin de citrato y formaldehdo (ver Anexos).
MTODO
l.
Trasladar 4,0 mL del lquido para dilucin de eritrocitos en un frasco pequeo con la pipeta de 5 mL.
2. Con la pipeta para sangre aspirar sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,02 mL. Si la sangre es venosa asegurarse que se mezcle completamente invirtiendo el frasco que contiene la sangre y el anticoagulante varias veces durante un minuto, luego aspirar con la pipeta.
130
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III 3. Limpiar el exterior de la pipeta que contiene la sangre, con papel absorbente. Asegurarse que la sangre contine en el mismo nivel.
Sangre
III
4. Depositar la sangre en el frasco que contiene el lquido para dilucin. La dilucin de esta sangre ser de 1 x 200.
5.
Enjuagar la pipeta aspirando y expulsando este lquido tres veces en el mismo frasco.
6.
7 .
Montar la laminilla de vidrio en la cmara para recuento, presionndola cuidadosamente para colocarla en su sitio. Si se ha montado adecuadamente, entre las dos superficies de vidrio se observan unas bandas de color, llamadas anillos de Newton.
131
Procedimientos de Laboratorio
8. Con una pipeta Pasteur llenar solo el rea cuadriculada de la cmara de recuento.
9. Si el lquido se derrama en el canal que se encuentra entre las dos cmaras, la operacin se debe repetir: retirar y limpiar la laminilla de vidrio; limpiar tambin la cmara para recuento y llenarla con otra gota.
10. Dejar reposar la cmara por 3 minutos, para que las clulas se asienten.
11. Colocar la cmara en la platina del microscopio. Con el objetivo de l0x enfocar el rea cuadriculada de la cmara y enseguida cambiar al objetivo 40x para contar los eritrocitos.
132
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
l.
III
2. Notificar el resultado como el nmero de eritrocitos que hay por milmetro cbico de sangre sin diluir. Ejemplo: En los primeros cinco cuadros se cuentan 390 clulas. Clulas por milmetro cbico: 390 x 10 000. Resultado que se notifica: 3,9 millones de eritrocitos/mm3.
133
Procedimientos de Laboratorio
HEMATOCRITO
PRINCIPIOS GENERALES
Se llama hematocrito (Hcto) al volumen total que ocupan los eritrocitos, dividido entre el volumen de sangre. Ejemplo: si el volumen de los eritrocitos en litro (1 000 mL) de sangre es de 450 mL, el hematocrito ser: 450 mL / 1 000 mL. Este resultado se notifica como un porcentaje de 45%. Se tiene el mtodo de microescala, la sangre se deposita en un tubo capilar largo y se centrifuga empleando un "cabezal para microhematocrito". Luego se mide el nivel de la columna de eritrocitos por medio de una escala especial. Es el mtodo ms rpido y se emplea sangre extrada de un dedo.
MTODO DE MICROESCALA
MATERIALES
134
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
Tubos capilares con heparina (heparina seca como anticoagulante) de 75 mm de longitud y 1,5 mm de dimetro interior. Si la sangre venosa est mezclada con bipotsica de EDTA no ser necesario que los tubos contengan heparina. Cera blanda o arcilla. Lanceta para extraccin de sangre capilar.
PROCEDIMIENTO
III
l.
Obtener sangre capilar. La sangre deber salir libremente o despus de exprimir muy suavemente el rea.
3. Aplicar el extremo delgado (marcado con un crculo rojo) del tubo capilar con heparina sobre la gota de sangre. La sangre ingresar en el tubo por capilaridad. Llenar los 3/4 del tubo.
4. Taponar el extremo contrario del tubo, que no ha estado en contacto con la sangre, con la cera blanda o arcilla. Asegurarse que el taponamiento sea hermtico y que la cera llegue a unos 2 mm de profundidad dentro del tubo.
135
Procedimientos de Laboratorio
Si no tiene cera o arcilla, cerrar el extremo del tubo calentndolo cuidadosamente sobre la llama de una lmpara de alcohol. Dejar enfriar en posicin horizontal.
5. Disponer de una gradilla numerada en que haya colocado arcilla. As el tubo de cada paciente se puede fijar en posicin vertical junto al nmero que le corresponde.
6. Colocar los tubos en las ranuras del cabezal de la centrfuga, el extremo del tubo que se ha taponado con cera deber apuntar hacia fuera, lejos del centro. Verificar que el nmero de la ranura corresponda al nmero de la muestra.
7 .
8. Al finalizar la centrifugacin cada uno de los tubos tendr en su interior tres capas: En la parte superior, una columna de plasma (P). A la mitad, una capa delgada de glbulos blancos (GB). En la parte inferior y hasta el fondo, una columna de glbulos rojos (GR).
136
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
a. Uso de la escala
l. Sostener el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columna de los glbulos rojos quede exactamente al mismo nivel que la lnea horizontal correspondiente al 0. Desplazar el tubo a travs de la escala hasta que la lnea marcada con el nmero 1,0 quede al nivel del tope de la columna de plasma. Vigilar que el fondo de la columna de los glbulos rojos contine sobre la lnea 0; tambin asegurarse que el tubo se encuentre en posicin completamente vertical.
2.
III
3. Leer la lnea que pase al nivel del tope de la columna de glbulos rojos, que indicar el hematocrito de stos: En la figura es 0,4 que se notifica como porcentaje igual a 40% (ver figura). Las lneas finas no remarcadas de la escala corresponden a intervalos de 0,05.
l.
Medir en mm la longitud de toda la columna, desde el tope del plasma hasta la base de la columna.
2. Medir en mm la longitud de la columna de eritrocitos. 3. Usar la siguiente frmula: Hcto = Longitud de la columna de eritrocitos Longitud de toda la columna
137
Procedimientos de Laboratorio
4.
138
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
MATERIALES
Un espectrofotmetro o colormetro fotoelctrico calibrado. Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) de 0,02 mL (20 mm 3 o 20 m) con tubo de goma y boquilla. Una pipeta graduada de 5 mL. Tubos de ensayo. Lquido de Drabkin para dilucin (Ver Anexos). Solucin estandarizada para cianometahemoglobina.
139
Procedimientos de Laboratorio
2. Ajustar la concentracin de la solucin de referencia a la dilucin utilizada en este mtodo (250 es el factor de dilucin cuando, 0,02 mL de sangre se diluyen con 5 mL del lquido de Drabkin). Por lo que se aplicar la siguiente frmula:
Ejemplo Concentracin de la solucin de referencia = 60 mg / l00 mL Entonces el valor de la concentracin ajustada en g / 1 000 mL, ser: 60 x 2,5 = 150 g / 1000 mL Convertido en gramos / 100 mL = 15,0g / 100 mL
Tubo Solucin estandarizada Lquido de Drahkin Dilucin de la solucin estandarizada 1 4,0 mL Sin diluir 2 2,0mL 2,0mL 1x2 3 1,3mL 2,7mL 1x3 4 1,0 mL 3,0 mL 1x4
140
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
5. Leer las diluciones en el colormetro: Colocar en el colormetro un filtro verde o poner la longitud de onda en 540 nanmetros (nm). Llenar un tubo de ensayo al mismo nivel con lquido de Drabkin y colocarlo en el aparato. Poner la aguja del colormetro en cero. Leer en el tablero el contenido de los tubos 1, 2, 3 y 4 usando un tubo de ensayo.
6. Preparar un grfico trazando las lneas de las soluciones estandarizadas diluidas perpendicularmente a la de sus concentraciones. Se dio como ejemplo la concentracin de la solucin de referencia calculada en 15 g/l00 mL, se tiene entonces:
141
Procedimientos de Laboratorio
l.
Depositar 5 mL de lquido de Drabkin con una pipeta para dilucin en un tubo de ensayo.
2. Aspirar sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,02 mL de una pipeta de sangre. Si se usa sangre venosa asegurarse que se mezcle adecuadamente con el anticoagulante.
4. Depositar la sangre en el lquido de Drabkin y enjuagar la pipeta varias veces aspirando y expulsando varias veces el lquido en el mismo tubo.
142
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
5. Mezclar el contenido del tubo y dejarlo reposar por 5 a 10 minutos para que se produzca la hemlisis.
III
6. Poner el colormetro en cero con lquido de Drabkin. Leer en el tablero del colormetro la absorbancia de la sangre diluida del paciente usando el tubo de ensayo.
7 .
8. Si se forma turbidez en la sangre diluida, centrifugar el lquido antes de hacer la lectura en el tablero del colormetro.
143
Procedimientos de Laboratorio
En poblaciones de altura, la hemoglobina se incrementa debido a la hipoxia, por tal razn debe corregirse.
De acuerdo con la altitud, sumar el factor de correccin que se muestra en la tabla siguiente.
Altitud
11 g/l00 mL
Altitud Menor a 1 000 1 000 1 500 2 000 2 500 3 000 3 500 4 000 4 500
Factor de correcin hemoglobina (g/100 mL) 0 0,2 0,5 0,8 1,3 1,9 2,7 3,5 4,5
Factor de correcin hematocrito(%) 0 0,5 1,5 2,5 4,0 6,0 8,5 11,0 14,0
144
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
MATERIALES
Una lanceta estril. Alcohol al 70%. Filtro de papel o papel secante. Un reloj con segundero o un cronmetro.
MTODO
l. Limpiar con suavidad el lbulo de la oreja utilizando una pieza de algodn con alcohol al 70%. No frotar. Dejar secar.
145
Procedimientos de Laboratorio
2. Hacer un pequeo corte de 3 mm de profundidad con la lanceta, en el borde inferior del lbulo de la oreja. A la vez, poner a funcionar su reloj con segundero o cronmetro.
3.
4.
Recoger la primera gota en una esquina del papel del filtro o papel secante. No tocar la piel con el papel.
5. Esperar 30 segundos y recoger la segunda gota de sangre en el papel secante, pero un poco ms adelante de la primera gota.
6. Recoger las siguientes gotas de sangre una cada 30 segundos. Las gotas sern cada vez ms pequeas. Cuando las gotas dejen de salir y el papel secante ya no absorba sangre, detener el funcionamiento del reloj o del cronmetro.
146
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III 7 . Anotar el tiempo transcurrido, segn el reloj o el cronmetro. Otro mtodo consiste en contar el nmero de gotas recogidas en el papel secante y multiplicarla por 30 segundos. Ejemplo:
Sangre
III
Si se han recogido siete gotas. El tiempo de sangrado es 7 x 30 segundos = 210 segundos, convertidos en minutos es 3 minutos.
RESULTADOS
El tiempo de sangra normal aplicando el mtodo de Duke es de 1 - 5 minutos. Comunicar el resultado indicando el valor normal que corresponde al mtodo usado (mtodo de Duke). Si el tiempo se prolonga el paciente requiere un estudio de plaquetas.
147
Procedimientos de Laboratorio
MATERIALES
Dos tubos de ensayo de 75 x 10 mm marcados para el nivel de 1 ml. Un cronmetro. Un bao mara a 37 C.
148
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
MTODO
l. Obtener sangre venosa por puncin.
2. Poner a funcionar el cronmetro tan pronto como la sangre empiece a entrar en la jeringa. Extraer 2,5 ml.
III
3. Llenar con esta sangre cada uno de los dos tubos de ensayo hasta la marca de 1 mL. Taponar ambos tubos con algodn no absorbente.
5.
Despus de 3 minutos sacar el primer tubo del bao mara. Inclinar el tubo hasta un plano de 45 para observar si la sangre se ha coagulado. Repetir el paso 5 para el segundo tubo.
149
Procedimientos de Laboratorio
6.
Si la sangre no ha coagulado, colocar los tubos otra vez en el bao mara y examinarlos cada 30 segundos hasta que se observe la formacin del cogulo. La formacin del cogulo corresponde al momento en que resulta posible invertir cada tubo sin que se derrame su contenido.
ATENCIN!
Al observar la formacin del cogulo, detener el cronmetro y anotar separadamente el tiempo de coagulacin requerido por cada tubo.
RESULTADOS
El resultado definitivo del tiempo de coagulacin es el promedio de los dos resultados. Ejemplo
150
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
Los grupos sanguneos se heredan segn las leyes genticas. Son cuatro tipos y reciben el nombre de sistema de grupos sanguneos ABO. En toda transfusin sangunea se deber determinar con mucho cuidado los grupos sanguneos de cada donador y cada receptor. El paciente solo recibir sangre de su propio grupo. La tipificacin de los grupos sanguneos se realiza:
III
Probando los glbulos rojos (para reconocer sus antgenos) con sueros clasificadores conocidos, anti A, anti B, y anti AB. Probando el suero (para identificar sus anticuerpos) con glbulos rojos de ensayo conocido, perteneciente a los grupos A, B y O.
En los hospitales pequeos y en caso de urgencia, puede ser que el paciente deba recibir sangre de un grupo distinto al suyo, segn las siguientes reglas:
Grupo sanguneo A: Deber recibir sangre del grupo A; si no se dispone de ella, usar sangre del grupo O. Grupo sanguneo B: Deber recibir sangre del grupo B; si no se dispone de ella, usar sangre del grupo O.
151
Procedimientos de Laboratorio
Grupo sanguneo AB: Deber recibir sangre del grupo AB; si no se dispone de ella, usar sangre del grupo A, del grupo B o del grupo O (en este orden). Grupo sanguneo O: Slo podr recibir del grupo O.
Grupo O A B AB
Los eritrocitos del paciente se enfrentan con tres antisueros: anti A, anti B y anti AB. Los antisueros se conservarn segn las instrucciones del fabricante. No es conveniente usar un antisuero si se nota turbio, es probable que se encuentre contaminado por bacterias, no se deber usar. El estudio se puede efectuar en un portaobjetos, o bien en un tubo de ensayo (especialmente en los casos dudosos).
152
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
III
2. Aspirar el plasma con una pipeta Pasteur. Conservar este plasma para clasificar grupos sanguneos por medio de eritrocitos estandarizados. SANGRE VENOSA COAGULADA
l.
153
Procedimientos de Laboratorio
3. Aspirar el suero con una pipeta Pasteur. Conservar el suero para hacer clasificaciones de grupos sanguneos por medio de eritrocitos estandarizados.
SANGRE CAPILAR l. Este mtodo es til en nios. Depositar tres gotas de solucin de citrato trisdico en concentracin de 38 g/L (ver Anexos).
2. Colocar en el mismo tubo, inmediatamente diez gotas de sangre. Esta sangre no se coagular.
2. Centrifugar. Aspirar y eliminar el lquido sobrenadante. 3. Aadir nuevamente 2 mL de solucin de cloruro de sodio. 4. Agitar el tubo suavemente. De este modo se ha obtenido una suspensin de glbulos rojos al 10%.
154
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
PROCEDIMIENTO
1. Preparar y numerar tres portaobjetos:
Portaobjetos 1: Agregar una gota de anti A. Portaobjetos 2: Agregar una gota de anti B. Portaobjetos 3: Agregar una gota 4de anti AB.
III
2. Agregar a cada portaobjetos una gota de la suspensin preparada de glbulos rojos al 10%.
3. Mezclar la preparacin de cada portaobjetos con un aplicador de madera (o un palito de dientes). Usar un aplicador nuevo en cada portaobjetos.
4. Hacer oscilar el portaobjetos hacia delante y hacia atrs para terminar de hacer la mezcla.
LECTURA
155
Procedimientos de Laboratorio
LECTURA
La lectura se debe realizar antes de que transcurran 2 minutos, para evitar una falsa aglutinacin. Aglutinacin positiva (+) Se forman pequeos conglomerados de glbulos rojos que flotan en un lquido claro. Esta aglutinacin deber ocurrir en menos de 2 minutos. Reaccin negativa (-) Los glbulos aglutinan. rojos no se
RESULTADOS
El resultado final se identifica haciendo la lectura de los tres portaobjetos.
Portaojetos Anti A + + -
Portaojetos Anti B + + -
Portaobjetos 3 Anti AB + + + -
156
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
MATERIALES
Una pipeta gotera, calibrada para suministrar 20 gotas por mL. Pipetas Pasteur con perillas de goma (chupn). Una centrfuga. Solucin de cloruro de sodio (ver Anexos). Tubos de ensayo de 50 x 11 mm, para el lavado de los eritrocitos. Eritrocitos testigos de los grupos A, B, y O. Antisueros: anti A, anti B y anti AB. Tubos de ensayo pequeos, con una gradilla.
III
157
Procedimientos de Laboratorio
PROCEDIMIENTO
1. Preparar y numerar tres tubos de ensayo:
Tubo 1: Agregar una gota de anti A. Tubo 2: Agregar una gota de anti B. Tubo 3: Agregar una gota de anti AB.
3. Si no cuenta con una centrfuga, dejar reposar los tubos durante una hora a temperatura ambiente
4.
Si se cuenta con una centrfuga, dejar reposar los tubos por 15 minutos a temperatura ambiente. Luego centrifugar, por un minuto a baja velocidad.
158
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
LECTURA
l.
Sacudir ligeramente el fondo del tubo de ensayo y luego examinar el sedimento de glbulos rojos.
III
Aglutinacin positiva (+) Los glbulos rojos forman uno o ms conglomerados y se observa un lquido sobrenadante claro.
Reaccin negativa (-) Los glbulos rojos vuelven a formar una suspensin fcilmente, sin aglutinacin visible.
Si ocurre una aglutinacin dbil colocar una gota de suero de los eritrocitos y examinar con el microscopio, usando el objetivo l0x.
159
Procedimientos de Laboratorio
Aglutinacin evidente Se observa grandes conglomerados de glbulos rojos sobre un fondo claro.
Aglutinacin dbil Se observan conglomerados pequeos de glbulos rojos y algunos glbulos rojos sueltos en el campo microscpico.
4. Si los glbulos rojos no aglutinan y forman "columnas de moneda", aadir dos gotas de solucin de cloruro de sodio a la gota de la mezcla de glbulos rojos que se encuentra en el portaobjetos. Examinar con el microscopio si existe aglutinacin positiva los conglomerados de glbulos blancos conservar su forma y si es negativa, la "columna de monedas" se dispersar.
160
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
Para la determinacin del grupo Rhesus (Rh), se hace una prueba que permite detectar el antgeno D, empleando el suero anti D. Se dice que los individuos son Rh positivos, cuando son portadores del antgeno D.
III
161
Procedimientos de Laboratorio
l. Centrifugar 2,5 mL de sangre durante 5 minutos a alta velocidad. 2. Verificar que el volumen del sedimento de eritrocitos sea igual al volumen del plasma sobrenadante. Si el plasma es mayor aspirar el excedente con la pipeta hasta que ambos volmenes sean iguales. 3. Mezclar el plasma y los eritrocitos con suavidad.
SANGRE COAGULADA l. Romper el cogulo con una pipeta para dispersar los eritrocitos.
2. Trasladar una porcin de eritrocitos sueltos, acompaados de suero, a un tubo de centrifugacin. 3. Centrifugar por 5 minutos a alta velocidad. 4. Aspirar con una pipeta el exceso de suero hasta que el volumen de este y el de los eritrocitos sean iguales. Mezclar el suero y los eritrocitos con suavidad.
5.
162
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
6. Verificar la presencia de eritrocitos sueltos, para lo cual se extiende una gota de la suspensin mezclada en un portaobjetos limpio y se examina con el microscopio a 10x. Si contiene conglomerados de eritrocitos desechar esta suspensin y preparar otra, fresca.
MTODO
1. Encender el calentador elctrico, cuya temperatura deber ser de 40 C en la superficie. Colocar los portaobjetos numerados sobre el calentador y dejarlos por 5 minutos.
III
2. Si no se dispone de un calentador elctrico calentar los portaobjetos sobre la llama de un mechero de alcohol antes de iniciar la prueba. Probar la temperatura sobre el dorso de la mano; el calor deber ser soportable.
3. Depositar en el portaobjetos una gota de la mezcla de eritrocitos y del suero que se va a examinar ms gota de suero anti D.
163
Procedimientos de Laboratorio
4. Mezclar empleando un aplicador, un palito de dientes o el extremo redondo de un tubo de ensayo pequeo.
RESULTADOS
Rh positivo En el centro y la periferia de la mezcla se observa claramente un gran nmero de pequeas aglutinaciones de eritrocitos. Estas aglutinaciones se debern formar en menos de 3 minutos.
164
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
MTODO
l. Preparar una suspensin de eritrocitos al 2% en su propio suero o plasma. Ajustarlo para 2%.
III
2.
Colocar en un tubo de ensayo 1 gota de la suspensin de eritrocitos al 2 % ms una gota de suero anti D.
3.
RESULTADOS
Examinar el lquido que se encuentra en el fondo del tubo de ensayo, colocando el tubo en posicin casi horizontal, sobre una superficie iluminada.
165
Procedimientos de Laboratorio
Rh negativo
ATENCIN!
En caso de duda, calentar un portaobjetos, aspirar una gota de sedimento de eritrocitos con una pipeta Pasteur y preparar un frotis. Examinarlo con el microscopio a 10x. Desechar el suero anti D contaminado, si est turbio y blanquecino. Frecuentemente se producen resultados falsos negativos porque los tubos se han tratado con movimientos bruscos Se debe leer las instrucciones que figuran en las etiquetas de los frascos para usar estos antisueros. Algunos sueros anti D se elaboran para usarlos nicamente con el mtodo del tubo de ensayo o el mtodo del portaobjetos. Es difcil identificar el grupo al que pertenece si la sangre ha permanecido ms de 2 das en la refrigeradora. La sangre recogida en un recipiente con citrato de sodio solo se podr determinar por el mtodo del tubo de ensayo.
166
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
COMPATIBILIDAD SANGUNEA
PRINCIPIOS GENERALES
Esta prueba llamada tambin "Prueba cruzada". Consiste, en determinar si el suero del paciente contiene anticuerpos que aglutinen los eritrocitos del donador.
III
MATERIALES
Suero del paciente. Suspensin al 5% de eritrocitos Lavados del donador. Albmina bovina al 20%. Bao Mara o incubadora a 37 C. Una centrfuga. Pipetas Pasteur.
MTODO
1. Preparar una suspensin al 5% de eritrocitos lavados del donador.
167
Procedimientos de Laboratorio
3. Colocar en cada tubo numerado dos gotas de suero fresco del receptor y 2 gotas de la suspensin al 5% de eritrocitos lavados del donador.
4. Mezclar los eritrocitos y el suero con suavidad, golpeando el fondo de cada tubo.
5. Colocar los tubos en un bao Mara o una incubadora a 37 C durante 90 minutos. En caso de urgencia es probable que no se pueda incubar los tubos durante el tiempo necesario. Si se cuenta con menos de 45 minutos, examinar el tubo 1: Centrifugar el tubo 1 a baja velocidad. Examinar con el microscopio empleando el objetivo de l0x el sedimento de los eritrocitos.
Si no existe aglutinacin se puede aceptar la sangre para el paciente, pero se debe escribir la siguiente nota en la etiqueta de la bolsa de sangre "Sangre compatible segn estudio urgente".
6.
Aadir dos gotas de albmina bovina al 2% al tubo 2. No mezclar, incubar durante otros 20 - 30 minutos.
168
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
RESULTADOS
Observar con el microscopio el sedimento de eritrocitos de cada tubo; para lo cual: Aspirar con una pipeta Pasteur el sedimento de eritrocitos. Evitar agitarlo demasiado. Extender el sedimento portaobjetos limpios. en
III
Examinar con el microscopio empleando el objetivo 10x, para determinar si existe aglutinacin.
Si no hay aglutinacin: La sangre es compatible y se puede administrar sin riesgos al paciente. Si hay aglutinacin: La sangre es incompatible y no se debe administrar.
169
Procedimientos de Laboratorio
Se han descrito un gran nmero de mtodos para su determinacin. Estos mtodos se diferencian por el anticoagulante empleado, las dimensiones del tubo, el volumen de sangre y el tiempo utilizado.
Esta prueba es ampliamente utilizada en el diagnstico y pronstico de diversos estados patolgicos como: Lupus eritematoso. Artritis reumatoide. Espondilitis anquilosante, etc.
La medicin de VSE se deber efectuar en menos de dos horas despus de que se haya obtenido la sangre. La VSE aumenta con la temperatura, a partir de los 23 C. En climas clidos se debe vigilar que los tubos empleados para VSE no se coloquen en un lugar caluroso del laboratorio.
170
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
MATERIALES
Un tubo de Westergren de 300 mm de longitud y 2,5 mm de dimetro interior. Graduado de 0 a 200 mm. Anticoagulante: citrato trisdico en proporcin de 38g/L (3,8%). Una jeringa de 5 mL. Un cronmetro o reloj.
III
MTODO
171
Procedimientos de Laboratorio
3. Depositar 1,6 mL de la sangre venosa en el frasco que contiene la solucin de citrato trisdico.
4.
5. Aspirar la sangre del frasco, y depositarla en el tubo de Westergren hasta la lnea 0. Evitar la formacin de burbujas en el interior del tubo.
7 .
Esperar durante 1 hora exacta (usar su cronmetro o reloj) y a continuacin, medir la altura de la columna del plasma segn la graduacin en mm (milmetros) del tubo a partir de la lnea 0, del extremo superior.
172
MINISTERIO DE S LUD
Captulo III
Sangre
RESULTADOS
Se expresa en VSEmm de altura. Los valores normales de Westergren son: Sexo Hombre Mujer Una hora 3 - 5 mm 4 - 7 mm Dos horas 7 - 15 mm 12 - 17 mm
III
Ventajas del mtodo Este mtodo es el ms sensible de la VSE para el estudio de enfermedades crnicas. Desventajas del mtodo Requiere mayor cantidad de sangre que otros mtodos.
MTODO DE WINTROBE
MATERIALES
Un tubo de hematocrito Wintrobe. Anticoagulante para 5 mL de sangre venosa. Una jeringa. Un cronmetro o reloj.
MTODO
l. Preparar el anticoagulante; mezclando 6 mg de oxalato de amonio ms 4 mg de oxalato de potasio. 2. Colocar 1 mL de sangre venosa en un tubo o frasco conteniendo solo 2 mg del anticoagulante.
173
Procedimientos de Laboratorio
3. Mezclar bien por inversin suave. 4. Aspirar la sangre del tubo o frasco y depositarla en el tubo de Wintrobe. Evitar la formacin de burbujas en el interior del tubo. Colocar el tubo en la gradilla de Wintrobe, en posicin completamente vertical. Esperar durante una hora exacta (usar su cronmetro o reloj). A continuacin, medir la altura de la columna del plasma segn la graduacin en milmetros (rnm) del tubo a partir del extremo superior.
5. 6.
RESULTADOS
Se expresan en VSEmm de altura. Los valores normales de Wintrobe son: Sexo Hombre Mujer Nios Lmite 0-7 mm 0-15 mm 1-15 mm Promedio 4 mm 10 mm 5 mm
Ventajas del mtodo Es sencillo, requiere pequea cantidad de sangre. Con la misma preparacin, una vez que se ha determinado la VSE, puede calcularse el valor del hematocrito y pueden hacerse frotis de la capa de clulas blancas. Desventajas del mtodo El exceso de mezcla de oxalato en el mtodo de Wintrobe puede hacer que la lectura de VSE aparezca baja, debido a que el oxalato retarda la sedimentacin.
174
MINISTERIO DE S LUD
CAPTULO
IV
ESPUTO
OBTENCIN DE ESPUTO......................................... 177 Principios generales............................................... 177 RECIPIENTES PARA RECOLECTAR MUESTRAS DE ESPUTO.......................................... 177 PROCEDIMIENTO DE OBTENCIN.......................... 178 Expectoracin espontnea..................................... 178 Expectoracin inducida.......................................... 179 EXAMEN DIRECTO DEL BACILO DE LA TUBERCULOSIS........................................................ 180 BACILOSCOPA......................................................... 180 Principios generales............................................... 180 Preparacin del extendido...................................... 180 Coloracin del extendido: Tcnica de Ziehl Neelsen....................................... 184 Observacin microscpica de la muestra Coloreada............................................................... 187 Mtodo de lectura................................................... 188 Informe de resultados de baciloscopla................... 189 Registro diario de baciloscopla............................... 190 CULTIVO DE BK......................................................... 191 Principios generales............................................... 191 Materiales............................................................... 192 Mtodos.................................................................. 193 Mtodo para muestras obtenidas aspticamente... 193 Mtodo para muestras contaminadas.................... 194 Lectura.................................................................... 198 Informe de resultados del cultivo............................ 199 Preparacin de medios de cultivo.......................... 199 PRUEBA DE SENSIBILIDAD DE M.tuberculosis A LOS MEDICAMENTOS ANTITUBERCULOSOS.... 204 Principios generales............................................... 204
Captulo IV
Esputo
OBTENCIN DE ESPUTO
PRINCIPIOS GENERALES
Una buena muestra Es aquella que proviene del rbol bronquial, y se obtiene despus de un esfuerzo de tos. Sin embargo, una muestra con apariencia de saliva puede ser positiva. Muestra suficiente Es aquella con un volumen aproximado a 5 a 10 mL. La hora de obtencin puede ser a cualquier hora del da, de preferencia ser el primer esputo de la maana y siempre antes del desayuno. El ambiente donde se obtiene la muestra debe tener buena ventilacin y debe prohibirse la presencia de otras personas, al momento de la obtencin de la muestra.
IV
En general, debern ser de boca ancha (aproximadamente 5 cm de dimetro) y 5 cm de altura. As, el paciente puede expectorar con facilidad dentro del recipiente y el laboratorista al momento de efectuar el examen directo puede elegir la mejor parte.
177
Procedimientos de Laboratorio
PROCEDIMIENTO DE OBTENCIN
EXPECTORACIN ESPONTNEA
1. Indicar al paciente que se ponga de pie.
2. Solicitar que haga un movimiento inspiratorio profundo, llenando de aire los pulmones.
3. Indicar al paciente que vacie los pulmones con una sola espiracin, tosiendo al mismo tiempo tan fuerte y profundamente como pueda.
178
MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV
Esputo
EXPECTORACIN INDUCIDA
Cuando el paciente no logra expectorar y es necesario el examen de esputo, se puede inducir la obtencin de la muestra de la siguiente manera:
1.
Acostar al paciente boca abajo sobre una camilla o cama, haciendo que su cabeza rebase el borde.
IV
2. Colocar una almohada doblada debajo del trax para lograr un plano inclinado, de modo que la base del trax quede ms alto que la boca, asimismo pedir que deje caer ambos brazos y la cabeza hacia el piso. 3. Indicar al paciente que inspire, retenga el aire y luego lo expulse con fuerza hasta obtener la expectoracin.
4. Escupir en el recipiente rotulado que deber estar sobre un papel peridico en el piso.
179
Procedimientos de Laboratorio
ATENCIN!
Procesar las muestras por series, cada serie no debe ser mayor a doce muestras. Preferentemente los portaobjetos deben ser nuevos, desgrasados con alcohol, en lo posible no reutilizar las lminas positivas.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV
Esputo
MATERIALES
Lminas portaobjetos, que no estn rayadas. Aplicadores o palitos de madera (bajalenguas). Mechero de alcohol.
Lpiz graso o para marcar vidrio. Papel peridico. Bandeja de acero inoxidable o fierro enlozado para recepcin de muestras (dimensiones recomendadas: 60 x 40 x 10 cm). Fenol al 5% (ver Anexos). Soporte de madera para lminas portaobjetos.
IV
PROCEDIMIENTO
l.
Colocar sobre la mesa de trabajo una hoja doble de papel peridico o la bandeja de fierro con papel peridico, humedecido con fenol al 5%.
2.
Colocar los envases conteniendo las muestras de esputo previamente rotuladas sobre la mesa de trabajo.
181
Procedimientos de Laboratorio
4. Numerar los envases y las lminas portaobjetos con el lpiz graso en forma correlativa. Trazar una lnea en el tercio inferior de cada lmina portaobjetos en la cara opuesta del extendido empleando el lpiz graso, la que dividir la superficie de la lmina en una tercera parte destinada a la numeracin y dos terceras partes para hacer el extendido.
5. Destapar cuidadosamente el envase de la muestra, manteniendo la boca del envase cerca del mechero encendido.
6. Dividir el aplicador de madera (bajalengua) en dos o tres partes y agarrarlo entre el pulgar y el ndice de la mano, para luego seleccionar y extraer la porcin muco-purulenta de color amarillo verdoso del esputo, enrollndola en el aplicador.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV 7 . Colocar la porcin elegida sobre el portaobjetos y extenderla, haciendo movimientos en vaivn, hasta lograr que el extendido sea uniforme (ni muy fino ni muy grueso), tratando de dispersarla en el centro de la lmina, dibujando un crculo u valo de 2 cm de largo por 1 a 2 cm de ancho, sin llegar a los bordes de la lmina, para evitar que el laboratorista se contamine al manipularla.
Esputo
8. Verificar que el extendido tenga grosor homogneo y adecuado. Si es demasiado fino, es posible producir un resultado falso negativo. Si es muy grueso, el material puede desprenderse durante la coloracin o puede resultar difcil la visualizacin de bacilos debajo de una capa gruesa de mucus. 9. Colocar el extendido, sobre el soporte de madera para lminas portaobjetos y dejar secar a temperatura ambiente.
IV
10. El extendido no debe ser calentado a la llama mientras est hmedo pues el calor fuerte altera la estructura de los bacilos y su posterior tincin; adems puede generar aerosolos.
11. Tomar el extendido seco con una pinza manteniendo la cara que contiene la muestra hacias arriba y pasarlo rpidamente sobre la llama del mechero tres o cuetro veces cuidando que no se caliente demasiado.
ATENCIN!
Nunca debe calentarse la lmina mientras se haga el extendido, debido a que por el calor se forma precipitado granulos.
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Procedimientos de Laboratorio
12. Los extendidos deben ser coloreados de inmediato, ya que algunos bacilos pueden permanecer vivos despus de fijados con calor hasta que incorporan la fucsina. 13. Terminado el extendido, descartar los aplicadores en un recipiente que contenga una solucin de hipoclorito de sodio al 1%; este recipiente ir al autoclave o directamente a incineracin.
MATERIALES
Una serie de lminas portaobjetos con extendidos fijados. Dos varillas de vidrio unidas por sus extremos, por un tubo de goma. Reactivos para coloracin: fucsina bsica fenicada, azul de metileno, fenol de cristales, cido clorhdrico, alcohol de 95 y agua destilada (ver Anexos). Un microscopio binocular, con objetivo de l00x. Aceite de inmersin. Un mechero de alcohol. Un soporte de madera para lminas portaobjetos.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV
Esputo
MTODO
l. Colocar sobre los bordes del lavadero las dos varillas de vidrio unidas por sus extremos, por un tubo de goma.
2.
Colocar sobre este soporte de varilla, la serie de lminas fijadas con el extendido hacia arriba, el nmero hacia el lado del laboratorista.
IV
3. Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con el colorante fucsina bsica fenicada. No olvidar filtrar el colorante antes de efectuar la tincin.
4. Calentar suavemente con la llama del mechero de alcohol o con la llama de un hisopo embebido en alcohol, por debajo de cada lmina portaobjetos, hasta la emisin de vapores, repetir el proceso tres veces. No debe hervir la preparacin. Si el volumen del colorante disminuye por evaporacin, agregar ms colorante hasta cubrir el extendido y dejar enfriar. El tiempo mnimo de coloracin con fucsina es de 5 minutos.
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Procedimientos de Laboratorio
5. Eliminar la fucsina tomando la lmina por el extremo numerado, entre el dedo pulgar y el ndice o con una pinza, inc1inndola hacia delante y dejando caer agua corriente a baja presin. Girar el extendido y lavar tambin la parte posterior.
6. Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con la solucin de alcohol cido, durante 2 minutos, hasta obtener una coloracin rosa plido. De ser necesario, decolorar nuevamente y dejar reposar 1 minuto.
7 . Eliminar el alcohol cido, lavar nuevamente las lminas con agua corriente a baja presin, cuidando de no desprender la pelcula que form el extendido.
8. Cubrir la superficie del extendido con el colorante azul de metileno, durante 30 segundos a 1 minuto. Eliminar el azul de metileno y lavar cada lmina con agua a baja presin, por ambas caras de la lmina portaobjetos.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV
Esputo
9. Colocar las lminas coloreadas en orden numrico sobre el soporte de madera y dejar secar al medio ambiente.
ATENCIN!
Las muestras despus de su obtencin deben procesarse de inmediato. En caso de muestras de esputo, si el laboratorio no puede procesarlas el mismo da de su obtencin, pueden conservarse en refrigeracin a 4 C por no ms de una semana.
IV
La observacin microscpica tiene por objetivo: Determinar si en el extendido hay bacilos alcohol cido resistentes (BAAR). Establecer el nmero de estos BAAR.
Se usa un microscopio con objetivo de l00x de aumento. Antes de usarlo, se debe colocar una gota de aceite de inmersin sobre el extendido.
En la observacin microscpica los BAAR presentan las siguientes caractersticas: Son de color rojo fuerte: destacan sobre un fondo azul.
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Procedimientos de Laboratorio
Tienen forma recta o como bastoncitos delgados, ligeramente curvos. Son muy pequeos (1 - 4 m). Son frecuentemente granulosos. Se disponen en grupos de 3 - 10 bacilos que asemejan trozos de hilo o parecen formas de letras torcidas (con frecuencia se encuentran cerca de los hilos de fibrina).
En la observacin microscpica los BAAR se pueden confundir con: Levaduras, que se tien ms o menos de rojo. Al calentarlas se rompen y forman grupos de grnulos voluminosos de color rojo. Manchas de colorante, cuando el portaobjetos no se ha decolorado adecuadamente. No olvidar que otro bacilo patgeno resistente a los cidos es el bacilo de la lepra.
MTODO DE LECTURA
Es importante tener en cuenta que se considera como campo microscpico til, aquel en el cual se observa elementos celulares de origen bronquial, es decir, leucocitos, fibras mucosas y clulas ciliadas. Los campos en que no aparezcan dichos elementos no deben considerarse en la lectura. Una vez identificados los campos proceder de la siguiente manera:
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV l. Observar un mnimo de 100 campos tiles. Hacer un examen completo del primer portaobjetos empleando el objetivo de 100x, avanzando de izquierda a derecha, con iluminacin mxima y sin filtro de color.
Esputo
2. Apuntar el nmero de bacilos observados y el nmero de campos microscpicos tiles a observarse, que variar segn la cantidad de bacilos que contenga la muestra.
IV
+ ++ ++++
Negativo: No se encuentran BAAR EB 100 campos microscpio observados Menos de 1 BAAR por campo, en 1000 campos microscopios observados. 1 a 10 BAAR por campo, en 50 campos microscpio observados. Ms de 10 BAAAR por campo, en 20 campos microscpios observados.
