ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DE MICRORGANISMOS Na natureza encontramos vrias espcies de microrganismos (bactrias, fungos,algas e protozorios) convivendo no mesmo ambiente.

Para estudar as propriedades deum determinado microrganismo em particular, deve-se primeiramente isol-lo emcultura pura, ou seja, uma cultura isenta de todos os demais tipos de organismos, ondetodas as clulas na popula o sejam id!nticas (originrias de uma mesma clulaparental). CULTIVO DE CULTURAS PURAS
MEIOS DE CULTURA

"s ingredientes necessrios para o crescimento de microrganismos podem sersupridos por um sistema vivo, como um #ospedeiro animal ou vegetal, uma cultura declulas, ou por uma mistura de todos os nutrientes re$ueridos juntos em um sistema artificial, denominado meio de cultura. "s meios de cultura contm os materiais nutrientes para o cultivos dos diferentes microrganismos. %stes meios podem ser preparados no pr&prio laborat&rio com p&s desidratados, ou ad$uiridos prontos no comrcio em placas de Petri ou tubos de ensaio. %stes meios podem ser em caldo (l'$uido) ou gar (s&lido). "s meios l'$uidoss o (teis para a obten o de relativa grande biomassa de microrganismos e revela o de provas bio$u'micas, mas n o permitem a separa o de dois ou mais microrganismos de espcies diferentes em uma popula o mista, n o possibilitando a observa o de algumas caracter'sticas espec'ficas dos microrganismos, como a morfologia de suas col)nias. Para se determinar as necessidades nutricionais de um microrganismo s o utilizados meios quimicamente e!ini os, ou seja, se con#ece a composi o e*ata de tais meios. Meios e cu"tu#a m$nimos ou %asais s o meios onde somente s o fornecidos elementos $u'micos necessrios ao microrganismo, na forma de molculas ou f&rmulas i)nicas simples. Nesses meios somente s o encontrados uma (nica fonte de carbono (geralmente glucose), de nitrog!nio (sais de am)nio ou nitratos), de f&sforo,etc. e n o s o detectados fatores de crescimento, aminocidos ou cidos nuclicos. Meios com !ina"i a es es&eciais s o meios $ue fornecem informa+es especiais sobre os microrganismos, Meios se"eti'os ( s o desenvolvidos para promover o crescimento de determinados microrganismos em detrimento de outros, $ue tambm se encontram na amostra em $uest o. - prtica mais comum a incorpora o de subst.ncias tais como antibi&ticos ou inibidores $ue propiciam tal sele o. %*., -gar de /#a0er-1artin seletivo para Neisseria gonorrhoeae e N. meningitidis onde os organismos contaminantes s o inbidos pela colistina, nistatina, vancomicina e trimetroprim e 123 (sacarose e bacitracina) 4

seletivos para Streptococcus mutans. Meios i!e#enciais ( s o desenvolvidos para facilitar a separa o presuntiva de espcies de microrganismos $ue porventura estejam colonizando um mesmo ecossistema. %sses meios, via de regra, permitem a obten o de col)nias com caracter'sticas fenot'picas diferenciadas (morfologia, colora o, etc), de acordo com o processamento de agentes cromog!nicos ou a(cares e indicadores incorporados ao meio. %*., garsangue (Porphyromonas e Prevotellas). Meios e en#iquecimento ( s o varia+es dos meios seletivos empregados para se estimular o crescimento de certos microrganismos e*igentes e $ue encontram-se particularmente presentes em pe$ueno n(mero numa amostra $ue inclui grande n(mero de outros da microbiota normal. Meios &a#a anae#)%ios ( s o meios pr-reduzidos empregados na coleta e manuten o de bactrias anaer&bias, onde s o adicionadas subst.ncias redutoras (cido asc&rbico 5,67, ciste'na 5,67, tioglicolato de s&dio 5,67) $ue se combinam com o o*ig!nio e indicadores de o*i-redu o (azul de metileno, resazurina). Meios &a#a o cu"ti'o e %act*#ias 4 simulam o habitat natural das bactrias. Pode ser adicionado sangue, soro animal, glicose, etc. %*., 3rain 8eart 9nfusion -gar 4 389 agar. Meios &a#a o cu"ti'o e !un+os 4 os fungos podem crescer em uma mistura simples contendo glicose, uma fonte de nitrog!nio inorg.nico ou org.nico e alguns minerais. %m geral esses meios t!m uma concentra o maior de a(car (:7) e um p8 menor (;,< a =,>) $ue o meio para cultivo bacteriano (p8 >,= a ?,=). %*., 2abouraud -gar. ,ATORES -UE IN,LUENCIAM A ESCOL.A DO MEIO - origem do material a ser analisado - espcie $ue se imagina estar presente na amostra -s necessidades nutricionais dos organismos. M/TODOS DE CULTIVO Inocu"a01o @uando o in&culo (material colocado no meio de cultura), obtido de uma suspens o original da amostra, colocado dentro ou sobre um meio geleificado (gar), as clulas s o imobilizadas e cada uma ir se multiplicar produzindo uma col)nia isolada. Aada col)nia nada mais do $ue clulas individuais agrupadas, com ancestral (nico, vis'vel a ol#o nu.
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T*cnica e es+otamento &o# est#ias2 atravs de uma ala ou agul#a de semeadura esgota-se o material por meio de estrias na superf'cie do meio. T*cnica a semea u#a em su&e#!$cie2 o in&culo espal#ado na superf'cie do gar com o au*'lio de uma ala de vidro (ala de BigralsC0).

