Sunteți pe pagina 1din 65

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ

VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA
Facultatea de Horticultură
Str. Mănăştur Nr.3-5 ,400372, Cluj-Napoca, România
Tel: 0264-596384; Fax:0264-593792

Conf.dr.ing. Corina Cătană

MICROBIOLOGIE ŞI
MICROPROPAGARE
Note de curs

Cluj-Napoca
Editura AcademicPres

2010
C1. Biotehnologia clasică şi modernă
În prezent, umanitatea se confruntă cu o problemă serioasă şi anume "hrana". Din
păcate, pentru o parte a populaţiei (mai evident în ţările lumii a 3-a), producţia agricolă
este incapabilă să satisfacă chiar şi cele mai elementare nevoi, problema devenind şi mai
acută prin creşterea numărului populaţiei planetei (5,8 miliarde în prezent faţă de 1,6
miliarde în 1914 şi, probabil, cam 8,3 miliarde până în 2025), fapt care va face insuficient
volumul producţiei agricole actual. Pentru a asigura necesarul de hrană preconizat pentru
2025, nivelul mediu al producţiei trebuie să crească semnificativ (de exemplu, cel al
cerealelor cu până la 80%). Sofisticatele sisteme agricole de înaltă tehnologie ale ţărilor
dezvoltate (mărirea suprafeţelor cultivate, dezvoltarea sistemelor de irigare şi creşterea
numărului lucrărilor agricole) încearcă, dar cu rezultate limitate, să rezolve dorinţa de a
creşte masiv producţia alimentară. În plus, la nivel mondial, sunt înregistrate şi pierderi
ale producţiei agricole, estimate între 20-40%, cauzate de diferiţi factori: insectele- care
produc pierderi de 14%, plantele dăunătoare- 10% sau bolile – care produc pierderi de
12%, acestea fiind doar pierderi de ordin primar.
Natura a dezvoltat o diversitate vegetală enormă, fiind descrise până în prezent un
număr de aproximativ 250.000 de specii vegetale dintr-un total estimat la cel puţin
500.000 specii diferite. Plantele trăiesc în ecosisteme în care interacţionează cu alte
organisme, prin mecanismele de apărare, simbioze sau polenizare. Aceste interacţiuni
specifice implică o gamă largă de compuşi chimici. La un anumit nivel, există o
biochimie similară necesară supravieţuirii unei celule vii dar, pe lângă aceste procese
primare, organismele vegetale produc şi o serie de metaboliţi secundari cu rol esenţial în
interacţiunea cu alte organisme. Datorită numărului mare de organisme şi a numărului
practic infinit de interacţiuni, în cursul evoluţiei a apărut un număr enorm de metaboliţi,
până în prezent fiind înregistraţi peste 100.000, numărul lor sporind anual, în medie, cu
alţi peste 4.000 (Verpoorte et al., 1998). Pe lângă rolul lor în asigurarea calităţii
alimentare a plantelor (gust şi culoare), aceşti compuşi prezintă şi importanţă economică,
fiind resursa de substanţe active pentru obţinerea de medicamente, substanţe aromatice,
esenţe şi parfumuri, insecticide şi coloranţi. Mai mult chiar, în ultimi ani a devenit tot mai
evidentă importanţa lor preventivă şi terapeutică când sunt utilizaţi ca ingredienţi şi
aditivi alimentari, aspect care fundamentează un domeniu complet nou şi anume, cel al
nutriceuticalelor.
Progresul în ştiinţa plantelor este cea mai bună speranţă pentru realizarea unei
agriculturi profitabile, susţinute economic şi stabilă din punct de vedere ecologic şi, astfel
cercul se închide - Natura, om şi tehnologie.

Strategia iniţială de selecţie şi menţinere a unor forme vegetale valoroase a pornit


de la o alegere simplă, adeseori întâmplătoare imediat ce observaţia empirică că
seminţele unor plante căzute pe pământul răscolit încolţesc, cresc şi fructifică a
fundamentat ideea de cultură, respectiv de agricultură. Încetul cu încetul plantele au fost
mai întâi domesticite iar cultivarea lor a înlocuit treptat vânătoarea şi culesul. Profesorul
Indra Vasil spunea odată că: “alegerea făcută de omul neolitic s-a dovedit a fi înţeleaptă
şi remarcabil de durabilă şi, de asemenea, a ajutat la susţinerea dezvoltării civilizaţiei
umane prin asigurarea unei bogate şi dependente surse de nutriţie pentru populaţia aflată
mereu în creştere numerică” şi deci, în nevoi.
Deşi ne-am dori o armonie continuă între om şi natură, încă din acele vremuri a
existat o permanentă luptă între forţele naturale ale biodiversităţii şi nevoia omului de a
produce alimente, într-un sistem de producţie intensiv, din ce în ce mai progresiv. La
început, ameliorarea plantelor în scopul îmbunătăţirii lor, s-a bazat pe încercare şi eroare.
Descoperirile făcute de Darwin şi Mendel au demonstrat că: 1) combinaţiile caracterelor
genetice sunt favorizate între indivizi, în cadrul populaţiilor, printr-un proces de selecţie
naturală şi 2) că aceste caractere individuale (genele) manifestă un proces de segregare în
descendenţă, în conformitate cu un program predictibil.
În zilele noastre, din punct de vedere tehnic, în activitatea de creare de soiuri şi
hibrizi comerciali, amelioratorul trebuie să rezolve, trei grupe de probleme esenţiale,
reprezentate de:
- utilizarea unei variabilităţi genetice cât mai largi, în limitele resurselor sale
materiale şi umane,
- găsirea posibilităţilor de selecţie a recombinanţiilor care prezintă
caracteristicile dorite de el şi,
- utilizarea unor metode rapide de obţinere a unei descendenţe numeroase ale
selecţiilor valoroase, cu caracteristici previzibile şi stabile.
Biotehnologia vine să întâmpine aceste deziderate ale amelioratorului pe două căi:
- prin creşterea randamentului şi a eficienţei de selecţie propriu zisă şi,
- prin lărgirea şi completarea bazei genetice prin mecanisme directe sau
indirecte de modificare genetică, bază din care amelioratorul poate selecta o
formă cât mai potrivită scopurilor sale.
Ulterior cultivării plantelor, în demersul uman de cunoaştere în sine a lucrurilor şi
proceselor până la acţiune şi aplicaţie practică (şi invers) omul a descoperit prepararea
vinului (vinificaţia) după ce a observat că sucul stors din struguri şi păstrat mai multă
vreme, fermentează şi se transformă într-o băutură cu noi calităţi. Tot aşa, omul a ajuns să
ştie cum să-şi prepare pâinea, brânzeturile, să-şi păstreze un timp mai îndelungat
alimentele. Azi considerăm tehnicile de panificaţie, vinificaţie, fabricare a berii, de
preparare a brânzeturilor ca reprezentând ”biotehnologiile tradiţionale”. După ce celebrul
chimist francez Louis Pasteur (1822-1895) a descoperit rolul esenţial al
microorganismelor în procesele de fermentaţie sau după ce autori ca Takamine (1914) în
SUA şi Boidin şi Effront (1917) în Franţa şi Belgia au reuşit producerea biotehnologică a
enzimelor, amilaza (folosind specii ca Asp. oryzea şi Baccilus mesentericus) putem vorbi
cu adevărat de o biotehnologie, clasificată azi ca fiind ”veche ”.
Lucrările lui Fleming (1929), Chain şi Abraham (1940) asupra penicilinei,
Waksman, (1943), asupra streptomicinei, Smith şi Worrel, (1949-53), asupra
cloranfenicolului, reprezintă precursori ai biotehnologiei moderne – deoarece ele
reprezintă primele realizări în acest domeniu. Prima producţie industrială prin fermentaţie
a penicilinei a fost realizată de către o echipă formată din Florey şi Chain şi cea condusă
de Perlman în perioada 1940-48. Au urmat apoi, fabricarea prin fermentaţie a acidului
glutamic (în Japonia, 1957), a lizinei (Japonia, SUA, 1957-58), a treoninei (1960), a
fenilalaninei, 1961 (USA). Brevetul de invenţie pentru fabricarea vitaminei B12 este
datat în 1960 .
Descoperirea succesivă a antibioticelor (> 4000 între 1939-59), folosirea lor în
timpul celui de al doilea război mondial, au fost favorizate şi de realizarea primelor
bioreactoare (ceea ce a marcat apariţia bioingineriei), a punerii la punct a procedeelor (de
exemplu: folosirea aşa numitelor culturi – pure, noţiune fundamentală în microbiologie,
larg utilizată acum în biotehnologie.
Dezvoltarea industriilor cosmetice, chimice, agro-industrială, şi agro-alimentară
(fermentative şi de bioconversie), au contribuit la formarea, dezvoltarea şi diversificarea
biotehnologiilor moderne.
Datorită valorii unor astfel de cercetări şi realizări, în prezent au luat fiinţă
Societăţi (1983 – Sociétés de Biotechnologie dans le Monde). Există aproximativ 700
societăţi specializate (în Biotechnologie nouvelles (SSB), în SUA, aprox. 300 în Europa.
Începând cu anii 80, guvernele lumii întregi se interesează asupra perspectivelor
bio-industriilor, de maniera orientării politicii lor economice pentru stimularea şi
susţinerea financiară a cercetării şi industrializării în acest domeniu. Desigur, există
Programe naţionale de Biotehnologii – elaborate şi coordonate de diverse ministere.
S-au înfiinţat firme specializate (Imunotech – anticorpi monoclonali, 1981;
Coletica (cosmetice), CLOMATEC (imunologie), Genset (sinteze ADN şi ARN),
BIOEUROPE (Contracte de cercetare) care supervizează şi direcţionează dezvoltarea
biotehnologiei.
Materia de bază o constituie de obicei experienţa etno-farmacologică,
etnomedicală sau/şi etnobotanică sau cunoştinţe/informaţii specifice de utilizare a unui
anumit compus pentru un anumit scop. Sursa cea mai importantă şi masivă o constituie
speciile vegetale sălbatice. Din cele peste 400 specii etnobotanice, doar 1/3 au fost
analizate fitochimic în mod corespunzător. Se estimează că, în prezent, doar 5-15% din
totalul de 25.000 până la 75.000 de specii vegetale au fost studiate ca potenţială sursă de
substanţe utile (Simon, 1986), iar în ţări mai puţin evoluate, în domeniul ştiinţei doar 1%
din specii au fost analizate. Pentru un proces complet de analiză fitochimică sunt necesare
aproximativ 100 kg de material original (rădăcini, tulpini, frunze, flori, fructe, seminţe).
Acest procedeu este destul de greu de realizat datorită numărului mare de indivizi ce
trebuie colectaţi, situaţie care poate perturba compoziţia floristică a unui areal dat sau
poate duce chiar la distrugerea-dispariţia unor specii rare sau endemice.
În domeniul biologiei celulare şi moleculare ultimii ani au avut şi continuă să aibă
un impact considerabil asupra lucrărilor de ameliorare vegetală concretizându-se,
conform unor reputaţi amelioratori precum Gallais, Jacobse, Elliot în trei direcţii
importante:
-elemente de biologie celulară utilizabile în ameliorare,
-elemente de biologie moleculară utilizabile în ameliorare,
-manipularea genetică la plante în scop de ameliorare.
Dezvoltarea biologiei celulare şi moleculare, genetica moleculară şi ingineria
genetică au permis punerea la punct a unor tehnici (de exemplu: tehnica amplificării in
vitro a ADN = PCR (Polymerase Chain Reaction), chromosome walking, chromosome
painting, RFLP (Restriction Fragments Length Polimorphism), identificarea şi cartarea
genelor), care sunt în prezent mijloace aproape obligatoriu folosite în procesul
biotehnologic.
Dintre obiectivele noi realizate prin intermediul ingineriei genetice menţionăm:
posibilitatea de creştere a randamentului fotosintetic, sporirea randamentului de creştere a
utilizări îngrăşămintelor minerale, modificarea genelor care participă la activizarea căilor
metabolice exprimate prin spor de producţie. Prin utilizarea unor agenţi, vectori de tipul
plasmidei Ti de la Agrobacterium este posibilă realizarea transferului unei heterogene de
la o formă donoare la plantele cultivate. Transferul de gene este, fără îndoială, o sursă de
variabilitate genetică. În momentul de faţă, la plantele de cultură, este posibil transferul a
unor gene care determină:

-depozitarea unei mari cantităţi de proteine în seminţe;

-sinteza unor enzime specifice care să permită acumularea, în organe specializate, a unor
cantităţi dorite de amidon sau alte zaharuri;

-sinteza unor compuşi toxici pentru anumite insecte dăunătoare;

-sinteza unor proteine virale de tip capsidic care să asigure protecţia îimpotriva infecţiilor
virotice;

-sinteza unor produşi ce induc androsterilitatea.

Pentru a se ilustra câştigurile ce se aşteaptă de la manipulările genetice utillizate


în ameliorarea plantelor nu este lipsit de interes să se prezinte şi principalele gene ce se
doresc a fi transferate plantelor de cultură, de la alte organisme. Dintre acestea,
deocamdată, au fost realizate:

-rezistenţa la boli virotice, prin transferul la plantele de cultură, a unor gene virale
ce determină sinteza proteinelor capsidice sau a ARN-ului viral antisens ;

-rezistenţa la atacul insectelor, bazată pe transferul la plante, al genelor pentru


sinteza proteinelor cristale şi a inhibitorilor proteinazei ;

-rezistenţa la erbicide, obţinută prin realizarea unei mutaţii în gena ce determină


sinteza proteinei ţintă sau prin introducerea în plante a unor gene ce determină
supraproducţia de proteină ţintă sau detoxifierea substanţei active a erbicidului ;

-rezistenţa la bolile bacteriene realizată prin transferul la plantele de cultură a


genelor ce codifică sinteza unor peptide cu efect bactericid ;

-reglarea conţinutului în amidon al tuberculilor de cartof prin transferul de gene ce


influenţează sinteza enzimei GBSS, responsabilă pentru producţia de amidon ;

-obţinerea unei fermităţi ridicate a pulpei fructelor de tomate prin includerea, în


genotipul soiurilor valoroase, a unor gene ce reglează sinteza enzimei poligalacturonaza,
responsabilă cu înmuierea pieliţei şi pulpei fructelor.

La acest nivel vorbim deja de o altfel de strategie a dezvoltării biotehnologiei


adică de o strategie caracteristică ştiinţelor aplicative, care porneşte de la idee spre
aplicaţiile practice. Aceasta presupune obligativitatea ca înaintea oricărui demers practic
să se efectueze mai multe investigaţii teoretice (aşa numita cercetare fundamentală).
Tehnologia se distinge de ştiinţă prin obiectul său, prin realitatea tehnică, dar este totuşi
ştiinţă datorită conţinutului său. În zilele noastre, tehnologia se hrăneşte din ştiinţă şi
hrăneşte ştiinţa prin executarea tehnică a acesteia, ceea ce presupune (după Soran et al.,
1993):
- manieră metodică (deci se pun probleme care trebuiesc rezolvate – în ştiinţă un
răspuns negativ este acceptat; în tehnologie – nu are valoare, pentru că nu poate fi
aplicat. Exemple de probleme puse şi rezolvate de biotehnologie: prepararea laptelui
lipsit de lactoză, medicamente pe bază de enzime, modelarea artificială a fotosintezei,
obţinerea de seminţe artificiale)
- rigoare în demersuri – datorită preţurilor de cost ridicate, programele aprobate
pentru finanţare în biotehnologie trebuie să fie temeinic fundamentate
- precizie în observaţii şi măsurători, chiar dacă conceptele rezultate sunt de manieră
generală.
- necesitatea susţinerii matematice (“asigurarea statistică” a rezultatelor) (spre
deosebire de cercetarea în ştiinţă – unde simpla observaţie şi descriere a unui
fenomen sau proces este suficientă, în biotehnologie, rezultatele se finalizează sub
forma tehnologiilor de producţie – ceea ce presupune elaborarea unui program care
poate şi trebuie să fie reproductibil şi funcţionabil, oricând şi de către oricine, în
condiţiile respectării condiţiilor indicate în aşa numitele protocoale de lucru.
Definirea biotehnologiei
Termenul de Biotehnologie este rezultatul asocierii a două cuvinte de origine
greacă BIOS-viaţă şi TECHNE-artă, artefact, lucru făcut de mâna omului; adică, în sens
modern, tehnică. Până la apariţia şi intrarea în vigoare a noilor legiferări internaţionale,
biotehnologia se putea defini ca fiind o ramură a biologiei care se ocupă de elaborarea
unor procedee tehnice pentru obţinerea diverselor bunuri necesare omului, folosindu-se
de particularităţile metabolice ale diverselor sisteme vii, în particular ale celulelor de
diverse provenienţe (Soran, 1993). Totuşi, aşa cum atrăgea atenţia Topală (1986),– „nu
tot ceea ce are tangenţă cu biologia şi cu tehnica este biotehnologie, după cum nu orice
tehnică biologică sau tehnologie bazată pe o materie primă biologică este biotehnologie”.
Aspect foarte bine demonstrat de limitarea precisă a noţiunii de biotehnologie, în
accepţiunea sa modernă, legiferată prin Protocolul de la Cartagena, în Articolul 3, ca
fiind aplicaţia :
 (a). tehnicilor in vitro asupra acidului nucleic, incluzând tehnica ADN-ului
recombinant şi injectarea directă de acid dezoxiribonucleic (ADN) în celule sau
organite celulare, sau
 (b). fuziunea celulelor dincolo de limita taxonomică a familiei, care depăşesc
barierele fiziologice reproductive naturale sau cele de recombinare şi care nu
sunt tehnici folosite în ameliorarea şi selecţia clasică
Aplicaţiile practice se pot întrevedea şi realiza după elucidarea aspectelor
teoretice. Principala diferenţă între ceea ce ar putea însemna termenul de „tradiţional”
şi „nou” (cu sensul de „noutate”) în biotehnologia vegetală este aceea că primul se
bazează esenţial pe organismul ca întreg, în timp ce cel de-al doilea se referă la
nivelul celular al organismului.