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Procedimientos de Laboratorio
1.
Leer 100 campos ms, contabilizando solo campos microscpicos tiles, en busca de positividad.
2. Si persiste el resultado (1 a 9 BAAR) realizar otro extendido de una porcin ms representativa de la misma muestra, en bsqueda de positividad y reportar el nmero de BAAR observado. 3. Derivar la muestra problema a cultivo para su confirmacin bacteriolgica. 4. Indicar en el formato de resultados, en "observaciones", que se est derivando la muestra a cultivo y sugerir el envo de nuevas muestras del paciente.
Los registros son medios prcticos para obtener informacin que ayudan en las actividades de vigilancia, supervisin y evaluacin del Programa Nacional de Control de Tuberculosis.
Ofrece informacin necesaria para preparar los informes mensuales y trimestrales sobre deteccin y control de casos de tuberculosis. El personal que realiza las baciloscopas estar obligado, bajo responsabilidad, a llevar el registro diario de las baciloscopas efectuadas y velar por la integridad y puesta al da de la informacin. Para ello se requiere un libro donde se consigna una numeracin correlativa anual. Se empezar anualmente el 2 de enero y terminar el 31 de diciembre del mismo ao, desde el nmero 1 hasta el ltimo correspondiente.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV
Esputo
CULTIVO DE BK
PRINCIPIOS GENERALES
El cultivo es el mtodo bacteriolgico ms sensible y especfico para detectar la presencia de Mycobacterium tuberculosis y otras micobacterias. Aporta de 20 a 25% casos ms a lo diagnosticado por baciloscopa. Se indica cultivo para Mycobacterium tuberculosis, en los siguientes casos:
IV
Para diagnstico
Paciente sintomtico respiratorio con BK (-) y radiografa de pulmones con sospecha de TB (Rx anormal). Paciente paucibacilar, es decir, cuando se encuentra de 1 a 9 BAAR en 100 campos microscpicos observados.
Muestras extrapulmonares: todas Ias muestras de biopsias, piezas anatmicas, tejidos y fluidos (exudados, orina, lquido cefalorraqudeo, lquido sinovial, etc) de casos con sospecha de tuberculosis extrapulmonar, debern ser sometidas a cultivo. Toda muestra de paciente inmunosuprimido, especialmente personas viviendo con VIH (virus de la inmunodeficiencia). Toda muestra de personas privadas de su libertad. Persona con tuberculosis pulmonar con algn factor de riesgo de TB MDR Muestras de pacientes menores de 15 aos. De no tener riesgo de TB MDR, se conservar la cepa, para el caso que el nio presente mala evolucin durante su tratamiento.
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Procedimientos de Laboratorio
Para control Persona con tuberculosis con sospecha de fracaso al esquema I o II de tratamiento, por persistencia de baciloscopa positiva al segundo mes de tratamiento o cuando presenta baciloscopa positiva despus de un periodo de negativizacin. Persona con tuberculosis con esquema estandarizado o individualizados para el control del tratamiento.
Otras indicaciones Persona con tuberculosis crnica multitratadas (ms de dos tratamientos previos). En forma excepcional, el laboratorista derivar a cultivo muestras a pedido y bajo responsabilidad del mdico, quienes debern indicar en observaciones de la Solicitud de Investigacin Bacteriolgica en Tuberculosis las condiciones de la persona con tuberculosis que ameriten la prueba, que sean diferentes a Ias antes mencionadas.
MATERIALES
Materiales para la obtencin de muestras. Una centrfuga. Estufa o bao Mara. Mortero de porcelana estril. Mascarilla protectora. Agua destilada estril. Hidrxido de sodio (NaOH) al 4%. Rojo de fenol. cido sulfrico. Tubos estriles con tapa rosca. Mechero de Bunsen o de alcohol.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV Pipeta Pasteur con chupn. Bandeja de madera de fondo inclinado. Gradilla. Tubos con medio de Ogawa acidificada. Tubos con medio de Lowenstein Jensen.
Esputo
MTODOS
IV
Las muestras obtenidas aspticamente son recolectadas en un recipiente estril, y se cultivan sin realizar un proceso de descontaminacin previo. Las muestras recolectadas aspticamente son: Muestras obtenidas por puncin: Lquido cefalorraqudeo, pleural, peritoneal y articular. Muestras obtenidas por biopsia (tejido): Pulmonar, hgado, ganglio.
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Procedimientos de Laboratorio
destilada estril, hasta obtener una suspensin que puede ser inoculada directamente en el medio de cultivo.
Las muestras contaminadas tales como: esputo, orina, contenido gstrico, etc. deben ser descontaminadas antes del cultivo. La descontaminacin tiene por objeto: Eliminar la flora asociada a M.tuberculosis, cuyos grmenes se multiplican ms rpido que el bacilo. Homogeneizar (uniformizar) la muestra, especialmente el esputo, a fin de liberar al bacilo M.tuberculosis del mucus, material celular y tejidos.
l.
Se procede de la siguiente manera: Centrifugar las muestras de orina y contenido gstrico a 3 000 o 3 500 RPM (revoluciones por minuto) durante 20 a 30 minutos.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV
Esputo
a. Descontaminacin con centrifugacin (Mtodo de Petroff) y uso del medio de Lowenstein Jensen
l. Trabajar frente a la llama del mechero. Cada operador debe procesar en series de doce muestras por vez. Es conveniente trabajar utilizando tubos con tapa rosca; si no se cuenta con ellos, usar tubos con tapn de algodn bien ajustado.
IV
2. En un tubo, mezclar 2 mL de la muestra con 4 mL de solucin estril de hidrxido de sodio al 4%. Ajustar firmemente la tapa del tubo, para impedir que al agitarlo se diseminen aerosoles que son peligrosos para el operador.
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Procedimientos de Laboratorio
5. Agregar al sedimento 1 - 2 gotas de solucin de rojo fenol (indicador de pH) y 1 - 2 gotas de solucin de cido sulfrico al 10 o 15% para producir el viraje del indicador, desde rojo violceo al amarillo - anaranjado.
6.
Efectuar un lavado para eliminar los restos de cido sulfrico: Agregar aproximadamente 3 mL de agua destilada estril, agitar, centrifugar durante 10 minutos y se desecha el sobrenadante.
7 . Inocular el sedimento al medio de cultivo Lowenstein- Jensen. La can-tidad inoculada a cada tubo de medio de cultivo es de 4 - 5 gotas. Durante el sembrado de la muestra descontaminada, los tubos con el medio de cultivo deben mantenerse en posicin inclinada cerca de la llama.
8.
Tomar con una pipeta Pasteur 1 mL de muestra descontaminada y sembrar 4 - 5 gotas en cada tubo de medio de cultivo, dejando escurrir la muestra sobre la superficie del medio, sin tocarla con la pipeta.
196
MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV
Esputo
9. Una vez sembrados los tubos con medio de cultivo, colocarlos sobre una bandeja de fondo inclinado, para que el lquido sembrado cubra toda la superficie del medio. Llevarlos a la estufa a una temperatura entre 35 y 37 C, dejando floja la tapa de cada tubo para que pueda evaporarse la parte lquida de la siembra. 10. Despus de 48 horas, revisar los tubos y, si se ha evaporado el lquido, ajustar la tapa rosca. Si se usan tapn de algodn, flamearlo e introducido con una pinza y cerrar con un tapn de jebe estril.
IV
l.
Sobre la mesa de trabajo colocar las muestras numeradas y en una gradilla colocar tubos estriles numerados con la misma secuencia de las muestras.
2. Colocar 1 mL de muestra (esputo. sedimento de muestra centrifugada, etc.) en cada tubo estril de acuerdo con la numeracin correspondiente. Agregar 4 mL de solucin estril de hidrxido de sodio (NaOH) al 4%. 3. Dejar a 37 C por 20 minutos en estufa o en bao mara.
4. Retirar los tubos de la estufa o bao mara, homogenizar (mezclar) el contenido de cada tubo con una pipeta e inocular 0,1 mL (por tubo) en dos tubos de medio Ogawa, y baar toda la superficie del medio.
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Procedimientos de Laboratorio
5. Colocar los tubos en una bandeja de madera de fondo inclinado, e incubar en estufa a 37 C.
LECTURA
El desarrollo de M.tuberculosis generalmente aparece luego de 2 a 3 semanas. Las observaciones de los cultivos se hacen despus de 48 horas de incubacin de la muestra, para descartar contaminacin: Alcalinizado: color blanco amarillo. Acidificado: color azul oscuro, por mala descontaminacin (neutralizacin) de la muestra. El desarrollo de colonias antes de las 48 horas es indicativo de contaminacin, algunas veces el medio se lica por accin de grmenes proteolticos.
Las revisiones posteriores se realizarn durante la incubacin a los 7, 30 y 60 das. Si no se observan colonias en el tiempo mencionado, se deja los cultivos hasta las 8 semanas antes de proceder a informar el resultado como negativo. Las colonias tpicas son de color crema, rugosas, con aspecto de coliflor y de borde irregular. Se desarrollan en la superficie del medio y el sitio en que se implantan no cambia de color. De las colonias que no tienen una morfologa tpica, se debe hacer un extendido y colorearlo por Ziehl Neelsen para examinarlo. Si son bacilos cido - alcohol resistente (BAAR), se debe enviar el cultivo al laboratorio de referencia para su identificacin.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV
Esputo
No se observa colonias. Nmero total de colonias, si hay menos de 20. De 20 a 100 colonias.
++
Colonias separadas de 100 a 200. Colonias confluentes (agrupadas), se observan en toda la superficie del medio. Cultivo contaminado.
IV
+++
199
Procedimientos de Laboratorio
Tubos de ensayo con tapa rosca o algodn 16 x 160 mm. Un coagulador a gas o elctrico, regulable a 80 - 85 C, con bandeja de fondo inclinado.
CONSTITUYENTES
Solucin de sales: Fosfato monopotsico (P04H2K) Citrato de magnesio Glicerina bidestilada Agua destilada 2,4 g g 0,6 g 12 600 mL mL Sulfato de magnesio (S04Mg7H20) ,24
L-asparagina 3,6 g
1 000 mL
MTODO
l. Disolver las tres primeras sales y la asparagina en 200 - 300 mL de agua destilada. Calentar en bao mara hasta disolucin de la asparagina.
2. Pasar la solucin del paso 1 a un frasco de 2 000 mL de capacidad, agregar agua destilada hasta completar 600 mL y 12 mL de glicerina. 3. Esterilizar en el autoclave durante 15 minutos a 121 C. Dejar enfriar a temperatura ambiente. 4. Los huevos deben ser frescos. Limpiarlos con agua y detergente, enjuagar con agua corriente y dejar secar. Luego, lavarlos con alcohol de 70.
200
MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV
Esputo
5. Con las manos cuidadosamente lavadas, quebrar los huevos uno por uno en el borde de una probeta de 1 L y observar la yema de cada uno, que debe ser firme y conservar la forma redonda, sin aplastarse ni romperse. 6. Vaciar los huevos de la probeta en el vaso de la licuadora y mezclarlos a baja velocidad durante algunos segundos cuidando de no causar exceso de burbujas. 7 . Vaciar los huevos homogenizados (mezclados) en el frasco que contiene la solucin de sales, asparagina y glicerina. 8. Agregar la solucin de verde de malaquita. 9. Agitar el frasco en forma circular.
IV
10. Filtrar el contenido por el embudo cubierto de gasa, recibir el filtrado en el frasco fraccionador cuidando de cerrar con pinza de Mohr el cao de salida. 11. Distribuir el medio hacindolo escurrir por la pared del tubo, flameando la boca del tubo al sacarle y ponerle la tapa.
12. El coagulador, debe haberse encendido previamente hasta lograr una temperatura de 85 C.
13. Asegurarse que cada tubo y el ngulo de la bandeja del coagulador, donde se colocan los tubos, sean adecuados como para que el medio forme en el tubo un plano inclinado, quedando por lo menos 3 cm entre la boca del tubo y el extremo del plano inclinado.
201
Procedimientos de Laboratorio
14. No deben transcurrir ms de 15 a 20 minutos desde el momento del llenado del tubo hasta la colocacin en el coagulador. 15. Colocar los tubos en el coagulador durante 30 minutos a la temperatura descrita. 16. Terminada la coagulacin, llevar los tubos a una estufa a 37 C, dejndolos con las tapas ligeramente flojas durante 48 horas para controlar su esterilidad y permitir que se elimine el agua de condensacin. 17 . Transcurridas las 48 horas, ajustar bien las tapas para evitar la desecacin y guardar los tubos en refrigeracin. Si se usan tubos con tapn de algodn, se guardarn en bolsas de plstico cerradas hermticamente, a fin de mantener la humedad.
ATENCIN!
Se recomienda no usar el medio despus de transcurridos 2 meses desde su preparacin.
MTODO
l. PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE SALES - Disolver en 100 mL de agua destilada, el fosfato monopotsico y el glutamato de sodio y colocar en bao mara a 100 C o en autoclave a
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV 121 C por 15 minutos. Luego, enfriarla a temperatura ambiente. 2. PREPARACIN DE HUEVO HOMOGENIZADO
Esputo
Lavar los huevos con detergente y enjuagar con agua de cao, dejar secar en una canastilla de alambre. Limpiar los huevos con algodn embebido en alcohol al 70% y dejar secar. Romper los huevos uno por uno y verter en un vaso pequeo, para comprobar si estn en buenas condiciones, de lo contrario descartar y cambiar de vaso. Vaciar los huevos en un beaker y mezclar con una bagueta o palillos estriles. Filtrar utilizando cuatro capas de gasa estril.
3.
Agregar 6 mL de glicerol y 6 mL de verde de malaquita al 2% a la solucin de sales y mezclar bien. Agregar el huevo homogeneizado lentamente a la solucin del paso 3, evitando la formacin de burbujas. Mezclar suavemente y dejar reposar por 30 minutos.
IV
4.
5.
6. Distribuir el medio en tubos de 20 x 125 mm, en una proporcin de 6 mL por tubo, evitando la formacin de burbujas. 7 . Colocar los tubos inclinados en el coagulador y dejar a 90 C por una hora.
8. Despus de la coagulacin, sacar los tubos y dejarlos enfriar. Luego, guardarlos en bolsas de plstico y cerrarlas hermticamente, anotando la fecha de preparacin. Pueden guardarse en el refrigerador hasta por un mes.
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Procedimientos de Laboratorio
Es un examen para determinar la sensibilidad o resistencia de una cepa de M.tuberculosis a los frmacos antituberculosis. El laboratorio de referencia nacional para la realizacin de pruebas de sensibilidad es el Instituto Nacional de Salud (INS) y/o laboratorios acreditados por ellos y por un laboratorio supranacional a solicitud del INS. El mtodo de las proporciones es utilizado como el estndar internacional para la realizacin de las pruebas de sensibilidad a frmacos de primera lnea. Consiste en determinar la proporcin de mutantes resistentes de una poblacin a una o ms drogas. Para las pruebas de sensibilidad a drogas de segunda lnea se utilizar el mtodo del agar en placa. Se debe solicitar la prueba de sensibilidad a drogas de primera lnea en el momento del diagnstico, a toda persona con tuberculosis que tenga alto riesgo de desarrollar TB MDR: Antecedente de ser contacto de paciente con TB MDR confirmada con prueba de sensibilidad (PS) o en tratamiento con drogas de segunda lnea. Coinfeccin VIH. Diabetes mellitus. Tratamiento prolongado con corticoides. Recada en menos de seis meses de egresar como curado de esquema uno o dos de tratamiento. Persona con tuberculosis multitratada. Personal de salud activo o cesante con menos de dos aos de cesanta. Estudiantes de ciencias de la salud que realizan actividades en reas clnicas y/o de laboratorio y/o salas de necropsia. Internos de penales o exinternos de penales. Trabajador de establecimientos penitenciarios. Contacto de paciente fallecido por tuberculosis, durante el tratamiento. Personas con antecedente de tratamiento previo particular y/o autoadministrado.
204
MINISTERIO DE S LUD
Captulo IV
Esputo
Personas con antecedente de abandono de tratamiento antituberculoso. Antecedente de hospitalizacin previa por cualquier motivo en los ltimos dos aos, por ms de 15 das. Tratamiento previo con presencia de reaccin adversa a frmacos antituberculosos (RAFA) que oblig a modificar dosis y/o cambiar y/o suprimir algn medicamento. Contacto de persona con tuberculosis que fracas a tratamiento antituberculosis. Cepas de cultivo positivo, de personas con infeccin VIH o SIDA/TB. Se debe solicitar la prueba de sensibilidad a drogas de primera y segunda lnea a: Toda persona con tuberculosis que ingresa a un esquema de tratamiento que incluya medicamentos de segunda lnea. Toda persona con tuberculosis con prueba de sensibilidad que indique presencia de bacilos MDR. Antecedente de contacto con persona con TB MDR confirmada o en tratamiento para TB MDR. Antecedente de contacto de persona con tuberculosis tratado con medicamentos de segunda lnea. Antecedente de haber recibido drogas de segunda lnea por un perodo mayor de 30 das. Abandono a esquemas de tratamiento con medicamentos de segunda lnea. Fracaso a esquemas de tratamiento con medicamentos de segunda lnea. Recada a esquema de tratamiento con medicamentos de segunda lnea. Pruebas rpidas de sensibilidad BACTEC 460 TB es responsabilidad del INS. GRIESS, es una prueba directa a partir de muestras de esputo. Detecta resistencia a isoniacida y rifampicina y ser de responsabilidad de los laboratorios de referencia regional y de laboratorios intermedios validados. MODS, es otra alternativa de prueba directa a partir de muestras de esputo, detecta resistencia a isoniacida y rifampicina y ser de responsabilidad de los laboratorios de referencia regional y de laboratorios intermedios validados.
IV
205
CAPTULO
V
ORINA
OBTENCIN DE ORINA............................................ 209 Principios generales............................................... 209 RECIPIENTES PARA ORINA...................................... 211 Materiales............................................................... 211 Mtodos de obtencin............................................ 211 EXAMEN DIRECTO DE FROTlS DE ORINA............. 213 Principios generales............................................... 213 Materiales............................................................... 213 Mtodo.................................................................... 214 Lectura e informe.................................................... 215 SEDIMENTOS URINARIOS........................................ 216 Principios generales............................................... 216 Elementos microscpicos de los sedimentos urinarios.................................................................. 217 Preparacin del sedimento urinario........................ 228 GRAVEDAD ESPECFlCA Y pH DE LA ORINA......... 230 MEDICIN DE LA GRAVEDAD ESPECFICA............ 230
Principios generales............................................... 230 Materiales............................................................... 230 Mtodo.................................................................... 231 Lectura y resultados............................................... 231 MEDICIN DEL pH..................................................... 233 Principios generales............................................... 233 Materiales............................................................... 233 Mtodo.................................................................... 233 Resultados.............................................................. 234 USO DE TABLETAS Y TIRAS REACTlVAS EN LOS EXMENES DE ORINA.............................................. 235 Principios generales............................................... 235 Tabletas y tiras reactivas........................................ 236 PRUEBA DEL EMBARAZO........................................ 238 Principios generales............................................... 238 Materiales............................................................... 238 Mtodos.................................................................. 239 Mtodo del tubo de ensayo.................................... 239 Mtodo del portaobjetos......................................... 239
Captulo V
Orina
OBTENCIN DE ORINA
PRINCIPIOS GENERALES
La cantidad apropiada de orina que se debe recoger es de aproximadamente 50 mL. Es importante la higiene personal previa a la obtencin de la orina. La contaminacin de la orina es frecuente por bacterias localizadas debajo del prepucio, en secreciones vaginales, en uretra distal, bacterias de la mano, de la piel y de ropas.
La higiene personal previa a la obtencin de la orina es necesaria hacerla en el momento de tomar las muestras y no antes.
MUJERES
Debern lavar el rea genital en todos los casos. Evitar recolectar muestras durante los periodos menstruales. Utilizar compresas de gasa estril, en una solucin de jabn antisptico, y limpiar alrededor del meato urinario, separando los labios vaginales. Enjuagar bien con agua estril mientras se mantienen separados los labios vaginales. Secar con gasa estril.
209
Procedimientos de Laboratorio
HOMBRES
Debern lavar el rea genital en todos los casos. Utilizar varias compresas de gasa estril, en una solucin de jabn antisptico para limpiar el glande. Si no est circuncidado, retraer el prepucio o piel que cubre el glande y mantenerlo retrado hasta que termine la limpieza. Enjuagar con agua estril. Secar con gasa estril.
210
MINISTERIO DE S LUD
Captulo V
Orina
MATERIALES
Recipientes indicados: estril o limpio segn sea el examen solicitado. Jabn antisptico. Gasa estril.
MTODOS DE OBTENCIN
Recoger la muestra a la mitad de la miccin. Eliminar la primera parte de la miccin y desecharla. La orina que emite a continuacin se recoge directamente en el recipiente. Tapar el recipiente y terminar de orinar libremente.
211
Procedimientos de Laboratorio
Las muestras obtenidas con sonda, deben ser efectuadas por un mdico o un personal de salud capacitado. Se indica en situaciones especiales que determina el mdico. En nios la orina se puede recoger en una bolsa de material plstico con boca adhesiva, que se fija alrededor de los rganos genitales del nio durante 1 - 3 horas, dependiendo del examen solicitado. Muestras de 24 horas El paciente deber orinar en la maana, al levantarse; esta orina no se recoge. Posteriormente, toda la orina que se produzca durante el resto del da se reunir en el frasco, as como toda la orina que se produzca en el curso de la noche. Al da siguiente, cuando el paciente se levante deber depositar en el frasco la primera orina de la maana. El frasco se llevar inmediatamente al laboratorio.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo V
Orina
MATERIALES
Un recipiente estril, para la obtencin de la muestra. Una centrfuga. Tubos cnicos para centrifugacin, estriles, con tapa rosca o tapn. Un portaobjetos. Un asa de siembra. Un mechero Bunsen.
Reactivos para las tinciones de Gram y Ziehl Neelsen (Ver Anexos). Aceite de inmersin. Un microscopio.
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Procedimientos de Laboratorio
MTODO
l. Verter 10 mL de la orina obtenida en el tubo cnico para centrifugacin, estril, de preferencia con tapa rosca o taponado con un taco de algodn estril que se fijar en la boca del tubo con gasa y un hilo.
4.
Mezclar el sedimento, que queda en el fondo del tubo, usando un asa de siembra estril (flameado) hasta que se forme una suspensin homognea (uniforme).
5.
6. Teir el frotis del portaobjetos 1 con tincin Gram y el portaobjetos 2 con tincin Ziehl Neelsen (ver Anexos)
214
MINISTERIO DE S LUD
Captulo V
Orina
2. Buscar pus, es decir, numerosos leucocitos teidos de rojo. 3. Buscar microorganismos como: 4. Bacilos gramnegativos. Cocos grampositivos. Levaduras gramnegativos.
Para informar sobre los resultados, indicar si se ha observado leucocitos o pus, microorganismos, etc., haciendo una descripcin precisa. Ejemplo: Abundantes leucocitos. Escasos eritrocitos. Escasas clulas epiteliales.
215
Procedimientos de Laboratorio
SEDIMENTOS URINARIOS
PRINCIPIOS GENERALES
En las personas sanas la orina casi no contiene microorganismos. La orina contiene elementos microscpicos en suspensin: clulas, cristales, etc. Como todos estos elementos en suspensin se sedimentan en la orina, si esta se deja en reposo durante algunas horas, se les llama sedimentos urinarios. En ciertas enfermedades del aparato urinario se pueden encontrar bacterias: Cuando existe una infeccin en el conducto inferior, uretritis; en la vejiga, cistitis; en los riones, nefritis. Cuando se excretan en la orina bacterias de una infeccin que afecta otra parte del organismo.
Cuando existen las condiciones mencionadas en el tem anterior, los sedimentos se alteran y se pueden encontrar los siguientes elementos: Pus. Nmero anormal de glbulos rojos o eritrocitos. Cristales anormales.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo V
Orina
Para expresar la cantidad de eritrocitos es importante usar un solo mtodo, para lo cual se recomienda usar: Una gota de sedimento urinario con pipeta Pasteur calibrada (50 gotas por cada mL). Un cubreobjetos de 20 x 20 mm. Examinar con el microscopio usando el objetivo de 40x.
La lectura e informe teniendo en consideracin lo anterior ser el siguiente: De 0 - 10 eritrocitos por campo = Escasos eritrocitos. De 10 - 30 eritrocitos por campo = Cantidad moderada de eritrocitos. Ms de 30 eritrocitos por campo = Abundantes eritrocitos.
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Procedimientos de Laboratorio
Para expresar la cantidad de leucocitos se emplea el mismo mtodo usado para los eritrocitos. La lectura e informe respecto a la cantidad de leucocitos es el siguiente: De 0 - 10 leucocitos por campo = escasos leucocitos. De 10 - 20 leucocitos por campo = cantidad moderada de leucocitos. De 20 - 30 leucocitos por campo = abundantes leucocitos. Racimos de ms de 20 leucocitos degenerados = se observan numerosos leucocitos en racimos. Racimos de leucocitos y numerosos leucocitos degenerados = campo lleno de leucocitos.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo V
Orina
c. Levaduras
No se deben confundir con eritrocitos. Se observan ocasionalmente en muestras de orina que contienen glucosa. Se debe verificar que la orina sea fresca (antes de que transcurran 2 horas desde la miccin). Se observan con las siguientes caractersticas: Tamao: Forma: 5 - 12 m. cuerpos redondeados de varios tamaos, a veces se les observa en gemacin (brote).
d. Trichomonas
De gran movilidad en la orina fresca. Se observa: Tamao: 15 m. Forma: redonda, globular. Membrana ondulante: lateral. Flagelos: cuatro flagelos.
e. Espermatozoides
Se encuentran ocasionalmente en la orina de los hombres. Se observa: Cabeza: muy pequea, 5 m Flagelo: largo y flexible, 50 m. Movilidad: mviles en la orina muy fresca.
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Procedimientos de Laboratorio
f.
Clulas epiteliales
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Captulo V
Orina
CLULAS RENALES
Son pequeas, granulosas y de ncleo visible. Casi siempre se encuentran junto con las protenas urinarias.
g. Cilindros
Tienen aspecto de cilindro y son alargados. Cruzan casi todo el campo microscpico cuando se examinan con el objetivo de 40x. Se forman durante las enfermedades de los tbulos renales, que se pueden llenar de sangre, de otras clulas y de depsitos de sustancias qumicas. Existen difrentes tipos de cilindros:
CILINDROS HIALINOS
Se encuentran en individuos sanos despus de esfuerzos musculares intensos. Son transparentes y refractan la luz. Sus extremos son redondeados o delgados.
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Procedimientos de Laboratorio
CILINDROS GRANULOSOS
Provienen de clulas epiteliales degeneradas de los tbulos renales. Estos cilindros son cortos, llenos de grnulos voluminosos, de color amarillo y extremos redondeados.
CILINDROS SANGUNEOS
Los cilindros se encuentran llenos de eritrocitos ms o menos degenerados, de color castao.
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Captulo V
Orina
ATENCIN!
No se debe confundir con cilindros : Las acumulaciones de cristales de fosfatos, que son pequeas y delimitadas. Las acumulaciones de moco translcido, cuyos extremos se adelgazan hasta tomar forma de hilos.
h. Cristales
Los cristales pueden tener las siguientes formas: Formas geomtricas uniformes (A). Formas amorfas, que consisten en acumulaciones de grnulos pequeos sin forma definida (B).
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Procedimientos de Laboratorio
CIDO RICO (EN ORINA CIDA) Asemejan formas de cuadros, rombos, cubos o "rosas". Tamao: 30 - 150 m. Color: amarillo o rojo pardo.
FOSFATOS TRIPLES (EN ORINA NEUTRA O ALCALlNA) De forma rectangular o semejante a hojas de helecho o estrella. Tamao: 30 - 150 m. Color: incoloro, refractan la luz.
URATOS (EN ORINA ALCALlNA) Asemejan cactus o grupos de agujas, frecuentemente se encuentran junto con los fosfatos. Tamao: 20 m. Color: amarillo, refractan la luz.
224
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Captulo V BILIRRUBINA Es muy raro de hallarla Forma: muy pequeos, de forma cuadrada, esfricos o en agujas. Tamao: 5 m. Color: castao.
Orina
SULFONAMIDAS (EN ORINA NEUTRA O CIDA) Se observa en pacientes que estn siendo tratados con sulfonamidas. Se debe notificar la existencia de estos cristales, ya que pueden causar lesiones renales. Forma: de formas variadas (ruedas o agujas).
CRISTALES MENOS FRECUENTES Fosfato clcico (en orina neutra o alcalina) De forma estrellada. Tamao: 30 - 40 m. Color: incoloro.
Carbonato clcico (en orina neutra o alcalina) Agrupados en pares, asemejan granos de maz Tamao: pequeos. Color: incoloro.
Sulfato clcico (en orina cida) Forma de prismas alargados separados o formando haces. Tamao: 50 - 100 m.
225
Procedimientos de Laboratorio
CRISTALES AMORFOS
FOSFATOS AMORFOS (EN ORINA ALCALlNA) Grnulos pequeos, dispersos. Blanquecinos.
i.
Sustancias extraas
Sustancias extraas que se encuentran en el sedimento cuando: Se usan recipientes o portaobjetos sucios. Las muestras de orina se dejan expuestas al aire.
Entre dichas sustancias tenemos: Gotas pequeas de aceite (refractan la luz) (a). Grnulos de almidn (se tien de negro azulado) (b). Granos de polen (c). Pelos (d). Fibras de algodn (e). Burbujas (f).
MATERIALES
Una centrfuga elctrica o manual. Un tubo cnico de 15 mL para centrifugacin. Una pipeta Pasteur, calibrada para que suministre 50 gotas por cada mL. Un portaobjetos y cubreobjetos 20 x 20 mm.
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Captulo V
Orina
PROCEDIMIENTO
l.
Mezclar la orina.
2. Verter la orina en un tubo para centrifugar hasta llenar 3/4 partes de su capacidad.
URATOS AMORFOS (EN ORINA CIDA) Grnulos muy pequeos, de color amarillento, agrupados en racimos compactos. En la orina que se ha conservado en el frigorfico se suelen encontrar gruesos precipitados de uratos.
227
Procedimientos de Laboratorio
CISTINA (EN ORINA CIDA) Se encuentran en la cistinuria (enfermedad hereditaria). Forma: laminillas hexagonales. Tamao: 30 - 60 m. Color: incoloras.
COLESTEROL (EN ORINA CIDA) Forma: laminillas cuadradas con escotaduras en un lado.
4. Verter el sobrenadante de la orina centrifugada, invirtiendo el tubo en un vaso para anlisis (no sacudir el tubo).
5. Agitar el tubo para que el sedimento forme nuevamente suspensin. Extraer algunas gotas de esta suspensin con una pipeta.
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Captulo V
Orina
6. Colocar una gota de la suspensin en un portaobjetos y cubrirlo con el cubreobjetos. No olvidar numerar el portaobjetos con el nmero que contiene la muestra.
7 .
Examinar inmediatamente con el microscopio: Primero, examinar con el objetivo 10x. Luego, examinar con el objetivo 40x. No usar filtro de color.
229
Procedimientos de Laboratorio
La gravedad especfica se mide por medio de un urinmetro calibrado de 1 000 a 1 060. La temperatura de la orina tambin se debe medir para calcular correctamente la gravedad especfica.
MATERIALES
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Captulo V
Orina
MTODO
l. Verter 40 mL de orina en la probeta.
2.
3. Esperar a que el urinmetro se detenga. El urinmetro no debe tocar paredes ni el fondo de la probeta.
4. Leer la gravedad especfica, que indica la escala del urinmetro en la superficie de la orina, es decir, el punto inferior del menisco. 5. Retirar el urinmetro. Medir la temperatura de la orina inmediatamente con el termmetro.
LECTURA Y RESULTADOS
Tomar nota de: La temperatura medida en la orina.
231
Procedimientos de Laboratorio
A la gravedad especfica medida: Agregar 0,001 por cada 3 C que mida la temperatura de la orina por arriba de la temperatura de calibracin del urinmetro. Restar 0,00 1 por cada 3 C que tenga la orina por debajo de la temperatura de calibracin del urinmetro.
Ejemplo La temperatura de la orina es de 26 C. La temperatura del urinmetro calibrado es de 20 C. La gravedad especfica medida es de 1,021.
Entonces: La temperatura de la orina es 6 C mayor que la temperatura de calibracin del urinmetro. Agregar a la gravedad especfica: 6/3 x 0,001 = 2 x 0,00 1 = 0,002
Los resultados son: Gravedad especfica normal 1,020 (variacin normal: 1,010 - 1,025). Gravedad especfica baja Menos de 1,010 (en casos de transtornos renales, endocrinos. Carece de importancia si el paciente ha ingerido una gran cantidad de lquidos antes de la prueba). Gravedad especfica elevada Superior a 1,025 (en casos de prdidas de glucosa y protenas por la orina).
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Captulo V
Orina
MEDICIN DEL pH
PRINCIPIOS GENERALES
La orina normal tiene una reaccin ligeramente cida, con un pH de 6,0 aproximadamente. En ciertas enfermedades el pH de la orina puede aumentar o disminuir. Una manera prctica y rpida de determinar el pH es sumergir en la orina piezas de papel indicador de colores. El color cambia segn el pH. Este papel indicador se compara con un cuadro estandarizado testigo en el que figuran las cifras correspondientes.
MATERIALES
Muestra de orina fresca (recin eliminada). Una pinza.
Papeles indicadores de tipo universal, para medir pH en intervalos de 1 a 10. Papeles indicadores de graduacin limitada para intervalos de 5,0 - 7,0 y 6,0 8,0.
MTODO
l. Tomar con la pinza la tira de papel indicador de tipo universal, el cual se sumerge 0,5 cm en la orina y se observa su color.
233
Procedimientos de Laboratorio
2. Comparar el color que se ha producido con los que figuran en el cuadro estandarizado. Vea la cifra del pH en la unidad cuyo color corresponda ms estrechamente al de la tira de papel.
3.
Segn el resultado obtenido repetir el paso 1 con una tira de papel indicador de graduacin limitada.
Ejemplo: Para pH 6: usar el papel indicador con intervalo de 5,0 - 7,0 Para pH 8: usar el papel indicador con intervalo de 6,0 - 8,0.
4. Comparar el color producido con los que figuren en el cuadro estandarizado del papel indicador de graduacin limitada.
RESULTADOS
pH normal Aproximadamente 6,0 (lmite del intervalo normal, de 5,0 a 7,0 durante el da). pH cido 4,5 - 5,5 (casos de diabetes, fatiga muscular, acidosis, etc.). pH alcalino 7,8 - 8,0 (en casos de infeccin urinaria, alimentacin vegetariana, etc.).
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo V
Orina
PRINCIPIOS GENERALES
Son productos comerciales, y su presentacin puede ser: Tiras de papel reactivas que se sumergen en la orina. Tabletas sobre las cuales se depositan gotas de orina. Tabletas que se ponen en contacto con la orina.
Si el resultado es positivo, hay un cambio de color en las tiras y las tabletas. Las ventajas de este mtodo son: Fciles y rpidos de usar. No requiere de utensilios de vidrio, balanzas o sustancias qumicas.
Las desventajas de este mtodo son: El costo de estos reactivos es alto. En ciertos casos son poco estables y no reaccionan.
ATENCIN!
Es necesario : Seguir las instrucciones del fabricante. Conservar estos productos en los lugares secos. Conservar tapado el frasco que contiene estos productos inmediatamente despus de usarlos.
235
Procedimientos de Laboratorio
Cuando el resultado es positivo hay un cambio de color, dependiendo del reactivo impregnado en la tira o tableta. En todos los casos, sea con tiras o tabletas, se deben poner en contacto con la orina, sumergiendo las tiras o colocando gotas en las tabletas.
a. Deteccin de glucosa
Las tiras estn impregnadas con glucosa oxidasa y reactivos de color. Si el resultado es positivo se forma en el papel un color violeta azulado. Se puede usar para confirmar un resultado dbilmente positivo que se haya obtenido por medio de mtodos que no sean especficos.
b. Deteccin de protenas
Las tiras estn impregnadas con azul de tetrabromofenol. Si el resultado es positivo se forma en el papel un color verde amarillento (huellas de protenas) o verde azulado (fuertemente positivo). Algunos son demasiado sensibles y pueden dar resultados dbilmente positivos que son falsos.
236
MINISTERIO DE S LUD
Captulo V
Orina
e. Deteccin de urobilingeno
Las tiras estn impregnadas del p-dimetilaminobenzaldehdo. El resultado positivo produce un color rojo.
237
Procedimientos de Laboratorio
PRINCIPIOS GENERALES
La prueba del embarazo se basa en la presencia de gonadotrofina corinica humana (HCG) en la orina de la mujer embarazada. Actualmente se dispone de preparados comerciales para detectar la HCG urinaria, que resultan ms rpidos y econmicos. Con este tipo de prueba en general, los resultados positivos se observan a partir de 15 das despus de que ha existido retraso en el perodo menstrual.
Las muestras de orina se deben obtener en un frasco limpio, bien enjuagado. Si quedan huellas de un detergente, puede causar un resultado falso.
ATENCIN!
La prueba debe realizarse sin demora, si esto no es posible, conservar la orina en la refirgeradora
MATERIALES
Reactivo comercial para llevar a cabo la prueba. Un tubo de ensayo o un portaobjetos.
238
MINISTERIO DE S LUD
Captulo V
Orina
2. Resultados Resultado positivo Se observa un anillo uniforme de color rojo pardo, en el fondo del tubo. Resultado negativo No se forma anillo. El lquido contina siendo homogneo
2. Seguir las instrucciones del fabricante. 3. Resultados a. Resultado negativo Las partculas de ltex se aglutinan sobre el portaobjetos.
b. Resultado positivo No se produce aglutinacin (lo impide la HCG que se encuentra en la orina de la mujer embarazada).
