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Introduccin a la Biologa Celular y Molecular

TP1: Diluciones
Objetivos
? Familiarizarse con las unidades mas utilizadas en biologa molecular y ser capaces de intercambiar gilmente las distintas unidades. ? Familiarizarse con el material de uso corriente en el laboratorio, la preparacin de soluciones y el empleo de diluciones a partir de soluciones concentradas

Introduccin
Diluciones Cuando una solucin es de uso corriente en un laboratorio, se suele preparar una solucin madre o stock, que se encuentra en una concentracin mayor de la que se utiliza. A partir de sta, se realiza una dilucin para preparar la solucin a la concentracin de uso. Se dice que una solucin es NX (se lee n por) cuando esta concentrada N veces respecto de la de uso corriente. Ej.: PBS 5X (PBS cinco por) es una solucin stock de PBS 5 veces ms concentrada que el PBS de uso normal. La solucin de uso normal sera 1X. Puede prepararse PBS 1X haciendo una dilucin 1/5 de la solucin stock (para 1000 ml de PBS 1X deben utilizarse 200 ml PBS stock 5X y agregar H2O bidestilada hasta llevar la solucin a 1000 ml de volumen final). Otro ejemplo: Si tenemos una solucin 10X cuya concentracin molar es 5 M, la solucin de uso normal es 0.5 M (es decir diez veces ms diluida). A veces es necesario diluir mucho una solucin concentrada (Ej: 1/1000, 1/1000000). En estos casos se suelen hacer diluciones sucesivas que se denominan diluciones seriadas, para disminuir los errores de medicin al pipetear volmenes muy pequeos. Ejemplo.: Preparar 1 ml de una solucin de un anticuerpo que contenga 0.1 g/ml (microgramo/mililitro=106 gramo/ml)), a partir de una solucin stock de 1 mg/ml (miligramo/mililitro =103 gramo/ml) Debera realizarse una dilucin 1/10000 (1/104) es decir pipetear 0.1 l stock + 999.9 l buffer de dilucin. Conviene entonces hacer diluciones sucesivas que, con menor error de pipeteo, permitan alcanzar la concentracin buscada. Ej. 4 diluciones seriadas 1/10 x 1/10 x 1/10 x 1/10 = 1/10000, o 2 diluciones seriadas 1/100 x 1/100 Tener en cuenta: Las soluciones diluidas se expresan a menudo en "mili...", "micro...", "nano...", "pico...", "fento...". Ej: 10 M, 1 pg/ml, etc. Recordar: 1 mmol (milimol) = 10-3 moles (aplicable a otras unidades: gramo, etc.) 1 mol (micromol) = 10-6 moles 1 nmol (nanomol) = 10-9 moles 1 pmol (picomol) = 10-12 moles 1 fmol (fentomol) = 10-15 moles Las unidades ms usadas en esta materia son mili y micro Concentraciones La masa de sustancia que corresponde a un mol de molculas de esa sustancia es lo que conocemos como masa molar M (se utiliza tambin el trmino peso molecular PM) y se expresa en gramos. Ej: la masa molar del oxgeno O2 es de 32 g/mol y del agua 18 g/mol.

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Pero OJO! no confundir con la masa molecular relativa Mr, que aunque coincide numericamente con M no lleva unidades de masa, sino que, justamente es relativa y nos dice cuantas veces ms pesada es una molcula de una sustancia respecto de la unidad de masa atmica (u.m.a.), de 1 Dalton (Da), que corresponde al tomo hidrgeno. As, la Mr del agua es 18 u.m.a. o 18 Da, o bien, 18 veces ms pesada que un tomo de hidrgeno. Las unidades de concentracin que utilizaremos sern: ? % p/p: Porcentaje masa en masa, g de soluto por cada 100 g de solucin (SN) (soluto + solvente). ? % p/v: Porcentaje masa en volumen, g de soluto por cada 100 cm3 o 100 ml de SN. ? % v/v : Porcentaje volumen en volumen, ml de soluto por cada 100 ml de SN. ? M : Molaridad, N de moles de soluto por cada 1 litro o 1000 cm3 de SN. ? m: Molalidad, N de moles de soluto por cada 1 Kg de solvente. ? N: Normalidad, N de equivalentes de un cido o de una base por cada 1 litro de SN. Ejemplo: Una solucin 2 M de HCl es lo mismo que una solucin 2 N, mientras que una solucin 4 M de cido sulfrico ser lo mismo que una solucin 8 N para este cido.