 M*to o e pour-plate2 uma suspens o de clulas misturada com gar fundido a :=A, $ue se verte em uma placa de Petri. @uando o gar se solidifica, as clulas s o nele imobilizadas e crescem, formando col)nias. 2e a suspens o de clulas $ue ser inoculada foi previamente dilu'da, as col)nias formadas estar o bem separadas, com alta probabilidade de ser derivada de uma (nica clula. 1as para se ter certeza disso necessrio repicar uma col)nia do tipo desejado, suspend!-la em solu o apropriada e repla$ue-la. %ste procedimento dever ser repetido $uantas vezes for necessrio, o $ue ir assegurar a obten o de uma cultura pura.

Aol)nias -par!ncia das estrias

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Dm outro mtodo de obten o de cultura pura o de i"ui01o com e3tin01o. -suspens o original da amostra dilu'da seriadamente e semeiam-se amostras de cada dilui o. 2e apenas algumas amostras de uma dilui o particular e*ibirem crescimento, presume-se $ue essas culturas se originaram a partir de clulas isoladas. %ste mtodo utilizado somente $uando n o poss'vel o cultivo em placa por algum motivo e deve ser empregado apenas para se isolar o tipo de organismo predominante em uma popula o mista. MANIPULAO DO CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOS Por vezes, e*tremamente dif'cil reproduzir o crescimento microbiano em meios artificiais, assim como este ocorre em ambiente natural. Para contornar este problema reproduz-se em laborat&rio as condi+es ideais para o crescimento do microrganismo $ue se deseja isolar, tais como, diferentes meios de cultura $ue conten#am os nutrientes e*igidos pelo 1icrorganismo temperatura de incuba o aera o p8 @uando se deseja identificar a maior parte das espcies presente em uma amostra de uma popula o mista de microrganismos deve ser realizada a semeadura em tantos meios e condi+es de incuba o diferentes $uantos sejam necessrios para se obter o crescimento da maioria das espcies presentes na amostra. Para o isolamento de um tipo particular de microrganismo presente em uma popula o mista, alguns recursos podem ser empregados de acordo com as caracter'sticas do microrganismo desejado, tais como meios diferenciais, meios seletivos, meios enri$uecidos, o a$uecimento do material, a o de lcalis ou cidos fortes, e inocula o em animal sens'vel.
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ISOLAMENTO DE AER45IOS %stes microrganismos re$uerem o*ig!nio para sua sobreviv!ncia. -p&s a semeadura em placas ou tubos com meio de cultura, estes s o mantidos em estufa a ;?A em presena de o*ig!nio do ar atmosfrico. %*istem grupos de microrganismos,como a Neisseria gonorrohoeae, $ue necessitam n'veis elevados de di&*ido de carbono(A"E), neste caso pode ser utilizado o mtodo da jarra microaer&fila. -p&s semeados, os meio s o colocados dentro da jarra 4 juntamente com uma vela acesa $ue ent o fec#ada #ermeticamente. -p&s a vela se apagar ser obtida uma $uantidade reduzida de o*ig!nio livre e um teor de di&*ido de carbono de apro*imadamente 657. ISOLAMENTO DE ANAER45IOS Burante a prepara o dos meios, estes s o fervidos para $ue a maior parte do o*ig!nio dissolvido seja retirada. " gs nitrog!nio livre de o*ig!nio colocado nostubos contendo o meio, e ent o um agente redutor deve ser adicionado (normalmenteciste'na), o $ual remove os (ltimos traos de o*ig!nio. "s meio s o esterilizados emautoclave na completa aus!ncia de o*ig!nio. C6ma#a e anae#o%iose, a manipula o dos microrganismos dentro da c.mara $ue contm luvas especiais acopladas F parede da c.mara. - atmosfera dentro da c.mara uma mistura de #idrog!nio, di&*ido de carbono e nitrog!nio. " material introduzido ou removido da c.mara por meio de um sistema fec#ado para o ar. @ual$uer res'duo de o*ig!nio na c.mara removido pela rea o com o #idrog!nio, na presena do catalisador paldio. 