Micropropagarea Biotehnologia
Material: celule organizate, ţesuturi, fragmente de Material: celule neorganizate: calus, suspensii
ţesuturi, plantă întreagă celulare, celule imobilizate, celule individuale
Obiectiv: obţinere de material genetic modificat,
Obiectiv: multiplicarea nelimitată a aceluiaşi tip de obţinere de metaboliţi secundari
material biologic valoros Procese biologioce implicate: metabolismul celular
Procese biologice implicate: creşterea şi Stabilitate genetică: variabilitate genetică şi
dezvoltarea somaclonală
Stabilitate genetică: obligatorie
Metode şi tehnici: complexe şi sofisticate, destul de
costisitoare
Metode şi tehnici : simple şi ieftine Aplicaţii imediate: ştiinţifice, comerciale şi
industriale
Aplicaţii imediate: comerciale

Cultura in vitro a unor specii agricole şi horticole este, probabil, primul exemplu
de implicare a cuceririlor biologiei celulare în ameliorarea plantelor. Concret, cultivarea
in vitro a materialului vegetal (ţesuturi meristematice, celule, embrioni) permite obţinerea
rapidă a unui număr impresionant de indivizi identici din punct de vedere genetic.
Potenţialul culturii in vitro este imens, însă incomplet exploatat.

Noţiunea de “cultură de ţesuturi vegetale” este sinonimă cu “cultura in vitro “(în sticlă) şi se referă la:

cultura în condiţii aseptice a unor:

Organisme vegetale
Organe vegetale
Ţesuturi vegetale
Celule, suspensii celulare vegetale
Protoplaşti
Organite celulare, vegetale, etc.

Ce înseamnă cultura în condiţii controlate?

 Cultura aseptică (axenică)


Lipsă de contaminare (bacterii, ciuperci, virusuri, drojdii)
Mediu sterilizat
Lipsit de microorganisme
 Condiţii controlate de cultură
Suport nutritiv artificial (mediu lichid sau solid)
Fizice (temperatură, lumină, umiditate)

Cursul nr 2
Ce este micropropagarea?

Micropropagarea poate fi definită ca un sistem de cultură pe un suport


nutritiv în condiţii de asepsie totală a oricarei părţi, organ, ţesut sau
celulă vegetală.
Aplicaţiile micropropagării sunt:
Principale
-multiplicarea clonală rapidă a formelor de interes agronomic
-stabilirea, menţinerea şi desfacerea pe piaţă a clonelor libere de viroze
Secundare
-în cazul speciilor recalcitrante
-ca metodă suport în procesele de ameliorare
Paralele (alternative)
- metodă folosită pentru conservarea materialului genetic,
-metodă de transport a materialului vegetal (se realizează în containere mici)

De ce este importantă micropropagarea ?


Pentru că asigură producţie prin:
cantitate- obţinerea într-un timp scurt, pe tot parcursul anului a unor cantităţi de material extrem de
uniform şi într-un număr practic nelimitat
calitate- fiind o metodă de multiplicare vegetativă asigură uniformitatea genetică a materialului
biologic, într-o stare fitosanitară excelentă
şi pentru activitatea de cercetare şi studiu asupra unor aspecte precum:
organogeneza
elemente consumate
reglare hormonala vegetală
metoda suport pentru programele de ameliorare genetică

Caracteristicile obligatorii ale micropropagării:


Se realizează pe medii nutritive
Asigură controlul total al influenţei factorilor fizici şi chimici
Principiile de bază ale micropropagării
1. Totipotenţa celulară 1902 Haberland
2. Asepsia 1922 Robbins
3. Mediul de cultură 1934 White
4. Reglarea hormonală 1957 Skoog şi Miller
5. Etapizarea culturii 1964 Murashige.

Avantajele micropropagării
În principal, alături de celelalte ramuri ale economiei, agricultura cunoaşte şi ea profunde
transformări. În contextul acestor prefaceri intervenite în agricultură, biotehnologiile moderne devin o
alternativă viabilă.
Una din aceste noi bio-tehnologii este cultura de ţesuturi la plante.
Importanţa utilizării tehnicii de înmulţire a plantelor prin culturi de ţesuturi rezultă din
numeroasele avantaje pe care le prezintă această metodă în comparaţie cu metodele de înmulţire vegetativă
tradiţionale (clasice). Potenţialul acestei metode este prezentat de unii autori ca fiind nelimitat. Există însă
si reţineri cu privire la folosirea pe scară largă a micropropagãrii, reţineri ce se referã la posibilitatea
menţinerii valorii biologice a materialului produs, întrucãt nu poate fi exclus riscul apariţiei unor mutaţii
accidentale. Folosită însă corect, cultura in vitro, poate deveni din acest punct de vedere competitivã
culturii in vivo.
Pentru a scoate mai bine în evidenţă importanţa acestei metode, în cele ce urmează enumerăm
câteva din principalele avantaje oferite de către utilizarea în practică a tehnicilor in vitro de
micropropagare:
tehnica de multiplicare in vitro se poate aplica la toate speciile de plante, atunci când sunt cunoscute şi
îndeplinite condiţiile şi cerinţele la nivel optim;
se pot iniţia şi practica culturi pe tot parcursul anului, în laboratoare special amenajate, cu explante
provenite de la culturi din câmp, din seră sau din alte culturi controlate putîndu-se obţine material de
plantat independent de sezon;
în comparaţie cu metodele tradiţionale de înmulţire, cultura in vitro permite multiplicarea rapidă, într-
un ritm accelerat;
favorizează crearea de noi genotipuri, prin inducerea variabilităţii genetice (mutaţii, hibrizi somatici
prin fuzionare de protoplaşti, transfer de informaţie genetică, etc.);
în majoritatea cazurilor se transmit fidel, la toţi descendenţii, caracteristicile părinţilor din care provin
explantele ( sunt şi unele excepţii, exemplu la culturile de calus poate apare fenomenul de
poliploidizare);
crează o economie importantă de forţă de muncă şi de spaţii de producţie în comparaţie cu înmulţirea
clasică;
se poate realiza reîntinerirea plantelor foarte îmbătrînite, respectiv juvenilizarea materialului de plantat
obţinîndu-se plante de valoarea celor generate din embrionul seminţei;
scurtează perioada de ameliorare a soiurilor la toate speciile de plante dar, în mod deosebit, la speciile
lemnoase ( dela 10 – 15 ani la numai 2-3 ani);
permite obţinerea de material de plantat cu valoare biologică ridicată fiind, prin definiţie, liber de
viroze;

existã posibilitatea înmulţirii plantelor pentru producerea de samânţă hibridă


atunci când genotipul parental este inapt de autopolenizare.
uşurează schimburile de material biologic între laboratoare de acelaşi tip atât la nivel naţional cît şi la
nivel internaţional
facilitează conservarea fondului genetic în "bănci de gene", întrucât prin păstrarea genotipurilor
valoroase existente se împiedică eroziunea (degradarea genetică) a speciilor;
înlesneşte crearea de plante cu calităţi speciale privind conţinutul în glucide, aminoacizi, vitamine etc.
micropropagarea constitue o metodă îmbunatătită de munca, activitatea desfăsurăndu-se în condiţii de
igienă maximă.
Numeroasele avantaje enumerate au determinat pe mulţi specialişti din cercetare şi producţie să
treacă la introducerea şi aplicarea acestei tehnici, pe scară din ce în ce mai largă, iar la expoziţii
internaţionale de horticultură şi-au făcut apariţia incinte aspetice, posibil de a fi instalate în condiţii mai
puţin proprii înfiinţării unor laboratoare pretenţioase. In acest mod chiar şi micii producători şi amatorii pot
beneficia de utilizarea acestor tehnici moderne de înmulţire a plantelor.

Dezavantajele şi riscurile micropropagării


Când vorbim despre avantajele multiplicării in vitro a plantelor trebuie să luăm în considerare şi
anumite riscuri pe care le implică această tehnică în condiţiile unei producţii lărgite, de tip industrial, de
generare a materialului de plantat, prin operarea de subculturi, respectiv prin micropropagare, şi anume:
există pericolul introducerii "explozive" în cultură într-un anumit sezon sau an, a speciilor sau soiurilor
atunci la modă, ceea ce poate cauza saturarea pieţei cu acelaşi tip de produs, conducând la o scădere a
cererii;
răspândirea în cultură a unui număr redus de clone sau chiar înfiinţarea de culturi monoclonale, ce va
conduce la o "sărăcire genetică" a speciilor sau a varieţăţilor aflate în cultură, apare pericolul selectării
naturale de dăunători care pot decima într-un timp scurt exemplarele unei anumite clone ;
în condiţiile micropropagării in vitro se remarcă prezenţa unor fenomene fiziologice nedorite, cum este
cazul vitrificărilor sau necrozelor;
pierderi pot fi cauzate şi din lipsa de profesionalism şi conştiinciozitate a persoanelor angajate în
operaţiunile implicate în lanţul tehnologic de micropropagare in vitro.
trebuie avute în vedere posibile accidente şi întoxicării personalului muncitor cu diferite substanţe
toxice folosite în decursul fluxului tehnologic, precum şi procentul de pierderi de plante datorat fazelor
de aclimatizare.

Tehnicile şi metodele de cultură in vitro permit obţinerea a două tipuri de creştere: creşterea
materialului vegetal în formă organizată (celule, ţesuturi specializate şi organe) şi respectiv, creşterea
materialului vegetal în formă neorganizată (calus, suspensii celulare).

Creşterea organizată
Creşterea organizată constă în crearea sau/şi menţinerea unei structuri vegetale definite. Aceasta
se realizează cînd diferite organe vegetale, cum sunt vîrfurile de creştere ale lăstarilor sau rădăcinilor
(zonele meristemelor apicale), primordiile foliare, muguri floriferi sau flori aflate într-o fază iniţială de
dezvoltare, fructe mici în fază incipientă de dezvoltare, transferate pe medii de cultură îşi continuă
creşterea. Creşterea organizată se realizează şi cînd sunt create organe rezultate direct dintr-un fragment de
ţesut plasat în cultură (deci dintr-un explant) sau dintr-o masă de celule iniţial neorganizată (creşterea din
timpul proceselor de regenerare). Acest din urmă proces, care duce la formarea unor organe de novo, se
numeşte organogeneză (formarea organului vegetal) sau morfogeneză (adică dezvoltarea formei).
Cultura ţesuturilor organizate
Cultura de organe: se foloseşte ca termen general pentru acele tipuri de culturi în care formele
organizate ale creşterii (adică structuri definite cum sunt primordiile foliare, flori, fructe imature) pot fi
menţinute in mod continuu.
Cele mai importante tipuri de culturi de organe sunt:
cultura de meristeme, în care părţi extrem de mici ale vîrfului de creştere (0,5-1 mm) ,
respectiv domul meristematic cu una-două primordii foliare sunt izolate aseptic din planta
mamă şi crescute pe mediu. Acest tip de cultură duce la formarea unei singure plante
cultura de noduri, izolaţi aseptic din mugurii laterali, fiecare fiind purtătorul unui
fragment mic de tulpină (1 cm) care poartă 1-2 muguri laterali. Acest tip de cultură duce
la formarea a 1-2 lăstari
cultura de lăstari, este iniţiată aseptic din mugurii laterali sau din vîrfurilor ramificaţiilor
laterale, vîrfuri de dimensiuni mai mari decît cele ale meristemelor (1-2 cm), şi care
conţin şi cîteva primordii foliare. Acest tip de cultură duce la formarea lăstarilor multipli
cultura de embrioni zigotici, constă în disecţia aseptică a seminţelor fertilizate sau
nefertilizate provenind din fructe mature sau imature şi creşterea lor pe mediu pînă în
faza de plantulă. Acest tip de cultură duce la formarea unui număr mai mare de plantule.
Cultura embrionilor zigotici este total diferită de ceea ce înseamnă cultura embrionilor
somatici!
Cultura de rădăcini izolate, presupune cultura pe mediu nutritiv, în condiţii aseptice şi
controlate a rădăcinilor plantelor separat de restul plantei. Acest tip de cultură duce la
formarea unui sistem radicular ramificat. Cultura de rădăcini izolate este total diferită de
ceea ce înseamnă cultura de rădăcinuţe lînoase (hairy roots), care sunt ţesuturi tumorale
foliare sau caulinare!

Creşterea neorganizată
Existenţa plantelor superioare depinde de alocarea organizată a unor funcţii specifice pentru
fiecare parte a organismului. Aceste părţi devin diferenţiate, adică pentru îndeplinirea unor activităţi
specifice sunt modificate şi funcţionează diferit.
Creşterea neorganizată nu se găseşte frecvent în natură dar poate fi realizată cu succes în condiţii
de cultură in vitro prin plasarea unor fragmente vegetale pe un mediu special. Ţesutul care rezultă în urma
creşterii pe acest tip de mediu nu conţine nici o structură vegetală care să poată fi identificată, conţinînd
doar un număr limitat de celule specializate sau diferenţiate tipice plantei întregi. O celulă diferenţiată este
o celulă care a dezvoltat o formă (o morfologie specifică) sau/şi funcţie (fiziologie specializată). Un ţesut
diferenţiat (de exemplu epiderma) este agregarea mai multor celule diferenţiate. Obţinerea separată doar a
unui tip de celule diferenţiate este greu de realizat deoarece formarea lor în cultură poate fi controlată
numai pe o durată limitată de timp, adică nu putem menţine şi multiplica, pe o durată nedeterminată în
timp, o cultură alcătuită strict numai din celule epidermale (de exemplu). Ţesuturile neorganizate însă
permit menţinerea lor, prin transfer repetat pe un mediu nutritiv, pe o durată foarte lungă de timp.
Procesele de diferenţiere care sunt induse in vitro pot fi studiate pentru descrierea botanică a
formării organelor distincte în timpul morfogenezei.
Cele mai importante tipuri de culturi neorganizate sunt:
cultura de calus (ţesut), reprezintă creşterea şi menţinerea unei mase mari de celulare
neorganizate care rezultă din creşterea coordonată sau dezorganizată a unor organe
vegetale mici, părţi de ţesut vegetal sau culturi de celule inişiate anterior
cultura de suspensii celulare (celule), reprezintă creşterea unor populaţii de celule şi
agregate celulare mici, 20-100 celule, dispersate într-un mediu lichid şi în condiţii de
agitare continuă pe platformă rotativă orizontală
cultura de protoplaşti (cîte o singură celulă) reprezintă cultura unor celule vegetale
izolate ca urmare a îndepărtării temporare a peretelui celular
cultura de antere (grăunciori imaturi de polen), reprezintă cultura anterelor întregi care
conţin microspori imaturi de polen în scopul obţinerii de plante haploide prin formarea
embrionilor somatici direct din polen. Cultura de polen este cea obţinută prin creşterea
polenului scos din antere.
C3 Compoziţia mediului de cultură şi rolul componentelor sale

În corpul plantei s-au dezvoltat funcţii specializate ale diferitelor tipuri de ţesuturi, care
interacţionează pentru a asigura creşterea şi dezvoltarea organismului ca întreg. În culturile de părţi,
organe,ţ esuturi sau celule vegetale separate de corpul întreg al plantei mamă creşterea autotrofică nu mai
poate fi realizată astfel încît funcţiile părţilor lipsă trebuie asigurate de mediul nutritiv. Săruri, vitamine,
aminoacizi, fitoregulatori de creştere , zaharuri sunt componentele mediului de cultură care asigură una
sau mai multe funcţii pentru creşterea plantelor in vitro. Fiecare specie vegetală, ţesut sau tip particular
de cultură are o altă formulă de optim pentru alcătuirea sa. Găsirea formulei de mediu optime pentru
cultură reprezintă parte din arta şi ştiinţa culivării materialului vegetal in vitro.
În reuşita cultivării explantelor vegetale pe medii aseptice, un rol important revine compoziţiei
chimice a mediilor de cultură (a naturii elementelor prezente în substrat, proporţia lor şi compuşii sub care
ele sunt administrate), epuizării preferenţiale a unor compuşi din mediu sau a concentrării acestora,
fenomene ce duc la instalarea unor manifestări de carenţă, de toxicitate, soldate uneori, chiar cu
necrozarea inoculilor.
Încă din momentul efectuării primelor încercări de cultivare pe medii aseptice a explantelor
vegetale pe baza cercetărilor de nutriţie s-au făcut tatonări pentru elucidarea rolului jucat de către diferite
elemente chimice, compuşi şi concentraţiile optime în care trebuie să fie prezente acestea în mediile de
cultură. Mediile de cultură sunt concepute astfel încît să asigure creşterea explantului într-un spaţiu total
artificial. Faţă de mineralele obişnuite găsite şi în sol, pentru cultura in vitro substratul nutritiv trebuie să
conţină şi compuşi organici cum sunt vitaminele, regulatori de creştere şi o sursă de carbon.

Substanţe anorganice
Poate cea mai consacrată şi utilizată formulă de mediu de cultură este MS, formulă realizată de
Murashige şi Skoog în 1962. Acest mediu a fost realizat prin analiza compuşilor anorganici din plantele de
tutun, compuşi care apoi au fost testaţi, prin adăugarea experimentală în compoziţia substratului nutritiv în
doze asemănătoare celor găsite în plante.

Macroelementele
Elementele chimice de bază care intră în structura materiei vii sunt: C, O, H, N, S, P, K, Mg, Na,
Cl, Al, Fe. Aceste elemente asigură cca 99,9 % din materia vie.
Cele mai întîlnite macroelemente în formulele de mediu sunt: calciu (Ca), magneziu (Mg), azotul (N),
fosforul (P), potasiu (K) şi sulful (S). Prezenţa lor este indispensabilă plantelor crescute pe medii de cultură
datorită rolului lor structural şi funcţional în sinteza proteinelor (N şi S), sinteza nucleotidelor (P, N, şi S),
sinteza peretelui celular (Ca), co-factor enzimatic (Mg) şi integritatea membranei celulare (Mg). Sărurile
utilizate pentru prepararea mediilor de cultură trebuie să prezinte un înalt grad de puritate.