239
CAPTULO
VI
PARASITOLOGA Y MICOLOGA
OBTENCIN DE HECES............................................ 243 Principios generales............................................... 243 RECIPIENTES PARA HECES.................................... 245 Materiales............................................................... 245 Mtodo de obtencin.............................................. 246 PROCEDIMIENTOS DE DIAGNSTICO EN PARASITOLOGA....................................................... 249 GUA DE IDENTIFICACIN....................................... 249 HELMINTOS ADULTOS QUE SE ENCUENTRAN EN HECES.......................... 250 Helmintos redondos frecuentes.............................. 250 Tenias o helmintos planos segmentados.......................................................... 251 Otros helmintos...................................................... 254 HUEVOS Y LARVAS DE PARASITOS INTESTINALES........................................................... 255 Principios generales............................................... 255 Caractersticas de los huevos................................ 256 AMEBAS, FLAGELADOS Y CILlADOS: FORMAS MVILES.................................................................... 262 Principios generales............................................... 262 Amebas.................................................................. 262 Flagelados.............................................................. 264 Ciliados................................................................... 265 AMEBAS, FLAGELADOS Y CILlADOS: FORMAS QUSTICAS................................................................. 266 Principios generales............................................... 266 Quistes de amebas................................................. 267 Quistes de flagelados y ciliados............................. 268 EXAMEN DIRECTO DE HECES................................. 269 Principios generales............................................... 269 EXAMEN DE TINCIN CON YODO Y CON SOLUCIN SALINA O CLORURO DE SODIO.............................. 270 Materiales............................................................... 270 Mtodo.................................................................... 270 EXAMEN DE HUEVOS DE OXIUROS MTODO DE LA CINTA ADHESIVA............................ 273 Principios generales............................................... 273 Materiales............................................................... 273 Mtodo.................................................................... 273 MTODO DE CONCENTRACIN DE PARSITOS... 274 Principios generales............................................... 274 Mtodo de flotacin de Faust................................. 274 Mtodo de sedimentacin de Ritchie..................... 276 EXAMEN DIRECTO DE Trichomonas EN SECRECIONES GENITOURINARIAS........................ 279 Principios generales............................................... 279 Materiales............................................................... 279 Mtodo.................................................................... 279 EXAMEN DE GOTA GRUESA Y FROTIS PARA LA IDENTIFICACIN DE Plasmodium........................... 281 Principios generales............................................... 281 Coloracin de la gota gruesa y frotis...................... 282 Examen microscpico del Plasmodium.................. 286 Principios generales............................................... 286 Frotis....................................................................... 288 Gota gruesa............................................................ 290 Determinacin de la densidad parasitaria.............. 293 OBTENCIN DE MUESTRAS PARA DIAGNSTICO DE LEISHMANIASIS.................................................. 297 Muestra de cuerpos fluidos (linfa).......................... 297 Muestra de frotis..................................................... 298 Muestra de tejido (biopsia)..................................... 300 EXAMEN DIRECTO Y CULTIVO EN EL DIAGNSTICO DE LEISHMANIASIS TEGUMENTARIA..................... 302 Principios generales............................................... 302 Procesamiento e identificacin del parsito............................................................. 303 EXAMEN QUMICO PARA ENCONTRAR SANGRE OCULTA EN LAS HECES........................................... 310 Principios generales............................................... 310 Materiales y reactivos............................................. 310 Mtodo.................................................................... 310 Precauciones en el laboratorio............................... 312 Precauciones para el paciente............................... 312 OBTENCIN DE ESCAMAS...................................... 313 Principios generales............................................... 313 EXAMEN DIRECTO CON HIDROXIDO DE POTASIO AL 10%........................................................................ 313 Materiales............................................................... 314 Procedimientos....................................................... 314 Lectura.................................................................... 314 Control de calidad interna....................................... 315 CULTIVO Y TIPIFICACIN DE HONGOS DERMATOFITOS........................................................ 315 Materiales............................................................... 315 Procedimiento......................................................... 316 Lectura.................................................................... 316 Control de calidad interna....................................... 319 MEDIOS DE CULTIVO................................................ 319 Agar Sabouraud glucosado.................................... 319 Agar papa glucosado.............................................. 320
Captulo VI
Parasitoga y micologa
OBTENCIN DE HECES
PRINCIPIOS GENERALES
Cada muestra debe contener, por lo menos 4 mL (4 cm3). Esta es necesaria para facilitar la deteccin de los parsitos cuando se encuentran poco concentrados.
ATENCIN!
Nunca dejar las muestras de heces expuextas al aire en recipiente sin tapa. Nunca dejar muestras para examinarlas al terminar la maana (2 o 3 horas despus). Nunca aceptar muestras de heces mezcladas con orina.
VI
243
Procedimientos de Laboratorio
ATENCIN!
Nunca dejar lubricantes para humedecer el hisopo rectal.
244
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
MATERIALES
Recipientes indicados segn el examen solicitado. Hisopo rectal estril si el examen solicitado es bacteriolgico y el paciente tiene problemas en la recoleccin, o se trata de un nio pequeo.
VI
Para la obtencin de huevos de oxiuros se necesita: Una cinta adhesiva transparente de 12 cm de largo por 1 cm de ancho. Un bajalengua. Una lmina portaobjetos.
245
Procedimientos de Laboratorio
MTODO DE OBTENCIN
a. Examen parasitolgico
Usar un recipiente limpio para obtener la muestra.
1. Pegar la cinta adhesiva en la lmina portaobjeto, dejando que sobresalgan ambos extremos de la cinta.
2.
3. Separar la cinta adhesiva del portaobjeto con suavidad y doblarla sobre el extremo del mango del bajalengua, de tal modo que la parte pegante quede hacia fuera.
246
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI 4. Sostener el extremo formado (bajalengua y la cinta adhesiva) con la mano derecha, presione firmemente el portaobjeto contra el mango del bajalengua.
Parasitoga y micologa
5. Separar con la mano izquierda las nalgas del paciente. Aplicar presionando el extremo del bajalengua cubierto con la cinta adhesiva, en varios sitios de la piel que rodea al ano.
6. Colocar de nuevo la cinta adhesiva sobre el portaobjeto, con el lado adhesivo hacia abajo. Para estar seguro que la cinta se adhiere uniformemente y no se forme burbujas de aire, presionar el portaobjeto con un trozo de algodn.
VI
b. Examen bacteriolgico
Usar un recipiente estril para obtener la muestra.
247
Procedimientos de Laboratorio
En el caso de nios u otros pacientes que tengan problemas en la recoleccin de muestra, obtenerla directamente, introduciendo en el recto un hisopo previamente embebido en el espesor del medio de transporte que se va usar y luego se introduce en el recto. Una vez que est dentro del recto (alrededor de 3 cm), aplicar un movimiento de rotacin amplio al hisopo para arrastrar mucosidad de la pared de la ampolla rectal y luego un movimiento circular pequeo para arrastrar deposicin.
MTODO
l. Colocar el hisopo con la muestra en un tubo estril o en el tercio superior del tubo con medio de transporte.
2.
Cortar la porcin sobrante del palo del hisopo y ajustar fuertemente la tapa del tubo.
248
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
La parasitologa mdica es el estudio de los parsitos que causan enfermedades al ser humano. En el laboratorio se pueden llevar a cabo exmenes de:
VI
Huevos o larvas de helmintos Que son visibles por medio del microscopio.
Protozoarios unicelulares)
(organismos
249
Procedimientos de Laboratorio
a. scaris
Helmintos redondos grandes. Color: rosceo. Grosor: 0,3 - 0,5 cm. Longitud: macho: 15 cm (con cola en forma de bucle). hembra: 20 - 25 cm (con cola recta).
b. Oxiuros
Frecuente en heces de nios. Tambin se pueden hallar en los pliegues de la piel que rodea el ano. Helmintos redondos pequeos. Color: blanco. Longitud: macho: 0,5 cm. hembra: 1 cm (de cola puntiaguda).
250
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
b. Tenias frecuentes
Tena de la res (Taenia saginata) Segmentos rectangulares separados. Salen por el ano acompaados o no de heces. Poros colocados alterna e irregularmente.
VI
Segmentos color marfil, de 1-2 cm. Con veinte ramificaciones uterinas aproximadamente.
251
Procedimientos de Laboratorio
Tena del cerdo(Taenia solium) Pequeas cadenas de 3-4 segmentos rectangulares. Salen por el ano casi siempre acompaados de heces.
c. Examen de tenias
l.
Examinar una cadena de segmentos para observar el orden de los poros laterales
252
MINISTERIO DE S LUD
Parasitoga y micologa
3.
Sostener el portaobjetos contra la luz, observar y contar las ramificaciones uterinas a simple vista.
4.
Para examinar el esclex o cabeza, seguir los siguientes pasos: Colocar todo el helminto en una placa Petri o en un plato lleno de agua. Por medio de una pinza trasladar el helminto poco a poco a otro plato, desenrollarlo comenzando por el extremo ms grueso.
VI
Si al final de la porcin ms delgada (cuello), se observa un ensanchamiento del tamao de un alfiler (esclex o cabeza), examinar con una lupa o microscopio.
253
Procedimientos de Laboratorio
a. Ancylostoma duodenale Presenta una cpsula bucal que muestra dos dientes fusionados.
b. Nector americanus En lugar de dientes, tiene un par de placas semilunares en las superficies ventral y dorsal de la cpsula bucal.
254
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
Los huevos de parsitos intestinales se identifican por su: Tamao. Envoltura. Forma. Contenido.
El tamao de los huevos se puede determinar adaptando una regla micromtrica al ocular del microscopio.
Entre las estructuras que se pueden confundir con huevos de parsitos tenemos: Grnulos de almidn de origen vegetal que son residuos de alimentos, como la papa, la yuca, etc. (a).
VI
Fibras de carne digerida (b). Jabones (c). Burbujas y gotas de grasa (d). Pelos vegetales (e). Granos de polen y esporas de Hongos (f).
255
Procedimientos de Laboratorio
a. Ancylostoma duodenale
Tamao: 50 - 60 m. Forma: oval, con polos o extremos redondos y ligeramente aplanados. Envoltura: delgada, se observa como una lnea oscura. Color: las clulas que hay en su interior son gris plido. Contenido: vara segn el grado de maduracin: Heces frescas: Se observa 4, 8 o 16 clulas granulosas. Heces de menos de 12 horas: masa uniforme compuesta por numerosas clulas granulosas. Heces de 12 a 48 horas: el huevo se encuentra lleno por una larva enrollada sobre s misma, se llama "huevo embrionario".
b. Nector americanus
Los huevecillos son semejantes a los de Ancylostoma, pero un poco ms largos y estrechos de 30 x 40 m a 64 x 76 m.
c. scaris lumbricoides
Existen cuatro tipos de huevos de scaris:
256
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
Tamao: Forma:
Envoltura: tiene dos envolturas: envoltura externa, que es spera, parda, cubierta de pequeas protuberancias (mamelonada). Envoltura interna, que es lisa, gruesa, sin color. Contenido: una sola masa central, redonda y granulosa.
VI
Tamao: Forma:
Envoltura: Tiene dos envolturas: Envoltura externa, que es parda y con protuberancia. Envoltura interna, que es muy delgada, a veces se observa dos lneas. Contenido: Se encuentra lleno de grnulos brillantes, voluminosos y redondos.
257
Procedimientos de Laboratorio
d. Diphyllobothrium latum
Tamao: Forma:
70 m. oval, uniforme.
Envoltura: lisa y delgada. Contenido: masa de clulas pequeas ordenadas alrededor de una clula central voluminosa. Color amarillo plido.
258
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Captulo VI
Parasitoga y micologa
e. Enterobius vermicularis
Tamao: Forma: 50 - 60 m. oval, plana de un lado y redondeada del otro lado. Envoltura: lisa y delgada, a veces se observa doble lnea. Contenido: masa granulosa pequea, oval e irregular. Se puede observar en otros casos el embrin (pequea larva enrollada).
f.
Fasciola heptica
Tamao: 130 m. Forma: oval con polos redondeados. Color: amarillo o pardo oscuro. Envoltura: lisa, con doble lnea. Contenido: una masa de clulas voluminosas granulosas. Otras caractersticas Presenta oprculo (O) en uno de los polos; en esta regin la envoltura es irregular. En el polo contrario hay engrosamiento (E) de la envoltura.
VI
g. Hymenolepis nana
Tamao: Forma: Color: Envoltura: 40 - 45 m. oval o redonda. gris plido. Presenta dos envolturas: La envoltura externa, delgada. La envoltura interna, ms gruesa en los polos, con filamentos que salen a partir de estos. Se observa grnulos entre ambas membranas. Contenido: masa redonda que corresponde al embrin con seis ganchos, dispuestos en forma de abanico y con grnulos en el centro.
259
Procedimientos de Laboratorio
h. Strongyloides stercoralis
LARVAS: Tamao: Cola: Boca: Tubo digestivo: de gran movilidad 200 - 300 m de longitud y 15 m de grosor. delgada. pequea. consta de un esfago (O) con un ensanchamiento en un extremo y un poro anal (A) en el otro extremo. espacio redondo, en la parte media de la larva.
50 m. oval, con polos redondos y ligeramente aplanados. Color: gris plido, la solucin de yodo los tie de pardo oscuro. Envoltura: delgada, se observa como una lnea oscura. Contenido: una larva gruesa, enrollada una o dos veces, algunas veces en movimiento.
260
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
i.
Trichuris trichiura
50m alargada. envoltura anaranjada. Contenido amarillo. doble, gruesa y lisa. Presenta un tapn redondo y transparente en cada polo. una masa uniforme. granulosa
Otras caractersticas
Contenido:
j.
VI
Los huevos de estos cstodos son casi idnticos. Son huevos embrionarios. Tamao: Forma Color: 30 - 40 m. redonda. el color de la envoltura es amarillo oscuro. El contenido es amarillo claro o gris.
Envoltura: gruesa, lisa y con lneas transversales. Contenido: una masa granulosa con tres pares de ganchos. Saco externo: a veces el huevo se encuentra encerrado en un saco transparente, en cuyo interior flota.
261
Procedimientos de Laboratorio
PRINCIPIOS GENERALES
Los protozoarios son microorganismos compuestos por una sola clula. Su forma mvil se denomina trofozoto y la forma inmvil, quiste.
Los trofozotos se encuentran principalmente en: Heces lquidas. Heces con moco. Heces blandas, no formadas.
Los trofozotos tienen movimiento debido a: Movimientos lentos de la clula. Presencia de flagelos, que semejan ltigos. Presencia de cilios, que son pelos numerosos y cortos.
Los trofozotos se clasifican en: Amebas: Ciliados: sin flagelos ni cilios con cilios.
262
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
Ncleo:
Movilidad: se mueve en una sola direccin ayudada por un pseudpodo que le hace avanzar. Citoplasma: el ectoplasma es transparente y el endoplasma granuloso fino en la que puede haber vacuolas. La entamoeba patgena presenta vacuolas en cuyo interior se observa glbulos rojos.
VI
b. Entamoeba coli
Tamao: Forma: Ncleo: 20 - 40 m. ovalo alargada. visible en preparaciones frescas, sin tincin. La membrana es irregular y granulosa; el cariosoma es grande y excntrico.
Movilidad: frecuentemente inmvil o se desplaza con lentitud emitiendo pseudpodos. Citoplasma: es difcil diferenciar el ectoplasma del endoplasma granuloso.
263
Procedimientos de Laboratorio
Naegleria sp. Suelos hmedos, fondo de piscinas, aguas termales. Aguda Nasal Ameboide y flagelar Cariosoma grande, central. Membrana nuclear gruesa sin cromatina en su pared interna. Con dos o ms poros que atraviesan las dos membranas qusticas.
Acanthamoeba Suelos hmedos, fondo de piscinas, aguas termales. Crnica Nasal y otras vas Ameboide Cariosoma grande, central. Membrana nuclear gruesa sin cromatina en su pared interna. Pared qusica muy arrugada, mamelonada con poros
Trofozotos
Movilidad: se desplaza hacia delante con pequeos saltos, o bien dando giros. Contenido: presenta dos grandes ncleos ovalados, poco visibles.
264
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b. Trichomonas hominis
Tamao: Forma: Ncleo: Flagelos: Membrana ondulante: solo se encuentra en un lado; es sumamente mvil. 10 - 15 m. oval con dos adelgazados. difcil de identificar. generalmente cuatro. polos
VI
"Boca":
265
Procedimientos de Laboratorio
266
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VI
b. Entamoeba coli
12 - 20 m. redonda o ligeramente oval. Ncleos: 1 - 8, de membrana irregular engrosada en algunas partes, no forma un crculo perfecto. Con cariosoma voluminoso excntrico. Vacuola: algunas veces existe una vacuola voluminosa, que comprime dos ncleos, uno en cada polo. Citoplasma: con yodo se tie de amarillo plido brillante. Cuerpos cromatoides: extremos agudos o mellados, en forma de "cuchillo". Tamao: Forma:
267
Procedimientos de Laboratorio
a. Giardia lamblia
Tamao: Forma: 8 12 m. oval, con un polo ms redondeado que otro. Con gruesa envoltura de doble pared. 2 - 4, de membrana delgada cariosoma pequeo, central. semeja un cabello; en forma de "S" que recorre el quiste a lo largo, por el centro.
Ncleos: Fibrilla:
b. Balantidium coli
Tamao: 50 70 m. Forma: redonda. Ncleos: uno semejante a un rin y otro pequeo que asemeja una mancha gruesa. Envoltura: delgada con pared doble. Citoplasma: granuloso, verdoso, lleno de cuerpos de inclusin.
268
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Captulo VI
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VI
269
Procedimientos de Laboratorio
MTODO
l. En un portaobjetos colocar Una gota de solucin salina o de cloruro de sodio, en la mitad del lado izquierdo del portaobjetos. Una gota de solucin yodurada de lugol, en la mitad del lado derecho del portaobjetos.
2.
Tomar 1 - 2 mg de material fecal (de preferencia de la parte profunda de la muestra y si hay moco, elegir esta porcin) con el aplicador de madera.
270
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
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3. Mezclar la porcin tomada de la muestra con la gota de solucin salina o de cloruro de sodio.
4.
VI
6.
7 .
Examinar las preparaciones con el microscopio con objetivos de 10x y 40x, comenzando en el ngulo superior izquierdo del cubreobjeto.
271
Procedimientos de Laboratorio
8. Observar con atencin las formas, recordando que los quistes y trofozotos de los protozoarios se observan en forma natural en el lado sin colorear (solucin salina o de cloruro de sodio). 9. Las estructuras internas (ncleos, vacuolas, etc.) se observan en las tinciones con solucin yodurada de lugol.
10. Suele encontrarse como elementos normales, estructuras pertenecientes a la ingestin de alimentos, como fibras vegetales, granos de almidn, esporas de hongos, granos de polen, fibras musculares lisas o estriadas, cristales de cidos grasos, cristales de oxalato de calcio, etc.
272
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Captulo VI
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MATERIALES
Material para obtencin de huevos de oxiuros. Un microscopio. Una pipeta Pasteur. Portaobjetos. Cubreobjetos.
VI
MTODO
l. Obtenida la muestra por el mtodo de la cinta adhesiva, esta queda lista para mirarla al microscopio.
2. Si la muestra es obtenida usando un hisopo de algodn aspirar la solucin de cloruro de sodio (donde ha sido sumergido el hisopo) con una pipeta de Pasteur. Colocar una gota en el portaobjeto, poner un cubreobjeto encima de la gota y queda lista para mirarla al microscopio.
3. Observar con el microscopio utilizando objetivo de 10x, en busca de los huevos de Enterobius vermicularis.
273
Procedimientos de Laboratorio
MATERIALES
Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Portaobjetos. Cubreobjetos. Sulfato de zinc al 33,3% (ver Anexos). Lugol (ver Anexos). Agua corriente tibia. Aplicador de madera. Una centrfuga. Un microscopio.
274
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Captulo VI
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MTODO
l. En el tubo de ensayo mezclar, usando el aplicador de madera, 2 g de heces con 8 - 10 mL de agua corriente tibia, centrifugar a 3 000 RPM durante 3 minutos.
2. El lquido sobrenadante obtenido en el tubo centrifugado, se elimina. Aadir 2 - 3 mL de agua y volver a centrifugar segn el procedimiento anterior. Repetir 3 - 4 veces esta operacin hasta obtener un lquido sobrenadante claro.
VI
4. Colocar el tubo centrifugado en una gradilla, llenndolo con el sulfato de zinc hasta el borde del tubo y colocar encima un cubreobjetos, dejar en reposo por 15 minutos.
275
Procedimientos de Laboratorio
5. Despus de los 15 minutos, sacar el cubreobjetos, levantndolo. Colocarlo en un portaobjetos con una gota de lugol y observarlo al microscopio con objetivos de 10x y 40x.
MATERIALES
Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Portaobjetos. Cubreobjetos. Formol al 10% (ver Anexos). ter sulfrico comercial. Lugol (ver Anexos). Agua corriente tibia. Un aplicador de madera. Bagueta. Una centrfuga. Un microscopio.
MTODO
l.
276
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI 2. Despus del ltimo lavado, llenar hasta la mitad el tubo centrifugado, con formol al 10% y 2 mL de ter.
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3.
Tapar con un tapn de jebe y sacudir vigorosamente, teniendo cuidado que el tapn no salte.
4.
VI
5. Se observar que en el tubo quedan cuatro capas que son, de arriba hacia abajo: el ter con las grasas disueltas, una capa de detritus, el formol y el sedimento.
6. Desprender el tapn de detritus de las paredes del tubo, usando una bagueta y eliminar el resto de las capas, quedando en el tubo, nicamente el sedimento.
277
Procedimientos de Laboratorio
7 . Diluir el sedimento con el lquido sobrante que escurre por las paredes del tubo, agitndolo.
8. Poner una gota en un portaobjetos, con una gota de lugol. Colocar encima un cubreobjetos y observar en el microscopio con objetivos de l0x y40x.
278
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Captulo VI
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VI
MATERIALES
Portaobjetos. Cubreobjetos. Solucin de cloruro de sodio, tibia a 37 C (ver Anexos). Un asa de siembra. Material para obtencin de muestra. Un microscopio.
MTODO
l. Obtener la muestra.
279
Procedimientos de Laboratorio
3. Aadir una gota tibia de solucin de cloruro de sodio. Mezclar y poner un cubreobjetos.
4. Observar en el microscopio con objetivo de l0x: unos organismos pequeos redondeados y transparentes, del tamao de un leucocito, que se mueven rpido dando saltos y giros.
5.
Movilidad: giran.
Membrana: ondulante, se encuentra solo en un lado y parece aleta de un pez; es muy mvil.
6. Si no se encuentra nada en la gota que se ha examinado, preparar en otro portaobjetos un frotis amplio y delgado de la secrecin. Aplicar tincin Gram al frotis seco (buscar bacterias, podra haber gonococos).
280
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
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PRINCIPIOS GENERALES
El parsito causante de la malaria o paludismo es el plasmodio que se encuentra en la sangre. La gota gruesa es la extensin de una gota de sangre en forma cuadrangular de un dimetro aproximado de 1 a 1,5 cm mediante la cual se puede concentrar la densidad del parsito permitiendo un examen rpido. Con la gota gruesa se puede detectar la presencia del plasmodio, su especie y la densidad parasitaria. El frotis sanguneo es la extensin de una gota de sangre de tal manera que se pueden observar al microscopio, tanto los eritrocitos como los parsitos en un slo plano. Con el frotis sanguneo se logra diferenciar claramente la especie de plasmodio.
VI
La recoleccin de sangre se debe hacer en el momento en que se presenta la fiebre (en esta etapa los parsitos son ms numerosos) y antes que se administren medicamentos antipaldicos. Para el pronstico y el tratamiento de la enfermedad es importante que se identifique la especie en el laboratorio.
281
Procedimientos de Laboratorio
Existen 4 especies diferentes de parsitos que causan malaria o paludismo en el mundo: Plasmodium vivax. Plasmodium malariae. Plasmodium ovale. Plasmodium falciparum.
En el Per solo se presentan tres de ellas. Plasmodium ovale solo se encuentra presente en el frica. Un paciente puede tener ms de una especie de parsitos del paludismo al mismo tiempo.
La preparacin de la gota gruesa se tie inmediatamente con Giemsa diluida. Los frotis se deben primero fijar durante 2 - 3 minutos con metano.
MATERIALES
Probetas de 10, 50 y 100 mL. Beaker o vaso plstico de trabajo. Un agitador de vidrio. Una gradilla para portaobjetos. Un cronmetro o reloj con segundero. Un frasco gotero con metanol. Colorante Giemsa (solucin madre) (ver Anexos). Agua amortiguada (ver Anexos) puede ser reemplazada por agua de lluvia o agua hervida fra.
282
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
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l.
Utilizar la probeta de vidrio para preparar colorante de Giemsa diluido al 5% con agua amortiguada de pH 7,2 en la proporcin de 1 gota de Giemsa (solucin madre) con 1 mL de agua amortiguada (o agua de lluvia o agua hervida fra).
VI
3. Si solo es una lmina (gota gruesa) para colorear, se necesitar aproximadamente 1,5 mL de solucin preparada. Si se tuviera que colorear dos lminas, se necesitar tres gotas de solucin Giemsa (solucin madre) por cada 3 mL de agua amortiguada.
4.
Antes de colorear verificar si las claves de las lminas coincidan con las solicitudes de diagnstico.
5. Colocar las lminas a travs de dos varillas de vidrio. Cubrirlas suavemente con el colorante de Giemsa diluido. Nunca echar el colorante muy alejado de las lminas, porque pueden formarse "espumas" que dificultaran el examen microscpico.
283
Procedimientos de Laboratorio
6. Dejar reposar las lminas con el colorante por 10 minutos (la experiencia le indicar el tiempo correcto para cada lmina o grupo de lminas).
7 . Transcurrido el tiempo indicado de coloracin, lavar suavemente el colorante de la lmina aadiendo un chorro suave de agua limpia.
8. Colocar en una gradilla las lminas inclinadas, con la cara de sangre teida hacia abajo, para eliminar el exceso de agua, facilitar el secado y protegerlos del polvo.
284
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI 2. Colocar las lminas con las muestras hemticas en el beaker o vaso, en posicin vertical, de dos en dos y separadas por tarjetas de cartn de 2 x 3 cm de rea, de tal manera, que los lados que contengan la muestra estn hacia las caras externas y entren en contacto con el colorante. Asegurar el bloque de lminas formadas, pasndole alrededor una liga o hilo de pabilo.
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3.
Preparar una cantidad suficiente de colorante de Giemsa diluido para llenar el beaker o vaso plstico.
4. Una vez que las lminas con las muestras se hayan colocado en el beaker o vaso plstico, llenar el recipiente lentamente con el colorante de Giemsa diluido. Evitar mojar los cartones. Tapar el beaker. 5. Dejar las lminas en el colorante por 10 minutos, lejos de la luz del sol. Transcurrido el tiempo indicado de coloracin, quitar la tapa, sacar el bloque de lminas del recipiente con colorante y enjuagarlo sumergindolo y sacndolo alternativamente en un recipiente con agua limpia, hasta que no se desprenda colorante en el enjuague. Evitar mojar los cartones. Dejar escurrir el agua del bloque. Colocarlo sobre papel toalla o papel higinico y dejarlo secar.
VI
6.
7 .
8. Cuando est seco, retirar las lminas del bloque, una por una, y colocarlas en la gradilla de madera, de modo que queden inclinadas y con la gota gruesa hacia abajo, evitando que la muestra toque algo.
285
Procedimientos de Laboratorio
a. Trofozoto joven
Es el estadio ms pequeo, presenta un ncleo o cromatina de color rojo grosella y una masa citoplasmtica tenue de color celeste. Carece de pigmento malrico. Las formas de citoplasma pueden variar desde anillos, comas, crculo. En P. vivax y P. falciparum se pueden presentar formas con dos ncleos.
b. Trofozoto mediano
Ms grande que el estadio anterior. El citoplasma en P. vivax se puede presentar en forma de anillo, coma o fragmentado. En P. malariae el citoplasma es redondeado y compacto. En P. falciparum es similar, pero no es comn observarlo en sangre perifrica. A partir de este estadio se observa pigmento malrico o hemozona.
d. Esquizonte presegmentado
Parecido al adulto pero con presencia de dos a ms ncleos.
e. Esquizonte segmentado
El nmero de merozotos (cromatina rodeada de citoplasma) define la especie. El pigmento se encuentra a un lado.
f. Gametocitos
En P. vivax y P.malariae solo se puede observar el gametocito macho o microgametocito cuyo ncleo es grande y el citoplasma muy tenue. El pigmento se ve en forma concntrica.
286
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
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PRINCIPIOS GENERALES
VI
LMINAS TEIDAS
En todas las etapas de desarrollo las diversas partes del parsito se tien del mismo color. La cromatina (ncleo del parsito) es generalmente redonda y se colorea de un rojo intenso. El citoplasma del parsito toma diferentes formas, desde una forma de anillo a una totalmente irregular. Se colorea siempre de azul, aunque la tonalidad puede variar entre las especies de plasmodio.
287
Procedimientos de Laboratorio
FROTIS
Para fines de aprendizaje de las especies de plasmodio, etapas de desarrollo, etc.; es mejor iniciarse en la lectura del frotis.
l.
Una manera de distinguir entre las cuatro especies de malaria es ver el efecto que tiene el parsito dentro de los glbulos rojos infectados:
El tamao del glbulo rojo. Su forma, su color. Los grnulos de Schffner se pueden ver como un moteado en los glbulos rojos. El pigmento malrico.
2. El examen de frotis de sangre no es recomendable rutinariamente, ya que requiere mayor tiempo de observacin en comparacin con la gota gruesa.
3. El examen de frotis es recomendado en los siguientes casos: Cuando no es posible examinar la gota gruesa por ser muy pequea. Cuando es necesaria la identificacin de la especie.
288
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
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P. falciparum Tamao normal Pueden ser dentados Pequeo y delicado, a menudo dos puntos de cromatina y generalmente dos o ms anillos por eritrocito. Raro en sangre perifrica. Si lo hay es de tamao moderado. Pigmento en grnulos. Raro en sangre perifrica Mediano, con numerosos merozotos(12-32). Pigmento en una masa nica. Raro en sangre perifrica.
P. malarie Tamao normal o menor que lo normal Casi compacto. Generalmente uno a dos anillos por eritrocito. Pequeo, compacto. A menudo en forma de banda. Pigmento granulado.
Pequeo a grande. Un anillo por Trofozoto joven eritrocito. (anillos) La infeccin mltiple es muy rara. Grande, ameboide. Pigmento en forma Trofozoto de bastones finos. mediano Tamao mediano, con citoplasma compacto. Pigmento fino. Grande, con numerosos merozotos(12-24), promedio 16. Pigmento concentrado en 1 - 2 masas.
VI
Pequeo, pocos merozotos grandes (6-12), promedio: ocho dispuestos en rosetas. Pigmento granulosos ubicado generalmente en la parte central. Parecido al de la P. vivax pero ms pequeo y menos numeroso en el frotis.
Esquizonte
Gametocitos
289
Procedimientos de Laboratorio
GOTA GRUESA
El examen de la gota gruesa es mejor para detectar la presencia de parsitos. Rutinariamente, la gota gruesa debe ser examinada primero. Presenta las siguientes caractersticas:
Los glbulos rojos han desaparecido. Los grnulos de Schffner se pueden observar alrededor del parsito. Los leucocitos se conservan sin modificaciones. Los parsitos pueden ser vistos semejantes a los leucocitos, pero tienen apariencia ms pequea que en el frotis. El citoplasma de los anillos finos de los trofozotos puede aparecer incompleto o roto en las preparaciones de gota gruesa. Las granulaciones de Maurer de Plasmodium falciparum no pueden ser vistos en gota gruesa.
l.
2. Colocar aceite de inmersin sobre la zona localizada de la gota gruesa y cambiar el objetivo a 100x.
290
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI 3. Examinar 100 campos. Desplazar la muestra de sangre siguiendo las flechas de la figura. 4. Usar un contador manual para contar los campos que van a ser examinados y para el recuento de parsitos.
Parasitoga y micologa
5.
CARACTERSTICAS DIFERENCIALES ENTRE ESPECIES Y ESTADIOS DEL PLASMODIO EN LA GOTA GRUESA TROFOZOTO
Plasmodium vivax Pequeo a grande. Moderado. Fragmento de forma irregular. nica, a veces dos. Jvenes (anillos, comas sin pigmento) mediano(citoplasma ameboide, fragmentado, con pigmento). Maduro o adulto (compacto) Filtro, desperdigado
Plasmodium falciparum Pequeo a mediano. Por lo general abundante. Uniforme, fino. A menudo dos ncleos.
Plasmodium malarie Pequeo a grande. Escaso a moderado. Regular, denso. nica grande.
VI
Formas
Frecuentemente Jvenes (anulares) anulares y comas, adultos (redondos, las formas compactos). maduras(compactas) slo presentes en casos graves. Pocos grnulos o en masa nica Abundante, generalmente rodeando el citoplasma.
Pigmentos
291
Procedimientos de Laboratorio
EZQUIZONTE
Estado/ Caracterstica Tamao Nmero Citoplasma Plasmodium vivax Grande. Escaso a moderado. 12-24 generalmente 16. En conglomerado regular formas maduras Plasmodium falciparum Pequeo a mediano. Poco frecuentemente, slo en formas graves. 12 -30, o ms. Aglomerados y compactos. Plasmodium malarie Pequeo . Escaso . 6 - 12, genralmente ocho. Merozotos en conglomerado laxo, de forma madura, algunos aparentemente sin citoplasma. Concentrado.
Cromatina
Formas
GAMETOCITO
Estado/ Caracterstica Formas inmaduras Plasmodium vivax Difciles de distinguir de trozotos maduros. Redondos, grandes. Formas maduras Grande y nica bien definida. Desperdigado fino Plasmodium falciparum Inmaduras: puntiagudas. En forma de banana o redondeadas. Plasmodium malarie Difciles de distinguir de trofozotos maduros . Redondeadas, compactas algunas veces tambin es dficil de distinguir de los trofozotos maduros . nica, bien definida. Desperdigada, rugoso, puede estar distribuido en la periferie. Solo con cromatina y pigmento.
Cromatina Pigmento
Formas erosionadas
Con citoplasma A veces se observa oscuro o ausente, y de color rosa. sOlo con cromatina y pigmento.
292
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
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PRINCIPIOS GENERALES
La densidad de los parsitos es el nmero de parsitos que se cuentan en cada campo microscpico. Generalmente se determina la densidad parasitaria en la gota gruesa. Es importante notificar la densidad de los parsitos por estadios en caso de P. falciparum (estadios asexuados y sexuados), los cuales se asocian a enfermedad ms grave, que algunas veces causa la muerte. La determinacin de la densidad parasitaria es til para conocer la gravedad de a malaria y para conocer la respuesta al tratamiento antimalrico. Si el tratamiento es eficaz, la densidad parasitaria en la sangre debe disminuir progresivamente.
VI
293
Procedimientos de Laboratorio
(1 a 39) se determina el nmero exacto de parsitos. Cuando se encuentra ms de 40 parsitos en 100 campos microscpicos se usa cruces, de la siguiente manera:
+/2 + ++ ++++
De 40 a 60 parsitos en 100 campos. Un parsito por campo en 100 campos. De 2 a 20 parsitos por campo en 100 campos. Ms de 200 parsitos por campo en 100 campos.
294
MINISTERIO DE S LUD
Parasitoga y micologa
Si despus de contar 200 leucocitos, hay nueve o menos parsitos, continuar contando hasta llegar a 500 leucocitos en su contador, luego anotar el nmero de parsitos por 500 leucocitos.
Para informar los resultados por microlitro de sangre, se debe usar la siguiente frmula:
VI
Si son contados 200 leucocitos, entonces: Parsitos por microlitro = Nmero de parsitos x 8 000 200 Parsitos por microlitro = Nmero de parsitos x 40
Si son contados 500 leucocitos, entonces: Parsitos por microlitro = Nmero de parsitos x 8 000 500 Parsitos por microlitro = Nmero de parsitos x 16
295
Procedimientos de Laboratorio
Cuando la infeccin es por Plasmodium falciparum, adems de la densidad parasitaria se debe registrar las fases de desarrollo: F F y Fg Fg = = = Anillos solamente. Anillos y gametos. Gametos solamente.
Cuando se detecta un caso positivo a Plasmodium falciparum, debe ser reportado al jefe inmediato y realizar un seguimiento o control tomando muestras como mnimo durante 7 das consecutivos. Si al paciente se le puede seguir observando por ms tiempo, se debe tomar dos muestras semanales la segunda, tercera y cuarta semanas. Para garantizar el diagnstico en el seguimiento o evolucin de un caso de Plasmodium falciparum, se debe observar como mnimo 300 campos microscpicos con la finalidad de observar cualquier signo de resistencia o recrudescencia (nueva aparicin de los parsitos). En caso de seguimiento a Plasmodium falciparum, se identificar la muestra con la clave original (primera muestra), en todas las lminas que se tomen, agregndose un nmero correlativo para cada una de ellas.
Claves de seguimiento:
296
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
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MATERIALES
Una jeringa de tuberculina estril (1 mL). Algodn. Alcohol al 70%. Agua oxigenada. Suero fisiolgico estril. Tubos con medio de cultivo agar sangre o NNN (ver Anexos).
VI
MTODO DE OBTENCIN
1. Lavar la lesin ulcerada (rea necrtica, muerta) del paciente con agua y jabn.
297
Procedimientos de Laboratorio
2. Elegir el rea decolorada de la ppula (pequeo ndulo) que se halla al margen de la lcera. Desinfectarla con alcohol al 70% y agua oxigenada.
4. Por puncin inyectar suavemente dentro del rea elegida y enseguida aspirar el contenido inyectado.
5. 6. Con 2 o 3 gotas del material aspirado, inocular en los tubos con medio de cultivo.
Retirar la jeringa.
MUESTRA DE FROTIS
MATERIALES
Lminas portaobjetos limpias y desgrasadas. Un bistur con hoja 20 o 21 estril. Algodn y gasa estril. Alcohol al 70%.
298
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
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MTODO DE OBTENCIN
l.
2.
VI
3. Presionar con firmeza los bordes de la lesin hasta que palidezca; en el borde interno, hacer una pequea incisin con la hoja del bistur estril tratando de levantar la piel; secar la sangre con gasa y raspar el tejido.
4. Con el material obtenido en la hoja de bistur, hacer el frotis en el portaobjetos, procurando que este sea delgado y evitando pasar dos veces por el mismo sitio.
299
Procedimientos de Laboratorio
5.
ATENCIN!
El frotis tambin puede realizarse con material de biopsia.
MTODO DE OBTENCIN
1. Lavar la lesin ulcerada con agua y jabn.
2. Elegir el borde de la lesin ulcerada. Desinfectar con alcohol al 70% y agua oxigenada. 3. Anestesiar con 0,5 cc de xilocana el rea elegida.