7a##as e anae#o%iose, os meios inoculados s o colocados em uma jarra juntamente com um envelope $ue contm subst.ncias $u'micas $ue geram #idrog!nio e di&*ido de carbono. %ste sistema inade$Gado para o cultivo de anaer&bios estritos. M*to o e Vei""on2 o microrganismo inoculado em meio s&lido em coluna alta, crescendo no fundo do tubo de ensaio. Para os anaer&bios s o utilizados meios #e u8i os, $ue s o meios de cultura com a adi o de um agente redutor (e*., tioglicolato de s&dio), $ue s o capazes de absorver o o*ig!nio ou gerar 8E e A"E. MEDIDA DO CRESCIMENTO DA POPULAO MICRO5IANA %*iste uma variedade de tcnicas para $uantificar o crescimento bacteriano. "s dois mtodos $uantitativos mais comuns s o a$ueles $ue avaliam o n(mero de clulas - DHAImJ 4 Dnidade Hormadora de Aol)nias por mJ 4 e*., Aontagem celular microsc&pica ou eletr)nica, contagem em placa ou atravs de membrana filtrante e a$ueles $ue medem o peso celular ou ainda

atravs da estimativa de unidades de absorb.ncia da massa de clulas em caldo ou outras suspens+es (turbidez). IDENTI,ICAO DOS MICRORGANISMOS -travs das tcnicas laboratoriais empregadas para caracterizar os microrganismos, $ue podem variar desde uma microscopia relativamente simples F anlise do material gentico encontrado na clula, procura-se en$uadrar o microrganismo numa espcie. Dma cole o de dados utilizada para caracterizar espcies diferentes, Ca#acte#$sticas Cu"tu#ais " primeiro passo para a identifica o de uma col)nia isolada a observa o da natureza do meio em $ue o organismo est crescendo. " estudo da morfologia das col)nias crescidas em meio s&lido (forma, dimens+es, estrutura, bril#o, etc) ir possibilitar uma identifica o preliminar, mas n o definitiva do organismo estudado, j $ue muitas espcies podem produzir col)nias $uen o diferem entre si. (e*., algumas col)nias de E. coli s o indistingG'veis das de Shigella $uando cultivadas em gar- 8eCtoen). Mo#!o"o+ia Co"onia" Ca#acte#$sticas Mo#!o")+icas "s microrganismos podem ser observados ao microsc&pio &ptico utilizando-seprepara+es fi*adas e coradas. Prepara+es a fresco (em gota pendente ou prepara+es entre l.mina e lam'nula), s o (teis $uando a estrutura do microrganismo pode serdistorcida pelo calor ou agentes $u'micos utilizados na prepara o do material seco e corado, podendo ser utilizadas tambm $uando o microrganismo n o se cora facilmenteou para observar motilidade ou ingest o de alimentos particulados. -s tcnicas de colora o servem para mostrar as vrias estruturas dos microrganismos (flagelos, membranas, cpsulas), identificar suas estruturas internas e ajudar a identificar e separar microrganismos similares. -s colora+es podem ser feitas com um ou mais corantes. Co"o#a01o sim&"es, realizada com uma (nica solu o corante. -s clulas coram-se uniformemente com esta tcnica. (e*., Kioleta de genciana) Co"o#a01o i!e#encia", envolve mais de uma solu o corante. %videncia diferenas entre as clulas microbianas ou parte das clulas. (e*., Aolora o de Lram, Aolora o de Mi#el-Nielsen) Co"o#a01o e G#am " microbiologista pode utilizar a co"o#a01o e G#am do material obtido de col)nias isoladas para obter, atravs de observa o ao microsc&pio &ptico, maiores informa+es sobre a morfologia celular. - maioria das bactrias pode ser dividida emdois grupos distintos de acordo com os resultados apresentados pelo Lram, 3actrias Lram-positivas 4 coram-se em violeta escuro 3actrias Lram-negativas 4 coram-se em vermel#o