Calciul. Calciul funcţionează ca şi co-factor pentru majoritatea enzimelor şi are un rol de o


importanţă particulară în procesele de sinteză a peretelui celular. Carenţa în calciu în mediile de cultură
duce la necrozarea vîrfurilor de creştere prin provocarea unor tulburări grave în ţesuturi, iar suprimarea din
mediu duce la moartea celuleor în cca două luni. La prepararea mediilor de cultură, calciul se foloseşte în
cantităţi de 1-3 mM, sub formă de clorură de calciu sau nitrat de calciu.

Magneziul. Magneziul este un element critic pentru funcţionarea enzimelor şi totodată este un
compus integral al moleculei de clorofilă. În corpul plantei cationul de magneziu echilibrează ionii
negativi. În mediul de cultură se utilizează în concentraţii asemănătoare clor de calciu, sub formă de sulfat
de magneziu.

Azotul. Prezenţa azotului este esenţială pentru creşterea şi viaţa plantelor. Majoritatea azotului
anorganic este convertit în aminoacizi şi apoi în proteine. Azotul necesar culturilor in vitro se asigură pe
două căi: săruri anorganice şi/sau organice. Azotul anorganic este reprezentat de ionii de amoniu şi nitrat.
Ionul de nitrat (NO3-), care are rol oxidant, se dă în concentraţii de 25-40 mM, iar cel de amoniu (NH4+), cu
rol reducător, se dă în concentraţie de 2-20 mM, sub formă de săruri anorganice. Plantele prezintă o
creştere mult mai bună în prezenţa ambelor forme de ioni, dar mai ales în medii de cultură slab tamponate
este necesară utilizarea ambelor forme, fiind asigurată astfel menţinerea valorii stabile a pH-ului. Cînd se
administrează numai ioni de amoniu acesta are un efect toxic. În mediul de cultură valorile concentraţiei de
azot anorganic sunt cuprinse între 25-60 mM
Azotul se poate asigura şi sub formă organică ca aminoacizi cum sunt: glicina (2mg/l), l-
glutamină, asparagină, tirozină (100mg/l), l-arginina sau cisteina (10 mg-l), hidrolizate (cazeina hidrolizată
0,02-0,1%) sau acizi organici. Formele organice sunt utilizate mai ales cînd nu se administrează amoniu.
Avantajul utilizării formulelor organice este dat de faptul că majoritatea formelor sunt deja reduse la forme
tipice din plante, astfel că pot fi asimilate la nivel celular cu mare uşurinţă. Prezenţa aminoacizilor pot avea
şi rol inhibitor astfel încît trebuie utilizaţi cu atenţie, mai ales în mediile destinate stimulării formării de
calus. Formele organice nu pot înlocui total prezenţa formelor anorganice.
Fosforul. Fosforul este necesar datorită faptului că face parte integrantă din acizii nucleici şi alţi
compuşi structurali. Obişnuit este utilizat sub formă de fosfaţi (PO 4-) cu valori cuprinse între 1-3 mM. În
exces, fosforul are efect toxic.

Potasiul. Potasiul reprezintă majoritatea ionilor pozitivi din plantă avînd rol în schimburile de ioni
prin echilibrarea ionilor negativi. Valorile de potasiu cerute de plante diferă foarte mult în funcţie de specie.
În general prezenţa lui în mediul de cultură este corelată cu concentraţia de nitraţi fiind utilizat la valori de
10-30 mM. Carenţa potasiului duce la necrozarea ţesuturilor, iar excesul stimulează evoluţia doar a unor
ţesuturi.

Sulful. Sulful este esenţial în structura proteinelor, prezenţa lui fiind critică în sinteza
aminoacizilor pe bază de sulf. Sulful prezintă valoare nutritivă diferenţiată, astfel că şi sulfiţii sunt mai
asimilabili decât sulfurile. Se dă în concentraţii de 1-3 mM, sub formă de ion de SO4- în asociaţie cu
magneziul şi rar înpreună cu ioni de amoniu.Carenţa de sulf induce o clorozare a ţesuturilor in vitro, iar
excesul de sulf exercită un efect toxic care produce necrozarea ţesuturilor.

Microelemente
Microelementele cele mai utilizate în mediile de cultură sunt: borul (Bo), manganul (Mn), cuprul
(Cu), iodul (I), fierul (Fe), molibdenul (Mo), zincul (Zn), nichelul (Ni), cobaltul (Co), aluminiul (Al), etc.
Microelementele sunt indispensabile, exercitând un rol special asupra ţesuturilor vegetale,
constituind co-factori enzimatici esenţiali plantelor (citocromoxidaza, peroxidaza). Se administrează de
ordinul µM. Suprimarea lor din mediu determinã reducerea creşterilor cu 40% la primul transfer,
determinând la cel de-al treilea transfer moartea celulelor. Între ionii din mediul de culturã se stabilesc
anumite interactiuni si chiar substituiri. Unele substante chimice pot imobiliza unii ionii sau pot provoca
precipitarea unor sãruri.

Borul (Bo). Borul este un element esenţial în activitatea enzimatică legată de biosinteza ligninei şi
metabolismul acizilor fenolici.. Se dă sub formă de acid boric iar carenţa lui duce la moartea meristemelor
şi a vîrfurilor de creştere.

Manganul (Mn). Prezenţa lui este necesară în reacţiile enzimatice, în mod special în procesele
respiratorii şi de fotosinteză dar şi în cresterea rãdãcinilor, fiind implicat si în sinteza proteicã. Se dă sub
formă de sulfat cu valori între 5-30 µM.

Cuprul (Cu). Cuprul, administrat sub formă de sulfat cupric, are rol în creşterea rãdãcinilor. La
nivel celular, prezenţa lui, deşi în cantităţi extrem de mici (0,1µM), este un factor critic în reacţia multor
enzime, înclusiv în sistemul de oxidare al citocromului. Excesul de cupru este toxic.
Iodul (I). Efectul iodului diferă în funcţie de specie. Deşi nu este un element esenţial se adaugă în
mediul de cultură deoarece stimulează creşterea rădăcinilor şi a culturilor de calus.

Cobaltul (Co). Nici acest element nu este esenţial în fiziologia plantei dar se regăseşte în
majoritatea mediilor de cultură destinate unei palete largi de aplicaţii. Se dă în concentraţii asemănătoare
celor ale cuprului (0,1 µM) iar în concentraţii mari poate fi toxic.

Fierul (Fe) Fierul este implicat în sinteza proteicã si intrã în compozitia unor metalo-enzime.
Prezenţa fierului, în concentraţie de 1µM, este necesară atît pentru sinteza clorofilei cît şi pentru majoritatea
reacţiilor de oxidare şi reducere. Aspectul cel mai important legat de prezenţa fierului îl reprezintă
menţinerea valorii optime a pH-ului în mediul de cultură, astfel încît ionii de fier să fie uşor asimilaţi de
celulele vegetale. Pentru stabilizarea ionilor de fier sunt utilizaţi agenţii de chelatizare, compuşi care leagă
ionii metalelor, ionii devenind astfel mult mai accesibili ţesuturilor vegetale la valori diferite ale pH-ului.
Marea problemă în adăugarea fierului este dată de formarea compuşilor insolubili în mediile cu valori
alcaline, fenomen evident mai ales în mediile lichide. Deşi există mai multe tipuri de agenţi de chelatizare,
la culturile in vitro cel mai folosit este forma potasică sau sodică a acidului etilen-diamino-tetra-acetic
(EDTA). Acesta prezintă avantajul că, faţă de alţi chelanţi, nu este toxic şi poate fi folosit la valori variabile
ale pH-ului (pînă la pH 8,0). Fe-EDTA-ul poate fi cumpărat ca atare sau poate fi preparat din sulfatul feric
(FeSO4·7 H2O) şi Na2EDTA.

Molibdenul (Mo). Molibdenul este co-factor a două enzime implicate în procesul de transformare
a nitraţilor în amoniu şi are acţiune pozitivă asupta ritmului de creştere al celulelor. Se dă sub formă de
molibdat de sodiu în concentraţii mici (1 µM).

Zincul (Zn). Prezenţa zincului este necesară în activitatea multor enzime şi joacă un rol esenţial în
dezvoltarea cloroplastelor. În mediul de cultură, concentraţia de zinc diferă destul de mult, avînd valori
cuprinse între 5-30 µM şi nu are efect toxic la concentraţii mai mari. Cea mai folosită formă de
administrare este cea de sulfat de zinc.

Nichelul (Ni), aluminiul (Al) şi siliciul (Si) nu au rol esenţial în creşterea şi dezvoltarea plantelor
in vitro şi de aceea se găsesc mai rar în formulele de mediu de cultură.

Compuşi organici
Există o diversitate de compuşi organici care sunt utilizaţi la preopararea mediilor de
cultură. Compuşii organici au rol în creştere (zaharurile) şi pentru stimularea evidentă a proceselor de
creştere celulară (vitaminele, compuşii organici nedeterminaţi şi acizii organici).
Carbonul organic

Datoritã faptului cã celulele inoculilor nu sunt complet autotrofe menţinerea lor în viaţã depinde
de prezenţa unei surse de carbon, de tipul glucidelor, alcoolilor sau a acizilor organici.
Zaharurile servesc ca sursă energetică pentru ţesuturile şi plantele crescute in vitro.
Glucidele se adaugã în concentratiile de 1,2-8% în anumite experimente se pot utiliza si fructozã
,glucoză, maltozã , arabinozã .
Dintre alcooli , eficient s-a dovedit glicerolul (polialcool) , în unele cazuri putându-se adãuga si
mezo – inozitol (alcooli ciclici).
Acizii organici de tipul acizilor :fumaric , succinic ,si citric au un rol
favorabil în crestere desi au o valoare energeticã mai micã decãt cea a zaharozei.

Vitamine
Vitaminele sunt indispensabile unei multiplicãri şi creşterii optime
Tiamina (vitamina B1) - stimuleazã creşterea biomasei celulare şi tisulare.
Piridoxina (vitamina B6 ) - este precursorul unor enzime .
Vitamina C se recomandã ca agent antioxidant
Ciancobalamina se foloseşte în cazuri foarte rare.
Biotina este stimulator în proliferarea celulelor.
Acidul nicotinic influenţează dezvoltarea celulară.
Se mai folosesc : riboflavina, acidul pantotenic.

Mezo-inizitolul

Apa
Apa este solvent pentru substanţele hidrofile, asigurînd mediul de dispersie pentru coloizii
organitelor celulare. Calitatea apei utilizată la prepararea mediilor de cultură este un factor deosebit de
important. Apa utilizată trebuie să fie distilată sau bidistilată. În unele situaţii este necesară utilizarea apei
pure (apă distilată, sterilizată prin autoclavare şi apoi filtrată prin filtru Millipore. Apa distilată se păstrează
în recipiente bine închise pentru evitarea solvirii CO2 şi scăderea pH-ului.

Fitohormonii
Fitohormonii ocupă poziţii cheie in procesele de multiplicare celulară şi în creşterea acestora, în
general şi în sinteza plantelor cormofite in special.
Biogeneza fitohormonilor este localizată de regula în alte organe decît organele ţinta. Din locurile
de sinteză ei sunt translocate spre ţesuturile apte de a recepţiona semnale si de a reacţiona la stimuli primiţi,
ei determină producerea unor răspunsuri: biochimice, fiziologice, morfologice.
Celulele responsabile de biogeneza fitohormonilor, trebuie sa deţină un sistem enzimatic adecvat
sintezei sau deblocării căilor metabolice, responsabile de asigurarea manifestării integrale a activitaţii
fiecărui compartiment biomolecular.

Tip de fitohormon Funcţiile de bază Locul sintezei


AUXINELE Stimulează alungirea celulară; sunt implicate în În meristemele mugurilor
fototropism, gravitropism, dominanţa apicală, apicali, embrion, frunze
diferenţiere vasculară; stimulează sinteza tinere
etilenei şi induce formarea rădăcinilor
adventive la butaşi
CITOCHININELE Stimulează diviziunea celulară, contracarează În rădăcini şi
dominanţa apicală, implicate în creşterea transportate la alte
tulpinii, prelungeşte succesiunea frunzelor organe
ACIDUL Stimulează alungirea tulpinilor, stimulează În meristemele mugurilor
GIBERELINIC înflorirea la speciile bienale, reglementează apicali şi radiculari,
producţia enzimelor hidrolitice la cereale frunzele tinere, în
embrion
ACIDUL ABSCISIC Inhibă creşterea, stimulează închiderea În frunze, tulpini şi
stomatelor, menţine starea de repaus fructele verzi
ETILENA Stimulează coacerea fructelor, determină În ţesuturile fructelor
senescenţa frunzelor şi a florilor, precum şi coapte, nodurile
căderea lor caulinare, frunze şi flori
senescente

Alţi aditivi la mediul de cultură


Suplimenţi organici complecsi
Partea voodoo a mediilor de cultură este asigurată de cantităţi necunoscute a unor compuşi
complecsi, substanţe provenind din extracte naturale, care deşi nu sunt de dorit a fi folosite neputînd fi
stabilite exact din punct de vedere cantitativ şi calitativ, reprezintă uneori singura cale pentru reuşita unor
culture mai dificile. Aceşti suplimenţi organici sunt:
Laptele de nucă de cocos
Suc de portocale
Extract de drojdie
Extract de malţ
Suc de tomate
Pudră de banane, etc.
Cărbunele activ
La unele specii favorizează creşterea ţesuturilor în culturi de apex şi de antere, deoarece s-a
constatat că pulberea de cărbune absoarbe compuşii toxici rezultaţi în urma degradării zaharozei în timpul
sterilizării prin autoclavare, şi totodată absooarbe fitohormonii prezenţi în mediu. De asemenea, este folosit
ca substanţă antioxidantă.
.
Clasificarea mediilor de cultură
In funcţie de complexitatea formulei chimice: mediu de bază, mediu complex
În funcţie de destinaţia culturii: de iniţiere, de multiplicarede regenerare, de induicere a calusogenezei, de
înrădăcinare, culturi doică, medii cu val osmotică ridicată (pt. protoplaşti) de producţie (elicitatori,
precursori) etc.
În funcţie de tipul de suport asigurat: lichid, solid, în dublu strat, semisolid

Sisteme de suport
Agenţi gelifianţi

Agarul este cel mai comun agent solidificator, utilizat în prepararea mediilor de cultură,
preparându-se din alge roşii ale genului Gellidium şi comercializat sub formă de fibre, solzi sau pulbere.
Agarul fibre sau lamele se pretratează pentru îndepărtarea impurităţilor. Încercările de a înlocui agarul cu
gelatina nu au reuşit deoarece aceasta nu permite aerarea mediului solidificat, schimburile ionice şi
absorbţia substanţelor din mediu este frânată.
Ca agenţi de solidificare a mediului se mai folosesc
Agaroza: o formă pură de agar
Gelrite: un gelifiant sintetic
Phytagel: un substituent de agar sintetizat din gumă gellan. Acest produs nu opacizează mediul de cultură şi
datorită gradului ridicat de transparenţă este recomandată folosirea lui în cazul mediilor pentru studiul
creşterii şi dezvoltăării rădăcinilor.

Biogeluri, silicageluri sau geluri de poliacrilamide.