300
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
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4. Introducir el punch en el borde de la lesin y rotar varias veces con movimiento suave.
5. Retirar el punch, y con ayuda de la pinza y la hoja de bistur, cortar la base del tejido removido por el punch.
6. Presionar con gasa el rea donde se ha retirado el tejido, hasta que deje de sangrar. Luego cubrir la herida.
VI
7 .
Colocar la biopsia (el tejido cortado) sobre un papel filtro para absorber el exceso de sangre.
8. Introducir el tejido en un vial que contenga solucin salina estril o formol de acuerdo con lo indicado en el examen.
301
Procedimientos de Laboratorio
En nuestro pas se han descrito como forma clnica, la leishmaniasis tegumentaria ya sea cutnea (uta) o cutnea-mucosa (espundia).
EXAMEN DIRECTO
Se basa en la deteccin del parsito bajo su forma de amastigote, los cuales se encuentran dentro de los macrfagos.
La muestra se obtiene por frotis, de una puncin - aspiracin o una biopsia con la cual se puede realizar una impronta - frotis.
302
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
Este examen tiene una positividad que vara del 33 - 43%. A pesar de su baja positividad es de bajo costo y fcil de aplicar en sitios que cuentan como mnimo con un microscopio.
CULTIVO Se basa en la recuperacin del parsito bajo su forma de promastigote. La muestra se obtiene de una puncin - aspiracin o una biopsia.
a. Examen directo
MATERIALES
Materiales para la obtencin de muestra. Metanol absoluto. Coloracin Giemsa diluido 1 en 10 a partir de una solucin stock (ver Anexos). Agua corriente de cao. Microscopio con objetivo de l00x. Aceite de inmersin.
VI
MTODO
l.
303
Procedimientos de Laboratorio
2. Fijar las lminas que contienen el frotis o impronta-frotis cubrindolas con metanol absoluto durante 3 minutos o hasta que se haya evaporado.
3. Cubrir la lmina con coloracin Giemsa diluida 1 en l0 a partir de una solucin stock (ver Anexos) por 30 minutos.
5.
6.
Observar la lmina a un aumento de l00x, adicionar una gota de aceite de inmersin y examinar el frotis hasta que se visualicen los parsitos.
304
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
La observacin de formas amastigotes de Leishmania en los frotis indica un resultado positivo. El resultado debe informarse: leishmaniasis (+): observacin de amastigotes de Leishmania.
b. Cultivo
CULTIVO DE BIOPSIA (TEJIDO)
MATERIALES Materiales para la obtencin de la biopsia. Papel filtro. Una jeringa o micropipeta estril. Placa Petri estril u homogenizador. Vial que contenga solucin salina ms antibiticos (ver Anexos). Tubos con medios de cultivo NNN, USMARU o agar sangre (ver Anexos).
VI
MTODO
l.
Colocar la biopsia obtenida sobre un papel filtro para absorber el exceso de sangre.
2. Enseguida, introducir la biopsia en un vial que contenga solucin salina ms antibitico por dos horas, para que el antibitico acte sobre la flora normal de la piel.
305
Procedimientos de Laboratorio
3. Triturar la biopsia en un homogenizador o placa Petri estril que contenga 0,5 mL de solucin salina ms antibitico.
4.
5. 6.
Inocular 0,2 mL de suspensin para cada tubo de medio de cultivo. Mantener los cultivos a una temperatura de 22 C, hasta un mximo de 25 C.
MTODO l. Obtener la muestra por aspirado (puncin aspiracin). 2. Inocular 2 - 3 gotas del material aspi-rado, en cada tubo que contiene medio de cultivo.
306
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI 3.
Parasitoga y micologa
2. Utilizando un asa de siembra, tomar una gota del sobrenadante y observar al microscopio de luz con objetivo de l0x en bsqueda de promastigotes. 3. Solo la observacin de formas mviles de promastigotes indica positividad de la muestra. 4. El resultado debe informarse: Leishmaniasis (+): observacin de promastigotes de Leishmania.
VI
En los sujetos con reaccin positiva se produce una reaccin de hipersensibilidad cutnea: Se observa generalmente una zona rojiza e indurada en el sitio de la inoculacin. Un dimetro de induracin en el sitio de la inoculacin de 5 mm o ms se considera positivo.
307
Procedimientos de Laboratorio
MATERIALES
Una jeringa de lec con aguja N. 26 de pulgada (jeringa de tuberculina). Alcohol al 70%. Algodn. Leishmanina (antgeno) conservado en refrigeracin. Un lapicero. Una regla graduada en mm.
MTODO
3. Introducir intradrmicamente la aguja de la jeringa con el bisel hacia arriba, cargada con leishmanina. Lentamente introducir el antgeno formando una pequea ppula.
4.
308
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
LECTURA E INTERPRETACIN
l. 2.
A las 48 horas leer la prueba. En la zona de la inoculacin delimitar el rea de induracin con el lapicero, de la siguiente manera:
Trazar lneas con el lapicero desde uno de los bordes de la reaccin hacia el centro de la inoculacin, avanzando hasta encontrar resistencia al trazado.
VI
Repetir el trazo de lneas siguiendo los cuatro puntos cardinales.
3. Medir ahora el dimetro vertical (eje Y) del rea indurada (ppula) con una regla. 4. Si el dimetro es igual o superior a 5 mm se considera positivo.
309
Procedimientos de Laboratorio
MATERIALES Y REACTIVOS
Una centrfuga. Tubos cnicos para centrifugacin. Aplicadores. Una probeta de 20 mL. Tubos de ensayo. cido actico al 10%. Perxido de hidrgeno (solucin fresca, de 10 vol.) Etanol al 95%. Aminofenazona cristalina.
MTODO
l. Inmediatamente antes de llevar a cabo el ensayo preparar una solucin de aminofenazona como se indica a continuacin: 2. Poner alrededor de 0,25 g de aminofenazona en el fondo de un tubo de ensayo. Aadir 5 mL de etanol al 95%.
Colocar una porcin de la muestra de heces de 4 mL (4 cm3) aproximadamente para un tubo de centrifugacin.
310
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
3. Agregar 7 mL de agua destilada y mezclarla completamente. 4. Centrifugar a baja velocidad aproximadamente durante 5 minutos, o hasta que se precipiten los slidos (se puede emplear una centrfuga manual). 5. 6. Decantar el lquido flotante en otro tubo de ensayo y conservarlo. Aadir al tubo de ensayo que contiene el lquido flotante, sin mezclar: 10 gotas de cido actico al 10%. 5 mL de la solucin de aminofenazona.
Para evitar que se mezclen poner la solucin de aminofenazona con una pipeta deslizndola por la pared interior del tubo de ensayo. Agregar diez gotas de solucin de perxido de hidrgeno de 10 vol. No mezclar. Dejar reposar un minuto.
7 .
VI
REACCIN POSITIVA
Entre las dos capas de lquido aparece una coloracin azul: Azul plido = Azul oscuro = Azul negra = reaccin positiva reaccin positiva intensa reaccin positiva sumamente intensa + ++ +++
REACCIN NEGATIVA
No ocurre cambio alguno en el color.
311
Procedimientos de Laboratorio
PRECAUCIONES EN EL LABORATORIO
ATENCIN!
Los utensilios de vidrio deben estar limpios (sinresiduos de sangre). Se debe observar el resultado antes de que transcurra 5 minutos. Se pueden realizar ensayos testigos: - Negativos: con agua destilada. - Positivos: con agua que contenga 1% de sangre.
PRECAUCIONES EN EL PACIENTE
ATENCIN!
Durante un da entero, antes del examen, el paciente: - No deber comer carne de ninguna clase. - No deber cepillarse los dientes vigorosamente. Se ha dejado de recomendar el ensayo con bencidina a causa de las propiedades carcingeas de esta sustancia
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
OBTENCIN DE ESCAMAS
PRINCIPIOS GENERALES
Las escamas son laminillas formadas de clulas epidrmicas que se desprenden espontnea y mecnicamente de la piel; se incrementan como respuesta a un proceso infeccioso e inflamatorio. Los hongos productores de micosis superficiales y cutneas se encuentran asociados al estracto crneo de la epidermis, siendo necesario tratar las escamas para eliminar el material queratnico y liberar las estructuras micticas, para su ptima visualizacin. Antes de tomar la muestra, interrogue al paciente sobre el uso de talcos o cremas en el da del examen, para evitar la presencia de artefactos y dar resultados falsos (negativos o positivos). Igualmente, la muestra no debe tomarse cuando el paciente haya recibido tratamiento antimictico en los ltimos 5-10 das, ya que los resultados pueden ser falsamente negativos. Se recomienda limpiar el rea afectada con gasa humedicida en alcohol o en agua destilada estril, con el fin de eliminar el polvo y los contaminantes ambientales depositados en la piel. No se recomienda el uso de torundas de algodn, ya que las fibras del mismo pueden interferir con el examen directo. Las escamas suelen recolectarse por raspado con bistur, en las mrgenes de la lesin, donde est el crecimiento activo del hongo. Se aconseja tomar muestras de varias lesiones para obtener la mayor cantidad de escamas.
VI
313
Procedimientos de Laboratorio
MATERIALES
Lmina portaobjeto 75 x 25 mm, limpia y desengrasada. Lmina cubreobjeto 22 x 22 mm. Pipeta de transferencia estril de 2 mL. Hidrxido de potasio al 10% (KOH10%) (Ver anexos). Asa de siembra Plumn marcador
PROCEDIMIENTO
l. Con un plumn marcador, escribir en el borde de la lamina portaobjeto el cdigo de la muestra clnica a examinar.
2. Colocar una gota del KOH 10% en el centro de la lmina portaobjeto. 3. Esterilizar a la llama el asa de siembra. 4. Agregar con el asa de siembra, sobre la gota del KOH 10%, una porcin de la muestra clnica a examinar.
5. Colocar una laminilla cubreobjeto encima de la preparacin y dejar a temperatura ambiente por 03 minutos. 6. Observar al microscopio con objetivos de 10x y 40x.
LECTURA
NEGATIVO Cuando hay ausencia de elementos fngicos. POSITIVO Cuando se observa elementos fngicos se reportaran de la siguiente manera:
314
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
Presencia de hifas hialinas, tabicadas, o ambas. Presencia de levaduras Presencia de hifas y levaduras
VI
MATERIALES
Tubos conteniendo medio de cultivo agar Sabouraud glucosado en pico de flauta. Tubos conteniendo medio de cultivo agar papa glucosado en pico de flauta. Asa de siembra Muestra clnica
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Procedimientos de Laboratorio
PROCEDIMIENTO
l. Procesar las muestras de forma inmediata, preferentemente.
2. Sembrar por puntura con una diferencia de 1cm entre puntura y puntura la muestra clnica. 3. Sembrar la muestra clnica en cuatro tubos con el medio de cultivo elegido 4. Incubar a 25-30 C entre 7 a 30 das como mximo.
LECTURA
MORFOLOGA MACROSCPICA El color de las colonias presentan en general colores claros, desde tonos blanquecinos, rojos, amarillentos a marrn claro y naranja. MORFOLOGIA MICROSCPICA Las caractersticas microscpicas son las que determinan su identificacin en la mayora de casos. Se observan en el microscopio a 40x y aplicar los criterios de las claves taxonmicas. CLAVES TAXONMICAS
2. Macroconidios en forma de huso, de paredes gruesas y rugosas y frecuentemente con un pico terminal caracterstico. Estn formadas normalmente por ms de seis clulas (Figura 1.3a)................................................................................ M. canis (Figura 1.4) Macroconidios, cuando se presentan, similares a los de M. canis, aunque de mayor
316
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
longitud y con paredes ms lisas.Se observan formas con una constriccin en la zona central del macroconidio (Figura 1.3b). Con frecuencia la presencia de macroconidios es escasa, o no se llegan a observar. Clamidosporas terminales (Figura 1.3k) e hifas pectinadas caractersticas (Figura 1.3). En contraste con M. canis, no se desarrolla o presenta crecimiento escaso en el medio de arroz....................................M. audouinii Macroconidios de paredes delgadas............................................................................ 3
4. Macroconidios abundantes, fusiformes y simtricos, conteniendo hasta seis clulas (Figura 1.3c).......................................................................... M. gypseum (Figura 1.5) 5. Macroconidios alargados en forma de cigarro habano (Figura 1.3d) no siempre presentes. Abundantes microconidios redondeados formando grupos que asemejan racimos de uva inmadura (Figura 1.3i). Presencia de hifas espiriladas (Figura 1.3n). Ureasa positivo. Ensayo de perforacin del pelo positivo..................... ..................................................................................T. mentagrophytes b (Figura 1.6) Microconidios piriformes, estrechos, en forma de lgrima, aislados y dispuestos lateralmente en las hifas (Figura 1.3j). Macroconidios generalmente no presentes. Cuando se presentan, similares a los de T. mentagrophytes (Figura 1.3e). Reverso de la colonia rojiza; se estimula la produccin de este pigmento rojizo en PDA. Ureasa negativo. Ensayo de perforacin del pelo negativo.................................... T. rubrum c Macroconidios ovales en forma de porra, aislados o en racimos (Figura 1.3f). Ausencia de microconidios. Clamidosporas abundantes.................................................. E. floccosum (Figura 1.7)
VI
7. Abundantes microconidios redondeados formando grupos que asemejan racimos de uva inmaduros (Figura 1.3i). Presencia de hifas espiriladas (Figura 1.3n). Ureasa positivo. Ensayo de perforacin del pelo positivo............................................................................ T. mentagrophytes b Microconidios piriformes y estrechos, en forma de lgrima, aislados y dispuestos
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Procedimientos de Laboratorio
lateralmente en las hifas (Figura 1.3j) Reverso de la colonia rojizo; se estimula la produccin de este pigmento en PDA. Ureasa negativo. Ensayo de perforacin del pelo negativo.................................................... T. rubrumc Microconidios de mayor tamao, en forma de porra ms o menos alargados. Algunos en forma de globo (Figura 1.3h). Crece poco en ausencia de tiamina. Infeccin del pelo tipo endotrix..................................................................T. tonsurans (Figura 1.8)
8. Crecimiento moderadamente rpido (colonias > 15 mm de dimetro en 7 das)....... 9 Crecimiento lento (colonias < 10 mm de dimetro en 7 das).................................. 10
9. Microconidios, si se detectan, pequeos, en bajo nmero y en forma de porra. Similares a los de otras Microsporum spp. (Figura 1.3g). Clamidosporas terminales (Figura 1.3k) e hifas pectinadas caractersticas (Figura 1.3). No se desarrolla o presenta un crecimiento escaso en el medio de arroz..................................................M. audouinii 10. Colonias color prpura oscuro, violeta. No se detectan conidios. Escaso crecimiento en ausencia de tiamina. Infeccin del pelo tipo endotrix............................................................... T. violaceum Colonias con coloraciones claras, blanquecinas, grisceas, marronceas................. 11
11. Clamidosporas en cadenas largas densamente compactadas (Figura 1.3l). Algunas hifas en candelabro (Figura 1.3o) y/o terminadas en cabeza de clavo (Figura 1.3p). La mayora de cepas requieren tiaminad o tiamina e inositol. Infeccin del pelo tipo ectotrix megasporado.............................................................................T. verrucosum No se observan conidios. Tpicas hifas en candelabro (Figura 1.3o) y/o terminadas en cabeza de clavo (Figura 1.3p). No requieren tiamina. Infeccin del pelo tipo fvico. . .................................................................................................................. schoenleinii b: Trichophyton mentagrophytes est considerado como un complejo de especies (T. mentagrophytes var. mentagrophytes (variedad granular), T. mentagrophytesvar. erinacei, T. mentagrophytes var. interdigitale, T. mentagrophytes var. nodular (T. krajdenii), T. mentagrophytes var. quinckeanum). Segn autores algunas de estas variedades son consideradas como especies independientes o sinnimos de T. mentagrophytes. En contraste con T. mentagrophytes var.mentagrophytes, T. mentagrophytes var. erinacei y T. mentagrophytes var. interdigitale pueden presentar microconidios alargados (en forma de porra de pequeo tamao) en vez de redondeados. c: T. rubrum est considerado como un complejo de especies. Para algunos autores las especies T. fischeri, T. kanei, T. raubitscheckii, son consideradas como variedades o
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo VI
Parasitoga y micologa
sinnimos de Trichophyton rubrum. Algunas de las diferencias que presentan son: T. fischeri (especie no patgena), T. kanei (ausencia de microconidios; ureasa positivo dbil), T. raubitscheckii (ureasa positivo). d: Se han descrito cepas aisladas de tias de ovejas que no necesitan tiamina o inositol (T. verrucosum var. autotrophicum). En un estudio sobre los requerimientos nutricionales de esta especie se cita que el 84% de las cepas se desarrollaron en el medio conteniendo tiamina e inositol, el 16% en el medio conteniendo tiamina y ninguna cepa se desarroll en el medio sin vitamina.
VI
MEDIOS DE CULTIVO
319
Procedimientos de Laboratorio
2. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos. 3. Dispensar en tubos o placas (si se utilizan tubos de cristal, tambin se puede dispensar antes de esterilizar). 4. Solidificar en posicin inclinada.
5. Controlar la esterilidad colocando el medio envasado en una incubadora a 37 C por 24 horas y mantener el medio envasado en la refrigeradora hasta el momento de usarlo. 6. El medio debe ser de color mbar, transparente.
l.
2. Filtrar con papel whatman N. 2, aadir la glucosa y el agar y hervir hasta disolver el agar completamente. 3. Ajustar el volumen a un litro.
320
MINISTERIO DE S LUD
Parasitoga y micologa
6. Controlar la esterilidad colocando el medio envasado en una incubadora a 37 C por 24 horas y mantener el medio envasado en la refrigeradora hasta el momento de usarlo. 7 . El medio debe ser de color mbar, transparente.
VI
321
CAPTULO
VII
SECRECIONES
OBTENCIN DE SECRECIONES FARNGEAS................................................................ 325 Materiales............................................................... 325 Mtodo de obtencin.............................................. 325 TINCIN DE GRAM.................................................... 335 OBTENCIN DE SECRECIN TICA...................... 327 Materiales............................................................... 327 Mtodo de obtencin.............................................. 327 OBTENCIN DE SECRECIN URETRAL................ 328 Materiales............................................................... 328 Mtodo de obtencin.............................................. 328 OBTENCIN DE SECRECIN VAGINAL.................. 330 Materiales............................................................... 330 Mtodo de obtencin.............................................. 330 MICROORGANISMOS QUE SE OBSERVAN EN EL FROTIS....................................................................... 338 Examen directo de frotis con tincin de Gram........ 338 Principios generales............................................... 335 Reactivos................................................................ 335 Mtodo.................................................................... 335 Lectura.................................................................... 336 PREPARACIN DE FROTIS...................................... 332 Materiales............................................................... 332 Mtodo.................................................................... 332
Procedimientos de Laboratorio
324
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VII
Secreciones
MTODO DE OBTENCIN
1.
El paciente debe permanecer sentado en la posicin ms cmoda y con la mejor iluminacin (se puede usar una linterna).
2. Indicar al paciente que abra la boca sin sacar la lengua y que diga "ahhh...".
VII
3.
Mientras el paciente dice "ahhh...", bajar las 2/3 anteriores de la lengua con el bajalengua, empleando la mano izquierda.
4. Se deber observar las amgdalas (A), el fondo de la faringe limitada por los pilares (P) y vula (U).
325
Procedimientos de Laboratorio
5. Introducir el hisopo con la mano derecha. Evitar tocar la lengua, que se encuentra cubierta de microorganismos.
6.
Ubicar el lugar inflamado de la garganta (amgdalas o pilares). Estar enrojecida o blanca, segn sea el caso.
7 .
Frotar el hisopo con firmeza en la parte inflamada, hacindolo girar y, si existen membranas, recjalas con el hisopo.
8. Si no se encuentra inflamacin pasar el hisopo por las amgdalas, los pilares. Evitar tocar la vula.
326
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VII
Secreciones
MATERIALES
Hisopo de algodn no demasiado abultado. Tubo estril.
MTODO DE OBTENCIN
l.
Si el pus sale al exterior y llena el pabelln de la oreja, es preferible eliminado previamente con algodn estril.
VII
2. Introducir el hisopo en el conducto auditivo externo siguiendo una direccin ligeramente oblicua de atrs hacia adelante y de abajo hacia arriba.
327
Procedimientos de Laboratorio
MATERIALES
Asa bacteriolgica estril o hisopo estril de alambre delgado y de algodn no demasiado abultado. Guantes quirrgicos estriles. Solucin salina estril. Tubo con medio de transporte.
MTODO DE OBTENCIN
l.
Tomar la muestra a primera hora de la maana, antes de que el paciente haya orinado.
3. Aplicar al pene una ligera presin (desde atrs), de manera que salga una gota de secrecin (pus) por el meato.
328
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VII 4. Si la gota de pus no aparece introducir el asa o hisopo estril en el conducto uretral anterior, hasta una profundidad de 2,5 cm aproximadamente para obtener la muestra.
Secreciones
5.
Tomar el pus con el asa o hisopo estril e introducido en el tubo con medio de transporte.
VII
329
Procedimientos de Laboratorio
MATERIALES
Hisopo estril de alambre delgado y de algodn no demasiado abultado. Guantes quirrgicos estriles. Espculo estril. Tubo con medio de transporte.
MTODO DE OBTENCIN
l.
2. Entreabrir la vulva.
3. Introducir un espculo humedecido en agua tibia en la vagina. No usar lubricante. Visualizar el cuello uterino.
330
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VII 4. Introducir el hisopo estril dentro del canal cervical rotndolo suavemente y permitiendo que permanezca all por 10 - 30 segundos; retirar y colocar en un tubo estril o en un tubo con medio de transporte.
Secreciones
ATENCIN!
En mujeres que no han tenido relaciones sexuales se puede tomar la muestra a travs del orificio vaginal con un hisopo estril.
VII
331
Procedimientos de Laboratorio
PREPARACIN DE FROTIS
El examen microscpico directo de frotis teidos constituye una manera eficiente para estudiar la presencia de bacterias en medios biolgicos que normalmente son estriles, como el lquido cefalorraqudeo y el lquido pleural. Tambin se aplica a la orina centrifugada, esputo, pus y muestras que provienen del cuello del tero, vagina, bronquios, etc.
MATERIALES
ASA DE SIEMBRA
Es un alambre, con una aleacin de nquel y cromo, que por un extremo se fija a un mango que lo sostiene y por el otro extremo se dobla formando un pequeo crculo de aproximadamente 2mm.
PORTAOBJETOS
Se debe limpiar con una mezcla de etanol y ter, mediante una gasa. El portaobjetos deber estar rotulado.
332
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VII
Secreciones
MTODO
l. Flamear el asa de siembra hasta que se ponga al rojo vivo, para lograrlo, colocar el asa por arriba de la porcin azul de la llama, en posicin vertical.
3. Tomar una porcin de la muestra que se va a examinar, colocando el asa en posicin plana en la superficie del lquido.
VII
4.
5.
Sosteniendo todava el asa aplanada sobre el portaobjetos, mover trazando un espiral del centro a la periferia.
6. Dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los cuatro lados del portaobjetos.
333
Procedimientos de Laboratorio
7 .
8. En caso de frotis para diagnstico citolgico (cuello de tero, vagina, etc.), los frotis no se deben dejar secar, pues se alterara la morfologa de las clulas. En cuanto estn listos y mientras estn hmedos todava, se fijan con alcohol absoluto y ter o laca especial en spray.
9. Flamear de nuevo el asa hasta que est al rojo vivo para destruir las bacterias que se encuentren en ella, una vez usada.
10. Proceder a fijar, pasando el portaobjetos tres veces a travs de la llama del mechero de Bunsen, con la muestra hacia arriba. Dejado enfriar antes de aplicar la tincin.
11. Hacer la tincin de frotis fijo, se tiene la tincin de Gram, de Ziehl y Neelsen.
12. Es preferible marcar un crculo alrededor del frotis con un lpiz graso, a fin de que se pueda ver ms fcilmente.
334
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VII
Secreciones
TINCIN DE GRAM
PRINCIPIOS GENERALES
La tincin Gram sirve para clasificar las bacterias en dos grupos: Bacterias grampositivas, que se tien de azul violceo oscuro. Bacterias gramnegativas, que se tien de rojo, grosella o rosado.
REACTIVOS
Solucin de cristal violeta al 1 %. Solucin de safranina. Solucin de Lugol. Alcohol acetona. Agua corriente.
VII
MTODO
l. Fijar el frotis por calor suave y dejarlo enfriar.
2.
Cubrir el frotis con cristal violeta al 1 %, dejando que el colorante acte por 1 minuto.
3.
335
Procedimientos de Laboratorio
5. 6. 7 .
Enjuagar suavemente la preparacin con agua corriente. Cubrir el frotis con alcohol acetona por 1 minuto. Enjuagar suavemente con agua corriente.
8. Cubrir el frotis con solucin de safranina, por 30 segundos 9. Enjuagar suavemente con agua corriente y dejar secar la preparacin al aire libre.
LECTURA
Observar al microscopio, utilizando el lente de inmersin. Se deber buscar: Bacterias grampositivas: Se tien de azul violceo oscuro, como estafilococo, estreptococos neumococos enterococos, etc. Bacterias gramnegativas: Se tien de color rojo, grosella o rosado, como gonococos, vibrios, enterobacterias.
336
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VII
Secreciones
ATENCIN!
Puede ocurrir reaccin grampositiva falsa porque: El frotis se ha fijado antes de que estuviera seco. El frotis ha sido demasiado grueso. Quedaron sedimentos en el frasco de la solucin cristal violeta (debe filtrarse antes de usarlo). La solucin de lugol no se escurri completamente. La solucin de safranina se dej demasiado tiempo en el frotis.
Puede ocurrir reaccin gramnegativa falsa porque: No se dej actuar suficiente tiempo la solucin de lugol. El alcohol acetona se dej de,asiado tiempo en el frotis y no se lav adecuadamente.
VII
337
Procedimientos de Laboratorio
Se observan en muestras de pus provenientes de la uretra (gonococo) y del lquido cefalorraqudeo (meningococo). Existen otros diplococos que generalmente no son patgenos y se observan en muestras de exudado farngeo o de esputo.
338
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VII
Secreciones
VII
d. Bacilos gramnegativos
Son de tamao variable, con extremos redondeados o agudos. Pueden ser largos y rectos (bacilos coleriformes), con forma de coma (vibrio) o cortos y gruesos (proteus).
339
Procedimientos de Laboratorio
e. Cocobacilos gramnegativos
Su forma es variable; no son tan redondos como los cocos, ni tan alargados como los bacilos (haemophilus). Se pueden encontrar en diversas muestras.
f.
Levaduras y actinomicetos
LEVADURAS
Son de tamao variable, aunque mayores que las bacterias, puede observarse gemacin. Se puede observar como patgenas en exudado genital.
ACTINOMICETOS
Grnulos voluminosos que a veces pueden observarse a simple vista (su color vara entre blanco y amarillo).
El centro es gramnegativo y la periferia grampositiva. Se encuentran en muestras de pus cutneo, esputo, etc.
340
MINISTERIO DE S LUD
CAPTULO
VIII
BACTERIOLOGA
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO.............. 343 Principios generales............................................... 343 Preparacin de los principales medios de cultivo... 344 Mtodos de siembra en medios de cultivo............. 355 Mtodos.................................................................. 356 Lectura e Informe de una muestra cultivada.......... 358 UROCULTIVO............................................................. 361 Principios generales............................................... 361 Materiales............................................................... 362 Mtodo.................................................................... 362 Lectura e Interpretacin.......................................... 362 HEMOCULTIVOS........................................................ 364 Principios generales............................................... 364 Eleccin del medio para hemocultivo..................... 364 Obtencin de la muestra........................................ 365 Lectura del hemocultivo.......................................... 366 Microorganismos que se pueden encontrar en los hemocultlvos........................................................... 367 ANTlBIOGRAMAS...................................................... 368 Principios generales............................................... 368 Mtodo.................................................................... 368 Lectura.................................................................... 368 DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE GONORREA............................................................... 370 Principios generales............................................... 370 Examen directo....................................................... 370 Identificacin presuntiva de Neisseria gonorrhoeae........................................................... 375 Identificacin confirmatoria de Neisseria gonorrhoeae........................................................... 375 Informe................................................................... 375 DIAGNSTICO DE Yersinia pestis........................... 376 Principios generales............................................... 376 Obtencin de muestras.......................................... 377 Procesamiento de muestras................................... 379
Captulo VIII
Bacterologa
PRINCIPIOS GENERALES
Las bacterias requieren de medios de cultivo que contengan sustancias nutritivas parecidas en lo posible al medio natural en el que viven y se reproducen. Es importante conocer la procedencia de la muestra, para escoger el medio de cultivo apropiado que permita el crecimiento del microorganismo que se necesita estudiar. Las sustancias nutritivas, que contienen los medios de cultivo son: Compuestos orgnicos nitrogenados. Compuestos inorgnicos. Sustancias energticas, etc.
Los medios de cultivo se agrupan de acuerdo con: Su estado fsico Medio lquido. Medio slido. Medio semislido. Los requerimientos diagnstico son: para el
VIII
Medios nutritivos simples Se usa para el cultivo de la mayora de las bacterias. Ejemplo: caldo y agar nutritivo.
Medios nutritivos enriquecidos Permite el crecimiento de microorganismos exigentes en sus requerimientos nutritivos. Ejemplo: agar sangre y agar chocolate.
343
Procedimientos de Laboratorio
Medios selectivos o especiales Permiten solo el crecimiento de la especie que se desea aislar. Contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos grupos bacterianos, favoreciendo a su vez el desarrollo de otros. Ejemplo: agar Mac Conkey, agar hipertnico de Chapman, etc. Medios diferenciales Ponen de manifiesto la actividad bioqumica de un microorganismo, lo cual permite diferenciado de otro parecido. Medios para transporte Permite el transporte y la viabilidad de microorganismos. Ejemplo: el medio de Stuart es til para el transporte y conservacin de la viabilidad del gonococo hasta por 24 horas.
Se debe asegurar el mximo porcentaje de sustancias nutritivas de crecimiento. Debe adaptarse la reaccin final del medio de cultivo, a un pH ptimo para los microorganismos que se van a cultivar, con errores no mayores de 0,1 de la unidad del pH requerido. No debe olvidarse que una filtracin exagerada del medio puede eliminar las sustancias nutritivas. La esterilizacin debe tener un control minucioso de la temperatura y tiempo de duracin. La prolongacin indebida en el tiempo de esterilizacin destruye las sustancias nutritivas y se produce una reduccin del volumen de los medios. Debe usarse durante la preparacin de los medios solo recipientes de cristal, de preferencia Pyrex o similares. La reparticin de los medios de cultivo se realiza siempre cerca del mechero de Bunsen (o de alcohol), en tubos o placas Petri. En los tubos se debe formar un plano inclinado y en las placas se debe tener una distribucin homognea. Los medios de cultivo contenidos en tubos se conservan mejor en refrigeracin, ya que se disminuye la evaporacin.
344
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII Se tiene medios inclinados en tubo y medios en placa Petri: Medios inclinados en tubo, se emplea principalmente para resembrar cepas aisladas previamente, con la finalidad de identificarlas.
Bacterologa
Medios en placa Petri, se emplea principalmente para permitir el crecimiento de colonias individualmente aisladas. Las placas se colocan en la estufa con la base hacia arriba.
Debe seguirse al pie de la letra las instrucciones escritas en relacin con la preparacin de medios de cultivo, debiendo usarse exclusivamente, productos qumicamente puros, a no ser que se indique lo contrario.
En casas comerciales los medios se adquieren en forma deshidratada. Se debe registrar en el recipiente del medio deshidratado la fecha de recepcin y de apertura. Entre uso y uso, se debe almacenar como se indica en la etiqueta, con escasa luz, baja humedad ambiental, y con el recipiente fuertemente tapado.
VIII
Antes de empezar a usar un nuevo lote de medios de cultivo, realizar un control de calidad del medio.
345
Procedimientos de Laboratorio
Peptona 1,0 g Dextrosa 0,5 g Cloruro de sodio Agua destilada 0,5 g 100 mL
pH 7,0 - 7,4
2. Someter a la accin del calor, agitando constantemente hasta llegar al primer hervor. 3. Ajustar el pH con las tiras indicadoras de pH. Si est por debajo de un pH de 6,8 (cida) agregar gota a gota la solucin de NaOH, si por el contrario esta por encima de 7,4 (a1calino) agregar gota a gota la solucin de HCL hasta el pH adecuado (7,0 - 7,4). 4. Envasar el medio en tubos y esterilizar en autoclave a 121 C por 15 minutos.
5. Controlar la esterilidad colocando el medio envasado en una incubadora a 37 C por 24 horas. 6. Mantener el medio envasado en la refrigeradora hasta el momento de usarlo.
346
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
AGAR NUTRITIVO
COMPOSICIN Extracto de carne 3g Peptona 5g Agar 15 g Agua destilada 1 000 mL pH final 6.8 0,2 a 25 C
PREPARACIN
l.
Disolver los ingredientes previamente pesados en 1 000 mL de agua destilada, cuidando de disolver primero el agar.
2. Someter a la accin del calor y calentar hasta el primer hervor para que se disuelva por completo, agitando constantemente. 3. Ajustar el pH con las tiras indicadoras de pH. Si est por debajo de un pH de 6,8 (cida) agregar gota a gota la solucin de NaOH, si por el contrario est por encima de 7,0 (alcalino) agregar gota a gota la solucin de HCL hasta el pH adecuado (6,8 - 7,0). 4. Envasar el medio en tubos o placas de Petri y llevados a esterilizar al autoclave.
VIII
5. Controlar la esterilidad colocando el medio envasado en una incubadora a 37 C por 24 horas y mantener el medio envasado en la refrigeradora hasta el momento de usarlo. 6. El medio debe ser de color mbar claro, de transparente a ligeramente opalecente.
347
Procedimientos de Laboratorio
2. Dejar enfriar hasta alcanzar una temperatura de 45 C, es decir, hasta que el calor sea soportable en el dorso de la mano. 3. Agregar 5 mL de sangre citrada o desfibrinada de carnero con una pipeta estril. Agitar por rotacin en forma suave, con el fin de obtener una buena mezcla y evitar la formacin de burbujas. 4. 5. 6. 7 . Su color normal debe ser rojo cereza homogneo. Repartir el contenido en placas Petri estriles y dejar solidificar. Controlar la esterilidad en incubadora a 37 C, por 24 horas. Mantener el medio envasado en la refrigeradora.
AGAR CHOCOLATE
1. Preparar agar sangre hasta obtener su color normal rojo cereza.
2. Llevar el agar sangre antes de su solidificacin al bao mara a 80 C por 10 minutos. Por el calentamiento, el color rojo cereza cambiar al chocolate, debido a la ruptura de los hemates y la salida de la hemoglobina. 3. Durante el calentamiento mezclar constantemente para evitar la formacin de precipitado (grumos).
348
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
4. Repartir con mucho cuidado en las placas Petri para evitar la formacin de burbujas. 5. Otra manera de preparar agar chocolate es utilizar como base un agar de Mueller Hinton mezclado con sangre de carnero.
PREPARACIN l. Para rehidratar el medio se suspenden 50 gramos de agar Mac Conkey en 1 000 mL de agua destilada fra.
VIII
2. Calentar hasta el punto de hervor para disolver el medio completamente. 3. Esterilizar en la autoclave durante 15 minutos a 121 C. 4. Cuando el medio se ha enfriado a 50 C, repartir en placas Petri ms o menos 20 a 25 mL por placa.
349
Procedimientos de Laboratorio
Extracto de carne Proteosa peptona Lactosa Sales biliares Citrato de sodio Tiosulfato sdico Citrato frrico Agar Verde brillante Rojo neutro pH
g g g g g g g g
PREPARACIN l. Para rehidratar el medio preparado se suspende 60 gramos de agar salmomella shiguella en 1 000 mL de agua destilada fra.
2. Calentar hasta punto de hervor para disolverlo por completo. 3. Repartir el medio en placas Petri, ms o menos 20 a 25 mL por placa.
ATENCIN!
No se debe esterilizar en autoclave.
350
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
g g g
15,0 g
Lactosa 10,0 g Sacarosa 10,0 g Glucosa Sulfato ferroso Tiosulfato de sodio Rojo de fenol Cloruro de sodio 1,0 0,2 0,3 g g g
PREPARACIN l. Pesar 65 g de agar triple azcar hierro (TSI) para 1 000 mL de agua destilada.
VIII
2. Calentar al fuego hasta mezclar completamente. 3. Esterilizar a 121 C, durante 15 minutos. 4. Repartir en tubos, de tal manera que queden con 2,5 cm de fondo y 3,5 cm de tendido (medio inclinado).
THAYER-MARTIN MODIFICADO
351
Procedimientos de Laboratorio
COMPOSICIN Agar 10 g Medio base para gonococos (GC) 36 g Hemoglobina 10 g Suplemento nutritivo 10 mL Solucin de antibiticos pH final 10 mL Agua destilada 1 000 mL 7,2 0,2 a 25 C
PREPARACIN
l.
En un matraz de 250 mL colocar 125 "perlas de vidrio" (que sirven para obtener una buena mezcla) agregar los 10 g de hemoglobina y 125 mL de agua destilada, agitar hasta observar completa disolucin.
2. En una probeta de 500 mL colocar un embudo de vidrio con filtro de gasa -algodn - gasa (a manera de sandwich) para filtrar la solucin de hemoglobina. Completar a 500 mL con agua destilada y al final, colocar esta solucin en un matraz de 2 L para ser esterilizada en la autoclave. 3. En un matraz de 2 L mezclar 36 g de medio de GC base y 10 g de agar en 500 mL de agua destilada, calentando hasta hervir para disolver completamente. 4. Esterilizar por separado el agar base GC y la solucin de hemoglobina en autoclave a 121 C por 15 minutos. 5. Mantener estas soluciones estriles en bao mara a la temperatura de 50 56 C. 6. 7 . Rehidratar el suplemento nutritivo con lquido rehidratante estril y agitar para asegurar una completa disolucin. Seguir las instrucciones del fabricante. Rehidratar la solucin de antibiticos con agua destilada estril y dejar reposar 20 minutos. Seguir las instrucciones del fabricante.
352
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
8. Agregar al medio base 10 mL de suplemento nutritivo y 10 mL de solucin de antibiticos, mezclando suavemente. 9. Mezclar suavemente la solucin de hemoglobina al agar base y mantener en bao mara a la temperatura de 50 - 56 C hasta el momento de repartir el medio.