%ssa diferena na colora o est relacionada com a espessura e estrutura das paredes celulares das bactrias. Mic#osco&ia 4&tica "s microsc&pios de luz conseguem uma amplia o m*ima (til de cerca de 6555* o taman#o original do espcime. Aom algumas modifica+es, incluindo oculares de alta pot!ncia a amplia o m*ima do microsc&pio luminoso pode c#egar a apro*imadamente E555*. - imagem formada pelas objetivas tambm ampliada pelas lentes oculares. -ssim, a combina o do sistema de lentes da objetiva e o sistema de lentes oculares produz a amplia o. %*istem diversos tipos de microsc&pio de luz, 1icrosc&pio de campo claro, de campo escuro, de fluoresc!ncia, de contraste de fase. " microsc&pio eletr)nico produz uma amplia o m*ima (til de cerca de E55.555 4 :55.555* o taman#o original do espcime, devido ao alto poder de resolu o proporcionado pelo comprimento de onda muito curto dos fei*es de eltrons utilizados, em vez da luz. %ste microsc&pio permite o e*ame de v'rus e das ultra estruturas das clulas microbianas. %*istem avanos mais recentes na microscopia, como a$uelas $ue utilizam computadores, outras fontes de ilumina o, ou novas tcnicas de colora o Ca#acte#$sticas Meta%)"icas %*istem vrios testes laboratoriais $ue podem determinar a atividade metab&lica (metabolismo o*idativo, metabolismo fermentativo, catabolismo protico) de umorganismo. " registro das rea+es realizadas por uma espcie microbiana (til e muitasvezes essencial para sua identifica o Ca#acte#$sticas ,isio")+icas Aondi+es f'sicas como a atmosfera gasosa, a temperatura, o p8, a luminosidade e os fatores de crescimento pr&prios de cada microrganismo tambmfornecem par.metros para a identifica o. Por e*emplo, os microrganismos do corpo #umano crescem a ;=A e os do oceano a temperaturas entre : e E5A. Ca#acte#$sticas Anti+9nicas Dma clula microbiana apresenta estruturas f'sicas em sua superf'cie $ue podem agir como ant'geno e induzir, desta forma, a produ o de anticorpos. "s anticorpos produzidos em animais de laborat&rio podem ser usados para detectar a presena de ant'genos (nicos em culturas bacterianas e s o usados para caracterizar microrganismos. Ca#acte#$sticas &ato+9nicas - inocula o do microrganismo em #ospedeiro sens'vel (animal, plantas ou