Suporturi mecanice
C4 C4 Etapele micropropagãrii

Cultura de ţesuturi reprezintă o metodă comercială rapidă de multiplicare a


cultivarelor noi obţinute, a speciilor rare şi a plantelor cu probleme de multiplicare prin
metodele clasice. Datorită cererii tot mai ridicate pentru material vegetal
micromultiplicat, de la cele cîteva laboratoare existente acum cîţiva ani, în prezent
funcţionează o adevărată industrie. Cu toate că încă funcţionează unităţi de producţie care
se ocupă exclusiv de multiplicarea plantulelor, care sunt apoi vîndute mai departe
cultivartorilor, tendinţa generală este ca marile unităţi cultivatoare prin crearea propiului
laborator de micropropagare să-şi includă şi etapa de multiplicare in vitro a materialul
săditor.
In vivo=care creşte în condiţii naturale
In vitro= care creşte în condiţii perfect controlate; în vase de sticlă
Ex vitro= aclimatizat pentru condiţii naturale, provenind dintr-o cultură in vitro

T. MURASHIGE descrie în 1974 etapele succesive care trebuie parcurse


la producerea de plante in vitro, in regim industrial, distingând 3 stadii :
- Stadiul I, de infiintarea culturilor aseptice.
- Stadiul II, de multiplicare si propagare “in vitro” a subiectului
- Stadiul III, de pregatire a plantelor generate “in vitro”, pentru transferarea lor “ex-vitro”

În 1982, din ratiunii de ordin economic, Debergh si Maene recomandă extinderea numărului de
stadii, prin înfiinţarea unui Stadiu 0, premergator explantării, şi subdivizarea Stadiului III, în două
substadii.
Nu există reguli inviolabile pentru propagarea unei anumite specii vegetale prin culturi de ţesuturi
şi adesea este necesară ajustarea şi reajustarea compoziţiei mediului, a ambientului şi chiar a habitatului
astfel încât culturile să poata fi determinate să pornească în creştere şi dezvoltere.
Pentru obiectivele micropropagării poate fi descrisă o schemă ce cuprinde cinci etape de bază:
Etapa 0 de pregŕtire a materialului biologic
Etapa 1 de iniţiere a culturii “in vitro”
Etapa 2 de micropropagare
Etapa 3 de pregătire a plantulelor şi de înrădăcinare în vederea aclimatizării
Etapa 4 de aclimatizare.
Etapa 0 se referã la pregatirea plantelor - mame donoare de explante; Ele trebuie crescute in conditii
speciale de cultura, in spatii protejate, la temperatura de 25°C , in umiditatea atmosferica de 70%; plantele
vor fi udate numai la nivelul solului . Astfel, se obtine cresterea considerabila, a numãrului de inoculi
necontaminati . De regula - procentul de inoculi necontaminati nu depasea 50% .
Etapa 1 de iniţiere a culturii "in vitro"
Înfiinţarea culturii constă în exploatarea sau dimensionarea fragmentelor din care vor fi înfiinţate
culturile sau porţionarea inoculilor (calus, culturi de celule ori a suspensiei de protoplaşti) şi în introducerea
acestora în mediu, asigurând pe tot parcursul operaţiilor condiţii de asepsie totală.
În această etapă se practică - selectarea cu responsabilitate a materialului vegetal şi a explantului,
ales ca iniţiator al culturii, a mediilor de cultură şi a condiţiilor de incubare a inoculilor cu menţiunea că o
atenţie cu totul specială trebuie acordată momentului sterilizării materialului biologic. De asemenea este
importantă spălarea la jet de apă, timp îndelungat a materialului biologic donator de explante astfel
obţinându-se bune rezultate în întemeierea culturii aseptice la materialele biologice dificile. Această etapă
de iniţiere a culturii are o durată mai lungă de cca. 6 luni, în dependenţă cu materialul biologic cu care se
lucrează.
Alegerea metodei de pretratament a plantei care urmează să fie propragată "in vitro", în cazul
multor specii reprezintă o etapă esenţială de care depinde succesul sau insuccesul fazei de iniţiere a culturii
"in vitro".
Se iau în considerare următorii factori:
Gradul de contaminare a materialului de pornire;
Când explantele necesare iniţierii unei culturi sunt recoltate din părţi mature ale plantei
sunt necesare procedee foarte complicate de sterilizare.
Etapa 2 de Micromultiplicare
Multiplicarea ţesuturilor cultivate "in vitro".
Multiplicarea explantelor este un stadiu crucial pentru propagarea speciilor, în scopuri comerciale
şi, mai ales, când este cerută o rată rapidă de multiplicare.
Cel mai adesea, mediul standard de creştere este suplimentat cu citochinine, de obicei BAP sau
chinetină. Există cazuri când se înregistrează un efect negativ la aplicarea citochininelor în concentraţii
mari recomandate pentru sporirea ratei de multiplicare. În general, datorită habituării ţesuturilor vegetale la
aplicarea citochininei, apar probleme serioase. În acest caz există posibilitatea alternării diferitelor tipuri de
citochinine, ce de exemplu, folosirea didiazuronului, cu efect superior faţă de BAP la speciile de Malus,
dând o rată mai mare de multiplicare şi mai puţine, probleme în stadiile următoare.
Alţi factori care afectează rata de multiplicare includ intensitatea luminoasă, tipul de agar şi
cantitatea care se foloseşte, orientarea explantului pe mediu de inducţie.
3. Etapa de inradacinare
Etapa de înrădăcinare, se referă la unele modificări în compoziţia mediului de cultură si la
schimbarea condiţiilor de cultură. Dacă în etapa II au predominant auxinele iar citochininele au fost
absente din substratul de cultură sau adăgate în concentraţii foarte mici, sau chiar au lipsit hormonii in
totalitate, in etapa III se recomandă reinstalarea dominaţiei apicale la nivelul tulpinilor generate "in vitro"
si inrădăcinarea acestora. Exista 3 căi de abordare a etapei III.
1. cultura poate fi transferată pe medii care să permită alungirea lăstarilor: după care vor fi
recoltaţi si vor fi subcultivaţi pe un mediu proaspăt, pregătit pentru facilitarea rizogenezei la nivelul
minibutaşilor .
2. inoculii vor fi divizaţi prin fragmentarea culturii in unităţi care să deţină o capacitate
regenerativă rapidă -în propagule care apoi vor fi subcultivate, pentru a determina formarea de rădăcini, in
vederea transferării culturii "ex-vitro".
3. tulpiniţele derivate din Stadiul II, vor fi înrădăcinate "in vitro", pe medii agarizate, avănd o
balantă hormonală adecvată acestui scop.
Regenerarea de plante întregi din ţesuturi propagate "in vitro", în mod obişnuit, înseamnă
producerea de rădăcini, proliferarea ramurilor axilare.
Obţinerea înrădăcinării la unele specii se realizează prin reducerea concentraţiei de citochinine, în
prezenţa sau absenţa auxinelor, în special AIB (0,02 – 0,5 mg/l). Acest tratament poate fi folosit cu succes
în combinaţie cu reducerea componenţei ionice a mediului MS, cu jumătate din concentraţia nitraţilor. La
unele specii pentru stimularea înrădăcinării mediile pot fi suplimentate cu cărbune activ sau ascorbat,
tratament care nu este însă de rutină.

Etapa 4 de aclimatizare şi transferul la condiţiile ex vitro.


Plantele crescute în condiţii "in vitro" se adaptează la mediul artificial în diferite moduri. Forma
cea mai extremă o reprezintă vitrificarea ţesuturilor vegetale, ceea ce face ca materialul respectiv să nu fie
potrivit pentru transferul direct la condiţiile ex vitro. În acest caz, o perioadă de pregătire postregenerativă
este necesară pentru asigurarea supravieţuirii ex vitro a ţesuturilor cultivate "in vitro".
Cerinţele sunt, în general, asemănătoare pentru majoritatea speciilor. În condiţii
"in vitro" plantele cresc într-un mediu cu un înalt grad de umidiate, ca urmare
pentru aclimatizare a devenit o rutină folosirea camerelor izolate sau a sistemului
de ceaţă artificială. Umiditatea relativă este menţinută la un nivel relativ ridicat,
80%, atât în timpul zilei cât şi în timpul nopţii.

Este esenţială o spălare a rădăcinilor plantelor cultivate "in vitro" pentru îndepărtarea oricărui
reziduu de mediu, care reprezintă o excelentă sursă nutriţională pentru bacterii. Este indicată o fertilizare
cu un conţinut ridicat de fosfor, în special în primele stadii ale aclimatizării. Când umiditatea este foarte
mare, este necesară folosirea fungicidelor.
Cel mai critic factor în momentul şocului de adaptare îl constituie în opinia lui De Fosard,
funcţionarea maximă a rădăcinilor.Este necesară de asemenea protejarea tulpiniţelor impotriva uscăciunii
atmosferice. Acest stadiu poate fi prelungit, uneori, pănă la 4 luni . În consecinţa o deosebită importanţă
trebuie acordată momentului transferarii plantulelor din condiţiile in vitro, în condiţii naturale de viată,
precum şi modului în care se realizează această trecere, respectiv realizării unei acomodări treptate a
neoplantulelor, la condiţiile mediului septic.
Şansele de supravieţuire sunt determinate de pierderile prin transpiraţie, datorită lipsei stratului de
ceară şi a activităţii aproape inexistente a stomatelor. Anterior transferarii, plantulele trebuie calite la un
regim de viata mai sarac in umiditate. S-a observat că reducerea umidităţii relative la 80% faţă de
maximum cât este recomandat la unele specii este suficientă pentru a asigura formarea stomatelor
funcţionale şi acoperirea cu un strat de ceară suficient pentru asigurarea reducerilor, pierderilor de apă.
Această reducere a umidităţii relative se realizează prin deschiderea parţială a vasului sau prin răcirea bazei
vasului cu 2-3ºC sub temperatura aerului.
Pentru a mări şansele de supravieţuire se recomandă supunerea plantelor - prealabil deschiderii
recipientelor de cultură - la un regim special de lumină sau de temperatură prin ridicarea de cca.3-10 ori a
intensitaţii luminoase, in raport cu lumina din camera de creştere, din perioada dezvoltării inoculilor.
Intensitatea luminoasă, in funcţie de specie, va creste la 8-10 mii lucşi . Uneori, se recomandă aplicarea
unor şocuri termice, ori schimbarea fotoperioadei; în unele cazuri, se impune transferarea plantulelor de pe
medii lichide, pe medii solide, respectiv schimbarea calitaţilor fizice ale substratului de cultură, ori ale
compoziţiei chimice - hormonale - a mediului de cultură.
Procentul de supravieţuire in momentul trecerii plantulelor din condiţiile "in vitro", in mediul
septic, depinde de realizarea acomodării plantelor la noile condiţii şi în special de protejarea de stres
hidric, insolatie, extreme termice si curenţii de aer. Plantele vor putea fi cultivate după metodele
agrotehnice normale abia după acomodarea acestora la condiţiile septice.

C5 Embriogeneza somatică. Seminţe artificiale

Obţinerea de seminţe artificiale


Embriogeneza: reprezintă procesul iniţierii şi dezvoltării unui organism. Se
distinge faţă de organogeneză prin faptul că rezultă o structură autonomă care nu mai
are legătură prin intermediul sistemului vascular, cu nici o altă structură iniţială. În
practică, termenul include toate procesele (mai mult sau mai puţin sincrone) de
dezvoltare a celor doi poli: apical şi radicular.

Embriogeneza somatică: reprezintă procesul prin care, pornind de la celule somatice,


fără legătură vasculară cu ţesutul de origine, se formează o structură bipolară
asemănătoare embrionului zigotic. Embrionii somatici se pot diferenţia dintr-un
explant vegetal atât direct, din celule somatice organizate cât şi indirect, prin trecerea
printr-o fază de calus.
Organele plantelor se caracterizează prin anumite trăsături comune şi anume: structura
celulară şi tisulară (substratul material şi sediul proceselor biochimice), caracterul
sistemic al organelor, polaritatea, simetria, orientarea în spaţiu şi regenerarea. Caracterul
sistemic este dat de alcătuirea acestora din ansambluri de ţesuturi specifice, subordonate
activităţii biologice proprii organismului şi subordonarea fiziologică a organelor în cadrul
organismului în ansamblul său, ceea ce asigură realizarea funcţiilor sale biologice.
Polaritatea este dată de deosebirea morfologică şi fiziologică între baza plantei şi vârful
ei. Această trăsătură prezintă o importanţă deosebită în procesele de microbutăşire
deoarece indiferent de poziţionarea unui butaş, rădăcinile adventive se vor forma numai
la bază, crescând în jos, iar lăstăririle numai în partea superioară, crescând în sus.
Simetria, necesară pentru menţinerea echilibrului plantei în asigurarea verticalităţii se
realizează de la bază (cazul rozetelor de frunze) sau pe tulpina plantei.

Precondiţiile morfogenezei vegetale


Totipotenţialitatea celulară
Competenţa de regenerare
potenţialul pentru diviziune
efectul de poziţie
predispoziţia

Totipotenţialitatea celulară
La începutul secolului XX, Gottlieb Haberland (1902) a experimentat cultura
celulelor de tip mezofilian pe un mediu de cultură. Deşi celulele cultivate nu au intrat în
diviziune, acest experiment este important pentru fundamentarea teoriei totipotenţialităţii
celulei vegetale. Totipotenţialitatea celulară se defineşte ca fiind capacitatea genetică a
celulelor vegetale individuale, nucleate, de a regenera un organism vegetal întreg,
structural şi funcţional, în mod direct sau prin intermediul unei faze de calus.
Teoretic, toate celulele somatice sunt totipotente (Steward et al., 1958; Steward,
1968), dar practic există diferenţe mari între diversele tipuri de celule, speciile vegetale,
gradul de dezvoltare a celulelor de acelaşi tip, etc. În stadiul diferenţiat al celulei,
expresia capacităţii totipoţenţei se numeşte competenţă morfogenetică. Incapacitatea unor
specii/grenotipuri de a manifesta totipotenţa celulară este confundată adesea cu lipsa
capacităţii de regenerare. Expresia variabilă a acestei competenţe este doar rezultatul
gradului de specializare şi a statutului fiziologic al celulei respective sau a incapacităţii
cercetătorului de a identifica condiţiile de cultură optime cerute de acest proces.

Competenţa de regenerare
Într-un organism vegetal intact, la nivelul celulelor înalt specializate, nu mai apar
niciodată schimbări, întrucât prin ultraspecializarea lor acestea îşi pierd capacitatea de a
forma plante noi şi deci, aceste celule nu pot deveni morfogenice. Unele celule îşi
păstrează capacitatea pentru diferenţieri particulare sau pentru morfogeneză, sau pot
dobândi această capacitate ca răspuns la un stimul adecvat; acest tip de celule se numesc
celule competente.
Competenţa reprezintă prima condiţie a unei celule spre morfogeneză, adică de a
urma o cale de dezvoltare definită.
In vitro competenţa de regenerare este influenţată direct de genotip (genele
nucleare, genele citoplasmatice şi genele de interacţiune), faza ontogenetică a explantului
iniţial precum şi de condiţiile de cultură (mediul şi factorii fizici) aleşi. Toţi aceşti facori
sunt folosiţi în stabilirea unui răspuns morfogenic, relativ comun, în cadrul unei specii
vegetale.

potenţialul pentru diviziune- reprezintă precondiţia esenţială în


alegerea explantului iniţial, fiind definit de prezenţa unei capacităţi de
diviziune ridicată şi o plasticitate morfogenetică pronunţată
efectul de poziţie – în 1878 Vöchting sublinia importanţa poziţiei unei
celule în organism demonstrând că destinul ei este în funcţie de poziţia
sa (teoria proximităţii celulare). Deşi toate celulele specializate sunt
derivate dintr-o celulă iniţială (celula ou) nediferenţiată, dar care se
divide, forma şi polarizarea celulelor, a ţesuturilor şi respectiv, a
organelor vegetale ale unui organism, este stabilită încă din faza
embrionară. Stadiul de diferenţiere odată fixat, are un rol determinant
în evoluţia ulterioară a explantului prelevat. Astfel, explantele
prelevate din partea inferioară formează muguri vegetativi (lăstari) în
proporţie de 100 %, explantele din zona mediană formează muguri în
procent de aproximativ 25 % care evoluează spre lăstari floriferi iar
explantele prelevate din zona floriferă, sunt capabile să regenereze, pe
substratul de cultură, direct structuri florale.
predispoziţia- este realizată prin utilizarea ţesuturilor tinere, aflate în
creştere (de exemplu agregate celulare friabile periclinale, celule mari
nediferenţiate din coleoriză, mezocotil, apex radicular, etc.).
Organogeneza ca proces de dezvoltare
La modul general, dezvoltarea este procesul care rezultă într-un organism normal,
matur şi funcţional. Dezvoltarea cuprinde “toate evenimentele din timpul vieţii unui
organism care au ca scop realizarea corpului organismului în forma sa capabilă de a
exercita funcţiile vitale de nutriţie şi reproducere, de a folosi oportunităţile pentru a face
faţă evenimentelor de hazard din timpul vieţii” (Fosket, 1994). Organogeneza este un
proces de dezvoltare unic în lumea vegetală. Celulele animale urmează calea de
dezvoltare într-un mod ireversibil al diferenţierii spre un ţesut sau celule specifice
deoarece, în lumea animală mitoza duce la formarea a două celule fiice identice ca
urmare a separării celulelor prin formarea unei cute a membranei. (Rappaport, 1986). Cu
alte cuvinte, celulele animale şi ţesuturile rămân din punct de vedere structural şi
funcţional la forma la care au fost programate din momentul iniţierii dezvoltării. Spre
deosebire de celulele animale, celulele vegetale pe tot parcursul vieţii îşi păstrează
capacitatea de a se dediferenţia din structura şi funcţionarea lor curentă şi să înceapă o
nouă cale de dezvoltare care să sfârşească în structuri morfogenetice complet diferite.
Mitoza în celulele vegetale este un proces al diferenţierii interne a citoplasmei (Peters et
al., 2000); aceasta se poate datora şi faptului că formarea plăcii mediane în nucleu, în
timpul separării nucleelor fiice, se face într-o manieră centrifugală; materialul necesar
noului perete este furnizat de aparatul Golgi. Această manieră de separare, specifică
celulelor vegetale, permite menţinerea unor pori (deschideri) la nivelul plasmodesmatei
(Krager şi Monzer, 1998), deschideri prin care are loc mişcarea unor macromolecule
(McLean et al., 1997) şi chiar nuclei şi plastide (Zhang et al., 1990), celulele fiice
menţinând astfel o legătură informaţională cu celula mamă, continuitate simplastică
indispensabilă dezvoltării şi specializării celulelor (Lucas et al., 1993).
Fragmentele de ţesuturi vegetale cultivate in vitro pot produce, pornind de la una sau
mai multe celule, numeroase tipuri de primordii de novo, inclusiv de tipul acelora care se
vor diferenţia în embrioni, flori, frunze, lăstari şi rădăcini. Celulele din care se vor forma
plantule de novo sunt stimulate pentru a iniţia o serie de diviziuni celulare rapide care
au ca scop formarea unor agregate celulare de tip meristematic , denumite
meristemoizi. Termenul de meristemoid a fost introdus în anul 1966 de către Torrey şi
defineşte o masă sferică de 6-24 celule nespecializate mici, izodiametrice, cu perete
celular subţire, fără vacuole, cu nuclei mari şi citoplasmă foarte densă (Thorpe, 1982). În
primele faze de dezvoltare, meristemoizii sunt structuri morfogenice plastice, fiind
capabile să se dezvolte în diferite tipuri de celule primordiale. Această caracteristică de
dezvoltare flexibilă stă la baza folosirii culturilor de celule în sistemele de propagare.
Există două evenimente organogenice care sunt folosite în mod curent pentru propagarea
in vitro. Primul îl constituie regenerarea unui număr mare de meristeme caulinare, etapă
care este urmată de creşterea şi dezvoltarea lor în microbutaşi până la o mărime suficientă
pentru trecerea la al doilea eveniment care constă în inducerea producţiei de meristeme
radiculare de novo. Meristemele morfogenice pot lua naştere pe două căi distincte:
Direct din celulele diferenţiate ale ţesutului proaspăt transferat pe un mediu, fără
proliferarea unor celule nediferenţiate
Din celulele nespecializate, neorganizate şi dediferenţiate ale unei culturi de calus
sau suspensie.
Hicks (1980) a denumit aceste două căi ale morfogenezei ca organogeneză directă
şi, respectiv, indirectă. Cele două metode diferă prin prezenţa sau absenţa unui stadiu de
calus în secvenţierea organogenetică. Metoda care conţine ca fază intermediară
producerea de calus se numeşte organogeneză indirectă.