10. Repartir en placas Petri estriles entre 15 a 20 mL por placa de 100 mm de dimetro.
ATENCIN!
Los medios que no van a ser utilizados deben conservarse a temperatura de refrigeracin (aproximadamente durante 6 meses) protegidos con bolsas de plstico, con la finalidad de reducir al mnimo la deshidratacin.
d. Medios de transporte
MEDIO DE CARY Y BLAIR
COMPOSICIN Fosfato disdico 1,1 g Cloruro de sodio 5,0 g Tioglicolato de sodio 1,5 g Agar 5,0 g Agua destilada 991 mL pH final 8,4
VIII
353
Procedimientos de Laboratorio
PREPARACIN
1. 2.
Colocar los ingredientes en un baln con el agua destilada. Calentar en bao mara hasta que la solucin est clara (no se permite que hierva). Enfriar a 50 C. Agregar 9 mL de solucin de cloruro de calcio al l % recin preparada y ajustar el pH a 8,4 con NaOH 10 N gota a gota. Colocar cantidades de 5 a 7 mL en tubos con tapas de rosca (aflojado) estriles de 13 x 100 mm. Esterilizar (no en autoclave) a 100 C en bao mara hirviendo durante 15 minutos. Se aprietan las tapas despus de la esterilizacin.
3.
4.
5.
ATENCIN!
El medio es bastante estable si se almacena en un lugar fresco y oscuro y no se permite que se seque. Este medio se puede utilizar mientras no presente prdida de volumen contaminacin, ni cambio de color.
MEDIO TRANSGROW TG Este medio est compuesto por agar Thayer Martin modificado al cual se le agrega bicarbonato de amonio hasta lograr una concentracin final de 0,1 %.
354
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
Siempre debe trabajarse cerca del mechero de Bunsen para flamear la boca del tubo o la placa Petri con el medio, antes y despus de sembrar para evitar contaminaciones.
Para sembrar en placa Petri es importante que la superficie del medio este completamente seca, para conseguir esto las placas deben quedar en reposo durante 2 horas.
VIII
MATERIALES
Muestras para cultivar. Tubos y placas Petri con medios de cultivo Asas de siembra. Aguja de platino. Mechero de Bunsen.
355
Procedimientos de Laboratorio
MTODOS
2. Tomar con el asa de siembra una cantidad suficiente de la muestra. 3. Introducir el asa de siembra con la muestra hasta el fondo del tubo con medio lquido, sin tocar las paredes del mismo.
3. Deslizar el asa de siembra suavemente en zigzag en el tubo con medio slido, empezando desde el fondo del tubo.
356
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
1.
2. Tomar con el asa de siembra una cantidad suficiente de muestra. 3. El asa debe ser sostenida suavemente entre los dedos con cuidado de no hundida en el medio. 4. Sembrar en el medio slido en placa Petri, dividido en cuatro cuadrantes, inoculando la muestra en cantidades sucesivamente menores en cada cuadrante. Cada cuadrante presentar diferente distribucin de colonias.
VIII
2. Tomar con la aguja de platino (o alambre recto), una pequea cantidad de muestra. 3. Sembrar en el agar semislido introduciendo la aguja en forma vertical. Debe tenerse cuidado en hacer que el trayecto de salida sea el mismo que el de entrada.
357
Procedimientos de Laboratorio
dimetro
en
Consistencia Membranosa, cremosa mucosa, etc. Pigmentacin Amarilla, blanca, gris negra, etc. Olor Ptrido, alcohlico, etc.
358
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
En ocasiones esta descripcin puede llevar al diagnstico presuntivo del gnero y especie de que se trata. Posteriormente de una de las colonias, se debe hacer una coloracin Gram para determinar: Morfologa. Caracterstica de la tincin. Agrupacin. El aislamiento y pureza de la cepa aislada son indispensables. Debe pasarse a distintos sustratos para: Llegar a la identificacin por pruebas bioqumicas Realizar pruebas de sensibilidad antibitica.
Principales medios Agua peptonada, agar nutritivo, caldo nutritivo. Agar sangre, agar chocolate. Mac-Conkey, telurita, agar Sabourand, Lowenstein- Jensen, Selenia F, SS, corazn-cerebro, Thayer-Martin, TSI, LIA. Carbohidratos, agar con rea, agar con citrato, gelatina, descarboxilasa. Stuart, Amies, Transgrow, Cary y Blair.
VIII
Diferenciales Transporte
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Procedimientos de Laboratorio
Organismo control Escherichia coli. Proteus mirabilis. Salmonella enteritidis. Escherichia coli. Klebsiella pneumoniae. Proteus mirabilis. Klebsiella pneumoniae.
Reacciones esperadas Colonias rojas. Colonias incoloras. Colonias incoloras con centros rojos. Siempre rojo (+). No rojo (-). Mvil No mvil
Motilidad
360
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
UROCULTIVO
PRINCIPIOS GENERALES
Los cultivos son esenciales para determinar la identidad y cantidad exacta de las bacterias y para reconocer si los microorganismos encontrados en una muestra son patgenos o inocuos (no afectan la salud del hombre y se llaman tambin "saprofitos"). Para hacer el cultivo de la orina, llamado tambin urocultivo, el paciente no debe haber recibido antibiticos por lo menos cinco das antes del examen. Los cultivos sirven para aislar microorganismos que se encuentran en escasa cantidad y decidir cul ser el antibitico ms efectivo en el tratamiento de la infeccin (antibiograma). Los cultivos bacterianos pueden ser: Medios slidos: agar en placas Petri o en tubos. Medios lquidos: tubos con caldos de cultivo.
VIII
Los microorganismos que frecuentemente se encuentran en la orina infectada: E. coli. Pseudomona aeruginosa. Enterococo. Citrobacter. Klebsiella.
Se acepta que un recuento superior de 100 000 bacterias por mL de orina, indica infeccin de las vas urinarias.
361
Procedimientos de Laboratorio
MATERIALES
Muestra de orina. Microscopio. Placas de agar Mac Conkey. Placas de agar sangre. Asa de siembra estndar (calibrada).
MTODO
l.
Tomar la orina sin centrifugar, con el asa de siembra calibrada, es decir, que cada asada suministre 0,01 o 0,001 mL de orina.
2. Sembrar la orina por dispersinagotamiento con un asa de siembra calibrada, sobre una placa de agar sangre y otra sobre una placa de agar de Mac Conkey. 3. Rotular e incubar a 37 C.
LECTURA E INTERPRETACIN
Detallar las caractersticas de las colonias en el agar Mac Conkey y el agar sangre. Seleccionar colonias del agar Mac Conkey y replicar (resembrar) en los medios de diferenciacin bioqumica (TSI, citrato, rea, etc.) Las interpretaciones se harn de acuerdo con las reacciones bioqumicas de las enterobacterias (ver Anexos).
362
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
Para conocer el nmero de microorganismos en un 1 mL de orina, se cuentan las colonias y el resultado se multiplica por 100 si se us asa de 0,01 mL o por 1 000 si se us asa de 0,001 mL. El resultado ser el nmero de bacterias por ml de orina, considerndose:
Negativo (contaminacin) Dudoso, discutible y se pueden deber a envi tardo de la muestra al laboratorio, o a una contaminacion importante. Indica infeccin urinaria
De 0 - 100 000 bacterias por ml de orina. De 10 000 - 100 000 bacterias por ml de orina. Recuento superior a 100 000 bacterias por mL de orina.
Cuando el nmero de colonias sobrepasa el nmero de 100 000 bacterias por mL de orina, al informar no interesa precisar el nmero exacto de bacterias, solo debe informarse "ms de 100 000 bacterias por mL de orina".
VIII
363
Procedimientos de Laboratorio
HEMOCULTIVOS
PRINCIPIOS GENERALES
Es la prueba ms til y ms frecuentemente usada para demostrar la presencia de bacterias en la corriente sangunea. El mtodo del hemocultivo consiste en obtener sangre con la ms rigurosa tcnica de asepsia y aadida a un frasco que contiene un medio de cultivo elegido para aislar un determinado microorganismo (bacteria). Las muestras de sangre para hemocultivo deben obtenerse, antes que el paciente reciba terapia antimicrobiana. Es importante obtener la muestra de sangre, en el momento en que la temperatura del paciente se encuentra elevada. Esto da una mayor probabilidad de tener resultados positivos en el hemocultivo. Se requiere de un mnimo de tres hemocultivos seriados por paciente antes de considerar el caso como negativo.
364
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
OBTENCIN DE LA MUESTRA
l.
Generalmente, se extrae sangre del pliegue del codo, con la ms rigurosa tcnica de asepsia.
3. El medio de eleccin se calienta a 37 C en una estufa de cultivo, y el tapn de caucho del frasco se flamea con alcohol para destruir los microorganismos contaminantes en su superficie.
4.
Para llevar el frasco a la cabecera del paciente se cubre el tapn con un algodn mojado de alcohol.
VIII
5. Obtenida la muestra de sangre, se retira el algodn del frasco y la aguja de la jeringa se introduce a travs del tapn de caucho del frasco, se expulsa la sangre en el medio, se retira la aguja y se mezcla el contenido del frasco.
365
Procedimientos de Laboratorio
6. Cada frasco debe rotularse: nombre del paciente, fecha y hora de obtencin de la muestra.
366
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
Una vez que se han logrado colonias aisladas, debe determinarse su identificacin.
Los resultados, tanto positivos como negativos, deben comunicarse lo antes posible al mdico que lo solicit.
Streptococcus viridans. Streptococcus pyogenes. Staphilococcus aureus y albus. Diplococcus pnemoniae. Neisseria meningitidis. Brucella sp. Proteus-providence. Pseudomona aeruginosa. Enterococos. Estreptococcos anaerobios. Salmonella sp. Pasteurella tularensis. Leptospira sp. Streptobacillus monilifonnis. Escherichia. Citrobacter. Haemophilus influenzae.
VIII
Klebsiella.
367
Procedimientos de Laboratorio
ANTIBIOGRAMAS
PRINCIPIOS GENERALES
Es una prueba que se pide cotidianamente al laboratorio, a fin de seleccionar el antibitico ms eficaz en el tratamiento de una infeccin determinada. Consiste en efectuar un cultivo del microorganismo en el medio ms apropiado y despus diseminarlo en placa Petri con agar, al que se le colocan discos de papel de filtro impregnados con solucin de antibitico.
MTODO
1. Despus de preparar las placas Petri con el medio slido (agar sangre o MullerHinton) se distribuye sobre la placa el microorganismo previamente cultivado, en forma uniforme y abundante con un asa de siembra. Espesor del agar: 4 mm, lo que equivale a: 60 mL para las placas de 150 mm de dimetro. 25 mL para las placas de 90 mm de dimetro.
2. Colocar los discos sobre este medio slido con pinzas estriles, dejando 2 cm entre cada uno de ellos. 3. Inmediatamente, llevar a la estufa e incubar a 37 C durante 12 - 18 horas.
LECTURA
Se buscan las zonas de inhibicin (donde no crecen los microorganismos) alrededor de los discos ("halo claro") que deben ser medidas con una regla en mm, en la parte exterior y reversa de la placa.
368
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
Una zona de inhibicin indicar sensibilidad o resistencia del antibitico correspondiente, segn las medidas obtenidas en mm, para lo cual se usar una tabla de medidas, conforme a las instrucciones del fabricante (ver anexo).
ATENCIN!
Los discos deben conservarse a 4 C La zona de inhibicin depende de: El poder de difusin del antibitico en el medio. El espesor del medio: una placa con espesor grueso permite una difusin vertical mayor del antibitico, con lo que disminuye la difusin superficial, resultando la zona de inhibicin menor. La colocacin del disco: un disco colocado verticalmente deja pasar poco antibitico al medio.
Se utilizan discos para determinados microorganismos segn sean muestras de: Hemocultivos Urocultivos Coprocultivo Secreciones farngeas Lesiones de piel Secreciones vaginales Secreciones uretrales,etc
VIII
369
Procedimientos de Laboratorio
PRINCIPIOS GENERALES
Se le denomina Neisseria gonorrehoeae, diplococo gram negativo, intracelular, que adopta la forma arrionada. Es el agente etiolgico de la gonorrea, enfermedad de transmisin sexual. El perodo de incubacin de la enfermedad es de 4 - 8 das. En el hombre se manifiesta con abundante secrecin uretral mucopurulenta. En la mujer, puede no presentar sntomas. Las infecciones ms frecuentes causadas por el gonococo son: uretritis cervicitis, proctitis, salpingitis y oftalma del recin nacido, entre otras.
EXAMEN DIRECTO
El examen directo es de gran valor para el diagnstico de la gonorrea en el hombre, en la mujer su utilidad es menor, por tal razn, en este ltimo caso, el cultivo es necesario.
MATERIALES
Obtencin de la muestra: secrecin uretral, cervical, farngea, rectal, ocular. Asa bacteriolgica estril. Hisopo de algodn estril. Lminas portaobjetos. Tincin Gram (ver Anexos). Un microscopio. Aceite de inmersin.
370
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
MTODOS
l. De las muestras obtenidas directamente con asa bacteriolgica preparar dos frotis tan finos como sea posible que abarque una buena extensin de la lmina portaobjetos.
ATENCIN!
No debe frotarse vigorosamente, para evitar alteraciones de la morfologa celular. De las muestras obtenidas por hisopo: este debe rotarse suavemente sobre la superficie de la lmina portaobjetos, en lugar de frotarla; esto evita que se rompa los leucocitos y as se conserva la morfologa tpica intracelular. Dejar secar los frotis a temperatura ambiente o con calor suave, para luego realizar la coloracin Gram.
LECTURA
Con microscopio y objetivo de inmersin (100x), los gonococos se pueden reconocer por las siguientes caractersticas: Son diplococos, se agrupan en pares, con formas que asemejan riones. Son Gram negativos. Son intracelulares, se hallan dentro de los leucocitos.
VIII
A veces son extracelulares, agrupados en racimos entre leucocitos o cerca de leucocitos rotos.
371
Procedimientos de Laboratorio
INFORME
Resultado positivo Si se encuentran diplococos intracelulares gramnegativos agrupados en pares, con formas que asemejan riones. Resultado sospechoso Si solo se observan diplococos gramnegativos extracelulares. Debe confirmarse con cultivo. Resultado negativo No se observa diplococos gramnegativos.
CULTIVOS
La Neisseria gonorrhoeae se desarrolla en los siguientes medios de cultivo: Selectivos: Thayer Martn modificado. Enriquecidos: agar chocolate con suplemento de crecimiento.
Estos cultivos exigen condiciones especiales de anaerobiosis a pH 7,3 Y con atmsfera de 3 - 10% de CO2 y 70 - 80% de humedad. Las colonias se desarrollan en 18 - 24 horas.
MATERIALES
Obtencin de muestra de secrecin uretral, cervical, rectal, farngea, ocular. Asa bacteriolgica estril. Hisopo de algodn estril. Tubos o placas Petri conteniendo medios de Thayer Martn modificado o agar chocolate con suplemento de crecimiento. Estufa a 37 C. Jarra de anaerobiosis o frasco de boca ancha con tapa (tipo lata de caf, pintura u otro).
372
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII Vela blanca. Gasa o algodn humedecido con agua de cao.
Bacterologa
MTODO
l. Debe sembrarse directamente en la placa conteniendo el medio de Thayer Martin modificado o agar chocolate enriquecido.
2. La siembra se realiza rotando el hisopo sobre el medio, en forma de "Z", procurando depositar toda la muestra y con el mismo hisopo diseminarla en todo el medio, por el mtodo de dispersin-agotamiento.
VIII
SI LA MUESTRA HA SIDO TOMADA DIRECTAMENTE CON EL ASA Sembrar sobre el medio de cultivo, en forma de Z y luego con la misma asa se dispersa toda la muestra, por el mtodo de dispersin agotamiento.
373
Procedimientos de Laboratorio
INCUBAClN DE LAS PLACAS SEMBRADAS l. Debe tener un ambiente que contenga CO2 y humedad. Este ambiente se logra: Usando una jarra de anaerobiosis o frasco de boca ancha con tapa (tipo lata de caf, pintura u otro), colocar las placas sembradas (en forma invertida) en la jarra de anaerobiosis o frasco de boca ancha con tapa. En la base de la jarra o en la ltima placa se coloca sobre una lmina portaobjetos, un pedazo de vela blanca encendida, para proporcionar una atmsfera de 3 10% de CO2; as mismo, se coloca un pedazo de gasa o algodn humedecido con agua de cao para darle una atmsfera de 70 - 80% de humedad (este ltimo paso se repetir todas las veces que se abra la jarra o frasco).
2.
3. Cerrar hermticamente la tapa de la jarra o frasco e incubar a 37 C hasta por 72 horas. La vela se apaga cuando se consuma el O2.
LECTURA Los cultivos deben examinarse cada 18 - 24 horas, hasta por 72 horas. Se informa como resultado negativo si no hay crecimiento de colonias despus de 72 horas. Las colonias sospechosas de gonococos, despus de 20 horas en medio de agar chocolate son pequeas (2 - 5 mm), redondas convexas, brillantes, cremosas, mucoides, con bordes uniformes. Luego se vuelven ondeadas. En el medio selectivo de Thayer Martin modificado, las colonias gonoccicas aparecen generalmente como crecimiento selectivo.
374
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
INFORME
RESULTADO POSITIVO Si hay crecimiento de colonias con pruebas confirmatorias. RESULTADO SOSPECHOSO Si se ha realizado las pruebas de identificacin presuntiva. RESULTADO NEGATIVO Si no hay crecimiento de colonias despus de las 72 horas.
VIII
375
Procedimientos de Laboratorio
La Yersinia pestis pertenece a la familia enterobacteriaceae y es un bacilo gramnegativo aerobio, que cuenta con gran cantidad de antgenos y toxinas. La forma clnica ms frecuente, es la linfangitis regional aguda, llamada peste bubnica caracterizada por aumento de tamao de los ndulos linfticos con dolor (reas inguinales o axilares). Algunas formas menos comunes son la septicmica y la neumnica. El xito de los procedimientos para el diagnstico depende de una buena obtencin de la muestra y la rapidez con estas lleguen al laboratorio. Se debe obtener la muestra antes de la administracin de antibiticos. La confirmacin absoluta de un brote de peste, requiere del aislamiento e identificacin del agente etiolgico.
ATENCIN!
El material sospechoso deber manejarse con gran cuidado, usando mandil, guantes y mascarilla por el riesgo de infeccin. Se debe evitar que se dispersen en el aire gotas minsculas que pueden causar la infeccin de otras personas y la propagacin de la peste neumnica. El personal de laboratorio puede infectarse por diversas vas: lesin en piel, mucosas y tracto respiratorio.
376
MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
En la fase aguda de la enfermedad, hay una intermitente bacteremia (presencia del microorganismo en el torrente sanguneo), por lo que se requiere la obtencin de cuatro muestras de sangre para tener mayor probabilidad de cultivo positivo. Las muestras deben tener aproximadamente 5 mL de sangre en adulto y 2,5 mL en nios. Una vez aisladas por cultivo colonias sospechosas de Yersinia pestis, se debe enviar al laboratorio de referencia regional para su confirmacin diagnstica.
VIII
2. Desinfectar dos veces la piel del bubn con alcohol yodado, descartando el algodn cada vez, y una tercera vez con alcohol al 70%. Antes de la puncin debe haberse evaporado. 3. Sosteniendo la jeringa entre el ndice y el pulgar de la mano derecha introducir la aguja en el bubn.
377
Procedimientos de Laboratorio
4. Con la mano izquierda, tirar lentamente del mbolo de la jeringa. Deber entrar en esta, un lquido que puede ser sanguinolento, proveniente del bubn.
5.
En el caso que no entre lquido alguno en la jeringa, cargar la jeringa con 2 mL de solucin salina estril e inyectar en el bubn, empujar suavemente el mbolo con el pulgar. Imprimir a la aguja introducida en el bubn un movimiento circular, a continuacin, tirar lentamente el mbolo, para as obtener el lquido seroso.
6.
7 . Sostener la jeringa en posicin vertical, con la aguja hacia abajo e inocular parte del aspirado del bubn en el medio de transporte Cary y Blair. El resto del aspirado se usar para el frotis. Dejar caer una gota de la muestra contenida en la jeringa y extenderla con la misma aguja sobre una lmina portaobjetos formando una capa delgada. Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo VIII
Bacterologa
La obtencin de rganos de paciente fallecido, con diagnstico de sospecha de peste, es de suma importancia. En un cuerpo no refrigerado (24 - 48 horas) realizar autopsia inmediatamente, obtener muestras de hgado, bazo y tejido de ndulo linftico (bubn). Si no se puede procesar inmediatamente, se puede guardar hasta por 6 meses en medio de transporte Cary y Blair o Thioglicolato a 4 C. Se tiene la posibilidad de recuperar en un 100% por cultivo el agente etiolgico, as como realizar inmunofluorescencia directa. En un cuerpo no refrigerado (despus de 48 horas) obtener muestras de hgado, bazo y tejido de ndulo linftico (bubn) y procesar inmediatamente. Se tiene la posibilidad de recuperar en un 20% por cultivo el agente etiolgico, as como realizar inmunofluorescencia directa.
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
MTODO
MEDIO DE AGAR SANGRE AL 6% (ver Anexos). El medio de agar sangre al 6%, es el medio slido estndar que se usa para el cultivo de Yersinia pestis.
VIII
En caso de muestras de aspirado de bubn, esputo, rganos, sembrar directamente la muestra en el medio, la muestra se estra en la superficie del medio e incuba por 24 horas a 37 C. La Yersinia pestis crece como colonias translcidas blanco grisceas:
379
Procedimientos de Laboratorio
Despus de una incubacin de 48 horas, las colonias miden aproximadamente 1 - 2 mm de dimetro y son blanco grisceas y ms opacas. Para su confirmacin diagnstica enviar al Laboratorio de Referencia Regional.
CALDO INFUSiN CEREBRO CORAZN (BHI) (ver Anexos). El caldo de infusin cerebro corazn es el medio estndar usado en el laboratorio para el aislamiento primario, crecimiento y caracterizacin de Yersinia pestis. Antes de proceder a la inoculacin de las muestras, el medio debe encontrarse a temperatura ambiente. Realizar con el asa de siembra la inoculacin de la muestra en un tubo con tapa rosca que contenga 10 mL de caldo. Incubar a 37 C durante 24 a 48 horas. Crecen como pequeos cmulos de clulas en los lados y fondo del tubo; el resto del caldo permanece claro. Para su confirmacin diagnstica enviar al Laboratorio de Referencia Regional.
380
MINISTERIO DE S LUD
CAPTULO
IX
BIOQUMICA SANGUNEA
GLUCOSA EN SANGRE............................................ 383 Principios generales............................................... 383 Mtodo de la glucosa oxidasa................................ 383 REA EN SUERO....................................................... 385 ELECTROLITOS SRICOS........................................ 395 Principios generales............................................... 385 Mtodo de Chaney y Marbach............................... 385 Tiras reactivas........................................................ 387 Principios generales............................................... 395 CREATININA EN PLASMA O EN SUERO................. 388 Mtodo.................................................................... 395 POTASIO (K) .............................................................. 397 SODIO (Na)................................................................. 395 Principios generales............................................... 393 Mtodo.................................................................... 393 FOSFATASA ALCALlNA............................................ 393
Captulo IX
Bioqumica Sangunea
PRINCIPIOS GENERALES
La detenninacin de la glucosa (azcar) sangunea es necesaria para establecer el diagnstico de la diabetes mellitus y otras enfermedades en que existen alteraciones del metabolismo de los carbohidratos. En el mtodo de la glucosa oxidasa, el color formado en el proceso es directamente proporcional a la cantidad de glucosa sangunea que puede medirse con el espectrofotmetro. La glucosa es oxidada enzimticamente por la glucosa oxidasa a cido glucnico y agua oxigenada. La reaccin es la siguiente: Glucosa + H20 + O2 = cido glucnico + H202 El agua oxigenada formada es separada, y el agua y el oxgeno disminuyen por una peroxidasa en presencia de un aceptor de oxgeno, que es convertido en un componente coloreado, cuya cantidad se lee con el espectrofotmetro.
IX
383
Procedimientos de Laboratorio
MTODO
Preparar tres tubos de ensayo y marcarlos de la siguiente manera: Tubo de la muestra: M Tubo blanco: B Tubo estndar: S 1. En el tubo M colocar 0,1 mL de sangre total, suero, plasma o lquido cefalorraqudeo (LCR), agregar 1 mL de hidrxido de sodio 0,05 M y 0,1 mL de sulfato de zinc al 10%.
2. Mezclar y centrifugar. 3. Del sobrenadante tomar 0,2 mL y agregar 4 mL del reactivo enzima-color. 4. En el tubo S colocar 0,1 mL de la solucin estndar de glucosa y tratar igual que la muestra del paciente (repetir paso 1,2 y 3). 5. En el tubo B colocar 0,2 mL de agua destilada, agregar 4 mL del reactivo de enzima-color. 6. 7 . Colocar los tubos a 37 C en bao Mara durante 10 minutos. Leer con el espectrofotmetro la absorbancia entre 430 - 500 nm (nanmetro), poniendo a cero con el tubo B.
8. Calcular usando la siguiente frmula: Glucosa (mg I 100 mL) = Absorbancia de la muestra x 200 Absorbancia del estndar 9. Los valores normales son: Glucosa (mg / dL) : 70 - 115 mg / dL
384
MINISTERIO DE S LUD
Captulo IX
Bioqumica Sangunea
PRINCIPIOS GENERALES
Una de las funciones del rin es eliminar los productos de desecho no voltiles del metabolismo, entre ellos la rea y la creatinina; un aumento de las cifras de estas sustancias en suero es signo de transtorno renal. En el mtodo de Chaney y Marbach, la rea presente en el suero es hidrolizada por la ureasa en CO2 y NH3. Este ltimo reacciona luego con el fenol y el hipoclorito de sodio en medio alcalino y se produce un color azul de indofenol.
IX
PROCEDIMIENTO
l. Marcar tres tubos de ensayo de 150 x 16 mm con: Testigo Desconocido Blanco = = = T D B
385
Procedimientos de Laboratorio
2. Incubar los tres tubos durante 5 minutos en bao mara a 50 C Testigo T 1,0 mL 1,0 mL Desconocido D 1,0 mL 1,0 mL Blanco B 1,0 mL 1,0 mL
3. Agitar bien despus de cada agregado. 4. 5. Volver a incubar los tres tubos a la misma temperatura y durante igual tiempo. Sacar los tubos del bao Mara y agregar a cada tubo 10 mL de agua destilada, mezclar.
6. Leer en el espectrofotmetro a 525 nm, empleando la solucin blanco de reactivos para establecer el nivel cero de absorbancia. 7 . Calcular usando la siguiente frmula:
mg de rea por 100 mL de suero = Absorbancia del desconocido x 60 Absorbancia del testigo
386
MINISTERIO DE S LUD
Bioqumica Sangunea
Se observa aumento o falso positivo por ingestin de compuestos mercuriales diurticos, tiazdicos, gentamicina, kanamicina.
10. Se puede emplear plasma recogido con oxalato, citrato, heparina o EDTA como anticoagulante; pero no debe contener oxalato de amonio.
11. No utilizar plasma o suero preservado con fluoruro, pues esta sal inactiva la enzima. 12. La rea es estable en suero congelado durante varios meses.
TIRAS REACTIVAS
Es una prueba enzimtica para determinar la rea en sangre. Las tiras estn compuestas por ureasa purificada y azul de bromotimol, utilizando cromgeno como indicador. El color vara del amarillo verdoso a tonos ms oscuros. La comparacin del color se efecta en un cuadro de valores.
IX
387
Procedimientos de Laboratorio
PRINCIPIOS GENERALES
El plasma o suero se diluyen con agua destilada, y se precipitan las protenas con cido tngstico. Se agrega a una parte del filtrado libre de protenas, picrato alcalino con el cual, la creatinina forma un complejo de color rojo que se valora con el espectrofotmetro.
MTODO
l. Poner en un tubo de centrfuga limpio y seco lo siguiente: Plasma o suero Solucin tungtato de sodio al 10% cido sulfrico 0,66N Solucin de creatinina de 1 mg / 100 mL (Ver Anexos). 2,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
2. Mezclar cuidadosamente sin sacudir. 3. Centrifugar a 2 500 RPM durante 5 minutos. El lquido sobrenadante se usa en el paso siguiente. Preparar en cuatro tubos de ensayos limpios y secos lo siguiente:
4.
388
MINISTERIO DE S LUD
Captulo IX
Bioqumica Sangunea
Tubo Lquido sobrenadante Solucin patrn de creatinina Agua destilada Solucin alcalina de picrato
5.
6. Leer las densidades pticas del problema y de los patrones en un espectrofotmetro con banda de 520 nm; el cero de densidad ptica se obtiene con el blanco. 7 . Calcular usando la siguiente frmula Utilizar la lectura del patrn ms parecido a la del problema. Utilizando el patrn 1:
mg de creatinina por 100 mL = Lectura del problema x 1,0 Lectura e patrn 1 Utilizando el patrn 2:
mg de creatinina por 100 mL = Lectura del problema x 3,0 Lectura del patrn 2 8. Los valores normales son: 0,4 a 1,2 mg por 100 mL de plasma o suero.
IX
389
Procedimientos de Laboratorio
PRINCIPIOS GENERALES
Se incuba el suero con cido alfa-cetoglutrico y cido asprtico. Se forma cierta cantidad de cido oxalactico o de cido pirvico, respectivamente. En medio alcalino, el cetocido formado, da lugar a un compuesto coloreado proporcional a la cantidad de cido presente, y refleja la actividad de transaminasa.
MTODO
REACTIVOS (ver Anexos)
0,1 M 2 milimol.
pH
7,4.
Sustrato para TGO (transaminasa glutmico oxalactica). Sustrato para TGP (transaminasa glutmico pirvica). Reactivo cromgeno. Solucin NaOH 0,4 N.
PROCEDIMIENTO
l. Es idntica para las transaminasas oxalactica y pirvica: solo cambia el sustrato. Colocar 1 mL de sustrato (TGO o TGP) en un tubo de ensayo y poner en bao mara a 37 C durante unos minutos.
390
MINISTERIO DE S LUD
Captulo IX 3.
Bioqumica Sangunea
Incubar durante 60 minutos para TGO o durante 30 minutos para TGP en bao Mara a 37 C.
4. Trascurrido el tiempo necesario, sacar del bao y agregar 1,0 mL del reactivo cromgeno. Mezclar. 5. 6. 7 . Dejar reposar a temperatura ambiente por 15 minutos. Aadir 10 mL de NaOH 0,4 N. Mezclar por inversin y dejar en reposo por 20 minutos. Leer en el fotocolormetro a 505 nm poniendo a cero con agua y con un blanco de 1,0 mL de sustrato, 0,2 mL de suero, 1,0 mL del reactivo cromgeno y 10 mL de NaOH 0,4 N.
8. Los resultados se calculan sobre la curva de calibracin que se realiza en seis tubos de ensayo, segn la tabla siguiente: Solucin piruvato(mL) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Sustrato TGO (mL) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 Agua destilada (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Equivale TGO 0 20 55 95 148 216 Equivale TGP 0 23 50 83 125 -
Tubo 1 2 3 4 5 6
IX
9. En cada uno de los seis tubos aadir 1 mL de reactivo cromgeno, agitar suavemente y dejar 20 minutos en reposo a temperatura ambiente. 10. Agregar 10 mL de NaOH 0,4 N. Mezclar por inversin y dejar reposar 30 minutos. 11. Leer en el fotocolormetro a 505 nm poniendo a cero con agua destilada.
391
Procedimientos de Laboratorio
12. Los valores normales son: TGO: de 8 a 40 unidades por mL TGP: de 5 a 35 unidades por mL 13. Se puede observar. Aumento o falso positivo de TGO Por la ingestin de cido nalidxico, anticonceptivos orales, eritromicina, gentamicina, etc. Aumento o falso positivo de TGP Por la ingestin de agentes anablicos, metildopa, salicilatos, etc.
392
MINISTERIO DE S LUD
Captulo IX
Bioqumica Sangunea
MTODO
REACTIVOS (ver Anexos)
Buffer pH 10,5 Sustrato 0,012 M Hidrxido de sodio 0,02 N Agua destilada Solucin testigo de trabajo
PROCEDIMIENTO
1. Marcar en dos tubos de ensayo: D (desconocido) y B (blanco).
IX
2. Colocar 0,5 mL de buffer pH 10,5 y 0,5 de sustrato en los tubos de ensayo marcados. 3. Poner ambos tubos en bao Mara a 37 C durante 5 minutos. 4. 5. 6. Aadir 0,10 mL de suero en el tubo D. Aadir 0,10 mL de agua destilada en el tubo B. Mezclar. Colocar ambos tubos en bao de agua a 37 C durante 30 minutos.
393
Procedimientos de Laboratorio
7 . Transcurrido el tiempo indicado, agregar en cada tubo 10 mL de hidrxido de sodio 0,02 N. 8. Agregar 0,10 mL de suero en el tubo B. Mezclar bien. 9. Leer en el fotocolormetro a 407 nm ambos tubos, poniendo a cero con agua destilada. 10. Restar los resultados del tubo D del tubo B mediante la tabla de calibracin. 11. La obtencin de la tabla de calibracin, se realiza de acuerdo con lo siguiente:
Tubo 1 2 3 4 5 6
Solucin estandar Hidroxido de sodio de trabajo(mL) 0,02 N (mL) 0,5 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,6 10,1 9,1 7,1 5,1 3,1
12. Efectuar la lectura en el fotocolormetro a 407 nm poniendo a cero con agua destilada. 13. Se representa en papel semilogartmico las U.I. (Unidades internacionales) de fosfatasa a1calina. 14. Los valores normales son: Fosfatasa A1calina: 13 - 60 45 - 115 U.I. / L en adultos. U.I. / L en nios.
394
MINISTERIO DE S LUD
Captulo IX
Bioqumica Sangunea
MTODO
REACTIVOS (ver Anexos)
Reactivo de acetato de uracilo y zinc. Alcohol etilico de 95. cido tric1oroactico al 10%. Solucin testigo de sodio que equivale a 139 mEq/L
PROCEDIMIENTO
1. En un tubo de ensayo colocar 0,5 mL de suero. Agregar 2 mL de cido tric1oroactico al 10%, dejar reposar 5 minutos y centrifugar. El sobrenadante se usa para el siguiente paso.
IX
395
Procedimientos de Laboratorio
Desconocido D 0,5 mL 1 mL
Testigo T 0,5 mL 1 mL
Blanco C -
0,5 mL 1 mL
3. Mezclar cada tubo y colocarlos en el refrigerador durante una hora. 4. Centrifugar. Decantar cuidadosamente los tubos descartando el lquido sobrenadante y dejando los tubos invertidos durante varios minutos sobre papel de filtro. 5. Lavar las paredes de los tubos con 2 mL de alcohol de 95agitando suavemente, para resuspender el precipitado (sedimento). Centrfugar de nuevo y descartar el lquido sobrenadante invirtiendo los tubos en papel filtro como en el caso anterior. Disolver el precipitado (sedimento) con 5 mL de agua destilada. Si la solucin resulta turbia, se debe centrifugar.
6.
7 .
8. Leer en el fotocolormetro a 430 nm poniendo a cero con agua destilada. 9. Calcular usando la siguiente frmula:
mEq Na/L = Densidad ptica del desconocido - Densidad ptica del blanco x 139 Densidad ptica del testigo - Densidad ptica del blanco 10. Los valores normales son: 135 a 155 mEq Na/L
396
MINISTERIO DE S LUD
Captulo IX
Bioqumica Sangunea
POTASIO (K)
PRINCIPIOS GENERALES
Determinacin fotocolorimtrica del potasio El potasio del suero se precipita en forma de cobaltonitrito de sodio y potasio, el que se determina fotocolorimtricamente aprovechando el hecho de que las soluciones alcalinas de cobalto en presencia de glicina reducen el reactivo de los fenoles a un color azul.
MTODO
REACTIVOS (ver Anexos)
Reactivo de cobaltonitrito de sodio. Solucin semisaturada de acetato de sodio. Solucin lavadora saturada con cobaltonitrito de sodio y potasio. Solucin de glicina al 7,5% en agua destilada. Carbonato de sodio al 25% en agua destilada. Reactivo de Folin-Ciocalteu. Solucin testigo de potasio que equivale a 5,1 mEq/L
PROCEDIMIENTO
l. En dos tubos de centrfuga graduados marcados con: D (desconocido) y T (testigo), colocar: - Al tubo D: - Al tubo T: 0,20 mL de suero. 0,20 mL de solucin testigo de potasio.
IX
397
Procedimientos de Laboratorio
3. 4.
Agregar agitando constantemente, a cada tubo 0,5 mL del reactivo cobaltonitrito sdico recientemente filtrado. Dejar reposar 45 minutos a temperatura ambiente.
5. Agregar a cada tubo 1 mL de agua destilada, mezclar y centrifugar ambos tubos durante 15 minutos. 6. Decantar el lquido sobrenadante e invertir los tubos sobre papel filtro durante 15 minutos. Agregar al precipitado (sedimento) de cada tubo 1 mL de la solucin lavadora.
7 .
8. Centrifugar los tubos durante 15 minutos, decantar el lquido sobrenadante, invertir los tubos sobre papel de filtro durante 5 minutos. 9. Agregar a cada tubo 1 mL de alcohol eti1ico de 70, mezclar empleando una varilla de vidrio.
10. Lavar la varilla con 3 mL de alcohol etlico de 70, luego verter en el tubo correspondiente. 11. Centrifugar durante 5 minutos, decantar e invertir los tubos sobre papel filtro otros 5 minutos. 12. Repetir nuevamente los pasos 9 y 10. 13. Preparar un tercer tubo marcado B (blanco). 14. Agregar a los tres tubos D, T y B, 2 mL de agua destilada. 15. Sumergir en bao hirviente hasta que el precipitado se haya disuelto por completo (ms o menos 15 minutos). 16. Antes que se enfre, agregar a cada tubo 1 mL de la solucin de glicina y luego 1 mL de la solucin de carbonato de sodio. Mezclar.