micr&bios), com a finalidade de reproduzir a doena, poder determinar se este ou n o um pat&geno. Ca#acte#$sticas +en*ticas -travs dos avanos na biologia molecular surgiram tcnicas $ue permitem realizar anlises genticas para classificar ou identificar os microrganismos ou compreender a sua atividade, atravs de mtodos mais sens'veis e precisos. CONSERVAO DE CULTURAS PURAS -p&s a obten o de uma cultura pura dever ser adotado um mtodo de conserva o destas culturas vivas por um per'odo de tempo de acordo com o objetivo do estudo a ser realizado. Conse#'a01o &o# um cu#to &e#$o o : ias a meses;2 -rmazenagem F temperatura de refrigeradores (:A a 65A) Nepi$ues fre$Gentes Conse#'a01o &o# "on+os &e#$o os2 Nitrog!nio l'$uido a -6O>A Hreezers a -?5AI -6E5A Jiofiliza o 4 congelamento a seco - as amostras s o congeladas, desidratadas e fec#adas F vcuo, o $ue possibilita a viabilidade das culturas por muitos anos. %sta tcnica permite a obten o de uma cole o de microrganismos como refer!ncia, por e*emplo. Para o isolamento dos microrganismos em laborat&rio deve ser observada a atmosfera gasosa ideal para o crescimento de cada clula microbiana em particular, CULTIVO DE V<RUS Para isolar v'rus em laborat&rio, necessrio fornecer clulas #ospedeiras vivas, j $ue s o parasitas intracelulares estritos. V$#us %acte#ianos ( %acte#i)!a+os 4 s o facilmente isolados e cultivados em cultura de bactrias jovens em crescimento ativo em caldo ou meio solidificado em placa. V$#us animais2 Cu"ti'o em animais 'i'os, seu uso limitado, devido ao alto custo. -lguns v'rus animais como o v'rus da #epatite 3 podem ser cultivados somente em animais vivos. %m laborat&rio s o utilizados normalmente camundongos, coel#os e cobaias. 2 o utilizados em estudo sobre a resposta imune do #ospedeiro frente a uma infec o viral ou para determinar se um v'rus capaz de causar uma infec o. Cu"ti'o em o'os em%#iona os : e +a"in=a ou &ato;2 "vos embrionados (embri+es de >-6E dias) podem ser inoculados assepticamente com v'rus,

utilizando-se uma agul#a e seringa, por meio de um orif'cio aberto na casca. - abertura selada com parafina e os ovos s o incubados a ;>A por E a ; dias para permitir a multiplica o dos v'rus. Biferentes tecidos do embri os o inoculados, dependendo do tipo de v'rus. Cu"tu#a em teci os, uma vez obtida uma cultura de clulas, esta pode serutilizada como um #ospedeiro in vitro para um determinado v'rus. Podem ser utilizadas clulas de cultura primria ou clulas de lin#agem cont'nua.9dentifica o de v'rus depende do %AP (efeito citoptico), os v'rus invadem asclulas, geralmente causando algum tipo de altera o vis'vel. " %AP pode ter diferentes aspectos, dependendo do v'rus e do tipo de clulas na cultura. Dm tipo de %AP o corpsculo de incluso, $ue uma estrutura intracelular anormal. 2ua presena pode ajudar a identificar o v'rus $ue esteja causando uma infec o, por e*emplo, os corpsculos de Guarnieri s o caracter'sticos em clulas infectadas com o v'rus da var'ola. V$#us e P"antas Podem ser cultivados pela inocula o de uma suspens o viral em plantas por meio de uma agul#a #ipodrmica ou de escarifica+es provocadas nas fol#as da planta. -UESTION>RIO 6. Befina o termo Pcultura puraQ. E. Bescreva as principais caracter'sticas dos microrganismos usadas na identifica o das espcies. ;. Aite os passos para o isolamento de um microrganismo anaer&bio. :. @uais as tcnicas para conserva o de culturasR =. %*pli$ue a finalidade dos principais meios de cultura. 5I5LIOGRA,IA 5a#on? E@7@? Pete#son? L@R@? ,ine+o" ? S@M@ 1et#ods for identification of etiological agents of infectious disease. 9n, 3aile0 S 2cottTs Biagnostic 1icrobiolog0. O. ed. 2t. Jouis, 1osb0, 6OO:. Aap. :. p. :?:-=5:. 5ie#? O@ 1todos gerais de estudo das bactrias. 9n, 1icrobiologia e 9munologia. E;. ed. 2 o Paulo, 1el#oramentos, 6O<:. Aap. E=, p.:??-:OO. Pe"c8a#? M@7@? C=an? E@C@S@ A B#ie+? N@R@ Aaracteriza o dos 1icrorganismos. 9n, 1icrobiologia, Aonceitos e -plica+es. E.ed. vol.6. 2 o Paulo, 1c LraU 8ill do 3rasil. 6OO>. Aap.;. p. ?=-OO