Organogeneza directă

Explant primar Meristemoid Primordii de organe

Organogeneza indirectă

Calus Meristemoid Primordii de organe


Explant primar
Formarea organelor de novo prin intermediul organogenezei indirecte poate duce
la creşterea posibilităţii de introducere a variaţiei în constituţia cromozomială. De
exemplu, schimburi poliploidice la nivelul celulelor aflate în faza de calus şi astfel, poate
determina apariţia unor organe care să prezinte atât variaţii fiziologice cât şi morfogenice.
Pentru cercetările care sunt dirijate în scopul determinării căilor fizio-chimice a
procesului de organogeneză există un alt motiv care necesită reducerea sau măcar
minimalizarea acestui tip de dezvoltare organogenetică. Prezenţa unui stadiu de calus
aflat în diviziune determină o complicare a analizelor evenimentelor moleculare care
însoţesc şi care pot determina producţia organelor de novo. Grupurile de celule care în
mod particular sunt destinate pentru a deveni organogenice se găsesc într-un număr
relativ redus într-o masă mare de celule de calus aflate în diviziune, ceea ce limitează
foarte mult capacitatea de analiză a fiziologiei şi chimiei specifice acestor celule
(Schwartz şi Beaty, 1996).
Organogeneza directă se realizează fără o fază intermediară de calus, secvenţa
evenimentelor sintezei organelor de novo fiind următoarea:
- explantul de iniţiere
- meristemoidul
- primordiul organului.
Cea mai mare diferenţă dintre cele două căi de sinteză de novo o reprezintă
prezenţa sau absenţa unui stadiu intermediar detectabil de calus. Ţesutul de calus
conţinând celule care au fost diferenţiate în forme mai puţin specializate din punct de
vedere morfologic şi care sunt foarte flexibile schimbărilor, pot servi ca material de
pornire pentru organogeneza de novo. În absenţa unui stadiu intermediar de calus,
celulele prezente în interiorul explantului au capacitatea de a acţiona ca precursori direcţi
ai noului primordiu. (pentru exemple de organogeneză directă sau indirectă pornind atât
de la explante de tip meristematic cât şi nemeristematic, în sisteme diferite de cultură,
vezi Hicks, 1980).
Culturile în care se induce organogeneza sunt folosite ca modele sistem pentru a
determina evenimentele cauzale prin care sunt produse rădăcinile şi tulpinile în mod
direct, iar prin generalizare, de a da răspunsuri proceselor morfogenice. Într-un astfel de
model, procesul de organogeneză este împărţit în câteva faze, conform schemei adaptate
după Christianson şi Warnick, (1985).
competenţă determinare

EXPLANT ORGAN
(regenerare)
dediferenţiere inducere diferenţiere (rediferenţiere)

Punctul de interes în reprezintă cele două faze iniţiale care preced faza de
diferenţiere, adică de pierderea caracterului de specializat. Aceste faze cuprind
evenimente care încep cu dediferenţierea, ceea ce duce la obţinerea competenţei, urmată
de iniţiere care culminează cu stadiul complet de determinare. Diferenţierile morfologice
şi de dezvoltare ale organului nou format pot duce la realizarea structurii funcţionale
dorită. Primele două faze ale modelului presupun evenimente care se desfăşoară înaintea
morfogenezei (Hicks, 1980). Embrionii, meristemele apicale, organele primordiale şi
straturile de celule ale organelor mature sau fragmente complexe ale organelor mature,
chiar organe intacte şi protoplaşti, pot fi folosiţi ca explantele de iniţiere.

Dediferenţierea (după Schwartz şi Beaty, 1996)


Procesul de dediferenţiere presupune reversia spre un stadiu mai flexibil, plastic,
care poate să dea sau nu naştere unui ţesut de tip calus. În cazul organogenezei directe,
celulele competente care nu au produs calus pot fi considerate ca singurele implicate în
formarea organelor progenitoare, ceea ce presupune că aceste celule previn procesele de
dediferenţiere, fie în mod individual, fie în grupuri mici destinate de a produce noi
primordii. Explantele foliare de Convolvulus arvensis L. produc rădăcini şi lăstari prin
intermediul unei căi organogenice indirecte care implică procese de dediferenţiere ce duc
la formarea unei cantităţi limitate de calus din care sunt generate organe noi (Christianson
şi Warnick, 1983). Rezultatul completării acestei prime etape constă în obţinerea
statutului de competenţă a explantului iniţial, statul care se caracterizează prin capacitatea
de a răspunde la stimulii organogenetici. Atingerea nivelului de competenţă de către
ţesutul implicat nu reprezintă totdeauna un proces realizat într-o singură etapă, uneori
fiind necesară o etapă intermediară în care se folosesc fitoregulatorii de creştere. De
exemplu, în cazul calusului de Medicago sativa care a fost cultivat timp de 4 zile pe un
mediu cu o concentraţie relativ ridicată de chinetină şi o concentraţie scăzută de 2,4-D au
fost obţinute rădăcini. Lăstarii sunt produşi când calusul este tratat în acelaşi regim de
cultură, cu excepţia faptului că raportul regulatorilor de creştere este schimbat
(concentraţii mari de 2,4-D şi scăzute de chinetină). Tratamentul cu fitoregulatori de
creştere urmat de transferul pe un mediu lipsit de regulatori de creştere nu este suficient
ca să aducă ţesuturile în faza a doua de iniţiere, fază cerută pentru producerea rădăcinilor
sau a tulpinilor (Walker et al., 1979). Este necesară o anumită mărime cu o limită minimă
de 105 µm, precum şi o mărime minimă a diametrului agregatelor celulare de calus
pentru a fi competente pentru iniţierea morfogenezei.

Iniţierea
“Etape de iniţiere apare în perioada dintre momentul în care ţesutul devine
competent şi momentul în care devine complet determinat pentru a produce primordiile.
Această fază se caracterizează printr-un număr de timpi “fenocritici”, momente care
rezultă din funcţionarea unei căi genice integrate care dirijează procesele de dezvoltare şi
precede diferenţierea morfologică. În 1958 a fost sugerată ideea (Landauer) că anumiţi
stimuli chimici şi fizici pot să întrerupă o cale de dezvoltare determinată genetic, ceea ce
duce la modificarea rezultatului morfogenic care produc apariţia fenotipurilor de tip
mutant. Christianson şi Warnick, în 1984, au identificat câţiva agenţi chimici care
intervin în timpul fazei de iniţiere la Convolvulus arvensis. Agenţii care induc producerea
acestor tipuri de fenotipuri sunt efectivi numai în anumite momente specifice în timpul
etapei de iniţiere, fiind denumiţi elemente-cheie în calea genetică a proceselor de
dezvoltare. Agenţii inductori sau inhibitori specifici de etapă se pare că blochează
anumite căi directe de acţiune a genei sau a produsului genei prin activarea unei gene
control. În sistemul prezentat la Convolvulus arvensis a fost blocată gena de determinare
a iniţierii lăstarului apărând un fenotip modificat de tip calus.
Sfârşitul procesului de iniţiere este definit ca punctul în care o celulă sau un grup
de celule devin complet determinate pentru producerea lăstarilor sau a rădăcinilor.
Practic, acest punct este atins când explantele vegetale pot fi transferate de pe mediul de
inducere al lăstarilor sau rădăcinilor şi transferate pe un mediu de bază fără regulatori de
creştere conţinând doar săruri minerale, vitamine şi o sursă de carbon, cultura având ca
scop producerea organului dorit. În acest moment, ţesutul a încheiat complet procesul de
iniţiere şi poate fi considerat complet determinat pentru organogeneză” (Schwartz şi
Beaty, 1996).
Gradul de competenţă celulară pentru organogeneză variază în funcţie de specie şi
uneori chiar în cadrul speciei. Tipul de ţesut recoltat din planta mamă influenţează radical
organogeneza (la măr, obţinerea de embrioni somatici din frunză este dependentă de
genotip, Welander, 1988). Aceasta sugerează efectul primar şi secundar al unor gene.
Caracteristicile genetice ale ţesuturilor cultivate in vitro sunt direct legate de
comportamentul ţesutului respectiv manifestat ca parte a plantei întregi, (in vivo), dar
răspunsurile morfogenice ale fragmentului separat şi cultivat pe mediu sunt rezultatul
efectului secundar şi a altor gene, activate datorită noilor condiţii de viaţă. Existenţa
acestor mecanisme genetice de control a competenţei celulare poate fi:
- rezultatul unei expresii pleiotropice a genelor care sunt activate numai în
anumite tipuri de ţesuturi, sau
- controlată de secvenţe genice specifice care au un efect comun în toate tipurile
de celule, dar care :
sau sunt exprimate chiar în momentul recoltării explantului
sau nivelul lor de expresie depinde de prezenţa unui anumit grad de dezvoltare a
celulei.
Măsura în care explantul vegetal devine competent şi, eventual determinant, este
în funcţie de condiţii fizice şi chimice la care a fost expus. În cazul culturilor in vitro,
proprietăţile mediului nutritiv sunt asociate cu condiţiile fizice care, amândouă, joacă un
rol esenţial în determinarea semnalelor organogenice. Faptul că mediul de cultură este
elementul-cheie în controlul chimic al organogenezei in vitro ca raport dintre auxinele şi
citochininele prezente în mediu a fost demonstrat de Skoog şi Miller, încă din 1957.
Concluzia lor este că: “interacţiunile cantitative dintre factorii de creştere în special dintre
AIA şi chinetină (auxine şi citochinine) şi între acestea şi alţi factori asigură un mecanism
comun de control al tuturor tipurilor de creştere analizate, de la creşterea în mărime a
celulelor până la formarea organelor.” Pe lângă acestea, variabile precum: lungimea zilei,
calitatea şi cantitatea luminii, vârsta şi mărimea explantului vegetal, genotipul şi nutriţia
minerală sunt câţiva dintre factorii care influenţează capacitatea de regenerare. În absenţa
unor markeri genetici sau biochimici care să indice în mod clar calea de dezvoltare exactă
a explantului primar şi până când vor fi puse la punct metode de dirijare şi programare
genetică a ţesuturilor recalcitrante, singura modalitate de a determina iniţierea
organogenezei într-un ţesut vegetal, rămâne “ghicitul prin tatonare” (Schwarz şi Beaty,
1996).
Diferenţierea
Cea de-a treia etapă în organogeneză o reprezintă faza de diferenţiere, etapă în
care noul organ devine vizibil.
Faza de diferenţiere finală a organogenezei asigură primul moment în care poate
fi observată geneza structurală a noului organ ca rezultat al programului de dezvoltare
început în faza de iniţiere. Prin observaţia microscopică a schimbărilor arhitecturii
histologice interme şi de suprafaţă, care apar în timpul fazei de diferenţiere, pot fi
identificate etapele morfologice ale evenimentelor care apar în timpul procesului de
organogeneză : schimbări morfologice la nivelul suprafeţei explantului, apariţia
meristemoizilor, expansiunea vericală şi orizontală a noii regiuni formate, ieşirea noului
meristem de sub epidermă, primordiile foliare şi, în final, mugurele adventiv nou format.

C. Regenerare prin embriogeneză somatică (nezigotică)

Embriogeneza somatică a fost observată pentru prima dată de Reinert (1958) şi


apoi de Steward şi Mearks (1958). Regenerarea prin embriogeneză somatică se distinge
evident de regenerarea prin meristeme datorită unor caracteristici specifice de dezvoltare
şi anume:
Formarea unui embrion (somatic dar şi zigotic) începe de la o singură celulă şi
trece obligatoriu prin fazele globulară, cordiformă, torpedou şi de maturare (faza
cotiledonală); rezultatul este o structură bipolară, deţinând două tipuri de
meristeme: radicular, la un capăt şi, caulinar, la celălalt capăt, în timp ce
organogeneza dă naştere numai la un singur tip din cele două meristeme.
Embrionii somatici trebuie să îndeplinească obligatoriu criteriul de bază al unei
structuri bipolare, adică formarea unei structuri vasculare proprii şi izolate; în
cazul organogenezei, vasele conducătoare asigură continuitatea legăturii cu
ţesutul original (calusul).
Proteinele specifice care apar în cotiledoanele embrionilor somatici nu au fost
identificate în frunzele regenerate din lăstarii adventivi (Crouch, 1982).

Embriogeneza in vitro, pornind de la celule somatice, trebuie văzută ca o


proprietate generală specifică plantelor superioare. Când embrionii somatici sunt obţinuţi
pornind de la o singură celulă procesele decurg de la omogen şi general spre heterogen şi
particular, fenomenul demonstrând indiscutabil totipotenţialitatea celulară; prezenţa unui
program de dezvoltare foarte bine conservat este înnăscut într-un număr mare de tipuri de
celule. Culturile de celule embriogenice permit ca întreg genomul vegetal să poată fi
manipulat genetic prin tehnicile biologice. Odată ce celulele proliferează, pot fi
modificate genetic, iar plantele regenerate din astfel de celule modificate pot fi
reconstituite plante modificate.

Embriogeneza somatică
Un embrion, zigotic, somatic, (direct sau indus), este definit ca “un individ nou,
rezultat dintr-o singură celulă, care nu are legătură vasculară cu ţesutul mamă” (Haccius,
1978) şi este “stadiul primar multicelular al unui individ, stadiu care are loc înainte de
dezvoltarea structurilor şi a organelor caracteristice a unei specii date. În majoritatea
organismelor, embrionul este o entitate distinctă morfologic care funcţionează ca un
stadiu intermediar în procesul de tranziţie de la viaţa gametofitică la cea sporofitică”
(Gray, 1996). La speciile superioare, tipic este embrionul zigotic, care se dezvoltă în
interiorul seminţei. Acest tip de embrion se formează ca produs al fuziunii gametice, în
urma reproducerii sexuale, fiind denumit embrion zigotic.
Caracteristic speciilor vegetale este faptul că din ţesuturi nediferenţiate pot să
formeze embrioni nezigotici, perfect formaţi morfologic şi funcţional. Deoarece acest tip
de embrioni se formează apomictic (pe cale asexuată), plantulele care se dezvoltă din ei
sunt identice genetic cu planta mamă. Tipurile de celule din care pot să apară astfel de
formaţiuni aparţin diferitelor ţesuturi somatice şi sunt într-un număr diferit atât în faza
gametofitică cât şi sporofitică a ciclului vegetal. Iniţial, embrionii somatici au fost
denumiţi embrioizi, pentru a sublinia diferenţa faţă de embrionii zigotici şi din păcate
acest termen mai este menţinut în anumite lucrări. Diferenţa dintre embrionul zigotic şi
cel somatic nu este foarte bine înţeleasă şi descrisă în literatură.

Tabel.6. Clasificarea embrinilor (după Bhojwani şi Razdan, 1983)


1. Embrioni zigotici Formaţi prin fertilizarea celulelor ou sau a zigotului

Formaţi din alte celule decât cele zigotice


2. Embrioni nezigotici: - formaţi de celulele sporofitice, cu excepţia
- embrioni somatici zigotului
- embrioni somatici formaţi direct din alţi
- embrioni adventivi embrioni sau organe
- formaţi din celule ou nefertilizate
- embrioni partenogenetici formaţi de gametofilul mascul (microspori,
- embrioni androgenetici grăunciori de polen)

Datorită faptului că majoritatea acestor tipuri de embrioni pot fi manipulaţi în


culturile in vitro, sistemele de cultură embriogenice sunt folosite ca bază în metodologiile
destinate îmbunătăţirii calitative a plantelor, deoarece permit nu numai clonarea prin
propagarea vegetativă, dar şi schimbări specifice şi direcţionate care pot fi introduse în
indivizi de elită selecţionaţi. Celulele individuale modificate sau embrionii pot fi după
aceea multiplicaţi eficient in vitro, într-un număr foarte mare de exemplare înainte de
dezvoltarea plantei. Aceasă modalitate de manipulare genetică elimină consecinţele
nedorite ale reproducerii sexuale (recombinarea genetică în masă şi ciclurile de selecţie
cerute), astfel încât tehnologia de ameliorare este net superioară prin reducerea timpului
şi a efortului de execuţie.

Condiţiile de creştere a embrionilor somatici versus embrioni zigotici


În sămânţă, în ţesutul nucelar, embrionul se formează ca rezultat al fertilizării unei
celule ou. Unele specii au tendinţa de a forma mai mult de un embrion, ca urmare a
diviziunii celulei embrionice primare, rezultând poliembrioni (la unele varietăţi de
Citrus).
Embrionii somatici pot apărea uneori şi în natură, din ţesut ovular fără fuziunea
unor celule sau nuclee, proces denumit apomixie. Originea lor este unicelulară (dintr-o
celulă somatică diploidă a sacului embrionar, fiind denumiţi apospori- sau dintr-o celulă
nucelară, fiind denumiţi embrioni nucelari). Mai rar, embrionii somatici se formează
direct pe frunzele unor specii ca de exemplu Kalanchoe, Ranunculus Asplenium, etc.
În sămânţă, ţesutul nutritiv, endospermul, îmbracă embrionul zigotic aflat în
dezvoltare. În primele faze ale embriogenezei, substanţele nutritive ajung la embrionul
zigotic atât prin celulele suspensoare cât şi prin suprafaţa embrionului propriu-zis. În
funcţie de specie pot să apară diferenţe în modul de nutriţie prin suspensor sau embrionul
propriu-zis, de la o specie la alta. Spre deosebire de aceasta, în cazul embrionilor somatici
faptul că se dezvoltă fără ţesut protector (ei nu sunt îmbrăcaţi de un ţesut precum
endospermul), face ca ei să nu fie subordonaţi unui regim înalt controlat şi specializat
(Gray şi Purohit, 1991). Cel mai adesea, suspensorul este singura legătură între embrion
şi mediul de cultură. Aceasta demonstrează că suspensorul poate servi ca mod de
asigurare a nutriţiei necesare şi că endospermul nu este absolut necesar în timpul
embriogenezei şi a germinaţiei (Gray, 1996).