398
MINISTERIO DE S LUD
Captulo IX
Bioqumica Sangunea
17 . Aadir a cada tubo 1 mL del reactivo de Folin - Ciocalteu para uso. Mezclar. 18. Sumergir los tubos en bao de agua a 37 C durante 15 minutos. 19. Enfriar a temperatura ambiente, agregando a cada tubo cantidad suficiente de agua destilada hasta completar 6 mL. Mezclar bien. 20. Leer al fotocolormetro a 660 nm poniendo a cero con agua destilada. 21. Calcular usando la siguiente frmula: mEq K/L = Densidad ptica del desconocido - Densidad ptica del blanco x 5,1 Densidad ptica del testigo - Densidad ptica del blanco 22. Los valores normales son: 3,6 a 5,5 mEq K/L
IX
399
CAPTULO
SEROLOGA
DIAGNSTICO SEROLGICO DE SFILIS............... 403 Principios generales............................................... 403 Examen directo....................................................... 404 Mtodo.................................................................... 404 Examen de VDRL (prueba no treponmica).......... 406 Limitaciones del examen de VDRL........................ 415 Prueba de reagina plasmtica rpida (RPR)(prueba no treponmica)...................................................... 415 DIAGNSTICO DE LA INFECCIN POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFlCIENCIA HUMANA (VIH)............... 420 Principios generales............................................... 420 DIAGNSTICO DE LA INFECCIN POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS B......................................................... 425 Principios generales............................................... 425 Mtodo.................................................................... 426 DIAGNSTICO DE LA INFECCIN POR HIDATIDOSIS HUMANA..................................................................... 428 Principios generales............................................... 428 TCNICA DE AGLUTINACIN DE LTEX (AL) PARA EL DIAGNSTICO DE HIDATIDOSIS HUMANA ............... 428 MTODOS SEROLGICOS EN EL DIAGNSTICO DE BRUCELOSIS............................................................. 430 Principios generales............................................... 430 Materiales para serologa de Brucelosis............................................................... 431 Mtodos serolgicos............................................... 432 Control de calidad de las pruebas.......................... 439 MTODOS SEROLGICOS EN EL DIAGNSTICO DE SALMONELOSIS........................................................ 441 Principios generales............................................... 441 Aglutinacin en placa............................................. 442 Aglutinacin en tubo............................................... 444 Control de calidad de ambas pruebas.................... 447 Limitaciones............................................................ 447
Captulo X
Serologa
PRINCIPIOS GENERALES
La sfilis es una infeccin de transmisin sexual causada por una bacteria espirilar, el Treponema pallidum. El perodo de incubacin es de aproximadamente un mes. Las manifestaciones clnicas son variadas, por lo que de acuerdo con los estadios de la enfermedad es importante elegir la prueba de laboratorio adecuada para su confirmacin diagnstica y seguimiento de su evolucin, as tenemos: En la sfilis primaria se puede observar el chancro duro (genital, oral, rectal), cuya secrecin contiene gran cantidad de treponemas, los cuales pueden visualizarse por examen directo en un microscopio de campo oscuro. En la sfilis secundaria se observa lesiones en la piel y se realizan las pruebas treponmicas y no treponmicas. Luego de un perodo de latencia variado se presenta la sfilis terciaria, en la que hay compromiso cardiovascular o del sistema nervioso; en este caso, las pruebas treponmicas son las que hacen el diagnstico.
Son pruebas no treponmicas VDRL RPR Prueba del Laboratorio de Investigaciones en Enfermedades Venreas. Prueba de reagina plasmtica rpida.
Son pruebas treponmicas FTA-Abs MHA-TP Anticuerpos de treponema fIuorescentes absorbidos. Microhemaglutinacin para Treponema pallidum.
403
Procedimientos de Laboratorio
EXAMEN DIRECTO
Se requiere un microscopio con condensador para campo oscuro. El examen carece de valor si el paciente ha tratado la lesin (chancro duro) con algn ungento. En este caso se debe esperar tres das para efectuar el examen. El examen de frotis secos y teidos no se recomienda, ya que en la piel y en las membranas mucosas suelen existir treponemas saprofitos.
MATERIALES
Gasa estril. Solucin estril de cloruro de sodio al 0,9%. Una lanceta estril. Pipeta Pasteur con chupn. Portaobjetos de vidrio delgado. Un microscopio con condensador para campo oscuro.
MTODO
1. Limpiar el chancro con gasa humedecida con una solucin estril de cloruro de sodio al 0,9%. Secar bien.
2. Raspar los bordes del chancro varias veces con la hojilla de una lanceta estril colocada en posicin plana. Evitar provocar la salida de sangre.
404
MINISTERIO DE S LUD
Serologa
4.
Retirar la gasa y esperar durante unos minutos a que aparezca un lquido seroso de color rosceo.
6. Depositar una gota en el portaobjetos de vidrio delgado, especialmente fabricado para microscopa en campo oscuro.
LECTURA
Examinar el portaobjetos con el microscopio empleando un condensador para campo oscuro. Los treponemas se distinguen por sus cuerpos sumamente delgados y sus movimientos caractersticos, rotando alrededor de su eje longitudinal y enroscndose.
405
Procedimientos de Laboratorio
VDRL significa "Prueba del Laboratorio de Investigaciones en Enfermedades Venreas", que es el lugar donde se elabor por primera vez este examen. Se examina el suero o lquido cefalorraqudeo (LCR) en busca de reaginas, anticuerpos que se producen en personas que padecen de sfilis. La existencia de estos anticuerpos se pone de manifiesto por un antgeno, que es una suspensin de partculas minsculas que contiene cardiolipina, lecitina y colesterol La suspensin de antgeno forma grumos cuando se enfrenta con anticuerpos presentes en el suero o LCR (microaglutinacin en lmina) de pacientes con sfilis.
a. Antgeno
El antgeno es una solucin alcohlica que contiene cardiolipina al 0,03%, colesterol al 0,9% y lecitina al 0,21 %. El antgeno debe permanecer a una temperatura entre 23 a 29 C antes de su preparacin. Debe examinar el antgeno sostenindolo contra la luz. Si contiene partculas o un precipitado no se debe usar. Debe ser preparado el mismo da en que se use.
406
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
MTODO
l. Con una pipeta de 1 mL medir 0,4 mL de solucin amortiguadora para VDRL y depostelo en un frasco de fondo plano, de modo que el extremo de la pipeta toque el fondo del frasco.
3. Introducir en el frasco la punta de la pipeta conteniendo el antgeno de VDRL, de modo que llegue hasta el tercio superior del frasco.
407
Procedimientos de Laboratorio
4. Dar un movimiento rotatorio al frasco, sostenindolo en posicin vertical y deslizndolo en la superficie de la mesa de trabajo.
5.
A medida que se efecta este movimiento rotatorio dejar caer el antgeno contenido en la pipeta gota a gota. Este procedimiento debe durar aproximadamente 6 segundos o 18 20 movimientos rotatorios del frasco en un crculo de 5 cm de dimetro.
6.
7 . Con la pipeta de 5 mL medir 4,1 mL de solucin amortiguadora para VDRL y aada al frasco con la mezcla anterior.
8. Tapar el frasco y agitar el frasco vigorosamente, 30 veces durante 10 segundos aproximadamente. As la solucin quedar lista, para ser usada por un da, pero debe mantenerse entre 23 - 29 C (en estufa).
9. Antes de su uso, la solucin de antgeno, debe probarse con sueros testigos cuya reaccin (resultados) se ha determinado previamente.
408
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
Una jeringa de 2 mL Lminas serolgicas, de 2 x 3 pulgadas con anillos de 14 mm de dimetro. Frasco redondo de fondo plano con boca angosta y tapn de vidrio con capacidad de 30 mL Micropipeta de un canal graduable, rango 5 - 50 L Tips (1 - 100 L). Pipetas de 1 mL, 5 mL, y 10 mL. Frasco de vidrio con leja al 3 - 5%. Solucin antignica preparada. Solucin salina al 0,9% Solucin salina al 10% Sueros control (reactivo y no reactivo). Muestra de suero inactivado por calentamiento en bao Mara a 56 C por 30 minutos. Muestra de LCR centrifugado, pero no debe ser calentado.
409
Procedimientos de Laboratorio
MTODOS
l.
Numerar los anillos de la lmina serolgica con un lpiz graso en el orden en que indica la figura. Tomar nota de que los nmeros de los tubos correspondan a los nmeros de los anillos.
2. Con una micropipeta colocar 50 L (0,05 mL) del suero control reactivo al anillo 1 de la lmina serolgica y 50 L (0,05 mL) del suero control no reactivo al anillo 2. 3. A partir del anillo 3, colocar 50 L (0,05 mL) de los sueros problemas en cada uno de los anillos de la lmina serolgica.
4.
Aadir con una micropipeta 17 L (0,017 mL) de solucin antignica preparada sobre el suero contenido en cada uno de los anillos de la lmina.
5. De no contar con micropipetas, utilizar una jeringa de 2 mL con aguja calibre 18 (sin bisel) y sostenindola en posicin vertical deje caer una gota de solucin antignica sobre el suero contenido en cada uno de los anillos de la lmina.
410
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X 6. Colocar la lmina serolgica con las muestras en un rotador a 180 RPM por 4 minutos o rotarlo manualmente (segn lo indicado, ver materiales). Terminada la rotacin, examinar la lmina inmediatamente usando un microscopio con el objetivo de 10x y ocular de 10x.
Serologa
7 .
LECTURA E INFORME Grumos medianos o grandes = reactivo (R). Grumos pequeos = reactivo dbil (RD). Sin grumos = no reactivo (NR).
VDRL CUANTITATIVA EN SUERO l. Colocar 50 L (0,05 mL) de solucin salina al 0,9% del anillo 2 al anillo 6 de la lmina serolgica.
2. Aadir 50 L (0,05 mL) de suero problema en el anillo 1 y 2. 3. Mezclar la solucin salina y el suero del anillo 2 y transferir de este anillo, 50 L (0,05 mL) al anillo 3.
411
Procedimientos de Laboratorio
4. 5.
Mezclar el contenido del anillo 3 y transferir 50 L (0,05 mL) al anillo 4 Mezclar el contenido del anillo 4 y transferir 50 L (0,05 mL) al anillo 5 y as sucesivamente hasta el anillo 6.
6. Aadir con una micropipeta 17 L (0,017 mL) de solucin antignica sobre el contenido de cada anillo de la lmina serolgica (del anillo 1 al 6)
7 .
Colocar la lmina con las muestras en el rotador a 180 RPM por 4 minutos o rotarlo manualmente.
8. Tan pronto como hayan transcurrido los 4 minutos, colocar la lmina serolgica en el microscopio y examinar con el objetivo de l0x y ocular de l0x.
9. Si se obtiene reactivo por sobre el ttulo 1/8 continuar con las siguientes diluciones:
Preparar una dilucin 1/8, colocando en un tubo 0,7 mL de solucin salina al 0,9% y agregar 0,1 mL del suero problema. Colocar 50 L de solucin salina 0,9% en los crculos 2, 3 y 4 de la lmina serolgica. Aadir 50 L de la dilucin 1/8 en los crculos 1 y 2. Seguir el procedimiento repitiendo los pasos 3, 4, 5, 6, 7 y 8.
412
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X LECTURA E INFORMTICA Definir como: Reactivo Reactivo debil No reactivo (R) (RD) (NR)
Serologa
Segn las caractersticas microscpicas mencionadas anteriormente. Se informa los resultados segn el siguiente cuadro de titulacin para el examen cuantitativo de VDRL:
Resultado
Reactivo dbil 0 dils Reactivo 1 dils(1) Reactivo 2 dils (1/2) Reactivo 4 dils(1/4) Reactivo 8 dils(1/8) Reactivo 16 dils(1/16) Reactivo 32 dils(1/32)
Los resultados se notifican en trminos de la mayor dilucin de suero en que se haya producido la reactividad.
413
Procedimientos de Laboratorio
2. Mezclar vigorosamente y dejar reposar por 5 minutos. As estar lista para ser utilizada.
MTODO
l. Colocar 50 L (0,05 mL) de LCR problema en una lmina serolgica.
2. Aadir 10 L (0,01 mL) con micropipeta o de lo contrario una gota de suspensin antignica sensibilizada utilizando una jeringa con aguja de calibre 21 (sin bisel). 3. 4. Colocar la lmina en el rotador por 8 minutos a 180 RPM o rotarlo manualmente. Terminada la rotacin observar al microscopio con objetivo de l0x y ocular de 10x.
LECTURA E INFORME
Grumos medianos o grandes Grumos pequeos Sin grumos = = = reactivo (R)
414
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
Puede producirse un fenmeno de prozona (exceso de anticuerpos), en el cual la reactividad de un suero no diluido se ve inhibida. Este fenmeno de prozona se sospecha cuando se produce una reaccin dbilmente reactiva. Para evitar ste fenmeno de prozona todo suero que presente algn tipo de reaccin debe ser sometido a una prueba cuantitativa de VDRL. Puede producirse falsos positivos en muestras de persona o pacientes que usan narcticos, padecen de lupus eritematoso, mononucleosis, malaria, lepra, neumona viral, o que recientemente han sido inmunizados.
La prueba de RPR, es una prueba serolgica no treponmica de floculacin macroscpica. La prueba de RPR utiliza un antgeno que es una modificacin del antgeno de VDRL, que contiene partculas de carbn para ayudar a visualizar de modo macroscpico la reaccin, cloruro de colina para no inactivar los sueros y cido etildiaminotetraactico (EDTA) para hacer ms estable la suspensin. Para la prueba de RPR se usa dos tipos de muestras: suero y plasma. Dichas muestras no deben presentar turbidez (contaminado), no deben estar hemolizadas y deben estar a una temperatura de 23 - 29 C.
415
Procedimientos de Laboratorio
MATERIALES
Kit de RPR 18 mm prueba en tarjeta. Este kit trae lo siguiente: Tarjeta con crculos marcados.
Capilares. Antgeno. Aguja roma (sin bisel) N. 20. Aplicadores de madera o plstico. Frasco gotero de plstico.
ATENCIN!
El kid debe conservarse en refrigerin. Tips (1- 100 L). Rotador mecnico adaptable a 100 RPM. Frasco de vidrio de boca ancha con leja. Sueros control (reactivo y no reactivo). Micropipetas de un canal graduable rango 5 - 5 L
2. Colocar parte del antgeno (dependiendo del nmero de muestras a procesar), en el frasco gotero de plstico y verificar que la gota de antgeno salga de forma uniforme a travs de la aguja.
416
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
3. Colocar sobre cada uno de los crculos de la tarjeta, 50 L (0,05 mL) de los sueros a evaluar, o una gota utilizando el aplicador del kit. No olvidar colocar los sueros control. 4. Con ayuda del aplicador extienda la muestra dentro del crculo sin salir del margen. 5. Agregar 17 L (0,017 mL) de antgeno, con micropipeta o una gota con el gotero del kit, sobre las muestras a evaluar. 6. 7 . Colocar la tarjeta con las muestras sobre el rotador por 8 minutos a 100 RPM. Si no cuenta con rotador, hacer rotar completamente la tarjeta con las dos manos, sobre una superficie plana, dando 100 movimientos circulares por minuto, durante 8 minutos.
8. Luego de los 8 minutos, tomar la tarjeta con ambas manos y balancearla para observar los grumos, sobre todo en casos de nnima reactividad. 9. Hacer la lectura bajo una lmpara de luz, de preferencia.
LECTURA E INFORME
Lectura Grumos grandes, medianos o pequeos, pero definidos. Sin grumos. Informe Reactivo (R) No reactivo (NR)
417
Procedimientos de Laboratorio
2. Colocar 50 L (0,05 mL) del suero problema en el primer crculo y 50 L (0,05 mL) en el segundo crculo, mezclar bien en el segundo crculo. 3. Transferir 50 L (0,05 mL) al tercer crculo, mezclar bien y transferir 50 L (0,05 mL) al cuarto crculo, mezclar bien. 4. Transferir 50 L (0,05 mL) al quinto crculo y as sucesivamente hasta el sexto crculo.
5. Usando un aplicador, extender la mezcla en cada crculo comenzando en el sexto crculo y terminando en el primer crculo. 6. Agregar 17 L (0,017 mL) de antgeno, con micropipeta o una gota con el gotero del kit, sobre las muestras a evaluar. 7 . Colocar la tarjeta con las muestras sobre el rotador por 8 minutos a 100 RPM. Si no cuenta con rotador, hacer rotar completamente la tarjeta con las dos manos, sobre una superficie plana, dando 100 movimientos circulares por minuto, durante 8 minutos.
8. Luego de los 8 minutos, tomar la tarjeta con ambas manos y balancearla para observar los grumos, sobre todo en casos de mnima reactividad. 9. Reportar el ttulo hasta la dilucin en que se observe una reaccin, inclusive una reaccin muy fina, que considerar como reactivo mnimo.
418
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
Fenmeno de prozona (exceso de anticuerpos), en el cual la reactividad de un suero no diluido se ve inhibida. Puede sospecharse cuando se produce una reaccin mnima, o se aprecian grumos, bastante grandes mezclados con partculas sueltas de antgeno en la prueba cualitativa, por tanto, todo suero que presente algn tipo de reaccin debe ser sometido a una prueba cuantitativa.
Puede producirse falsos positivos en muestras de personas que usan narcticos padecen de lupus eritematoso, mononucleosis, malaria, lepra, neumona viral o hayan sido recientemente vacunadas.
419
Procedimientos de Laboratorio
PRINCIPIOS GENERALES
Para hacer el diagnstico de infeccin por VIH, se emplean pruebas para un diagnstico preliminar (tamizaje) y contirmatorias, que detectan anticuerpos en muestras de sueros. Las pruebas inmunolgicas ligadas a enzimas (ELISA) se usan para un diagnstico preliminar basado en la deteccin de los anticuerpos contra VIH. El suero o plasma son los elementos ms comunes usados para la deteccin de anticuerpos. Deben guardarse congelados en el caso de que la prueba no pueda realizarse inmediatamente luego de la recoleccin. Los procedimientos ms comnmente usados se clasifican como pruebas de ELISA indirecto, competitivo y de captura. Los antgenos usados en estas pruebas pueden ser derivados de virus lisados o producidos por recombinacin gentica o sintticamente. Los anticuerpos son producidos en animales y pueden ser monoclonales o policlonales. Estos reactivos se incluyen en los paquetes (kits) de las pruebas comerciales, ya sea fijados a fase slida o empaquetados separadamente junto con otros reactivos. Todos los juegos de las pruebas incluyen especmenes de control positivo y negativo que deben ser incluidos durante cada examen para asegurar la validez de los resultados de la prueba.
420
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
FUNDAMENTO
La muestra de suero se diluye en el soporte en el que se encuentra inmovilizado el antgeno. Se incuba por un perodo especfico de tiempo y a una temperatura exacta de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Substrato Enzima Anticuerpo antihumano conjugado a la enzima Anti/VIH (suero del paciente) Se produce color Prueba reactiva Antgeno VIH Pozo de poliestireno No hay unin no se produce color Prueba no reactiva
Si las muestras de suero contienen los anticuerpos especficos, estos formarn un complejo antgeno - anticuerpo y permanecern unidos al soporte. La muestra de suero se elimina por lavado.
Luego, agregar anticuerpos antiimunoglobulinas totales humanas conjugadas con peroxidasa. Incubar a la temperatura indicada por el fabricante. Este conjugado se unir al complejo antgeno-anticuerpo, si esto ltimo se produjo en el paso 2 del proceso. Realizar un nuevo lavado y agregar el substrato enzimtico.
421
Procedimientos de Laboratorio
En los casos en que se haya unido el conjugado, la reaccin genera un producto coloreado proporcional a la concentracin de anticuerpos en la muestra. La concentracin de anticuerpos es detectada por el espectrofotmetro a una longitud de onda determinada segn los procedimientos del fabricante. La lectura de resultados positivos se basa en la aparicin de un color que se puede detectar ya sea visualmente o con un espectrofotmetro. Es la prueba ms usada.
FUNDAMENTO
Es un mtodo indirecto modificado para detectar anticuerpos VIH. El anticuerpo VIH en la muestra positiva compite con el anticuerpo VIH marcado con la enzima por los lugares reactivos en los antgenos ligados al soporte de fase slida. Por lo tanto, ambos, la muestra y el anticuerpo marcado con la enzima son aadidos al mismo tiempo. El anticuerpo de la muestra positiva se ligar al antgeno, y por lo tanto evitar que los anticuerpos marcados con enzima se junten con el antgeno.
422
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
Substrato Anticuerpo del paciente Se produce muy poco o nada de color Prueba reactiva
Esto limitar la cantidad de enzima disponible para reaccionar con el substrato y no se producir ningn color para casos de muestras positivas con anticuerpos a VIH. En contraste, las muestras que son negativas para anticuerpos a VIH permitir a la gran mayora de los anticuerpos marcados con enzima ligarse al antgeno fijado al soporte. Al agregar el substrato de la enzima resultar en el desarrollo de un color similar al control negativo.
423
Procedimientos de Laboratorio
Substrato
Conjugado Anticuerpo del patiente Antgeno del VIH Anticuerpo monoclocal anti / VIH
PROCEDIMIENTO l. Despus de un perodo de incubacin y de lavado, el suero que se va a examinar es aadido e incubado.
2. La fase slida es luego lavada y se aade la inmunoglobulina anti-Ig humana marcada con la enzima, se incuba y se lava. 3. Aadir el substrato de la enzima, mezclar e incubar. 4. Si es positiva, en la muestra de suero se produce color.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
PRINCIPIOS GENERALES
TEST DE LTEX DIRECTO PARA LA DETECCIN DEL ANTGENO DE SUPERFICIE DE LA HEPATITIS B (HBsAg)
Se basa en una reaccin de aglutinacin de ltex. Las partculas de ltex estn sensibilizadas con anticuerpos monoclonales reactivos frente al antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). En el caso de una reaccin positiva pueden obtenerse distintos patrones de aglutinacin. En ausencia del antgeno HBsAg no se produce la aglutinacin. Los procedimientos del fabricante son incluidos en los paquetes (kits), y es especialmente importante que stos se entiendan y que todo el equipo, material y condiciones ambientales estn disponibles para la realizacin de la prueba. Todos los juegos de las pruebas incluyen controles positivos y negativos que deben ser procesados durante cada examen para asegurar la validez de los resultados de la prueba.
ATENCIN!
Los componentes del kit mantenidos a 2- 8 C, son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. No se debe congelar.
425
Procedimientos de Laboratorio
MTODO
Las partculas de ltex estn sensibilizadas con gamma-globulinas de conejo.
MATERIALES
Reactivo de ltex: 1 x 2,5 mL Control positivo: 1 x 0,5 mL Control negativo: 1 x 0,5 mL Placas de reaccin. Agitadores desechables. Prediluido. Prediluido.
PROCEDIMIENTO
l. Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.
2. Homogenizar completamente el reactivo de ltex. 3. Diluir la muestra que se examinar, 1/40 en salina (0,9% NaCl): 1 gota (50 L) de suero fresco ms 2 mL de salina (0,9% de cloruro de sodio).
6. Colocar una gota de cada uno de los controles en los correspondientes crculos de reaccin.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo X 7 .
Serologa
Aadir una gota de reactivo de ltex homogenizado a cada uno de los crculos.
8. Mezclar con distintos agitadores, cada uno de los crculos, de modo que el lquido se extienda por toda la superficie.
LECTURA
De acuerdo con los siguientes patrones de aglutinacin: HBsAg negativo No hay aglutinacin ni en la muestra diluida ni en la muestra sin diluir. HBsAg positivo (nivel medio o elevado) Aglutinacin en las muestras diluidas y sin diluir. HBsAg positivo (nivel bajo) Aglutinacin en la muestra sin diluir. No aglutinacin en la muestra diluida. HBsAg positivo (nivel alto) Aglutinacin en la muestra diluida. No aglutinacin en la muestra sin diluir (por fenmeno de zona).
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Procedimientos de Laboratorio
El Echinococcus granulosis es la especie de mayor importancia desde el punto de vista de salud pblica y de produccin animal.
Se basa en una reaccin de aglutinacin de ltex. Las partculas de ltex (como soporte) estn sensibilizadas con antgeno hidatdico, que al ser enfrentadas con suero que contiene anticuerpos especficos aglutinan evidenciando la reaccin antgeno-anticuerpo. El antgeno utilizado para esta prueba se prepara a partir de lquido de quiste hidatdico de Echinococcus granulosus liofilizado. La sensibilidad de la prueba es de 98% y especificidad es de 90%.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
MATERIALES
Partculas de ltex sensibilizadas. Suero control positivo. Suero control negativo. Suero problema. Placas de aglutinacin. Palito mondadientes.
PROCEDIMIENTO
l. 2. 3. 4. En una placa de aglutinacin, colocar en uno de los crculos 20 L de partculas de ltex sensibilizadas, ms 20 L de suero problema. En una placa de aglutinacin, colocar en uno de los crculos 20 L de partculas de ltex sensibilizadas, ms 20 L del suero control positivo. En una placa de aglutinacin, colocar en uno de los crculos 20 L de partculas de ltex sensibilizadas, ms 20 L del suero control negativo. Mezclar con ayuda de distintos palitos mondadientes cada uno de los crculos.
5. Luego agitar suavemente por rotacin, balanceando la placa de aglutinacin durante ocho minutos y finalmente realizar la lectura.
LECTURA
De acuerdo con los siguientes patrones de aglutinacin: La reactividad del suero (positivo), se manifiesta por la aparicin de pequeos grumos de aglutinacin de las partculas de ltex y que representa la formacin del complejo antgeno-anticuerpo. La falta de reactividad del suero (negativo), se manifiesta por la permanencia de la suspensin de las partculas al no estar presente anticuerpos especficos en el suero.
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Procedimientos de Laboratorio
430
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
ATENCIN!
Tanto los antgenos como los sueros deben estar a temperatura ambiente por lo menos una hora antes de realizar la prueba. Los antgenos para dignostico deben mantenerse en refrigeracin a una temperatura de 4 - 8 C. Se debe evitar su congelacin, porque quedan inutilizados definitivamente.
Aglutinoscopio. Placa o lmina de vidrio dividida en 72 cuadrados de 3,0 a 3,5 cm por lado. Pipetas graduadas para medir 0,08, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005 mL (puede usarse pipetas de 0,2 mL graduadas al milsimo o al centsimo). Gotero calibrado que d exactamente 0,03 mL por gota. Agitadores de metal, de plstico o palitos de dientes. Un cronmetro. Sueros control positivo y negativo. Tubos de ensayo 13 x 100 mm. Pipetas serolgicas de 10 y 5 mL Jeringas de 2 mL de capacidad con aguja N. 16 y 21/2 pulgadas de longitud. Micropipetas de 5 - 50 L, de 20 - 200 L y otra de 200 - 1 000 L de rango.
431
Procedimientos de Laboratorio
MTODO
l. Con la pipeta inclinada a 45 en contacto con la placa, depositar: 0,08 mL 0,04 mL 0,02 mL 0,01 mL 0,005 mL de la muestra de suero en una columna de la placa.
2. Agitar suavemente el antgeno y con el gotero en posicin vertical dejar caer una gota del antgeno sobre cada una de las muestras del suero.
432
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
3. Con un agitador o un palito de dientes, mezclar cuidadosamente el suero y el antgeno con un movimiento circular, empezando por la dilucin ms alta. La mancha circular ocupada por cada dilucin debe tener los siguientes dimetros: 0,08 0,04 0,02 0,01 = 27 mm. = 24 mm. = 21 mm. = 18 mm.
0,005 = 15 mm.
Si se trata del suero de un mismo paciente, no es necesario enjuagar y secar los agitadores cuando se agita de altas a bajas diluciones. Cambiar de agitador cuando se trata de sueros de diferentes pacientes.
4. Levantar la placa y agitar con un suave movimiento rotatorio (cuatro veces). 5. Colocar la placa en el aglutinoscopio, se apaga la luz oscureciendo la habitacin y se cierra la tapa para evitar la evaporacin, y se espera 8 minutos.
6. Al trmino de los 8 minutos se levanta la tapa, se prenden las luces del aglutinoscopio, se rota nuevamente la placa por cuatro veces y hacer la lectura inmediatamente.
LECTURA
l.
La lectura debe hacerse exactamente a los 8 minutos, que es cuando las muestras alcanzan la aglutinacin mxima, si se prolonga el tiempo favorece la evaporacin excesiva que da apariencia de aglutinacin en la periferia de la mezcla suero-antgeno.
433
Procedimientos de Laboratorio
REACCIN COMPLETA La mezcla suero-antgeno ha sido aglutinada y el lquido que las rodea es completamente transparente. El tamao de la masa aglutinada vara de fino a grandes grumos.
REACCIN INCOMPLETA Incluye todos los grados intermedios de reaccin que van de trazas de partculas aglutinadas y el lquido que las rodea no es transparente. En tal caso, si el porcentaje de aglutinacin es mayor del 50%, se informa como reaccin completa en este ttulo y si es menor del 50% se informa como negativa.
REACCIN NEGATIVA Es una mezcla homognea de suero-antgeno sin ninguna evidencia de aglutinacin.
434
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
MTODO
l. Colocar 0,03 mL de suero problema sobre uno de los cuadrados de la lmina de vidrio (o tarjeta de cartn, lmina de plstico, etc.)
2. Colocar una gota (0,03 mL) de antgeno de rosa de Bengala cerca de la del suero problema. 3. Mezclar bien el suero y el antgeno utilizando un agitador o un palito de dientes distinto para cada muestra. La mancha circular ocupada por la muestra debe tener un dimetro de 23 a 24 mm. Hacer girar la lmina o tarjeta durante 4 minutos a razn de 10 a 12 movimientos por minuto. Esto se puede hacer en forma manual o con rotadores mecnicos.
4.
435
Procedimientos de Laboratorio
LECTURA
El resultado de la prueba se lee a los 4 minutos sobre un fondo blanco.
REACCIN POSITIVA Presenta grumos de aglutinacin, que pueden ser grandes o pequeos.
MATERIALES
Antgeno para la prueba en tubo: 1 mL de antgeno ms 99 mL de solucin salina al 0,85% fenolada al 0,5%. Antgeno para la prueba 2ME: l mL de antgeno ms 49 mL de solucin salina al 0,85%. Solucin de 2ME 0,1 molar: 0,39 mL de 2-Mercaptoetanol Q.P. ms 49,61 mL de solucin de cloruro de sodio al 0,85% (no utilizar salina fenolada).
436
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
MTODO
l. Colocar dos hileras de 5 tubos de 13 x 100 mm en una gradilla por cada muestra de suero.
2. Identificar el primer tubo de cada hilera con el nmero correspondiente al suero problema.
3. Destinar una de las hileras a la prueba de tubo y marcarla con una T. Marcar con una M la otra hilera en la que se har la prueba de 2ME.
4. Con una pipeta de 0,2 mL se mide 0,08 mL de suero (primera dilucin) manteniendo la pipeta en posicin vertical sobre la pared interna del tubo, depositar en el fondo del mismo los 0,08 mL. Utilizando el mismo procedimiento, echar 0,04 mL de suero en el segundo tubo, 0,02 mL en el tercero, 0,01 mL en el cuarto y 0,005 mL en el quinto tubo.
5.
Repetir el procedimiento descrito para depositar las mismas cantidades de suero en la segunda hilera de tubos. Agregar 1 mL de solucin de 2-ME a cada tubo de las hileras marcadas con M (prueba de 2ME), agitar y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos.
6.
437
Procedimientos de Laboratorio
7 .
Agregar 2 mL de antgeno fenolado a cada tubo de las hileras marcadas con T (prueba de tubo); agitar.
8. Aadir 1 mL de antgeno para 2-ME a los tubos marcados con M, agitar. 9. Incubar los tubos por 48 horas a 37 C en estufa.
LECTURA
Las muestras deben ser observadas en el aglutinoscopio, con luz indirecta y fondo opaco: Reaccin positiva La mezcla suero-antgeno es clara y se presentan grumos que no se rompen con una agitacin suave. Reaccin incompleta La mezcla suero-antgeno es parcialmente clara y la agitacin suave no rompe los grumos, si la aglutinacin es mayor del 50% se reporta como positiva. Reaccin negativa La mezcla suero-antgeno no es clara y la agitacin suave no revela rumos.
Se reporta como ttulo aquella dilucin ms alta en que se haya producido una reaccin completa, tanto para la prueba en tubo como la de 2ME.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
Si se quiere conocer el ttulo final del suero por el mtodo de tubo se prepara una dilucin 1/16: 0, 1 mL suero problema ms 1,5 mL de suero fisiolgico o suero negativo. A continuacin, se procede como el mtodo anteriormente descrito. La lectura ser: ml 0,08 0,04 0,02 0,01 0,005 No diluida 1 / 25 1/50 1/100 1/200 1/400 Diluida 1/ 16 1 / 400 1/ 800 1 / 1 600 1 / 3 200 1 / 6 400
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Procedimientos de Laboratorio
DATOS GENERALES
Anotar en una ficha: El laboratorio productor del antgeno. El tipo de antgeno. La cepa utilizada. La fecha de expiracin. El volumen de antgeno por frasco. El nmero de frascos y si viene con gotero o no.
PUREZA
Hacer una coloracin de Gram debiendo observarse solo la presencia de cocobacilos gramnegativos.
ESTERILIDAD
Sembrar una gota del antgeno en: Un tubo de agar tripticase soya. Un tubo de caldo dextrosado con indicador de Andrade. Un tubo con agar Saboraoud.
CONTROL DE pH
Medir el pH, tanto del antgeno de prueba como del antgeno estndar, utilizando un potencimetro o papeles indicadores de pH, debiendo estar dentro de un rango adecuado para el antgeno que se prueba.
440
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
PRINCIPIOS GENERALES
La serologa del gnero Salmonella constituye el complemento necesario para el diagnstico de la fiebre tifoidea. El gnero Salmonella tiene principalmente dos clases de antgenos: El antgeno "O" o antgeno somtico termoestable. El antgeno "H" o antgeno flagelar termolbil.
A partir de la segunda semana, el paciente que sufre de fiebre tifoidea, contiene anticuerpos en la sangre, que pueden ser identificados probando el suero del paciente contra antgenos de salmonelas, los cuales pueden ser demostrados por la reaccin de Widal. La reaccin de Widal incluye: Aglutinacin en placa Procedimiento ampliamente utilizado por su simplicidad. Aglutinacin en tubo Debe utilizarse para confirmar la presencia de anticuerpos demostrados por la prueba en placa y para cuantificar su ttulo.
441
Procedimientos de Laboratorio
AGLUTINACIN EN PLACA
Se encuentra en el comercio antgeno de O y H de Salmonella para realizar la prueba. Este mtodo es rpido y exacto. Es preciso agitar bien el vial de antgeno, antes de usarlo, para garantizar una suspensin uniforme y lisa. No deben congelarse. Almacenar los viales con antgeno a 2 - 8 C.
MATERIALES
Antgeno de Salmonella typhi H Y O. Materiales para obtencin de suero del paciente. Pipetas serolgicas de 0,2 mL Placa de vidrio grande (20 x 20 cm) dividida con lpiz de cera y regla en cuadrados (2,5 - 1,27 cm) de preferencia, cinco hileras de seis cuadrados. Un aplicador o un palito de dientes.
MTODO
l. Depositar en los cuadrados de cada hilera o en cada lmina, las siguientes medidas del suero del paciente: 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 y 0,005 mL.
2. Aadir a cada medida del suero 0,03 mL de suspensin de antgeno. 3. Mezclar cada compuesto antgeno-suero con un aplicador o un palito de dientes, comenzar con la dilucin de suero de 0,005 mL y continuar hasta la dilucin de 0,08 mL. 4. Rotar (oscilar) la placa de vidrio suavemente 15 - 20 veces (durante 2 minutos). Proceder a la lectura inmediatamente.
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
LECTURA E INFORME
l. Observar la presencia de grumos, indicativo de aglutinacin.
2. Los grados de aglutinacin se interpretan con la siguiente escala: 4+ 3+ 2+ 1+ Negativo 3. Aglutinacin completa El 75% de las partculas, estn aglutinadas El 50% de las partculas, estn aglutinadas El 25% de las partculas, estn aglutinadas Ninguna aglutinacin
Las diluciones de suero sobre la placa corresponden a las siguientes diluciones en tubo (aglutinacin en tubo): 0,08 mL de suero 0,04 mL de suero 0,02 mL de suero 0,01 mL de suero 0,005 mL de suero 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320
4. 5.
Ttulo del suero El ttulo del suero que se informa corresponde a la ltima dilucin del suero en que se produce una aglutinacin de por lo menos 2+ (50%). Ejemplo de clculos. Placa 2 Dilucin 0,04mL 1+ 2+ 3+ 4+ 4+ Placa 3 Dilucin 0,02 mL 1+ 2+ 3+ 4+ Placa 4 Dilucin 0,01 mL 1+ 2+ 3+ Placa 5 Dilucin 0,005 mL 1+ 2+ Positivo 1/20 Positivo 1/40 Positivo 1/80 Positivo 1/160 Positivo 1/320 Resultados
443
Procedimientos de Laboratorio
AGLUTINACIN EN TUBO
En esta prueba, el suero del paciente se diluye de manera seriada en tubos de ensayo.
MATERIALES
Obtencin del suero del paciente. Cloruro de sodio al 0,85% formalizado (0,5 mL de formaldehdo por 100 mL de solucin salina). Antgeno de Salmonella O o H. Tubos 12 x 75 mm de fondo redondo. Pipetas serolgicas de 1 mL y 5 mL. Bao MWara. Fuente de luz adecuada.
Gradillas.
MTODO
l. Colocar ocho tubos enumerados en una gradilla para cada suero a probar. 2. Con la pipeta medir 0,9 mL de cloruro de sodio al 0,85% y depositarlo en el tubo 1 de cada hilera. Con la pipeta medir 0,5 mL de cloruro de sodio al 0,85% y depositarlo en cada uno de los tubos restantes (tubo 2 al tubo 8). Agregar 0,1 mL del suero del paciente al tubo 1.
3. 4.
444
MINISTERIO DE S LUD
Captulo X 5. 6. 7 . Mezclar bien el tubo 1. Transferir 0,5 mL del tubo 1 al tubo 2. Mezclar a fondo.
Serologa
Seguir llevando 0,5 mL del tubo 2 al tubo 3 y as sucesivamente hasta el tubo7. Desechar los 0,5 mL del tubo 7 despus de mezclar a fondo.
8. El tubo 8 es el tubo de control del antgeno. 9. Aadir 0,5 mL del antgeno (Salmonella O o H) a cada uno de los ocho tubos.