Precauciones para el uso de las micropipetas automticas


Las micropipetas son empleados para absorber y transferir pequeos volmenes de lquidos y permitir su manejo en las distintas tcnicas cientficas. Los volmenes captables por estos instrumentos varan segn el modelo: los ms habituales, denominados p2, p20, p200 y p1000, admiten un mximo de 2, 20, 200 y 1000 l, respectivamente. El uso de micropipetas permite emplear distintos lquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se emplean puntas desechables (o tip), de plstico, que habitualmente.. Algunas consideraciones generales sobre su uso: 1) Las micropipetas tipo Gilson tienen en la parte superior del mbolo su identificacin: P2, P20, P200, P1000, etc. Los volmenes mnimos y mximos de las pipeta tipo Gilson son los siguientes: Pipeta P2 P20 P100 P200 P1000 Vol. mnimo 0,1 2 20 30 200 Vol. mximo 2 20 100 200 1000

2) Para ajustar el volumen que se desea utilizar, debe girarse la rueda que se encuentra detrs del visor que indica el volumen. La rueda debe ser girada suavemente, NUNCA FORZARLA. NUNCA EXCEDER LOS VALORES ESTABLECIDOS EN EL PUNTO 1, YA QUE SE DESCALIBRA O SE ROMPE. El valor de estas pipetas es aproximadamente u$s 300 3) Dependiendo la marca y el modelo, los volmenes se indican de distinta manera, para las pipetas tipo Gilson:

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a. Para P20 los dos superiores indican la decena y la unidad en microlitros l, el tercer nmero (que est en otro color) indica la primer cifra despus de la coma. En el ejemplo de la foto indicara 10 l b. Para la P200 los tres nmeros indican centena, decena respectivamente. En el ejemplo de la foto indicara 100 l y unidad en l

c. Para la P1000 que solo tienen tres cifras en el visor, el primer nmero (en otro color) corresponde a la unidad de mil l, los otros dos la centena y la decena. En el ejemplo de la foto indicara 1000 l Otros modelos tienen los cuatro dgitos correspondientes al millar, centena, decena y unidad.

Introduccin a la Biologa Celular y Molecular Desarrollo


Importante: Repasar las diferentes formas de expresar la concentracin de una solucin y cmo interconvertirlas (molaridad, normalidad, % p/v, % p/p y la ley de Lambert-Beer). Se partir de una solucin stock de colorante azul de toluidina 0,16 p/v (PM=305,83). Con ella se construir una curva de calibracin y se averiguar la concentracin de una solucin desconocida por extrapolacin. a. Construccin de la curva de calibracin Cada grupo recibir 1 ml de solucin stock de azul de toluidina 0,16 p/v y realizar por triplicado diluciones seriadas al medio hasta la desaparicin del color de la solucin b. Dilucin incgnita: Cada grupo recibir 1 ml de una solucin de concentracin desconocida. Deber averiguar la concentracin de la misma, por extrapolacin en la curva realizada con las diluciones seriadas a partir de la solucin stock (preparada en el punto anterior) d. Medidas de absorbancia Se colocarn 100 l de las diluciones de la curva y de la muestra incgnita en cada pocillo de una placa de 96 wells. Se registrar la absorbancia en un lector de microplaca a 595 nm. e. Grfico de la curva de calibracin: Con el promedio (para cada punto) de los valores de absorbancia se graficar Absorbancia (Y) vs. concentracin en mM (X) en el programa Excel (o similar). Descartarn los puntos que no formen parte de la porcin lineal de la curva (por qu?), y se aplicar una regresin lineal. A partir de la ecuacin de la recta de regresin se calcular el valor de la muestra incgnita. Ejemplo:

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En las opciones de lnea de tendencia se selecciona presentar ecuacin y R2 en el grfico. El grfico ser algo as: La ecuacin relaciona Y (absorbancia) con X (la Ttulo del grfico y = 0,2x + 1E-16 concentracin de la solucin en cada R2 = 1 caso). Entonces, reemplazando el 0,2 valor de absorbancia de la muestra incgnita en esta ecuacin, puede 0,15 obtenerse el valor de concentracin, ya que es directamente proporcional 0,1 a su absorbancia. El valor de R2 da una idea de 0,05 qu tan bien se ajusta la recta de regresin a los puntos graficados. 0 Cuanto mayor sea este valor (ms cercano a 1) ms alineados estn 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 los puntos.
Absorbancia Concentracin (mM)