Ce este o sămânţă ?

O sămânţă vegetală este o structură generativă, alcătuită din embrion, endosperm


şi un înveliş de protecţie denumit testa. La dicotiledonate embrionul este alcătuit din două
cotiledoane ataşate unei axe centrale. Partea apicală, plumula, creşte sub formă de lăstar
iar partea bazală este alcătuită din hipocotil şi radicelă, viitorul sistem radicular.
Endospermul asigură suportul nutritiv pe durata germinaţiei, până când plantula este
capabilă de fotosinteză. Testa, asiguă protecţia embrionului pe durata germinaţiei fiind
îndepărtată pentru eliberarea rădăcinuţei şi apoi a tulpiniţei.

Ce este o sămânţă artificială?


Seminţele arificiale au fost introduce înjurul anilor 1970 ca analog seminţelor
obişnuite. Acest produs se adresează speciilor care nu produc seminţe viabile,
reprezentând metoda de multiplicare a acestora. Datorită dimensiunilor lor mici,
seminţele artificiale prezintă şi avantaje în ceea ce priveşte manipularea, depozitarea,
transportul şi plantarea lor.

Cum se obţine o sămânţă artificială?

Seminţele artificiale se obţin prin încapsularea unui propagul vegetal


(“embrionul“) într-un matrix format dintr-un material ce permite creşterea lor ulterioară
într-o plantă. Propagulele vegetale utilizate în obţinerea seminţelor artificiale pot fi
meristeme sau, cele mai folosite, embrionii somatici obţinuţi din culturi aseptice prin
multiplicarea in vitro, la scară industrială. “Endospermul” este realizat dintr-un hidrogel
obţinut natural din alge (agar, carageenan sau alginat), diferite plante (latexuri, guar) sau
din microorganisme (dextran, gellan sau gumă xantan.). La încapsulare se pot adăuga şi
elemente nutritive, fitohormoni sau pesticide şi fungicide. Bila de alginat, conţinând
embrionul somatic, este drajată (“testa“ seminţei artificiale). În cultură, aceste propagule
vegetale pot fi crescute relativ uşor, pe medii nutritive,dând naştere unor plante
individuale.

Avantajele seminţelor artificiale

Tehnologia seminţelor artificiale prezintă un real potenţial de asigurare a uneii


surse de material vegetal valoros prin combinarea beneficiilor multiplicării vegetative la
scară cu asigurarea uniformităţii genetice foarte ridicată( ca urmare a clonării in vitro) şi a
posibilităţilor de conservare pe termen lung. Seminţele artificiale prezintă potenţial
pentru agricultură prin faptul că tehnologia de obţinere este relativ simplă, ieftină,
pretabilă pentru producţia industrială. (Gray şi Purohit, 1991; Redenbaugh et al., 1991;
Redenbaugh, 1993). Tehnologia seminţelelor artificiale este folosită şi pentru obţinerea
individuală de plante modificate genetic.
C6 Căile de regenerare la plantele superioare
Regenerare din meristeme preformate
Regenerare din meristeme adventive (sau induse, sau de novo)
Regenerare prin embriogeneza somatica (nezigotica)

Caile de regenerare la plantele superioare

Crestere: A. Regenerare din meristeme preformate:


Meristeme apicale
Muguri apicali din organe
Noduri si microtuberculi
Muguri dorminzi

1. Multiplicare nelimitata- (dar in timp)


2. Stabilitate genetica
3. Repetivitate

Dezvoltare: B. Regenerare din meristeme adventive (sau induse, sau de novo)

TOTIPOTENTIALITATE organogeneza ca dezvoltare: directa (A)


indirecta (B)
1. Explant primar- meristemoid primordiu de organ
2. Explant primar-calus meristemoid primordiu de organ

Element de diferentiere intre organogeneza directa


si cea indirecta

Calusul= celule mai putin diferentiate, nedeterminate, intr-o forma morfologica mai
flexibila- servesc ca punct de plecare pentru organogeneza de novo

competenta determinare
EXPLANT ORGAN
(regenerare)
dediferentiere inducere diferentiere (rediferentiere)
1. Organogeneza directa:
Din frunza
Din cotiledoane
Din petiol REGENERARE MULTICELULARA din tesuturi
Din petala

2. Organogeneza indirecta: instabilitate genetica


calus

C. Regenerare prin embriogeneza somatica (nezigotica):


1. Embriogeneza somatica spontana- mai rar din calus
2. Embriogeneza somatica indusa- indusa prin tehnicile de cultura in vitro (concentratii
mari de hidrati de carbon, presiune osmotica mare

Sursele de celule embriogenice


zigotul
hibridul somatic

dupa unii autori : D. Regenerare unicelulara-PROTOPLASTUL


Este o metoda rara de multiplicare; foloseste mai mult ca metoda suport pentru
ameliorare
Cultura de protoplaste. Prin plotopalst se defineste “acea parte din celula care
poate fi plasmolizata si izolata inalturand peretele celular prin procedee mecanice
sau enzimatice. Protoplastul este deci o celula nuda, a carei protoplasma este
inconjurata numai de membrana plasmatica, capabila sa regenereze peretele
celular, sa creasca si sa se divida (Vasil, 1976)”. In aceasta stare protoplastul
devine apt pentru manipulari experimentale:
-transfer de organite celulare, microorganisme sau material genetic strain
-formarea celulelor hibride somatice prin fuzionarea unor protoplaste cu diverse
caracteristici generale
Izolarea protoplastelor se realizeaza prin procedee standard care constau in
tratarea celulelor sau tesuturilor cu amestecuri enzimatice care degradeaza
peretele celular. Cele mai utilizate enzime sunt celulaza Onozuka, driselaza,
maceraza, pectinaze si hemicelulaze.
Cele mai utilizate surse de protoplasti sunt reprezentate de suspensiile celulare si
de mezofilul foliar.
Hibridarea somatica, prin fuziunea protoplastilor este o metoda de obtinere a
hibrizilor intre plante apartinind aceleiasi specii sau a unor specii diferite,
imposibil de realizat prin metode conventionale. Tot la nivelul acestor “celule”
poate fi realizata si selectia liniilor rezintente la diferiti agenti patogeni, la
compusi toxici produsi de unele bacterii si ciuperci, la diferiti agenti stresanti:
erbicide, salinitate si antibiotice.

2.3 Cultura de tesuturi: antere, ovare. Obtinerea de plante haploide.


Culturi de antere. Obtinerea de haploizi a plantele superioare a constituit o
preocupare inca de la inceputul acestui secol, pe seama utilitatii lor in realizarea
de linii homozigote pure, la plantele de cultura cu caractere dorite, in interval de
numai citeva luni si pornind de la acestea, producerea de mutante valoroase.
Cultura de antere este o metoda relativ simpla, rapida, eficienta (Bajaj, 1983). Prin
cultivarea in vitro anterelor excizate sau a polenului, se poate obtine calus sau
plante haploide, la un numar relativ mare de palnte horticole, dintre care amintim:
sfecla, varza, ardei, tomatele, mazarea si fasolea, iar dintre speciile floricole:
crizantemele, frezia, gerbera, muscatele saintpaulia, crinii si paetunia.
Pentru cultura de antere dupa tehnica lui Guha si Maheshvari (1964, 1966)
anterele sunt recoltate aseptic si amplasate pe mediu cu agar. Dar in 1976
,Wernick si Kolenbach au cultivat anterele pe un strat subtire de mediu lichid, in
vase Petri. Superioritatea mediului lichid se datoreste absentei impuritatilor
frecvente in agar, un mai bun acces al nutrientilor si o mai eficienta inlaturare a
inhibitorilor din mediul alaturat anterei.
La unele specii anterele se deschid spontan si polenul se raspindeste in mediul
lichid, formand embrioni sau calus,care pot fi folosite in continuare ca material
biologic cu potential regenerativ.
Factorii care conditioneaza succesul culturilor de antere si polen, sunt atat de
natura genetica cat si de natura fiziologica si fizica.Aparitia haploizilor in natura,
ca si capacitatea microsporilor de a forma embrioizi sau calus, in vitro,sunt
controlate genetic si sunt afectate de diferentele genotipice dintre plantele donor.
Semnificatia genotipului plantei donor este evidentiata prin diferentierea care
exista intre specii .
Se folosesc doua cai pentru ameliorarea potentialului androgenetic:
a) ameliorarea genetica a materialului donor
b) ameliorarea conditiilor de cultura
Deoarece factorii genetici au un rol dominant doar prima cale este mai indicata
pentru practica.
Potentialul androgenic este mai mare la anterele recoltate a inceputul perioadei de
inflorit si scade pe masura ce creste varsta plantelor. Temperatura, fotoperioada si
intensitatea luminii, in timpul vegetatiei plantei donor, conditioneaza reactia
androgenetica. La unele specii tratamentele termice aplicate mugurilor florali
excizati sau anterelor s-au dovedit a fi favorabile androgenetic. La cereale s-a
aratat ca tratamentul anterelor cu temperaturi scazute creste procentul de plantute
verzi si il scade pe cel al plantelor albinotice.
Alte tratamente care pot influenta androgeneza sunt: presiunea atmosferica joasa,
anaerobioza, lumina si atmosfera suprasaturata in apa.
In general anterele sunt cultivate la 25-30C, dar androgeneza descreste spre
pragurile extreme.
Mediul de cultura trebuie sa contina zaharoza, fier, hormoni (citochinine, auxine),
ph-ul sa fie de 6,8, aminoacizi si mioinozitoli. Rolul laptelui de nuca de cocos sau
a extractului de cartof intens este deasemenea evident.
Cultura de antere si polen este utila nu numai in producerea unui numar mare de
plante haploide, dar este si un instrument folosit pentru studii de biologie aplicata.
Embriogeneza polenului este utilizata in inducerea, detectarea si analiza
mutantilor, deoarece un numar foarte mare de celule au capacitatea potentiala de a
regenera plante.
Cel mai mare potential al folosirii haploizior consta in obtinerea de pante
homozigote. Haploizii pot fi usor diploidizati si in timp relativ scurt, pot fi
obtinute linii pure. In acest sens obtinerea de haploizi a fost inclusa in numeroase
programe de ameliorare.
Cultura de ovare si ovule. Intrucat, in hibridare exista, adeseori, o
incompatibilitate intre partenerii sexuali, prin metoda culturilor in vitro se poate in
unele cazuri, facilita fie accesul polenului la ovul, fie acceptarea de catre ovule a
autopolenizarii invingandu-se barierele de autoincompatibilitate, a celor de
incompatibilitate la incrucisari (interspecifice sau intergenerice).
Cultura in vitro a pistilelor, ovarelor, ovulelor, precum si a ansamblelor de
componente florale (ovule, cu sau fara placenta; ovare, cu sau fara stil) a permis
completarea cunostiintelor actuale privind functionarea organelor respective si
privind biologia fecundatiei, a formarii embrionului, a semintei si a fructului.
Aceste cunostiinte servesc la obtinerea de noi succese in invingerea barierelor
incompatibilitatilor existente in hibridarea sexuala, fapt deosebit de important,
intrucat prin inmultirea sexuala se poate reinnoi, continuu, potentialul biologic al
plantelor, imbogatindu-se zestrea ereditara, cu caracterele mostenite la doi parinti,
posedand acumulari genetice diferite.
Meritul primei culturi de ovare ii revine lui La Rue (1942), care a reusit
cultivarea in vitro a ovarelor de Lycopersicon pimpinellifolium, insa nu a obtinut
seminte viabile.
In vitro pot fi culltivate atat ovule fertilizate, cat si ovule nefertilizate (pistile
cultivate pe medii aseptice si polenizate in vitro au dus la obtinerea de seminte
viabile la Nicotiana, pe cand la Oryza sativa s-au obtinut plantule din ovare
nepolenizate, iar la orhidee se pot obtine pantule prin cultivarea in vitro a
ovulelor). Ovulele pot fi recoltate ca fiind fertilizate in conditii naturale sau pot fi
fertilizate prin polenizarea lor, cultivate fiind pe mediu aseptic. La fertilizarea
ovulelor poate fi folosit fie polen proaspat, recoltat in perioada initierii culturilor
de ovule, ovare sau de pistile, fie pollen conservat, indeosebi in cazul urmaririi
realizarii de polenizari interspecifice sau intergenerice. Este necesar ca, prealabi
inocularii, polenul sa fie testat in ceea ce priveste capacitatea germinativa,
cresterea tubului polinic si sa se studieze, comparativ, eficienta catorva retete de
medii de cultura, in vederea asigurarii unei cresteri optime a tubului polinic,
respectiv conservarea si sustinerea intregului potential biologic al celulei
generative si a celei vegetative.
Pentru evitarea autopolenizarii se practica castrarea staminelor in faza de
preanteza. Cand floarea este imbobocita, bobocul poate fi sterilizat prealabil
deschiderii lui. Operatiunea de castrare se recomanda sa fie facuta cu
preacautinune cu instrumente sterile, pentru a preintimpina introducerea de
germeni in apropierea organelor ce urmeaza a fi inoculate pe medii aseptice.
Dezinfectarea bobocilor se face prin plonjarea lor in alcool 70 , timp de 1 minut,
apoi in incinta sterila se procedeaza la deschiderea florii si se trece la explantarea
pistilului. Acesta va fi sterilizat intr-o solutie de Domestos 20% timp de 20
minute, urmand 3-5 spalari in apa sterila. In operatiile de dezinfectie si in cele de
spalare, dupa dezinfectare, se va evita spalarea stigmatului, pentru a nu indeparta
secretia de la suprafata acestuia. Pistilul, dupa dezinfectare, este spalalat si este
zvantat pe hirtie de filtru sterila. Apoi este inoculat in mediul de cultura. Intr-o
ultima etapa peste stigmat se aplica polenul, flaconul cu inoculi se inchide si este
trecut la incubat, in camera de crestere.
Din pistilul sterilizat pot fi detasate fie ovarul (cultivat in vitro ca atare), fie
ovulele (cu sau fara placenta, cu sau fara funicul). Mediile de cultura cee mai
frecvent utilizate, atat pentru cultura de pistile, ovare, ovule, cat si de nucela, pot
fi mediul White (1963) sau Nitsch (1951), cu adaos de AIA sau chinetina.
Adeseori se recomanda introducerea in mediu a glicinei, a triptofanului si a
hidrolizatului de cazeina.
Incubarea culturilor se va face la lumina, in regim de 16 ore lumina pe zi, cu o
intensitate de 1000 lucsi. Temperatura mediului se recomanda a fi de 27 C.
In general cultura de ovare serveste cu succes la inducerea artificiala a
poliembrioniei. Mai este importanta pentru obtinerea de calus generat din
integumentele ovulului. Uchimiya si colab. (1971) au cultivat ovule nefertilizate
de Solanum melongena si au obtinut calus (pe mediu cu AIA si chinetina):
celulele calusului s-au dovedit a fi haploide.
Cultura de plante haploide. Termenul “haploid” este utilizat pentru desemnarea
indivizilor care contin numarul gametic de cromozomi ai speciei parentale.
Haploizii sunt de doua tipuri: monohaploizi, derivati din specii diploide, si
polihaploizi, derivati din speciie poliploide. Polihaploizii contin mai multe seturi
de cromozomi, identici sau diferiti si in functie de continutul in genomuri sunt
sterili sau fertili.
Plantele haploide constituie un material util pentru studiillle fundamentale si
cercetarea aplicativa. Un interes deosebit prezinta, din acest punct de vedere,
monohaploizii, la care toate genele pe care le poseda se exprima fenotipic. In
atare conditii, diferitele mutatii sau caracterele recesive pot fi imediat detectate. In
continuare, prin dublarea numarului de cromozomi se obtin plante diploide,
homozigote, fertille intr-o singura generatie, spre deosebire de cazul utilizarii
metodelor conventionale, cand pentru obtinerea homozigotiei este nevoie de un
timp incomparabil mai indelungat.
Pentru producerea mutantelor, haploizii constituie materialul ideal. Tratarea
plantelor haploide cu raze X a permis obtinerea unui mare numar de mutante la
Nicotiana tabacum (Nitsch, 1969). Celulele haploide cultivate in suspensie pot fi
folosite ca material experimental pentru studii de mutageneza si pentru obtinerea
unor mutante biochimice rezistente la patogeni, temperaturi ridicate sau scazute si
salinitate. Culturile de celule haploide au fost folosite, de asemenea, pentru
izoarea unei linii rezistente la streptomicina (Binding si colab., 1970), 5-
bromodeoxiuridina (Maliga si colab., 1973), aminopterina (1977), clorid de sodiu
(1973), valina (1978).
Din protoplasti halpizi au fost regenerate plante de tutun rezistente la metionin
sulfomixina (1973).
Haploizii poseda doua atribute majore care ar putea interesa amelioratorii: permit
scurtarea considerabila a timpului necesar pentru obtinerea liniilor homozigote,
iar conditia hemizigota pentru toti locii- la monohaploizi- reduce dificultatea
identificarii si manipularii caracterelor dorite.
In ultimul timp haploizii adrogenetici sunt tot mai frecvent utillizati in
ameliorarea unor plante importante din punct de vedere economic. La o serie de
specii au fost puse la punct tehnici eficiente de obtinere a haploizilor si
dihaploizilor: la grau si orez chinezii au obtinut rezultate deosebite, materializate
in soiuri noi productive, de calitate, rezistente la boli si a conditii nefavorabile, la
tutun s-au obtinut linii dihaploide cu o pronuntata variabilitate precum si specia
rezistenta la “bacterial Wild”, la secara Hoffman si Wenzel (1981) au demonstrat
utilitatea hapoizilor androgenetici pentru incorporare rapida a autocompatibilitatii
si reducerea continutuui de alkilrezorcinol.
Obtinerea de plante haploide este un procedeu de ameliorare care se are in vedere
si la specia Lycopersicon in special pentru creearea de soiuri rezistente la
substante toxice, erbicide, antibiotice.