10. Agitar cada uno de los tubos para mezclar el antgeno y el suero. 11. Poner los tubos en un bao mara de acuerdo con lo siguiente: Antgeno de Salmonella O, de 16 - 18 horas a 50 C. Antgeno de Salmonella H, 1 hora a 50 C. Es importante en esta prueba usar el tiempo y la temperatura recomendada y asegurarse que el bao Mara est en un lugar libre de vibraciones mecnicas.
12. Las diluciones resultantes van desde 1/ 20 hasta 1/1 280, respectivamente.
LECTURA E INFORME
l. Utilizando una lmpara fluorescente contra un fondo negro, registrar el grado de aglutinacin de la siguiente forma: 43+ 2+ 1+ Negativo El 100% de las partculas estn aglutinadas y el lquido sobrenadante es transparente. El 75% de las partculas, estn aglutinadas y el lquido sobrenadante est ligeramente turbio. El 50% de las partculas, estn aglutinadas y el lquido sobrenadante est moderadamente turbio. El 25% de las partculas, estn aglutinadas y el lquido sobrenadante est turbio. No es visible ninguna aglutinacin y las partculas permanecen como una suspensin turbia. Esta reaccin debe observarse en el tubo 8.
445
Procedimientos de Laboratorio
2.
La aglutinacin de los antgenos ("O", "H") tiene las siguientes caractersticas: Antgeno somtico "O" Se caracteriza por una aglutinacin compacta, gruesa, la cual tiende a ser difcil de dispersar. Antgeno flagelar "H" Tiene una aglutinacin floculante y fina. Debe tenerse cuidado de no agitar una reaccin de antgeno "H" demasiado, mientras se examina.
3. Ttulo del suero El ttulo del suero que se informa corresponde a la ltima dilucin del suero en que se produce una aglutinacin de por lo menos 2+ (50%).
4. Se considera que 1/160 de ttulo para el antgeno "O" es diagnstico de fiebre tifoidea, pero es todava ms importante demostrar que este ttulo va aumentando en pruebas sucesivas 1 - 2 semanas despus.
5. Tubo 1
Dilucin Dilucin Dilucin Dilucin Dilucin Dilucin Dilucin 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 2+ 3+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 1+ 2+ 3+ 4+ 4+ 4+ 4+ 1+ 2+ 3+ 4+ 4+ 4+ 1+ 2+ 3+ 4+ 4+ 1+ 2+ 3+ 4+ 1+ 2+ 3+ 1+ 2+ Positivo 1/20 Positivo 1/40 Positivo 1/80 Positivo 1/160 Positivo 1/320 Positivo 1/640 Positivo 1/1280
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MINISTERIO DE S LUD
Captulo X
Serologa
Para una mejor interpretacin de las pruebas en placa y en tubo, siempre incluir un suero de control positivo y negativo. Tanto los sueros controles positivos como los negativos se diluyen en la misma proporcin que el suero del paciente y se procesan exactamente de la misma forma siguiendo el procedimiento anteriormente descrito para la prueba en placa y en tubo. Un antgeno se considera que es de buena calidad si no aglutina con el suero control negativo y reacciona a un ttulo de 1/80 o ms con el suero control positivo.
LIMITACIONES
La principal limitacin es su interpretacin. El diagnstico definitivo no se hace slo con el resultado del laboratorio; tiene que ser hecho por un mdico, tomando en cuenta la historia clnica y el estado fsico del paciente. La aglutinacin en placa solamente es para descarte rpido de la enfermedad, cualquier cuantificacin y confirmacin del diagnstico se hace con la prueba de aglutinacin en tubo.
Presentan aglutinaciones falsas positivas los pacientes con enfermedad heptica activa crnica y en individuos vacunados contra la tifoidea.
447
CAPTULO
XI
RED DE LABORATORIOS
RED DE LABORATORIOS......................................... 451 OBJETIVOS................................................................ 451 UBICACIN DE LOS LABORATORIOS DE LA RED SEGN NIVEL DE COMPLEJIDAD............................ 452 Unidades tomadoras de muestra........................... 452 Laboratorios locales............................................... 452 Laboratorios intermedios........................................ 453 Laboratorio de referencia regional.......................... 453 Laboratorio de referencia nacional......................... 454 CONTROL DE CALIDAD EXTERNO.......................... 455 Principios generales............................................... 455 Control de calidad externo para enfermedades de importancia epidemiolgica.................................... 463 ENVO DE MUESTRAS.............................................. 463 Principios generales............................................... 463 Tipos de muestras que se envan.......................... 464 Procedimiento de envo de muestras..................... 464 PROCEDIMIENTOS PARA ENVO DE MUESTRAS DE SUERO........................................................................ 467 Materiales............................................................... 467 Obtencin y envo del suero................................... 449 PROCEDIMIENTOS PARA ENVO DE HECES PARA LA DETECCIN DE PARSITOS.................................... 470 Mtodos.................................................................. 471 PROCEDIMIENTOS PARA ENVO DE HECES PARA EXAMEN BACTERIOLGICO.................................... 473 Siembra y envo de muestras................................. 473 PROCEDIMIENTOS PARA ENVO DE SECRECIN URETRAL.................................................................... 474 Materiales............................................................... 474 Siembra y envo de muestras................................. 474 REGISTRO DE LAS MUESTRAS, REGISTRO DEL LABORATORIO E INFORMES DIARIOS Y MENSUALES.................... 477 Principios generales............................................... 477 Numeracin de muestras....................................... 477 Los registros del laboratorio................................... 478 Los informes diario y mensual................................ 478
Captulo XI
Red de Laboratorio
La Red de laboratorios se define como el conjunto de laboratorios de salud pblica agrupados por niveles de complejidad de acuerdo con los servicios que prestan, su infraestructura, equipamiento, etc., en: Unidades tomadoras de muestras. Laboratorio local. Laboratorio intermedio. Laboratorio de referencia regional. Laboratorio de referencia nacional.
En este contexto, la concepcin de red de laboratorios sirve para la descentralizacin de pruebas ya estandarizadas hacia los laboratorios de referencia regionales, a fin de lograr el fortalecimiento de los servicios de salud y mejorar la calidad de atencin a la poblacin. Su organizacin es responsabilidad de las subregiones de salud y del MINSA. Administrativamente los laboratorios regionales dependen de la Regin de Salud.
OBJETIVOS
l. Establecer normas de las acciones de los laboratorios de la Red en: Servicios. Transferencia tecnolgica. Bioseguridad. Control de calidad. 2. Coordinar y promover actividades de capacitacin y transferencia tecnolgica en los laboratorios de la Red de acuerdo al nivel de complejidad. 3. Desarrollar los laboratorios de la Red para que contribuyan a mejorar la vigilancia de las enfermedades trasmisibles y no transmisibles para evaluar los programas de prevencin y control de las mismas.
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Procedimientos de Laboratorio
LABORATORIOS LOCALES
Agrupa a los laboratorios de los establecimientos de categora II 1, I 4 y I 3. Cuenta con infraestructura fsica, equipos, materiales y reactivos, as como profesionales de salud para el trabajo en laboratorio de procedimientos segn nivel de complejidad (ver Anexos). Efecta las pruebas de muestras recolectadas o remitidas por los laboratorios de los establecimientos de categora I 2 y I - 1 Remite muestras para pruebas especiales a ser efectuadas por el Laboratorio Intermedio. Adems, realiza la capacitacin, supervisin, evaluacin y control de calidad de los procedimientos de obtencin de muestras de las unidades tomadoras de muestras.
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Red de Laboratorio
Participa en la Red elevando al Laboratorio Intermedio la informacin para fines de vigilancia y partes de las muestras para acciones de control de calidad.
LABORATORIOS INTERMEDIOS
Agrupa a los laboratorios de los establecimientos de categora III 2, III 1 y II - 2.
Cuenta con estructura fsica, equipos, materiales y reactivos as como profesionales de salud para el trabajo en laboratorio de los procedimientos, adicionalmente a los efectuados por los laboratorios locales, segn nivel de complejidad (ver Anexos). Efecta las pruebas de muestras recolectadas o remitidas por los laboratorios de los establecimientos de categora II 1, I 4 y I 3. Remite muestras para pruebas especiales a ser efectuadas por el Laboratorio de Referencia Regional. Ejerce la capacitacin, supervisin, evaluacin y control de calidad de los laboratorios locales. Participa en la Red elevando al Laboratorio de Referencia Regional informacin para fines de vigilancia y partes de las muestras para acciones de control de calidad.
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Procedimientos de Laboratorio
Cuenta con infraestructura fsica, equipos, material, reactivos y recursos humanos para el diagnstico de bacterias, virus, hongos y parsitos de las muestras remitidas por el nivel intermedio.
Ejerce la capacitacin, supervisin evaluacin y control de calidad al laboratorio intermedio. Remite muestras para pruebas especiales a ser efectuadas por el Laboratorio de Referencia Nacional.
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Red de Laboratorio
CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA ENFERMEDADES DE IMPORTANCIA EPIDEMIOLGICA a. Control de calidad externo de la baciloscopa
Es un proceso sistemtico, para comparar retrospectiva y objetivamente los resultados de diastintos laboratorios mediante programas organizados por un laboratorio de referencia. Se denomina tambin prueba de competencia. Hay tres mtodos de controles de calidad que deben combinarse para evaluar el desempeo del laboratorio.
1.
EVALUACIN DIRECTA Se realizan a travs de visitas tcnicas como parte del proceso permanente de garanta de calidad externa, segn los recursos disponibles y la capacidad de desempeo del laboratorio que se visita.
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Procedimientos de Laboratorio
El laboratorio supervisor debe realizar una visita semestral o anual al laboratorio supervisado por personal experimentado o formar equipos de supervisin con personal del laboratorio intermedio y el supervisor regional con listas de comprobacin y de instrucciones para la recoleccin de una muestra de baciloscopas seleccionada al azar para el control de calidad externo.
2.
EVALUACIN DE PANELES DE LMINAS DE BACILOSCOPAS ( CENTRO A LA PERIFERIA) El panel es un conjunto de lminas teidas en el laboratorio de referencia nacional o regional que se envan a los laboratorios supervisados, para lectura y notitificacin de resultados. Este mtodo comprueba el desempeo del personal que realiza la lectura, no del laboratorio en su conjunto. Determina si el laboratorista puede realizar adecuadamente las lecturas de las baciloscopas. El control con paneles es til para: Proveer datos preliminares de las capacidades de los laboratorios perifricos, previamente al programa de relectura. Detectar rpidamente los problemas asociados con la baja calidad de lectura de los resultados. Evaluar la capacitacin de los tcnicos de laboratorio. Evaluar la calidad de los resultados cuando no hay recursos disponibles para implementar la relectura. Criterios para la implementacin del control externo de calidad con paneles: Correcta preparacin de los paneles de frotis. Nmero de frotis a incluir en el panel. Tipos de frotis a incluir (coloreados, positivos dbiles, frotis espesos o muy finos).
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Condiciones de transporte de los frotis a los laboratorios (correo, servicio de transporte). Tiempo acordado a los tcnicos de los laboratoros para la lectura e informe de los resultados.
Criterios para la evaluacin del control externo de calidad con paneles: Entrega de los informes de los resultados a los laboratorios evaluados. La implementacin de las eventuales acciones correctivas. Mecanismos para resolver los resultados discrepantes.
3.
RELECTURA DOBLE CIEGO DE UNA MUESTRA DE LMINA DE BACILOSCOPA (PERIFERIA AL CENTRO) Este mtodo consiste en volver a leer una cantidad de lminas para evaluar si el laboratorio supervisado tiene un nivel aceptable de desempeo. La muestra debe haber sido seleccionada al azar y la relectura debe hacerse a doble ciego, es decir el evaluador desconoce los resultados obtenidos por el laboratorio evaluado. El mtodo de la relectura a ciegas recomienda lo siguiente: El muestreo realizado con 10% de los negativos y el 100% de los positivos no debe ser ms recomendado.
Los errores mayores y menores son incluidos para obtener el tamao de la muestra ms pequeo posible. Los frotis positivos y negativos no son ms clasificados y conservados separadamente. En caso de resultados discrepantes, se volver a releer la lmina por el mismo evaluador, si persiste la discrepancia, se optar por un segundo evaluador.
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Procedimientos de Laboratorio
La calidad del laboratorio es evaluado en funcin al nmero y al tipo de errores que superan el umbral limite predeterminado y no calculando el porcentaje de errores.
2. TRANSPORTE El envo de los medios deber realizarse en un contenedor de caja de cartn u otro material resistente e indicando la posicin de los tubos durante el transporte. Los paquetes debern estar correctamente etiquetados con la direccin exacta del Instituto Nacional de Salud, acompaados de la documentacin respectiva.
3. METODOLOGA Los tubos con medio de cultivo de cada lote sern identificados y enumerados de acuerdo a los nmeros aleatorios asignados. La inspeccin tomar en cuenta los siguientes criterios: De los tubos: medida de los tubos, tipo de tapas, hermeticidad de la tapa. Del medio de cultivo: volumen dispensado, presencia de burbujas en el
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medio, consistencia (seca o hmeda), pH (color), inclinacin del medio, esterilidad. El Control microbiolgico se efecta con la siembra en los tubos con medio de cultivo (Ogawa y Lowestein Jensen) de una suspensin bacteriana de la cepa M. tuberculosis H37Rv (1 mg/mL). La Lectura se realiza a las cuatro semanas a partir de la siembra y se anota el nmero de tubo y el nmero de colonias observadas, por cada lote. El anlisis estadstico de los resultados determina para cada lote de diez tubos los siguientes valores: 1) La suma de los recuentos de colonias observadas en cada tubo, 2) El promedio de recuento de colonias de cada lote de tubos del medio patrn y del medio en estudio y 3) La suma de las medias de los recuentos de cada lote al cuadrado. Resultados e interpretacin, la evaluacin de la calidad del medio en estudio se realizar por comparacin de los resultados entre los lotes sembrados en una misma experiencia de control. El lmite inferior (LI) para considerar la calidad del medio ser la media menos dos veces la desviacin estndar (DS). Los lotes cuyo recuento promedio se encuentran por debajo de ese valor sern considerados de baja calidad. Informe, el laboratorio de referencia nacional tendr un mximo de un mes para emitir el informe sobre el desempeo general de los laboratorios. Los laboratorios que obtengan resultados de baja calidad, se les realizar una supervisin directa por parte del laboratorio evaluador con el fin de tomar las respectivas medidas correctivas.
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FRECUENCIA DE CONTROL
El envo se realizar con frecuencia mensual.
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Ubicacin: del centro al borde externo. Extendido: fino, con cabeza, cuerpo y cola.
INFORME DE LA EVALUACIN
Los laboratorios intermedios remiten sus resultados de control de calidad, a sus niveles locales, en forma mensual. De la calidad tcnica de la lmina: si las lminas cumplen con las caractersticas de calidad tcnica de la gota gruesa y frotis se colocar S, lo cual significa que tiene calidad para la caracterstica que se est calificando; si las lminas no tienen estas caractersticas se colocar No, que significa que no tiene la caracterstica evaluada. Luego se halla el porcentaje para cada caracterstica evaluada, considerando slo los calificativos como S con una regla de tres simple. Una vez hallado el porcentaje, este se compara con la escala de calificacin: Calidad Tcnica de la lmina 80%-100% 70%- <79% <70% Bueno Regular Deficiente
De la reproducibilidad de lectura: para la reproducibilidad y concordancia de resultado, se determinar la concordancia y discordancia del total de lminas evaluadas expresadas en porcentaje y este se compara con la escala de calificacin: Reproducibilidad de lectura 98%-100% de concordancia califica como 95%-<98% de concordancia califica como <95% de concordancia califica como Bueno Regular Deficiente
El porcentaje mximo de discordancia aceptable es de 2%. Cuando sea mayor deber realizarse una supervisin directa para detectar las causas de la discordancia y corregirlas, dando sugerencias y pautas para ello.
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ENVO DE MUESTRAS
PRINCIPIOS GENERALES
En el sistema de la Red de Laboratorios se suelen enviar muestras de los laboratorios, segn su nivel de complejidad, a otros ms especializados, con el fin de que efecten exmenes que ellos no estn en condiciones de realizar. El objetivo es transportar las muestras y no a los pacientes, para efectuar las pruebas, cuando estas no se efectan en el establecimiento de salud en que se est atendiendo y de esta manera facilitar la atencin de los usuarios de los establecimientos. La remisin de muestras depender de la demanda y de la urgencia de las pruebas.
Los laboratorios intermedios remitirn a los laboratorios locales, previa programacin, los medios o material de transporte necesarios para el envo de muestras. El laboratorio local seguir este mismo criterio con las unidades tomadoras de muestra. Las unidades tomadoras de muestra sin profesional de salud remitirn para su respectiva lectura, lminas de baciloscopas y malaria, por lo que la frecuencia de remisin puede ser semanal. Las unidades tomadoras de muestras que cuenten con profesional de salud pueden recolectar muestras para otros exmenes que se realizan en los laboratorios locales, en tal caso se debe tener das fijos coordinados, con el laboratorio local para la toma y envo de muestras.
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c. Productos biolgicos
Son productos biolgicos terminados para uso humano o veterinario, por ejemplo, vacunas que se envan para control de calidad.
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Una envoltura exterior para proteger el recipiente secundario de las influencias exteriores durante el transporte (por ejemplo: deterioro fsico y agua). De no contar con este envase se puede adaptar envases de plstico de cierre hermtico, cajas de cartn, etc.
ATENCIN!
Nunca enviar muestras en tubos tapados con tapones de algodn, ya que permiten el escape de la muestra.
2. Para su identificacin el recipiente de envo debe estar correctamente rotulado con: El nombre o cdigo que identifique al paciente. Fecha de toma de muestra. Tipo de muestra. Examen solicitado. Procedencia. Nunca rotular la tapa.
3. Debe estar acompaado de las fichas o formularios, de ese modo el laboratorio receptor podr identificar la muestra y decidir como debe manipularla y examinarla.
4.
Se debe establecer por anticipado arreglos con el transportista y el receptor para tener la seguridad que las muestras se reciban y analicen rpidamente, esto puede hacerse por telfono o correo electrnico, radio, etc.
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Procedimientos de Laboratorio
5.
No debe enviarse ninguna sustancia infecciosa sin acuerdo previo entre el que lo enva, el que lo transporta y el que lo recibe.
6.
APERTURA DE PAQUETES CON MUESTRAS Las muestras se deben desembalar en bandejas. Toda muestra que lleve etiqueta "Peligro de infeccin" o que se reciba por flete o correo areo ser abierto en una cmara de seguridad biolgica.
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MATERIALES
Materiales para la extraccin de sangre. Una centrfuga. Un tubo para centrifugacin, de 10 mL, de fondo redondo con tapa rosca o tapn de goma, o un tubo de "vacuntainer" estril, o una jeringa estril y seca. Pipetas de Pasteur estriles. Un frasco estril de 10 mL, con tapa hermtica.
Chupn.
l.
Extraer 10 mL de sangre de una vena del brazo. Una vez localizada la vena, asegrese que haya una buena canalizacin que garantice un fluido rpido y fcil de la sangre; una puncin incorrecta aumenta la posibilidad de hemlisis.
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Procedimientos de Laboratorio
2. Sacar la aguja de la jeringa con ayuda de una pinza y eliminarla en un recipiente con desinfectante. Depositar la sangre en el tubo para la centrifugacin; para evitar la hemlisis presione lentamente el mbolo de modo que la sangre fluya por la pared interna del tubo. Tapar ste inmediatamente.
3. Dejar que la sangre coagule a la temperatura ambiente. Despus de un lapso de 30 minutos a 2 horas, pero no ms, centrifugar la sangre a 2 500 revoluciones por minuto durante 10 minutos.
4. Si no tiene centrfuga, la sangre se puede dejar varias horas en la refrigeradora; el cogulo se separar del suero.
5. Destapar el tubo. Aspirar el suero con una pipeta Pasteur y su respectivo chupn.
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Captulo XI 6. Depositar el suero en el frasco estril de 10 mL. Colocar inmediatamente la tapa rosca en el frasco. Los tubos no deben llenarse totalmente, con el fin de evitar que se destape el tubo.
Red de Laboratorio
7 .
Debe poner posteriormente en prctica los principios generales para envo de muestras.
9. La mayor parte de sueros se pueden conservar en el congelador de la refrigeradora a -2 C o temperaturas inferiores, por lo menos durante 1 mes.
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Procedimientos de Laboratorio
3.
4.
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b. Uso de MIF
l. Mezclar en un tubo o frasco pequeo: 4,4 mL de solucin de MIF con 0,3 mL de solucin yodada de Lugol.
4. Se preservan todas las formas de parsitos, incluso las formas vegetativas de amebas. Las muestras se preservan por tiempo indefinido.
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Procedimientos de Laboratorio
EN UN PORTAOBJETO
l. Para observar amebas y flagelados colocar una pequea porcin de la muestra de heces en un extremo del portaobjetos. Agregar a esta porcin tres gotas de APV.
2. Con un agitador de vidrio extender con cuidado esta mezcla hasta la mitad del portaobjeto.
3. Dejarlo secar durante 12 horas. (preferible a 37 C). 4. Se preservan, as preparados hasta por tres meses. La tincin se aplicar al recibirlos en el laboratorio de referencia.
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A veces es necesario enviar muestras de heces al laboratorio de referencia con el fin de realizar un cultivo para: Detectar vibriones de clera. Identificar otras bacterias (salmonella, shigella, etc.).
Para ambos casos se puede usar la misma forma de transporte, en el medio de Cary y Blair (ver pgina 468).
l.
2. En estas condiciones de transporte, el microorganismo patgeno permanece viable hasta por 4 semanas a temperatura ambiente.
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MATERIALES
Medio de transporte y crecimiento de Transgrow - Tg o de Stuart. Asa bacteriolgica o hisopo con la muestra.
l.
2. Sosteniendo el frasco tan verticalmente como sea posible (para evitar que escape el gas) frotar el hisopo con la muestra en toda la superficie del medio slido, de un extremo del frasco al otro, comenzando por el fondo. Colocar la tapa en el frasco inmediatamente.
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Esta preparacin se conserva hasta 3 das, sin embargo, es conveniente que se enve cuanto antes. Este medio de transporte tambin es adecuado para meningococos.
1.
2. Introducir el hisopo en el frasco que contiene el medio de transporte. Cortar la porcin excedente de la varilla del hisopo con tijeras estriles (flameadas).
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Procedimientos de Laboratorio
2. Colocar la pipeta dentro de un tubo vaco estril protegiendo los extremos de la pipeta con algodn.
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NUMERACIN DE MUESTRAS
A cada muestra, tan pronto como se reciba, se le asignar el nmero que le corresponda al anotarlo en el registro. Ese mismo nmero debe anotarlo inmediatamente en: La ficha de la solicitud. El recipiente de la muestra. Cada tubo de ensayo que se emplee con la muestra. Cada portaobjetos que se utilice con la muestra.
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Procedimientos de Laboratorio
Asimismo, se colocar datos especficos como nombre y apellidos del solicitante, fecha de recepcin de muestra y remisin de resultados, etc. Es preferible contar con registros separados para los diferentes anlisis. Por ejemplo: Registro de hematologa. Registro de orina. Registro de parasitologa. Registro de bacteriologa, etc.
Toda esta informacin es til para el responsable del laboratorio, para su administracin. Es de gran ayuda para el Sistema de Red de Laboratorios ya que notifica el nmero de resultados positivos referente a diversas enfermedades transmisibles.
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CAPTULO
XII
ANEXOS
ANTICOAGULANTES................................................ 481 EDTA...................................................................... 481 Heparina................................................................. 481 Anticoagulante de Wintrobe................................... 482 Citrato de sodio...................................................... 482 Precauciones al usar anticoagulantes.................... 482 REACTIVOS Y SOLUCIONES................................... 483 Agar sangre al 6%.................................................. 483 Agua amortiguada.................................................. 483 APV (alcohol polivinlico) ....................................... 483 Caldo infusin cerebro corazn (BHI).................... 484 Cary y Blair, medio de transporte........................... 484 Drabkin, para dilucin............................................. 485 Fenol acuoso al 5%................................................ 486 Formaldehdo, solucin al 10%.............................. 486 Formol.................................................................... 486 Hidrxido de potasio 10%....................................... 486 Giemsa, colorante.................................................. 486 Glemsa diluido, colorante....................................... 487 Bluffer fosfato......................................................... 487 Leishman, colorante............................................... 487 Lugol (solucin yodo - yodurada)........................... 488 Medio bifslco Usmaru (NNN modificado)................................................... 488 MIF (merthlolate - lodine - formol).......................... 489 NNN, medio de cultivo............................................ 490 Preparacin de los reactivos para la tlncin Gram .......................................................... 490 Preparacin de los reactivos para la tincin Zlehl y Neelsen........................................... 491 Prueba de identificacin de carbohidratos para neisseeria gonorrhoeae.......................................... 492 Prueba de la oxidasa.............................................. 493 Prueba de superoxol.............................................. 493 Reactivos usados para el mtodo de la glucosa oxidasa............................................. 494 Reactivos usados para medir creatinina en plasma o suero.................................................. 494 Reactivos usados para medir fosfatasa alcalina.... 495 Reactivos usados para medir potasio en sangre... 496 Reactivos usados para medir sodio en sangre...... 499 Reactivos usados para medir transaminasas en sangre....................................... 500 Reactivos usados para medir rea en sangre........ 501 Solucin amortiguadora para VDRL....................... 502 Solucin amortiguadora tamponada....................... 503 Solucin de citrato trisdico (38 g/L) (3,8%)........... 503 Solucin de citrato y formaldehdo......................... 503 Solucin de cloruro de sodio (0,85%) (solucin salina isotnica)...................................... 503 Solucin de sulfato de zinc (Faust)........................ 504 Solucin salina al 0,9%.......................................... 504 Solucin salina al 10%........................................... 504 Solucin salina ms antibiticos (antibitico concentrado)........................................ 504 Solucin yodurada de Lugol al 1 %........................ 505 Wright, colorante.................................................... 505 FICHA NICA DE AVISO DE ACCIDENTE DE TRABAJO........................................ 506 RECOMENDACIONES SOBRE LA CONDUCTA ANTE LA EXPOSICIN LABORAL A LA SANGRE U OTRAS SUSTANCIAS O MATERIALES POTENCIALMENTE CONTAMINADOS..................... 509 ALMACENAMIENTO DE SUSTANCIAS QUMICAS................................................................... 511 Principios generales............................................... 511 Incompatibilidades de almacenamiento de sustancias peligrosas............................................. 513 ESQUEMA DE INOCULACIN Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS QUE PROVOCAN DIARREA........... 515 ESQUEMA DE CONIDIOS.......................................... 516 IDENTIFICACIN DEL GNERO SHIGELLA.................................................. 517 IDENTIFICACIN DE Escherichia coli....................... 517 USO DE DISCOS PARA ANTIBIOGRAMAS............... 518 RED DE LABORATORIOS FLUXOGRAMA DE MUESTRAS................................. 519 RED DE LABORATORIOS FLUXOGRAMA DE RESULTADOS............................. 520 REGISTROS DE LOS CONTROLES POR ENVI DE PANELES DE FROTIS................................................ 521 REGISTRO DE EVALUACIN DE LA RELECTURA DOBLE CIEGO............................................................ 522 FORMATO DE RELACIN TOTAL DE LAMINAS ENVIADAS PARA EL CONTROL DE CALIDAD DEL DIAGNSTICO MICROSCOPICO DE MALARIA....... 523 REGISTRO DE LA CALIDAD TECNICA DE GOTA GRUESA Y FROTIS DE LAS LMINAS EVALUADAS.............................................. 524 HOJA DE INFORME MENSUAL DE LABORATORIO.525 BIBLIOGRAFA........................................................... 527 GLOSARIO................................................................. 534 INDICE ALFABTICO................................................ 536 ILUSTRACIONES EN COLOR................................... 543 Glbulos rojos o eritrocitos..................................... 543 Glbulos blancos o leucocitos................................ 544 Plasmodium vivax (frotis)....................................... 545 Plasmodium ovale (frotis)....................................... 545 Plasmodium falciparum (frotis)............................... 546 Plasmodium malariae (frotis).................................. 546 Plasmodium vivax (gota gruesa)............................ 547 Plasmodium falciparum (gota gruesa).................... 547 Preparacin de heces en fresco............................. 548 Entamoeba histolytica............................................ 548 Entamoeba coll....................................................... 549 Endollmax nana...................................................... 549 Giardia lamblia........................................................ 550 Frotis de heces hematoxilina............................... 550 Mycobacterium tuberculosis................................... 551 Neisseria gonorrhoeae........................................... 551 Helmintos................................................................ 552 Huevos de fasciola heptica................................... 552 Huevos de helmintos.............................................. 553 Huevos de scaris lumbricoides............................. 553 Estructuras que se confunden con huevos y/o larvas de parsitos............................................................ 554
Captulo XII
Anexos
EDTA
Son sales sdicas y potsicas del cido etilendiaminotetractico (EDTA). Se utiliza 0,2 mL de esta solucin en frascos de 2 mL o una gota para 5 mL de sangre. Poner a secar en estufa a 37 C hasta que se observe un polvo blanco. Se utiliza para: Recuento de plaquetas en cmara. Efectuar dosaje de hemoglobina, hematocrito. Efectuar recuento de glbulos rojos y blancos. Identificacin de grupos sanguneos.
Sus ventajas son: Impide la formacin de "artefactos" incluso despus de un reposo prolongado. Conserva la sangre hasta 2 - 3 horas a temperatura ambiente y hasta 24 horas si es refrigerada a 4 C.
HEPARINA
Los tubos con heparina se pueden obtener en el comercio. Se utiliza 0,1 - 0,2 mg para 1 mL de sangre. Es el mejor anticoagulante para prevenir la hemlisis y para las pruebas de fragilidad osmtica. No se usa para el recuento de leucocitos, ni para extensin de sangre porque produce un fondo azul en las preparaciones de Wright.
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
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Procedimientos de Laboratorio
ANTICOAGULANTE DE WINTROBE
Se prepara disolviendo 1,2 g de oxalato de amonio y 0,8 g de oxalato de potasio en agua destilada diluyendo con 100 mL. Se utiliza 0,1 mL de esta solucin por 1 mL de sangre. Poner a secar en estufa a 37 C hasta que se observe un polvo blanco. Se usa para el recuento plaquetario porque permite la formacin de agregados plaquetarios.
CITRATO DE SODIO
Se prepara disolviendo 3,8 g de citrato de sodio en agua destilada diluyendo hasta 100 mL. Se usa para el estudio de la velocidad de sedimentacin (1 parte de citrato para 4 partes de sangre), para efectuar pruebas de tiempo de protrombina, de trombina, de tromboplastina determinacin de fibringeno (combina 1 parte de citrato para 9 partes de sangre).
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Captulo XII
Anexos
AGAR SANGRE AL 6%
Medio agar base de sangre (comercial) 40 g Agua destilada 1 000 mL Sangre de cordero desfibrinada 60 mL pH final 6,8+/0,2 1. Mezclar bien el medio base en el agua destilada y calentar agitando frecuentemente hasta que hierva durante un minuto para disolver completamente el medio. 2. Usar la autoclave a 121 C durante 15 minutos. 3. Cuando el medio se encuentre a una temperatura entre 45 - 50 C, aadir la sangre desfibrinada de cordero, agitar para obtener una mezcla uniforme y repartir 20 mL en placas Petri estriles. 4. Controlar su esterilidad durante 24 horas a 37 C.
AGUA AMORTIGUADA
Ortofosfato disdico anhidro (Na2HP04) Ortofosfato monopotsico (KH2P04) 4g 5g
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Procedimientos de Laboratorio
SOLUCIN SCHAUDINN
Solucin Schaudinn 93,5 mL
SOLUCIN 2
Alcohol polivinlico (APV) 5,0 g
Preparar la solucin 1 y agregar caliente la solucin Schaudinn a 75 C. Agregar el APV, mientras se agitan las soluciones en forma constante.
Agua destilada 1000 mL pH final 7,4 +/-0,2 l. Mezclar los ingredientes en agua destilada y calentar agitando frecuentemente hasta que hierva durante un minuto para que se disuelva por completo.
2. Distribuir 8 mL del medio en tubos tapa rosca de 16 x 125. 3. Usar el autoclave a 121 C durante 15 minutos. 4. Controlar la esterilidad del medio durante 24 horas a 37 C.
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Captulo XII l. Colocar todos los ingredientes en un baln con el agua destilada.
Anexos
2. Se calientan en bao mara hasta que la solucin est clara (no se permite que hierva). 3. Enfriar hasta 50 C. 4. Agregar 9 mL de solucin de cloruro de calcio al 1% recin preparado y se ajusta el pH a 8,4 con hidrxido de sodio (NaOH) ION. 5. Colocar cantidades de 5 a 7 mL del medio de transporte preparado en tubos de 13 x 100 mm, estriles, con tapa de rosca (aflojado).
6. Colocar los tubos conteniendo el medio de transporte a 100 C en bao mara, hirviendo durante 15 minutos. Enfriar y apretar las tapas despus de la esterilizacin a vapor.
ATENCIN!
El medio es bastante estable si se almacena en un lugar fresco, oscuro y no se permite que se seque. Este medio se puede utilizar mientras no presente prdida de volumen, contaminacin, ni cambio de color.
FENOL ACUOSO AL 5%
cido fnico (cristales) 1 kg Agua destilada 100 mL
SOLUCIN STOCK
Al cido fnico, agregar 100 mL de agua destilada y calentarlo en bao mara, obteniendo 1 100 mL de fenol acuoso.
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Procedimientos de Laboratorio
SOLUCIN DE TRABAJO
Tomar 55 mL de la solucin stock y completar con 945 mL de agua destilada, obteniendo 1 000 mL de fenol acuoso al 5%. Conservar en un frasco de color mbar.
FORMALDEHDO, SOLUCIN AL 10 %
Solucin comercial de formaldehdo, por lo menos al 37% ("formalina") 100 mL Agua destilada 300 mL El formaldehdo es corrosivo y txico.
FORMOL
El formol comercial contiene aproximadamente 40% de peso de formaldehdo. Se le considera como formalina al 100% Y partiendo de l se hacen las diluciones que se requieran.
2. Filtar en el caso de observar precipitados. 3. Almacenar en un frasco ambar o evitar contacto con luz y a temperatura ambiente.
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Captulo XII
Anexos
GIEMSA, COLORANTE
SOLUCIN STOCK (SOLUCIN MADRE)
Colorante Giemsa en polvo 0,75 g Alcohol met1ico 65, mL Glicerina 35,0 mL l. Disolver el colorante Giemsa en un frasco oscuro con perlas de vidrio, agregar el alcohol metlico y la glicerina.
2. Agitar el frasco hasta lograr una mezcla homognea. 3. Mantener el frasco tapado por 3 das. 4. Usar despus del tercer da, previa filtracin del preparado.
2. Disolver el contenido de cada uno de los tubos en un litro de agua destilada. El pH final es de 7,2.
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Procedimientos de Laboratorio
LEISHMAN, COLORANTE
Colorante de Leishman Metanol c.s.p. 1,5 g
1000 mL
Enjuagar con metanol un frasco limpio. Colocar en su interior perlas de vidrio limpias y secas. Aadir el colorante y el metanol, hasta disolver bien. As el colorante estar listo para su uso. Es importante impedir la humedad durante su elaboracin y su posterior conservacin.
2. Dejar enfriar a temperatura ambiente. 3. 4. Sacar 15 mL de agar y agregar 15 mL de sangre desfibrinada, cuando el medio est a 56 C. Agregar 1 mL de antibitico concentrado.
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Captulo XII
Anexos
5. Homogenizar y repartir aproximadamente 1 mL del medio en tubos de 13 x 100. 6. 7 . Colocar los tubos en plano inclinado y dejar enfriar. Controlar a 37 C por 24 horas.
8. Guardar los tubos a 4 C hasta el momento de su uso. Se recomienda usar tubos conservados en refrigeracin hasta por 15 das. Pasados los 15 das preparar nuevos medios de cultivo.
2. Preparar solucin yodurada de lugol, 50 g/l (5%) Yodo 5 g Yoduro de potasio (KL) 10 g Agua destilada c.s.p. 100 mL Preparar de la misma manera que la solucin yodurada de Lugol (N. 2). Guardar en un frasco oscuro por un mes.
3. Cuando se vaya a usar, mezclar: Solucin madre de tiomersal Solucin yodurada de lugol (5%) 50 g/L 9,4 0,6 mL mL
XII
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489
Procedimientos de Laboratorio
Solucin B Oxalato de amonio 0,8 g Agua destilada 80 mL l. Mezclar las dos soluciones A y B. Guardar la mezcla por 24 horas antes de usar.
2. Filtrar en un frasco para tincin con un filtro de papel. Esta solucin puede durar 2 o 3 aos.
2. Aadir el agua destilada poco a poco, algunos mililitros cada vez, y mover hasta que el yodo y el yoduro se disuelvan.
490
MINISTERIO DE S LUD
Captulo XII
Anexos
3. Verter esta solucin en un frasco de vidrio oscuro y mezclado con el resto de agua destilada.
SOLUCIN DE SAFRANINA
Solucin madre Safranina O (certificada) Alcohol de 95 c.s.p.
2,5 100
g mL
FUCSINA FENICADA
Fucsina bsica 3 g Alcohol de 95 100 mL Fenol acuoso 55 mL Agua destilada c.s.p. 1000 mL l. Disolver por agitacin la fucsina bsica en alcohol de 95. Agregar el fenol acuoso, agitar y agregar agua destilada hasta completar 1 litro.
XII
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491
Procedimientos de Laboratorio
AZUL DE METILENO
l. Azul de metileno Alcohol de 95 Agua destilada c.s.p. 1 g 100 mL 1000 mL
Disolver por agitacin el azul de metileno con el alcohol de 95 . Agregar agua destilada hasta completar 1 litro.
SOLUCIN DECOLORANTE
cido clorhdrico Alcohol de 95 30 mL 970 mL
Con la pipeta dejar escurrir el cido clorhdrico por las paredes del matraz, que contiene el alcohol, agitar suavemente hasta completar la mezcla. Los reactivos deben conservarse en un frasco de color mbar. Se recomienda preparar los colorantes para un consumo no mayor de un mes. Todos los reactivos deben filtrarse cada vez que sean transferidos a los pequeos frascos cuentagotas que se emplean para la tincin. Esto es especialmente necesario para la fucsina fenicada.
492
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Captulo XII
Anexos
Carbohidratos (0,5 o 1 %): glucosa, lactosa, maltosa, sacarosa y fructosa. Esterilizados por filtracin.
1.