C7-8 Modificarea genotipului la plantele superioare. OMG

Ce sunt Organismele Modificate Genetic (OMG)?

- definiţii conform Legii nr. 214/2002 -

Organism modificat genetic (OMG) = orice organism, cu excepţia celui uman, al cărui material
genetic a fost modificat altfel decât prin încrucişare şi / sau recombinare naturală. În sensul acestei
definiţii, modificarea genetică este o consecinţă a utilizării următoarelor tehnici:
Tehnicile de recombinare a acizilor nucleici, incluzând formarea de noi combinaţii de material
genetic, prin inserţia moleculelor de acid nucleic, produse prin orice mijloace în afara unui organism, în
orice virus, plasmidă bacteriană sau alt sistem vector, şi încorporarea acestora într-un organism-gazdă, în
care acestea nu au loc în mod natural, dar în care sunt capabile de multiplicare continuă
Tehnicile care implică introducerea directă într-un microorganism a materialului ereditar
preparat în afara microorganismului, incluzând microinjectarea, macroinjectarea şi microîncapsularea
Tehnicile de fuziune celulară sau hibridare, când celule cu noi combinaţii de material genetic
ereditar sunt formate prin fuzionarea a două sau mai multe celule, prin intermediul proceselor care nu
există în mod natural

Organism = orice entitate biologică capabilă să transfere sau să replice material


genetic, inclusiv virusurile şi viroizii
Introducere pe piaţă = furnizarea OMG sau a produselor acestora, contra cost
sau nu, către terţe părţi

Evaluarea riscurilor asupra mediului = evaluarea efectelor pe care le pot


prezenta OMG sau părţi componente ale acestora, direct sau indirect, imediat sau
cu întârziere, asupra sănătăţii umane şi asupra mediului

Cand discutam despre organismele modificate genetic, Biotehnologia, este


legiferată prin Protocolul de la Cartagena, în Articolul 3, ca fiind aplicaţia :
 (a). tehnicilor in vitro asupra acidului nucleic, incluzând tehnica ADN-ului recombinant şi
injectarea directă de acid dezoxiribonucleic (ADN) în celule sau organite celulare, sau
 (b). fuziunea celulelor dincolo de limita taxonomică a familiei, care depăşesc barierele fiziologice
reproductive naturale sau cele de recombinare şi care nu sunt tehnici folosite în ameliorarea şi
selecţia clasică

OMG-urile şi mediul înconjurător- certitudini şi incertitudini ştiinţifice

Organismele modificate genetic sunt organisme a căror material genetic a fost


schimbat prin tehnici biotehnologice. O genă (sau mai multe gene) provenind de la o altă
specie (mai mult sau mai puţin apropiată genetic) este introdusă în organismul gazdă (cel
ce urmează să fie modificat) în scopul alterării- restricţionării producţiei unei proteine
specifice sau în scopul creării condiţiilor de producere a unei proteine, complet nouă
pentru organismul gazdă. Organismul rezultat în urma modificării va prezenta
caracteristici care nu se găsesc în mod normal în reprezentanţii speciei gazdă. Aşadar, un
organism modificat genetic este un virus, o bacterie, o plantă sau o formă de viaţă mai
complexă, a cărui ADN a fost modificat intenţionat cu un scop bine precizat, cum ar fi:

pentru cercetări legate de natura genelor sau procesele biologice controlate de


acestea
în scopul producerii unor proteine animale
în scopul corectării unor anomalii genetice
în scopul ameliorării calitative a unor specii vegetale (creşterea capacităţii de
producţie, a calităţii producţiei, rezistenţei la boli şi dăunători, a toleranţei faţă de
factori de stres sau ierbicide, etc.) sau animale.

OMG-urile de laborator

Obţinerea, testarea şi producţia produselor de tip antibiotice, medicamentelor,


suplimentelor alimentare, vaccinurilor sau a unor substanţe speciale (insulina, hormonii)
reprezintă aplicaţii comerciale ale biotehnologiei care, aproape în totalitate, sunt bazate şi
realizate pe baza unor studii fundamentale de laborator. De asemenea, produse
alimentare de tipul iaurtului, brânzeturi depind de bacterii care, datorită tehnicilor
biotehnologice, pot fi îmbunătăţite sau modificate în scopul ridicării potenţialului de
producţie. În practica modificării genetice, mai ales pentru produse care urmează să fie
introduse în consum, este aproape obligatoriu ca modificarea genetică să fie gândită şi
realizată astfel încât să afecteze procesul de producţie şi nu produsul în sine. Datorită
controlului strict a OMG-urilor utilizate în laborator şi în lanţul tehnologic
industrial(producţia industrială) aceste aplicaţii nu au cum să exercite efecte asupra
mediului înconjurător.

OMG-urile destinate culturii în câmp deschis


Care este diferenţa între un hibrid şi o plantă modificată genetic?
OMG Hibrid
Ce este? Un organism care, pe lângă Un organism obţinut prin
genomul propriu, mai conţine în încrucişarea a două forme
parentale aparţinând unor genuri,
plus una sau mai multe gene specii sau varietăţi diferite:două
provenind de la specii străine genomuri diferite contribuie la
(aceste gene se numesc transgene). formarea unui al treilea (hibridul)
Adică genomul propriu nealterat la
care se adaugă informaţie genetică
străină

(mutatiile reprezintă rearanjări ale


genomului propriu: fără adaos de
informaţie genetică străină)
Care este nivelul de OMG-urile prezintă acelaşi tip de Genurile şi speciile hibride
fertilitate? fertiltate ca şi specia/varietatea sunt fertile doar în prima
iniţială. generaţie (F1) după care
devin sterile.
Excepţie fac plantele V-GURTs
(Variety Genetic Use Restriction
Technologies) care, datorită
tehnologiei terminator, sunt sterile
Câte generaţii Sămânţa unei plante modificate Hibrizii din prima generaţie
poate fi folosită genetic poate fi semănată timp de manifestă fenomenul de heterozis
(exprimarea caracterelor de
sămânţa obţinută mai multe generaţiifără alterarea producţie la maximum). În
din această plantă? caracteristicilor sale .(cu excepţia generaţiile următoare acest
plantelor T-GURT- Trait Genetic fenomen nu se mai manifestă,
Use Restriction Technologies) producţiile scăzând semnificativ-
atât calitativ cât şi cantitativ.
Rstricţionările în urtilizarea
seminţelor din recoltă proprie sunt
dictate de drepturile de proprietate
intelectuală (patentul asupra genei
de interes, a promotorului , etc.)

Elemente genetice aprobate până în prezent în modificarea speciilor vegetale


pentru cultura în câmp, sunt :

Promotori:

P-35S- prelevat de la Virusul mozaicului conopidei (Cauliflower Mosaic


Virus CaMV) (56%)
P-nos- prelevat de la Agrobacterium tumefaciens (11%)
De origine bacteriană (22%)

Terminatori:

T-NOS- prelevat de la Agrobacterium tumefaciens (37%)


T-35 prelevat de la Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) (17%)
T-E9 prelevat de la Pisum sativum (12%)
Bacterial (22%)

Gene:

NPTII (29%)- prelevată de la Escherihia coli


Cry (20%)- prelevată de la Bacillus thuringiensis
Bar (15%)- prelevată de la Streptomyces hygroscopicus
EPSPS (12%)- prelevată de la Agrobacteriumt tumefaciens
PAT (11%)- prelevată de la Streptomyces viridochromogenes

În momentul de faţă este posibil transferul, la plantele de cultură a unor gene care
determină:
-depozitarea unei mari cantităţi de proteine în seminţe;
-sinteza unor enzime specifice care să permită acumularea, în organe
specializate, a unor cantităţi dorite de amidon sau alte zaharuri;
-sinteza unor compuşi toxici pentru anumite insecte dăunătoare;
-sinteza unor proteine virale de tip capsidic care să asigure protecţia
împotriva infecţiilor virale;
-sinteza unor produşi ce induc androsterilitatea.
Care sunt tipurile de modificări genetice aprobate până în prezent?

Rezistenţa la boli virotice, prin transferul la plantele de cultură, a unor


gene virale ce determină sinteza proteinelor capsidice sau a ARN viral
antisens ;
Rezistenta la atacul insectelor, bazata pe transferul la plante a genelor
pentru sinteza proteinelor cristal si a inhibitorilor proteinazei ;
Rezistenta la erbicide, obtinuta prin realizarea unei mutatii in gena ce
determina sinteza proteinei tinta sau prin introducerea in plante a unor
gene ce determina supraproductia de proteina tinta sau detoxifierea
substantei active a erbicidului ;
Rezistenta la bolile bacteriene realizata prin transferul la plantele de
cultura a genelor ce codifica sinteza unor peptide cu efect bactericid ;
Reglarea continutului in amidon al tuberculilor de cartof prin transferul
de gene ce influenteaza sinteza enzimei GBSS, responsabila pentru
productia de amidon ;
Obtinerea unei ridicate fermitati a pulpei fructelor de tomate prin
includerea, in genotipul soiurilor valoroase, a unor gene ce regleaza
sinteza enzimei polygalacturonaza, responsabila de inmuierea pielitei si
pulpei fructelor.
Tabel.1 Situatia actuala, pe plan mondial, a speciilor transgenice aprobate pentru cultura (sinteza din baza
de date AGBIOS)
Caracter Nr Specii transgenice aprobate pentru cultura pe
intrari in plan mondial
baza de
date
Rezistenta la virusuri 6 Papaya Squash Prun Cartof
Rezistenta la insecte 51 Cotton Tomato Cartof Porumb
Toleranta la erbicide 79 Agrostis stolonifera Creeping
Bentgrass Sugar Beet Brassica
napus (Argentine Canola)Argentine
Canola Polish
Canola Chicory Carnation Soybean Cott
on Inul pentru fibre, Inul pentru
ulei Alfalfa Tobacco Rice Wheat Poru
mb

Markeri 67 Sugar Beet Argentine


de selectie Canola Papaya Chicory Melon Squash
Soybean Cotton Flax,
Linseed Tomate Tutun Prun
Cartof Porumb

Inducerea androsterilitatii 9 Rapita Chicory Porumb


Modificarea culorii florilor 2 Garoafa
Intarzierea maturarii 7 Melon Garoafa Tomate

Modificarea amilazei pentru obtinerea de etanol Porumb

Care sunt tipurile de plante modificate genetic comercializate până în prezent?

Tabel 2. Cultivarea pe plan mondial a porumbului modificat genetic Bt (Bt şi Bt/Toleranţa la erbicide )
în perioada 1996 -2006 (milioane de hectare)

Caracter 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Total
Bt 0.3 3.0 6.7 7.5 6.8 5.9 7.7 9.1 11.2 11.3 11.1 80.6
Bt şi TET 0.0 0.0 0.0 0.0 1.4 1.8 2.2 3.2 3.8 6.5 9.0 27.9
Total 0.3 3.0 6.7 7.5 8.2 7.7 9.9 12.3 15.0 17.8 20.1 108.5
TE: Toleranţa la erbicide
Sursa: ISAAA (International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications), 2006

Tabel 3. Cultivarea pe plan mondial a bumbacului modificat genetic Bt (Bt şi Bt/Toleranţa la


erbicide ) în perioada 1996 -2006 (milioane de hectare)

Caracter 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Total
Bt 0.8 1.1 1.4 1.3 1.5 1.9 2.4 3.1 4.5 4.9 8.0 26
Bt şi TE 0.0 <0.1 0.1 0.8 1.7 2.4 2.2 2.6 3.0 3.6 4.1 20.5
Total 0.8 1.1 1.5 2.1 3.2 4.3 4.6 5.7 7.5 8.5 12.1 46.5
TE: Toleranţa la erbicide
Sursa: ISAAA (International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications), 2006

Tabel 4. Cartoful modificat genetic acceptat în mediu, acceptat ca furaj şi acceptat şi din punct de
vedere al securităţii alimentare
Evenimentul de transformare Compania Descriere
ATBT04-6, ATBT04-27, ATBT04-30, Monsanto Cartof rezistent la atacul gândacului din
ATBT04-31, ATBT04-36, SPBT02-5, Colorado prin introducerea genei cry3A
SPBT02-7 prelevată de la Bacillus thuringiensis
(subsp. Tenebrionis).
BT6, BT10, Monsanto Cartof rezistent la atacul gândacului din
BT12, BT16, Colorado prin introducerea genei cry3A
BT17, BT18, BT23 prelevată de la Bacillus thuringiensis
(subsp. Tenebrionis).
RBMT15-101, Monsanto Cartof rezistent la atacul gândacului din
SEMT15-02, Colorado şi la virusul PVY prin
SEMT15-15 introducerea genei cry3A prelevată de la
Bacillus thuringiensis (subsp. Tenebrionis)
şi a genei codificatoare a învelişului proteic
a virusului PVY.
RBMT21-129, Monsanto Cartof rezistent la atacul gândacului din
RBMT21-350, Colorado şi la virusul PLRV prin
RBMT22-082 introducerea genei cry3A prelevată de la
Bacillus thuringiensis (subsp. Tenebrionis)
şi a genei codificatoare a replicării
virusului PLRV. and the replicase
encoding gene from PLRV.
PLRV virusul răsucirii frunzei carofului (Potato LeafRoll Virus)
PVY - virusul Y al carofului (Potato Virus Y)
Sursa: din Baza de date AGBIOS, 2007
Statele Unite sunt cel mai important producător şi cultivator de plante modificate
genetic din lume, suprafaţa cultivată cu acest tip de organisme vegetale reprezentând 63%
din suprafaţa mondială cultivată cu plante transgenice. Astfel, nu este surprinzător faptul
că pe piaţa americană se găsesc şi foarte multe alimente conţinând OMG-uri (Bordogna
Petriccione, 2004). Cele mai des întâlnite culturi transgenice întâlnite în SUA sunt

Cultura transgenică Producţia culturilor Se regăseşte acest


transgenice OMG în produsul
alimentar?
Soia 81% (în 2003) din Soia transgenică se
totalul producţiei de soia regăseşte în majoritatea
în SUA a fost alimentelor procesate,
transgenic. sub formă de derivate
in 2003 din soia (cum sunt
uleiul, făina, lecitina,
extracte proteice, etc.)
Porumbul 40% (în 2002) respectiv Porumbul transgenic se
din totalul producţiei de regăseşte în multe
porumb în America a alimente procesate, cu
fost transgenic atât mai mult cât nu este
făcută o separare clară
între porumbul
convenţional şi cel
transgenic- nici la nivel
de cultură şi nici în
etapele de procesare
industrială.
Rapiţa Majoritatea rapiţei Rapiţa transgenică se
pentru ulei este foloseşte pentru
importată din Canada, obţinerea în principal a
unde 60% din rapiţă este uleiului, produs care
transgenică. intră în compoziţia unor
produse de consum
(margarină, ciocolată,
săpunuri, detergenţi)
Bumbacul 71% din totalul Bumbacul, pe lângă
producţiei de bumbac utilizarea lui în industria
american este textilă, este folosit
transgenic. pentru obţinerea uleiului
(din seminţe). Acest ulei
extras din seminţe
transgenice este utilizat
ca aditiv alimentar în
unele produse
alimentare procesate.
(Universitatea Cornell, 2004)

În 2007, SUA, urmată de Argentina, Brazilia, Canada, India şi China au continuat


cultivarea plantelor transgenice. Cu cele 57,7 milioane de hectare, SUA deţine locul întâi
pe glob (50% din suprafaţa mondială cultivată cu OMG-uri), susţinută şi de creşterea
cererii pieţei pentru porumbul transgenic destinat obţinerii etanolului. De notat faptul că
63% din porumbul modificat genetic, 78% din bumbacul transgenic şi 37% din tot restul
de specii transgenice cultivate în SUA în 2007, conţin două sau chiar trei evenimente de
transformare (două sau trei gene de interes, diferite) ceea ce asigură beneficii multiple.
Produsele transgenice multiple (stacked products- sunt OMG-urile care conţin mai mult
de o singură transgenă), datorită înglobării mai multor caracteristici de importanţă
economică, reprezintă viitorul în agricultura transgenică, atât pentru fermieri, procesatori
cât şi pentru consumatori (Clive, 2007). În 2007, conform datelor Serviciului
internaţional de achiziţie a datelor pentru aplicaţiile agro-biotehnologice (ISAAA-
International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications), un număr de 10
ţări au adoptat în cultură produse transgenice multiple (SUA, Canada, Filipine, Australia,
Mexic, Africa de Sud, Honduras, Chile, Columbia, şi Argentina) urmând ca extinderea
lor în cultură să fie adoptată şi în alte ţări.

Marele potenţial de utilizare al plantelor transgenice rezultă din uniformitatea


culturilor, 99% din modificările genetice fiind direcţionate spre inducerea toleranţei faţă
de erbicide şi respectiv, resistenţei faţă de atacul insectelor, în timp ce produsele
transgenice multiple (stacked products) le înglobează pe amândouă.

Nr. Ţări Suprafaţa Specia cultivată cu precădere în 2006


crt. (mil. Ha)

01* SUA 54,6 Soia, porumb, bumbac, rapiţă, papaya, lucernă


02* Argentina 18,0 Soia, porumb, bumbac
03* Brazilia 11,5 Soia, bumbac
04* Canada 6,1 Rapiţă, porumb, soia
05* India 3,8 Bumbac
06* China 3,5 Bumbac
07* Paraguay 2,0 Soia
08* Africa de Sud 1,4 Porumb, soia, bumbac
09* Uruguay 0,4 Soia, porumb
10* Filipine 0,2 Porumb
11* Australia 0,2 Bumbac
12* România 0,1 Soia
13* Mexic 0,1 Bumbac, soia
14* Spania 0,1 Porumb
15 Columbia <0,1 Bumbac
16 Franţa <0,1 Porumb
17 Iran <0,1 Orez
18 Honduras <0,1 Porumb
19 Republica Cehă <0,1 Porumb
20 Portugalia <0,1 Porumb
21 Germania <0,1 Porumb
22 Slovacia <0,1 Porumb

Sursa: ISAAA (Clive James, 2006).