2. Aadir los carbohidratos al medio base. 3. Repartir en tubos pequeos. 4. Inocular las colonias del agar chocolate a los tubos con carbohidratos, por puntura profunda. 5. 6. Incubar 18 - 24 horas a 37 C en aerobiosis (sin CO2). Realizar la lectura mediante el cambio de color del indicador rojo de fenol. Se considera positiva la produccin de cido cuando el indicador rojo de fenol ha cambiado de rojo a amarillo.
PRUEBA DE LA OXIDASA
1. Preparar el reactivo N, N, N, N, tetrametil-p-fenilendiamine al 1%, en un tubo o en un frasco color mbar.
2. Humedecer un pedazo de papel filtro con el reactivo preparado. 3. Tomar una porcin de la colonia sospechosa con un palito de madera o un alambre de platino. 4. Colocarlo haciendo una estra sobre el papel de filtro, esperar la reaccin 30 segundos. Si la reaccin es positiva el papel tomar un color azul violceo, y si es negativa no habr cambio de color en el papel.
PRUEBA DE SUPEROXOL
PRUEBA DE LA CATALASA USANDO PERXIDO DE HIDRGENO AL 30%
1. Depositar una gota del perxido de hidrgeno en una lmina portaobjeto.
XII
493
Procedimientos de Laboratorio
REACTIVO ENZIMA-COLOR
Glucosa oxidasa 125 mg Peroxidasa 5 mg O-dianisidina en alcohol de 95 (al 1 % ) 0,5 mL Preparado para 100 mL de solucin de fosfato. Una vez preparado debe conservarse en el refrigerador.
Mezclar la solucin de hidrxido de sodio con la solucin saturada de cido pcrico. El color del picrato alcalino no debe ser ms de dos veces intenso que el de la solucin de cido pcrico.
494
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Captulo XII
Anexos
SUSTRATO 0,012 M
l. Disolver 400 mg de p-nitrofenilfosfato disdico tetrahidratado en agua destilada y completar hasta 100 mL. Es estable 8 semanas en el congelador.
XII
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Procedimientos de Laboratorio
2. Diluir en matraz de 100 mL hasta 90 mL con agua destilada y aadir gota a gota HCI 1 N hasta que la solucin adquiera un tinte amarillo plido. 3. Completar a 100 mL con agua destilada. Es estable un ao en el refrigerador.
496
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Captulo XII l.
Anexos
Para la solucin A, disolver el nitrato de cobalto en agua destilada, luego se agrega el cido actico glacial. 2. Para la solucin B, disolver en otro matraz el nitrato de sodio en agua destilada. 3. Agregar 210 mL de la solucin B a la totalidad de la solucin A. Agitar bajo campana hasta que se ha eliminado el xido nitroso y filtrar. Este reactivo se conserva en el refrigerador y dura aproximadamente un mes.
Agregar al acetato de sodio trihidratado al agua destilada calentada previamente a 45 C. Agitar bien y colocar la mezcla en la estufa a 37 C durante la noche. Enfriar la mezcla a temperatura ambiente dejando que sedimente el precipitado. Diluir con otros 100 mL de agua destilada.
K2S04 70 mg Agua destilada 100 mL Solucin semisaturada de acetato de sodio Reactivo de cobaltonitrito de sodio 25 12,5 mL mL
l. Disolver K2S04 en el agua destilada. Agregar lentamente la solucin semisaturada de acetato de sodio y el reactivo de cobaltonitrito de sodio. Mezclar bien. 2. Dejar reposar por 30 minutos. 3. Filtrar lavando el precipitado dos veces con alcohol etlico de 70 y una vez ms con alcohol de 95, saturando luego con alcohol etlico de 10 con el precipitado, y dejar el resto de este en el fondo del frasco sin descartarlo. Para su uso tomar una pequea porcin del lquido sobrenadante de ese frasco y filtrar antes de utilizado.
XII
497
Procedimientos de Laboratorio
REACTIVO DE FOLIN-CIOCALTEU
Tungsteno de sodio 100 g Molibdato de sodio 25 g cido fosfrico al 85% cido clorhdrico concentrado 50 100 mL mL
Sulfato de litio 150 g Bromo 2 3 gotas Agua destilada 750 mL l. Usar un erlenmeyer de 2 L.
2. Colocar el tungsteno de sodio y el molibdato de sodio con 700 mL de agua destilada. Agitar y, una vez disuelto el contenido, agregar el cido fosfrico al 85% y el cido clorhdrico concentrado. Hervir esta mezcla durante 10 minutos. 3. Aadir el sulfato de litio, 50 mL de agua destilada y 2 o 3 gotas de bromo; se hierve la mezcla durante 15 minutos para separar el exceso de bromo, se enfra, se diluye hasta 1 L. 4. Filtrar. El reactivo debe tener color amarillo, sin tinte verdoso. Se conservar en el refrigerador. Si durante su conservacin adquiere un color verdoso, hay que tratarlo nuevamente con bromo.
498
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Captulo XII
Anexos
3. Mezclar ambas soluciones mientras hiervan y calentar nuevamente hasta el punto de ebullicin. Dejar en reposo durante una noche y luego filtrarla. 4. Mezclar la solucin filtrada con igual volumen de alcohol de 95, dejarlo durante 2 das en el refrigerador, al cabo de los cuales se filtra. El reactivo as preparado es estable a temperatura ambiente.
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499
Procedimientos de Laboratorio
TGO
(TRANSAMINASA
GLUTMICO
Acido d-l-asprtico 2,66 g Acido alfa-cetoglutrico 30 mg NaOH 1N 20,5 mL Solucin buffer de fosfatos de pH 7,4 c.s.p l. 100 mL
2. Transferir la solucin a un matraz de 100 mL lavando el erlenmeyer y completando a volumen con solucin buffer de fosfatos de pH 7,4. 3. Aadir una gota de cloroformo como conservador y guardar a 4 C.
500
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Captulo XII
Anexos
2. Transferir la solucin a un matraz de 100 mL lavando el erlenmeyer y completando a volumen con solucin buffer de fosfatos de pH 7,4. 3. Aadir una gota de cloroformo como conservador y guardar a 4 C.
REACTIVO CROMGENO
l. Disolver 20 mg de 2-4 dinitrofenilhidrazina en HC1 1N y completar a 100 mL.
XII
501
Procedimientos de Laboratorio
2. Completar a 500 mL con agua destilada. 3. Guardar en el refrigerador. Es estable durante un ao.
2. Agregar la solucin de formaldehdo. 3. Conservar en un frasco con tapa de rosca o tapn de vidrio.
502
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Captulo XII
Anexos
XII
503
Procedimientos de Laboratorio
Penicilina sdica 0,5 g Agua destilada. 10 mL l. Mezclar y agitar hasta lograr una total dilucin.
2. Filtrar con membrana 0,22 m. 3. Usar 1 mL de solucin para 100 mL de solucin salina.
504
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Captulo XII
Anexos
2. Agregar el yodo y mezclar hasta disolverlo. Aadir el resto de agua destilada (70 mL) y mezclar bien. 3. Conservar la preparacin en un frasco oscuro.
WRIGHT, COLORANTE
Colorante de Wright 0,3 g Glicerol 3,0 mL Metanol 97,0 mL Tener igual cuidado que con el colorante Leishman.
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505
Procedimientos de Laboratorio
TESTIGO DEL ACCIDENTE FORMA DEL ACCIDENTE (TABLA 3=) Apellidos y nombres de la personaque condujo al accidentado 5. CERTIFICACIN MDICA FECHA DE INGRESO (DD/MM/AA): PARTE DEL CUERPO AFECTADO: (TABLA 5) a) b) c) APELLIDOS Y NOMBRES DEL MDICO TRATANTE a) b) c) N. DE CMP:
Firma
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Captulo XII
Anexos
TABLA 1(#) TIPO DE TRABAJADOR 01 02 03 04 05 06 07 00 Empleado Funcionario Jefe de Planta Capataz Tcnico Operario Agricultor Otros
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 00
Contacto con materias calientes o incandescentes Contacto con fro Contacto con calor Explosin o implosin Incendio Atropellamiento por animales Mordedura de animales Choque de vehculos Atropellamiento por vehculos Falla en mecanismos para trabajos hiperbricos Agresin con armas Otros
009 010 012 015 016 020 021 022 023 024 025 029 030
Cara (ubicacin no clasificada en otro Nariz y senos paranasales Aparato auditivo Cabeza, ubicaciones mltiples Cuello Regin cervical Regin dorsal Regin lumbosacra (columna vertebral y Muscular adyacentes) Trax (costillas, esternn) Abdomen (pared abdominal) Pelvis Tronco, ubicaciones mltiples Hombro (inclusin de clavculas, omoplato y Axila)
TABLA 2(+) ACTIVIDAD ECONMICA DE LA EMPRESA ADAPTACIN DEL CIIU, NORMAS EN AGRICULTURA (CLASIFICACIN INTERNACIONAL INDUSTRIAL UNIFORME Y NORMAS EN AGRICULTURA) 122 130 210 220 230 290 314 321 322 331 351 352 353 354 356 362 369 371 372 381 382 410 500 713 920 Extraccin de madera Pesca Explotacin de minas de carbn Produccin de petrleo crudo y gas mineral Extraccin de minerales metlicos Extraccin de otros minerales Industrias de tabaco Fabricacin de textiles Industrias de cuero y productos de cuero y sucedneos del cuero Industrias de la madera y productos de madera y corcho Fabricacin de sustancias qumicas industriales Fabricacin de otros productos qumicos Refineras de petrleo Fabricacin de productos derivados del petrleo y del carbn Fabricacin de productos plsticos Fabricacin de vidrio y productos de vidrio Fabricacin de otros productos minerales no metlicos Industria bsica de hierro y acero Industrias bsicas de metales no ferrosos Fabricacin de productos metlicos Construccin de maquinarias Electricidad, gas y vapor Construccin Transporte areo Servicios de saneamiento y similares
TABLA 4() AGENTE CAUSANTE PARTES DE LA EDIFICACIN 031 032 033 034 035 01 02 03 04 05 06 07 08 Piso Paredes Techo Escalera Rampas Pasarelas Aberturas, puertas, portones. Persianas Ventanas Instalaciones Complementarias 10 11 12 13 14 15 16 17 18 30 31 32 33 34 76 40 42 43 44 46 47 48 49 Tubos de ventilacin Lneas de gas Lneas de aire Lneas o caeras de agua Cableado de electricidad Lneas o caeras de materias primas o productos Lneas o caeras de desages Rejillas Estanteras Electricidad Vehculos o medios de transporte en general Maquinas y equipos en general Herramientas (porttiles, manuales, mecnicos, elctricas, neumticas, etc. Aparatos para izar o medios de elevacin Onda expansiva Matrices Bancos de Trabajo Recipientes Andamios Escritorios Asientos en general Muebles en general Productos elaborados 036 039 040 041 042 043 044 045 046 049 050 070 080 100 133 134 135 140 150 160 180 181 Brazo Codo Antebrazo Mueca Mano (con excepcin de los dedos solos) Dedos de las manos Miembro superior, ubicaciones mltiples Cadera Muslo Rodilla Pierna Tobillo Pie (con excepcin de los dedos) Dedos de los pies Miembro inferior, ubicaciones mltiples Aparato cardiovascular en general Aparato respiratorio en general Aparato digestivo en general Sistema nervioso en general Mamas Aparato genital en general Aparato urinario en general Sistema hematopoytico en general Sistema endocrino en general Pie (solo afecciones drmicas) Aparato psquico en general Ubicaciones mltiples compromisos de dos o mas zonas afectadas especificadas en la tabla rgano, aparato o sistema afectado por sustancia qumicas Otros
182 000
XII
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507
Procedimientos de Laboratorio
TABLA 1(#) 933 000 Servicios mdicos y odontolgicos, otros servicios de sanidad veterinaria Otras actividades no especificadas Por ejemplo Agrcolas 70 77 79 80 81 00
Otros factores externos e internos al ambiente de trabajo Animales Factores climticos Arma blanca Arma de fuego Sustancias qumicas plaguicidas Otros
TABLA 6() NATURALEZA DE LA LESIN 01 02 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 00 Escoriaciones Heridas punzantes Heridas contusas (por golpes o de bordes Irregulares Herida de bala Perdida de tejidos Contusiones Traumatismos internos Torceduras y esguinces Luxaciones Fracturas Amputaciones Gangrenas Quemaduras Cuerpo extrao en ojos Enucreacion (perdida ocular) Intoxicaciones por otras sustancias qumicas Intoxicaciones por plaguicidas Asfixia Efectos de electricidad Efectos de las radiaciones Disfunciones orgnicas Otros
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Cada de personas a nivel Cada de personas de altura Cada de persona al agua Cada de objetos Derrumbes o desplomes de instalaciones Pisadas sobre objetos Choque 007 Choque contra objeto Golpes 008 Golpes por objetos (excepto cadas) Aprisionamiento o atrapamiento Esfuerzos fsicos o falsos movimientos Exposicin al frio Exposicin al calor Exposicin a radiaciones ionizantes Exposicin a radiaciones no ionizantes Exposicin a productos qumicos Contacto con electricidad Contacto con productos qumicos Contacto con plaguicidas Contacto con fuego
Regin craneana (crneo, cuero cabelludo Ojos (con inclusin de los prpados, la rbita y el nervio ptico Boca (con inclusin de labios, dientes y lengua)
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Captulo XII
Anexos
RECOMENDACIONES SOBRE LA CONDUCTA ANTE LA EXPOSICIN LABORAL A LA SANGRE U OTRAS SUSTANCIAS O MATERIALES POTENCIALMENTE CONTAMINADOS
Fuente: Revista Panamericana de Salud Publica / Pan Am J Public Health 2002. 11(2): 132-141 1. Cuidado inmediato de la zona expuesta - - Lavar las heridas con agua y jabn. Lavar las membranas mucosas con agua.
2. Determinar el riesgo asociado a la exposicin, en funcin del: - Tipo de lquido corporal implicado (sangre, lquidos corporales visiblemente sanguinolentos, otros lquidos corporales o tejidos potencialmente infecciosos, concentrados de virus). - Tipo de exposicin (lesin percutnea, exposicin de membrana mucosa o piel no intacta, mordeduras causantes de exposicin a sangre).
3. Investigar la fuente de la exposicin - - - - Evaluar el riesgo de infeccin con base en la informacin disponible. Investigar la presencia de HBsAg y anticuerpos anti-VHC y anti-VIH. Evaluar el riesgo de exposicin a las infecciones por VHB, VHC y VIH en fuentes desconocidas. No analizar la presencia de virus en agujas y jeringuillas desechadas.
XII
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Procedimientos de Laboratorio
4.
Investigar al individuo expuesto - Evaluar su inmunidad frente a la hepatitis B (antecedentes de vacunacin y respuesta a la misma).
5.
Administrar profilaxis tras las exposiciones que suponen riesgo de transmisin de VHB, VHC y VIH - - - - Iniciar la profilaxis cuanto antes (a ser posible, en un plazo de horas). Realizar prueba de embarazo en toda mujer en edad frtil que no se sepa embarazada. Buscar asesoramiento de un experto si se sospecha resistencia a los antivricos. Administrar la profilaxis durante 4 semanas, siempre que sea tolerada.
6.
Realizar pruebas de seguimiento y proporcionar asesoramiento - Aconsejar la bsqueda de atencin mdica ante cualquier enfermedad aguda durante el seguimiento.
Exposiciones al VHB
Determinar los anticuerpos anti-HBs* 1 a 2 meses despus de la ltima dosis de la vacuna. La respuesta de anticuerpos no es valorable si se administraron HBIg** en los 3 a 4 meses anteriores. En el caso de que la fuente de exposicin sea positiva y el trabajador expuesto sea VHB negativo, se debera aplicar gamaglobulina hiperinmune a las 24 48 horas post exposicin. Aplicar primera dosis de la vacuna contra V HB; la segunda y tercera dosis sern aplicadas a los 30 y 90 das despus de la primera dosis. Si la fuente de exposicin es negativa y el trabajador expuesto no esta vacunado, entonces se debe de aplicar esquema completo de vacunacin. Si no se logra identificar la fuente de exposicin y el trabajador expuesto tiene antecedentes de hepatitis o antecedentes de vacunacin, entonces se debe de aplicar esquema completo de vacunacin. Si el trabajador expuesto tiene anticore o antgeno de superficie positivo, no aplicar vacuna.
510
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Captulo XII
Anexos
Exposiciones al VHC
Determinar los anticuerpos anti-VHC y la ALT*** tras la exposicin y 4 a 6 meses ms tarde. Determinar el RNA del VHC a las 4 a 6 semanas si se desea un diagnstico ms temprano de la infeccin. Confirmar con otras pruebas los inmunoensayos enzimticos repetidamente positivos para anticuerpos anti-VHC.
Exposiciones al VIH
Determinar anticuerpos anti-VIH al menos durante 6 meses tras la exposicin (p.e.: 6 semanas y 3 y 6 meses). Determinar anticuerpos anti-VIH ante la aparicin de enfermedad compatible con sndrome retrovrico agudo. Aconsejar precauciones para evitar la transmisin secundaria durante el perodo de seguimiento. Examinar a los receptores de profilaxis pasadas 72 h y vigilar la toxicidad de los frmacos al menos 2 semanas
*Anti-HBs: anticuerpos frente al antgeno de superficie de la hepatitis B. **HBIg: inmunoglobulinas anti-hepatitis B. ***ALT: alanina aminotransferasa.
XII
511
Procedimientos de Laboratorio
Se debe tener como norma general, no guardar grandes cantidades de sustancias qumicas de alto riesgo en los lugares de trabajo. Todo producto qumico almacenado o en uso debe contar con tapas de cierre hermtico y con rtulos que permitan identificar fcilmente su riesgo. El almacenaje de diferentes productos qumicos, debe realizarse segn sus caractersticas de peligrosidad. Nunca organizar los productos quimicos por orden alfabetico o por nmero de artculo ascendente. La colocacin en las estanteras, se efecta de modo que cada peligrosidad de las consideradas compatibles, ocupe una estantera en toda su carga vertical. Se pretende con ello que la posible cada y rotura de un envase, solo afecte a otros productos de igual peligrosidad (vase Incompatibilidades de almacenamiento de sustancias peligrosas). No se deben almacenar por tiempo indefinido los productos qumicos ya que pueden sufrir cambios por influencias externas como luz, aire y calor, generando peligros que no se esperaban de estos materiales en su estado original. En caso de sustancias inflamables estas deben ser refrigeradas en armarios frigorficos especiales, no siendo recomendables los de uso domstico, ejemplos: formacin de perxido en teres y cetonas, inflamacin espontnea de metales en polvo (cadmio, hierro, nquel, etc.), rotura de envases por incremento de la presin interna al formarse CO y CO2 (cido frmico, urea, agua oxigenada, cido oxlico, etc.), formacin de gases reactivos y explosin por polimerizacin espontnea o por golpe. La manipulacin de sustancias que desprenden vapores, gases irritantes o mal olor, o la incineracin y calcinacin de combustibles y/o inflamables, deben realizarse solo bajo una campana de seguridad qumica. Se debe mantener neutralizantes disponibles para cualquier emergencia como: bicarbonato de sodio para los cidos, cido actico diluido para los lcalis. Toda sustancia qumicas debe ser catalogada y cada laboratorio debe mantener un inventario visible actualizado de todas las sustancias qumicas que almacena y /o utiliza.
Los productos cancergenos, productos inflamables, as como reactivos controlados, requieren un almacenamiento especial en armarios especficos, convenientemente rotulados y bajo llave. Las duchas de urgencia y las duchas de ojos han de ser examinadas mensualmente con relacin a su funcionamiento por el personal de laboratorio.
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Captulo XII
Anexos
+: se pueden almacenar conjuntamente; O: solamente pueden almacenarse juntas, si se adoptan ciertas medidas especficas de prevencin; - : no deben almacenarse juntas.
XII
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513
Procedimientos de Laboratorio
AGENTES INCOMPATIBLES
- Oxidantes con: inflamables, carburos, nitruros, hidruros, sulfuros, alquilmetales. - Reductores con: nitratos, cloratos, bromatos, xidos, perxidos, flor, cidos fuertes con bases fuertes, cido sulfrico con: celulosa, cido perclrico, permanganato potsico, cloratos.
AGENTES INESTABLES
- Productos cuyo almacenamiento prolongado entraa la posibilidad de descomposicin: amiduros alcalinos, ciertas sales de diazonio. Sustancias fcilmente peroxidables: compuestos allicos, compuestos vinlicos, estireno. Compuestos que reaccionan violentamente en contacto con el aire: fosfuros, hidruros, monmeros que polimerizan rpidamente: acetato de vinilo, estireno, acrilonitrilo.
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Mac Conkey
Incubar 24 horas a 37 C
Incubar 24 horas a 37 C
Captulo XII
Anexos
515
XII
Procedimientos de Laboratorio
Figura 1.3: ESQUEMA DE CONIDIOS Diferentes tipos de macroconidios (a-f), microconidios (g-j), clamidosporas (k-m) e hifas (n-p) (consultar clave taxonmicas).
516
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Captulo XII
Anexos
PRUEBAS BIOQUMICAS Indol Hidrgeno sulfurado rea Citrato Movilidad Rojo de metilo Voges Proskauer Fermentacin de glucosa(cido) Fermentacin de glucosa(lactosa) Lactosa
RESULTADO Variable Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Variable
XII
517
Procedimientos de Laboratorio
518
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Captulo XII
Anexos
519
XII
Procedimientos de Laboratorio
520
Laboratorio de Referencia Regional Piura Laboratorio de Referencia Regional Arequipa Laboratorio de Referencia Regional Tacna Laboratorio de Referencia Regional Cusco Laboratorio de Referencia Regional San Martn Laboratorio de Referencia Regional Loreto
Laboratorio Intermedio
Laboratorio Intermedio
Laboratorio Intermedio
Laboratorio Local
Laboratorio Local
Laboratorio Local
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Unidad Recolectora
Unidad Recolectora
Unidad Recolectora
Unidad Recolectora
PROCEDIMIENTOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD EXTERNO DE BACILOSCOPA PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LA TUBERCULOSIS
Lote de frotis N:
FROTIS N 1 2 3 4 5 6 7 8 9
LOTE N
RESULTADO ESPERADO
LOCALES, 10
OBSERVACIONES
Captulo XII
9 Anexos
10
521
XII
PARA EL DIAGNSTICO
Procedimientos de Laboratorio
522
CALIDAD DEL EXTENDIDO Adecuado No H Fino Grueso Deficiente CALIDAD DE COLORACION Tamao Bueno Deficente
ESTABLECIMIENTO DE SALUD: DISA/DIRESA: Referencia: Fecha de recepcin: Perodo de la colecta: 1er Evaluador: 2do evaluador:
LABORATORIO LOCAL
N Lmina
Resultado
RESULTADOS DE EVALUADOR
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MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO NACIONAL DE SALUD PUBLICA LABORATORIO REFERENCIAL NACIONAL DE MALARIA
FORMATO DE RELACIN TOTAL DE LAMINAS ENVIADAS PARA EL CONTROL DE CALIDAD DEL DIAGNSTICO MICROSCOPICO DE MALARIA
Mes evaluado Trimestre evaluado CDIGO DE LMINA RESULTADOS DE LABORATORIO POSITIVO NEGTATIVO
Laboratorio:
Microscopista:
Fecha:
N DE ORDEN
CDIGO DE LABORATORIO
Captulo XII
Anexos
523
XII
Procedimientos de Laboratorio
524
DE LA GOTA GRUESA DEL FROTIS RESULTADOS Tam Ubic. Exten. N P P MUESTRA Tam Ubic. Calid. Desh. Ton. PP COLORACION LABORATORIO EVALUADO LABORATORIO EVALUADOR (REVISOR) RESULTADO CONCORDANCIA N DISCORDANCIA Falso Negativo Falso Positivo Especie
MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO NACIONAL DE SALUD PUBLICA LABORATORIO REFERENCIAL NACIONAL DE MALARIA
Laboratorio Evaluador: Microscopista: Doc. Referencia: Trimestre/Mes: Fecha de Ingreso: Fecha de Emision:
FECHA DE EVALUACIN
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Tam: Tamao Ton: Calidad Exten: Extendido Ubic: Ubicacin Desh: Deshemoglobinizacion Concord: Concordancia Calid. Calidad PP: Precipitado Doc. Referencia: Documento de referencia
Establecimiento:
Pruebas de Laboratorio
Hemograma Completo
Hemoglobina
Hematocrito
Tiempo de coagulacin
Tiempo de sangra
Grupos sanguneos y Rh
Compatibilidad sangunea
Diagnstico de embarazo
VDR / RPR
10
11
12
Orina completa
13
Sedimento urinario
14
15
Gram de secreciones
16
Bk en esputo
17
Bk en orina
18
19
20
Graham
21
Gota Gruesa
22
Benedict en heces
23
24
25
Test de Hepatitis B
26
Identificacin de Leishmania
27
Hemocultivo
28
Urocultivo
29
Cultivo de Secreciones
30
Cultivo de Bk
31
Protenas sricas
32
Bilirrubinas
33
Fosfatasa Alcalina
34
Glicemia
Captulo XII
35
Urea srica
36
Creatinina srica
37
Transaminasas sricas
38
Electrlitos sricos
39
Protenas en orina
40
Papanicolau
Anexos
Total Exonerado
525
Total Ingreso
XII
Establecimiento:
Pruebas de Laboratorio
Hemograma Completo
Procedimientos de Laboratorio
526
Costo Total
Hemoglobina
Hematocrito
Tiempo de coagulacin
Tiempo de sangra
Grupos sanguneos y Rh
Compatibilidad sangunea
Diagnstico de embarazo
VDR / RPR
10
11
12
Orina completa
13
Sedimento urinario
14
15
Gram de secreciones
16
Bk en esputo
17
Bk en orina
18
19
20
Graham
21
Gota Gruesa
22
Benedict en heces
23
24
25
Test de Hepatitis B
26
Identificacin de Leishmania
27
Hemocultivo
28
Urocultivo
29
Cultivo de Secreciones
30
Cultivo de Bk
31
Protenas sricas
32
Bilirrubinas
33
Fosfatasa Alcalina
34
Glicemia
35
Urea srica
36
Creatinina srica
37
Transaminasas sricas
38
Electrlitos sricos
39
Protenas en orina
40
Papanicolau
MINISTERIO DE S LUD
Total Exonerado
Total Ingreso
Bibliografa
BIBLIOGRAFA
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Procedimientos de Laboratorio
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MINISTERIO DE S LUD
Bibliografa
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Procedimientos de Laboratorio
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Procedimientos de Laboratorio
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Procedimientos de Laboratorio
GLOSARIO
BEAKER
Son recipientes cilndricos y cortos, con una depresin en el margen de la boca. Se usan para facilitar la mezcla de una solucin dada. Son de variadas medidas.
ebonita aislante del calor. En el extremo proximal presenta una tuerca para insertar el alambre de platino o asa de siembra. Se utilizan para tomar muestras y hacer siembras de microorganismos.
C.S.P
MATRACES Y ERLENMEYER
EMBUDOS
Pueden ser de vidrio, porcelana o plstico. Se usan para transvasar lquidos en frascos de boca angosta. Existen de diferentes tamaos.
Son recipientes volumtricos de gran utilidad para la preparacin de soluciones, colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc. Los matraces se diferencian de los erlenmeyer, por tener base esfrica con fondo plano. En ambos el cuello termina en un reborde. Son de diferentes medidas.
FIOLAS
MECHEROS DE BUNSEN
Recipientes para cantidades de medidas exactas. Se emplean en la preparacin de reactivos y soluciones de concentraciones conocidas.
Son de metal con una tuerca movediza en su extremo, para medir la intensidad de la llama.
PIPETAS
PIPETAS PASTEUR
MANGOS DE KOLLE
Se emplean para la toma de pequeos inculos de siembra. Estn confeccionados de varillas de vidrio, de dimetro de 0,5 - 0,8 mm. La calidad de
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Glosario vidrio debe facilitar el reblandecimiento a la accin directa de la llama del mechero, para conseguir por estiramiento la capilaridad deseada, es decir, es una pipeta con porcin capilar.
PLACAS PETRI
Estn compuestas de dos piezas redondas de vidrio, de los cuales la ms grande hace de tapa. Las ms usadas son las de 150 x 100 mm de dimetro. Se emplean para aislamiento y cultivo de microorganismos.
PROBETAS
Son recipientes cilndricos con base ancha, de paredes gruesas graduadas. Se usan para medir lquidos en la preparacin de cualquier solucin. Tienen capacidades de 100 a 1 000 mL
TRPODE
Son de metal, de preferencia de fierro. Son muy buenos soportes de recipientes sometidos al calentamiento. Hay de varias alturas y dimetros.
TUBOS DE CENTRFUGA
Son de vidrio de paredes gruesas, graduados de medidas variables, pueden ser cnicos o cilndricos.
TUBOS DE PRUEBA
Deben ser de vidrio, con o sin reborde. Las medidas son variables y se dan en mm, considerndose el largo del tubo por el dimetro de la boca. Se utilizan para cultivos, soluciones, etc.
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Procedimientos de Laboratorio
NDICE
A
Alcohol etlico, 33 Agua oxigenada, 34 Aglutinoscopio, 67 Antibiograma principios generales, 354 mtodo, 354 lectura, 354 Anticoagulantes precauciones, uso, 466 Agar sangre al 6%, 467 Agua amortiguada, 467 Alcohol polivinlico (APV), 467 Autoclave componentes, 55 procedimientos, 57 Cloramina, 32 Centrfugas componentes, 62 manual, 63 elctrica, 63 Creatinina en plasma o en suero, 374, 477 Control de calidad baciloscopa, 440 malaria, 443 Citrato de sodio, 466 trisdico, 486 formaldehdo, 486 Cary y Blair, 468 Caldo infusin cerebro corazn (BHI), 468 preparacin, 178 coloracin, 182 lectura, 186 informe, 186 Brucelosis prueba de aglutinacin rpida en placa, 416 prueba de Rosa de Bengala, 419 prueba en tubo, 420 control de calidad, 423
B
Bioseguridad concepto, 15 niveles, 17 reglas importantes, 18 material recomendado, 24 Balanza de platillos, 60 analtica, 60 Baciloscopa
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ndice
D
Desinfeccin mtodos, 26 desinfectantes qumicos, 31 Desechos incineracin, 38 entierro, 39 Drabkin, para dilucin, 469
microorganismo, 324 Plasmodium, 284, 285 preparacin, 318 Fosfatasa alcalina, 478
G
Glutaral, 33 Gram preparacin, 473 tincin, 321,473 Giemsa colorante, 470 diluido, colorante, 471 Gota gruesa obtencin, 87, 286 (ver Sangre) coloracin de 1 a 10 lminas, 279 coloracin de ms de 10 lminas, 280 coloracin en bloque, 280 examen microscpico, 287, 286 densidad parasitaria, sistema de cruces, 289 por microlitro de sangre, 290
E
Esterilizacin mtodos, 27 Espectofotmetro, 66 Estufa, 29 Esputo recipientes, 40, 175 obtencin, 175,318 Embarazo mtodo del tubo de ensayo, 235 mtodo del portaobjetos, 235 EDTA, 465
F
Formaldehdo solucin al 10%, 470 Fenol acuoso al 5%, 469 Formol, 33,470 Frotis
Gonorrea examen directo, 356 cultivo, 358 identificacin, 361 prueba de carbohidratos, 475 prueba de la oxidasa, 476 prueba de superoxol, 476
537
Procedimientos de Laboratorio
L
obtencin de muestra, 293 biopsia, 296 aspirado, puncin-aspiracin, 302 linfa, 293 examen directo, 299, 298 cultivo, 301, 299 lectura e interpretacin, 303 intradermoreaccin, Leishmanina, 303 Leishman colorante, 471 Lugol solucin yodo-yodurada, 471
H
Heces recipientes, 40, 241 obtencin, 239 examen directo, 265 examen de tincin con yodo, 266 examen con solucin salina, 266 examen de huevos de oxiuros, 269 mtodo de la cinta adhesiva, 269 mtodo de concentracin, 270 mtodo de flotacin de Faust, 270 mtodo de sedimentacin de Ritchie, 272 examen bacteriolgico, 243 procedimiento de envo, 452 sangre oculta, 306 Hemocultivo principios generales, 350 lectura, 352 microorganismo s aislados, 353 Hemoglobinmetro de Sahli, 68 Heparina, 465 Hipoc1orito sdico, 32
M
Material de vidrio nuevo, 70 sucio, 69 Microorganismos por grupos de riesgo, 16 Microscopio componentes, 47 conservacin, 51 Mycobacterium tuberculosis cultivo, 188 Lowenstein-Jensen, 191 Ogawa acidificado, 194 prueba de sensibilidad, 201 envo del cultivo, 456 Medios de cultivo principios generales, 329 medios nutritivos simples, 332 medios nutritivos enriquecidos, 334
I
Incubadora, 65 Informe diario y mensual, 461
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MINISTERIO DE S LUD
ndice medios selectivos, 335 medios de transporte, 339 siembra en medios de cultivo, por inoculacin, 342 por estra, 342 por dispersin - agotamiento, 343 por puntura, 343 lectura e informe de una muestra cultivada, 344 medio NNN, 473 medio USMARU (NNN modificado),472 MIF (Merthiolate - lodine - Formol), 472 Diphyllobothrium latum,254 Entamoeba histolytica.259, 263 Entamoeba coli,263, 259 Enterobius vemicularis,255 Fasciola heptica,255 Giardia lamblia,260, 264 Hymenolepis nana, 255 Leishmaniasis,293 Necator americanus, 250, 252 Plasmodium vivax, 287, 285 Plasmodium fa lcipa rum , 287, 285, 292 Plasmodium malarie, 287, 285 Trichuris trichiura, 250, 257 Trichomonas hominis, 261 Taenia solium, 248, 257 Taenia saginata, 247, 257 recipientes, 207 obtencin, 205 frotis, 209 tincin, 211 gravedad especfica, 226 medicin de pH, 229 uso de tabletas, 231 Strongyloides stercoralis, 256 Potasio, 383 Potencimetro, 65
O
Orina
R
Red de laboratorios objetivos, 435 ubicacin por nivel de complejidad, Unidades recolectoras, 436 Laboratorios locales, 436 Laboratorios intermedios, 437 Laboratorio de referencia Regional, 437 Laboratorio de Referencia
P
Parsitos Amebas de vida libre. 260 Ancylostoma duodenale,250, 252 Ascaris lumbricoides.246, 253 Balantidium coli,264, 261
539
Procedimientos de Laboratorio
velocidad de sedimentacin, 167 Sedimentos urinarios elementos microscpicos, 213 preparacin, 224 Solucin amortiguadora, para VDRL, 485 tamponada, 486 cloruro de sodio 0,85%, 486 salina, isotnica, 486 0,9%, 487 10%, 487 ms antibiticos, 487 sulfato de zinc, 487 yodurada de lugol 1 %, 488 Suero obtencin y envo de suero, 449 Secreciones obtencin, vaginal, 316 uretral, 314 farngeas, 311 tica, 313 procedimiento de envo, 457 Trichomonas, examen directo, 275 Sfilis examen directo, 390 VDRL, 392 RPR (Reagina plsmatica rpida), 401 Sodio,
S
Salmonella aglutinacin en placa, 427 aglutinacin en tubo, 429 control de calidad, 432 Sangre recipientes para toma de muestras, 77 obtencin de sangre venosa, 80 obtencin de gota gruesa, 87 obtencin de sangre capilar, 90 extensiones, 91 tincin de extensiones, 96 clulas sanguneas, 102 hemograma, 103 leucocitos o glbulos blancos recuento, 122 eritrocitos o glbulos rojos recuento, 126 hematocrito, 131 hemoglobina, 136 tiempo de coagulacin, mtodo Lee y White, 145 tiempo de sanga, mtodo de Duke, 142 tipificacin de grupos sanguneos, 148
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MINISTERIO DE S LUD
ndice
T
Transaminasas en sangre, 376 TGO, transaminasa glutmico oxalactica, 483 TGP, transaminasa pirvica, 484 glutmico Yersinia pestis
U
rea mtodo de Chaney y Marbach, 372 Urocultivo mtodo, 348 lectura e interpretacin, 348 Ziehl y Neelsen
V
Virus de la Inmunodeficiencia Humana ELISA indirecto, 407 ELISA competitivo, 408 ELISA con antgeno de captura, 410 Virus de la hepatitis B test de ltex, 411
W
Wintrobe, anticoagulante, 466 Wright, colorante, 488
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A B C D E
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1 Eritrocito 2 Trofozoito joven 3 Trofozoito maduro en Eritrocito 4 Divisin de la Cromatina 5,6 E squizonte joven 7 Esquizonte maduro 8 Forma de margarita 9 Gametocito(hembra). 10 Gametocito(macho).
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1 Eritrocito 2 Trofozoito joven 3,4 Esquizonte joven 5 Esquizonte maduro, pigmento al centro 6 Gametocito con Cromatina compacta 7 Gametocito con Cromatina difusa
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MINISTERIO DE S LUD
1 Plaquetas 2 Eritrocito parasitado 3 Anillo libre 4 Pigmento 5 Grnulos de Schlfner 6 Ncleo del parsito 7 Esquizonte 8 Merozoitos
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Entomoeba histolytica
FORMA MINUTA (Luz intestinal) FORMA MAGNA (Invasora de tejidos)
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MINISTERIO DE S LUD
Entomoeba Coli
TROFOZOITO QUISTE BINUCLEADO
Endolimax Nana
1 Vacuola con bacteria 3 Ncleo 1 Ncleo
TROFOZOITO
QUISTE TETRANUCLEADO
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Giarda Lamblia
TROFOZOITO
QUISTE CUADRINUCLEADO
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MINISTERIO DE S LUD
Mycobacterium tuberculosis
(Coloracin Ziehl-Neelsen)
Nesseira gonorrhoeae
(Coloracin azul de metileno)
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HELMINTOS
1 2 3 4 5
Strongyloides stercorafis Taenia saginata Taenia solium Diphyllobothrium latum Taenia saginata
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MINISTERIO DE S LUD
HUEVOS DE HELMINTOS
1 2 3 4 5 6
Trichuris trichiura Ancylostoma duodenale Enterobius vermicularis Diphyllobothrium latum Taenia saginata Taenia solium Hymenolepsis nana
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7
1,8 Clulas vegetales 2 Vegetales espirales 3 Clula coloidal 4 Clula coloide teida con yodo 5 Pelos vegetales 6 Fibra de carne 7 Fibra de carne teida con yodo
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