14 ţări mari cultivatoare de plante modificate genetic (“ţări mari cultivatoare” înseamnă
aproximativ 50.000 ha cu varietăţi modificate genetic)

Nr. Ţări Suprafaţa Specia cultivată cu precădere în 2007


crt. (mil. Ha)

01* SUA 57,7 (+) Soia, porumb, bumbac, rapiţă, papaya, lucernă
02* Argentina 19,1 (+) Soia, porumb, bumbac
03* Brazilia 15,0 (+) Soia, bumbac
04* Canada 7,0 (+) Rapiţă, porumb, soia
05* India 6,2 (+) Bumbac
06* China 3,8 (+) Bumbac, tomate, ardei, papaya
07* Paraguay 2,6 (+) Soia
08* Africa de Sud 1,8 (+) Porumb, soia, bumbac
09* Uruguay 0,5 (+) Soia, porumb
10* Filipine 0,3 (+) Porumb
11* Australia 0,1 (-) Bumbac
12* Spania 0,1 (=) Porumb
13* Mexic 0,1 (=) Bumbac, soia
14 Columbia <0,05 (-) Bumbac
15 Chile <0,05 Porumb, soia, rapiţă
16 Franţa <0,05 (-) Porumb
17 Honduras <0,05 (-) Porumb
18 Republica Cehă <0,05 (-) Porumb
19 Portugalia <0,05 (-) Porumb
20 Germania <0,05 (-) Porumb
21 Slovacia <0,05 (-) Porumb
22 România <0,05 (-) Porumb
23 Polonia <0,05 Porumb
Sursa: ISAAA (Clive James, 2007).
* 13 ţări mari cultivatoare de plante modificate genetic (“ţări mari cultivatoare” înseamnă aproximativ
50.000 ha cu varietăţi modificate genetic)

Impactul agronomic şi cel asupra mediului al fluxului de gene depinde de caracteristici specifice în ceea ce
priveşte combinaţiile de plante şi măsura existenţei posibilităţii ca transferul de gene să aibă loc. Riscul este
definit ca fiind

RECOMANDĂRI PENTRU UTILIZAREA OMG-urilor IN CAMP DESCHIS


!!!!! incepand cu inauarie 2007 Legea nr. 414 interzice cultivarea
OMG-urilor in Romania!!!!!
Dimensiunea riscului

Probabilitate - şansa ca un risc să apară


Mărimea - dimensiunea efectului sau a impactului

Alte dimensiuni ale riscului


pot fi considerate şi cele mai puţin riscante: voluntar (risc asumat), comun, controlabil,
detectabil, cunoscut ştiinţific, cunoscut în alte condiţii, etc., sau
cele mai pronunţate: involuntare, neobişnuit, necontrolabil, indetectabil, necunoscut
ştiinţific, etc.

Atitudinea publică faţă de risc


Perceperea riscului în mod bi-polar: risc vs. siguranţă
Cunoaşterea potenţialului complet al riscului înaintea începerii oricărei activităţi
care includ un factor de risc
Acordarea unei importanţe mai mari aspectului moral decât problematicii
ştiinţifice

Transferul de gene poate fi împiedicat sau limitat prin bariere fizice sau biologice
efective. Alegerea metodelor optime se realizează în perspectuiva recomandărilor
legislative ale Uniunii Europeene.
Cel mai adesea, introgresia transgenelor este asociată cu capacitatea de hibridare a
speciei luată în calcul. Deşi datele experimentale sunt încă insuficiente, cercetările
din ultimii ani indică şi existenţa unor bariere fiziologice care acţionează în
direcţia opririi adopţiei de gene modificate de către rudele sălbatice ale plantelor
de cultură.
Persistenţa şi dispersia seminţelor determină fluxul de gene atât în spaţiu cât şi în
timp. Din acest motiv este necesară o cunoaştere exactă şi controlată a rolului
surselor de seminţe (băncile de seminţe, depozite şi a sistemului de diseminare) în
scopul prevenirii contaminării culturilor nemodificate genetic.
În scopul minimalizării unei posibile contaminări sau a fluxului de gene,
eficientizarea sistemelor de management precum şi schemele de utilizare
responsabilă a OMG reclamă o cunoaştere foarte bună a informaţiilor ştiinţifice
atât asupra seminţelor cât şi asupra genelor implicate în transferul polenului.
Monitorizarea plantelor modificate genetic trebuie să se fundamenteze pe o
temeinică cunoaştere ştiinţifică a biologiei, comportamentului şi ecologiei
culturilor modificate genetic în corelaţie cu speciile sălbatice înrudite.

Valoarea totală de piaţă a culturilor modificate genetic (estimată de


Cropnosis Serviciu de cercetare a pieţii şi consultanţă în domeniul protecţiei culturilor şi
a biotehnologiei)

În 2006, valoarea totală a culturilor modificate genetic a fost de 6.15 miliarde de


$, reprezentând 16% din valoarea totală de 38,5 miliarde $ a pieţei de produse pentu
protecţia culturilor şi 21 % din cele 30 miliarde $ obtinuţi pe piaţa mondială de sămânţă
mondială.
Totalul de 6,15 miliarde $ a fost obţinut după cum urmează:
2,68 miliarde $ din cultura soiei modificate genetic (44% ca suprafaţă mondială
cu plante transgenice)
2.39 miliarde $ din cultura porumbului modificat genetic (39%),
0.87 miliarde $ din cultura bumbacului modificat genetic (14%), şi
0.21 miliarde $ din cultura rapiţei modificate genetic (3%)
Valoarea de piaţă a pieţei mondiale a culturilor de plante modificate genetic este
determinată de preţul de vânzare a seminţelor modificate genetic plus taxele de
tehnologie aplicată aferente. În ultimii 11 ani, de când a fost acceptată spre
comercializare prima cultură modificată genetic (în 1996) valoarea mondială
acumulată este estimată la 35,5 miliarde $, valoarea mondială înregistrată în 2007
fiind de peste 6,8 miliarde $.

In tarile Comunitatii Europeene, controlul legislativ pentru OMG-uri este


obligatoriu si este reglementat prin legi si normative legislative, pentru urmatoarele
nivele

Productia de OMG-uri (Genetically Modified Organisms [Contained Use] Regulations


1992)

Cultivarea deliberate in mediu a OMG-urilor (Deliberate Release) Regulations 1992 –

Marketing-ul pentru OMG-uri OMG (Deliberate Release) Regulations 1992.

Reglementări legislative

Datorită celor trei tipuri de situaţie care pot exista:


- reglementarea tuturor organismelor noi (îmbunătăţite genetic, hibrizi, etc)
- nereglementarea nici unui tip de organisme
- reglementarea OMG-urilor pe baza normativelor legislative existente
în stabilirea unui sistem de reglementare trebuie pornit de la clarificarea întrebării: sunt
sau nu sunt Organismele Modificate Genetic diferite faţă de alte organisme?
Unul dintre cele mai bune exemple de definire a unui produs nou poate fi definirea „unui
aliment nou” utilizat în sistemul juridic canadian; conform acestora „un aliment nou”este:
un produs care nu a mai fost niciodată utilizat ca aliment
- aliment care rezultă dintr-un proces tehnologic nou, care nu a mai fost niciodată
utilizat în producerea alimentelor
- alimente consacrate care însă au fost modificate prin utilizarea de materiale
biologice modificate genetic.
În cazul în care se consideră OMG-urile ca fiind diferite de restul organismelor vii
trebuiesc instituite normative legislative noi şi specifice.
În cele mai multe cazuri, limbajul legislativ produs pentru normativele legale este
diferit ca sens de cel ştiinţific ceea ce impune dezvoltarea unor definiţii foarte exacte
pentru fiecare termen sau procedură utilizată. Având în vedere că definiţia legală este
singura acceptată legislativ, alături de definiţii ar trebui întocmită şi o listă a ceea ce se
poate modifica (o listă exactă a termenilor) ca urmare a evoluţiei ştiinţei/ tehnologiei.
Sistemele legislative trebuie să facă distincţie clară între cele trei aspecte de
abordare a problematicii legate de OMG-uri:ştiinţa, strategie şi politica generală.
- Abordarea ştiinţifică care va viza întotdeauna aspecte teoretite şi practice de
realizare a unui organism nou.
- Abordarea de tactică care urmăreşte să dea un răspuns efectiv nevoii exacte a
producerii noului organism , a rolului , necesităţii şi asigurării faptului că poate fi realistic
produs
- Abordarea din punct de vedere politic, cunoscut fiind influenţa pe care aceasta
îl poate avea asupra anumitor cercetări ştiinţifice
In conformitate cu informatiile de pe site-ul Ministerului Agriculturii, Padurilor si
Dezvoltarii rurale, in anul 1996 erau cultivate in intreaga lume in jur de 1,7 milioane de
hectare cu plante modificate genetic. In 2002 suprafata totala a crescut la 58,7 milioane
de hectare, ceea ce arata un ritm de crestere fara precedent in domeniul tehnologiilor
agricole, aproximativ de 35 ori. 99% din suprafata mondiala cultivata cu plante
modificate genetic este situata in patru state: SUA (66% din total), Argentina (23%),
Canada (6%), China (4%). In conformitate cu ultimele date, mai mult de jumatate din
populatia lumii traieste in tari in care este aprobata oficial cultivarea plantelor modificate
genetic. La nivelul Uniunii Europene sunt autorizate 18 OMG-uri, care includ varietati de
porumb, soia, rapita, cicoare si vaccinuri. In Romania, conform datelor oficiale, primele
soiuri de plante modificate genetic au fost testate in reteaua Institutului de Stat pentru
Testarea si Inregistrarea Soiurilor in 1997-1998. Primul soi de soia (Stine 2254 RR) si
primul soi de cartof (Superior New Leaf) modificate genetic au fost inscrise pe lista
oficiala in 1998.
Suprafata cultivata cu soia modificata genetic era de 15.500 de hectare in anul
1999, iar cea cu cartof modificat genetic, in acelasi an, de 35 hectare. In 2002 suprafata
cultivata cu soia modificata genetic a fost de 31.100 de hectare, iar cea cultivata cu cartof
modificat genetic a fost de circa 15 hectare.
In anul 2000 a fost constituita, in baza prevederilor OG nr. 49/2000, Comisia
Nationala pentru Securitate Biologica, care a aprobat oficial cultivarea, in scop comercial
(pentru o perioada de 3 ani), a soiei RR (toleranta la erbicidul glifosat) si a cartofului Bt
(rezistent la gandacul din Colorado), suprafetele cultivate fiind de 32.200 de hectare,
respectiv 90 de hectare, aprobare reinnoita in 2003.
In "Catalogul oficial al soiurilor de plante de cultura din Romania" (ed. 2003) sunt
inscrise 10 soiuri de soia modificate genetic.
Aspecte juridice
In SUA utilizarea organismelor modificate genetic se afla sub controlul strict al
US Food and Drug Administration. Pe baza modelului USFDA, a fost stabilit un cadru de
lucru pentru regimul de siguranta al alimentelor si in Europa. Legea pentru infiintarea
autoritatii in domeniu, European Food Authority (EFA), se afla in stadiul de dezbatere in
Consiliul si in Parlamentul European.
ROMANIA este singura tara din Balcani care a lucrat la o lege a organismelor
modificate genetic. Ordonanta Guvernului nr. 49/2000 a stabilit infiintarea Comisiei
Nationale pentru Securitate Biologica (CNSB), care a fost abilitata sa puna in aplicare
dispozitiile legislatiei nationale si internationale referitoare la regimul activitatilor care
implica utilizarea organismelor modificate genetic prin tehnicile biotehnologiei moderne.
Aceasta aplicare se face numai dupa avizarea scrisa, emisa de Punctul Focal National.
H.G. nr. 106/ 2002 prevede, incepand cu data de 7.02. 2003, etichetarea alimentelor
obtinute din organisme modificate genetic, sau care contin aditivi si arome modificate
genetic, ori sunt obtinute din organisme modificate genetic.
Ordinul M.A.P.A.M. nr. 462/2003 prevede obligativitatea agentilor economici
(persoane fizice sau juridice si asociatii fara personalitate juridica) de a declara, la
directiile pentru agricultura si dezvoltare rurala judetene, respectiv a municipiului
Bucuresti, suprafetele cultivate cu plante modificate genetic, ca si productiile realizate.

Avantajele folosirii codului ISBN sunt:


• identificarea documentelor si editurilor în baze de date bibliografice evitând
confuzia între titluri asemanatoare;
• facilitarea operatiilor de gestiune a stocurilor de carte în biblioteci, edituri, librarii,
agentii de difuzare;
• crearea bazelor de date pentru edituri si lansarea comenzilor pe calculator;
• participarea la programul CIP (Catalogarea înaintea Publicarii).

CE ESTE CODUL ISBN ?

Codul ISBN reprezinta numarul international standardizat al cartii.

Este întotdeauna format din 13 cifre grupate în 5 segmente de lungimi variabile, separate
de cratima:
• prefix 978 – indicativul pentru identificarea producţiei editoriale de carte la nivel
internaţional;
• codul de tara – indica grupul national, lingvistic sau geografic. Acest segment
desemneaza grupul lingvistic (limba) editorului si nu limba în care este publicata cartea;
973 şi 606 identifica editorii din România.
• codul de editura – identifica editorul documentului. Lungimea sa variaza în functie de
numarul lucrarilor publicate de editor;
• numarul de ordine – numeroteaza documentul printre publicatiile editorului;
• cifra de control – este ultima cifra a codului ISBN. Aceasta permite verificarea
validitatii codului ISBN.

Algoritmul de calcul al cifrei de control apartine Agentiei Internationale ISBN de la


Londra.

CATEGORII DE DOCUMENTE CARE PRIMESC COD ISBN

Primesc cod ISBN următoarele categorii de documente

a) Publicaţii tiparite (Printed Books):


• Cărţi şi brosuri tiparite;
• Cărţi audio pe casete, CD sau DVD;
• Atlase şi hărţi geografice cu text;
• Partituri muzicale cu text;
• Publicaţii cu foi volante, cu text (apariţie unică sub un titlu comun);
• Publicatii Braille;
• Publicaţii microforme;
• Publicatii electronice sau online;
• Copii digitizate ale publicaţiilor monografice tiparite;
• Programe de calculator educaţionale sau didactice;
• Publicaţii multimedia;

ISBN – INTERNATIONAL STANDARD BOOK NUMBER

ISBN este un cod international de identificare al cartilor, definit prin ISO 2108.

Agentia Internationala ISBN, cu sediul la Londra coordoneaza toate centrele nationale ISBN. Aceasta
are rolul de a stabili regulile cadru de acordare a codurilor ISBN, protocolul de înfiinţare şi
regulamentul de functionare a centrelor nationale, de a promova si coordona sistemul ISBN la nivel
mondial.
Agentia Internationala ISBN este asistata la nivel ce consultanta de reprezentanti ai ISO – Organizatia
Internationala de Standardizare, IPA – Asociatia Internationala a Editorilor, IFLA – Federatia
Internationala a Asociatiilor de Biblioteci, precum şi un grup privat de agenţii ISBN.

În România, sistemul de numerotare standardizata a cartilor – ISBN a fost introdus in anul 1989.

Sunt mereu întrebată, mai mult sau mai puţin acuzator, cum de reuşim, noi geneticienii, să creăm roşii atât
de frumoase dar fără gust? M-am hotărât să scriu un material, în spiritul hazului de necaz, dat fiind că nu
noi suntem responsabili pentru gustul nesatisfăcător al unor produse de pe piaţa de consum. Şi atunci, cine
ar fi?

Răspunsul la întrebare e clasic: BANII


Afirmaţie: roşiile sunt bune pentru sănătatea omului
Tradus: dacă sunt bune, sunt vandabile

Tradus în româneşte: roşiile sunt materiale comerciale perisabile, înregistrând pierderi uriaşe prin transport,
manipulare şi depozitare.
Soluţia: recoltarea fructelor în fenofază tehnologică
Tradus în româneşte: recoltarea fructelor în fază de gogonele!
Afirmaţie: scopul natural al plantei- comportament natural, de bun simţ: creşterea unui fruct copt-adică,
celule mature, apte de biosinteze de substanţe hrănitoare capabile să hrănească o sămânţă viabilă. Când
sămânţa ajunge la maturitatea fiziologică, în celulele mature se declanşează programul de moarte celulară,
adică are loc sinteza enzimelor cu rol în degradarea peretelui celular al corpului exocarpului, pericarpului şi
endocarpului, în scopul eliberării seminţelor.
Tradus în româneşte: fleşcăirea pulpei fructului întru gloria speciei (eliberarea seminţei)
Afirmaţie: un fruct copt este perisabil
Tradus în româneşte: ce mă interesează pe mine ca producător de FRUCTE, nevoile de drept ale speciei?
Lasă că e alt fermier responsabil cu producerea de seminţe şi răsaduri.
SOLUŢIA?
Genetică, zici tu...şi mulţi alţii ca tine.
Afirmaţie: Genetica e ştiinţă, e aparatură, e tehnologie, e...scumpă.
Afirmaţie: Piaţa înseamă profit- profitul cere soluţii pragmatice: ieftin, simplu, bun pentru mine ca individ,
ce mă doare pe mine capul de sănătatea speciei...umane, vegetale sau care or mai fi!
SOLUŢIA?
Tehnologică, că e accesibilă...în plus, prin recoltarea timpurie reduc şi costurile tehnologice
Că doar cine-s şi tomatele astea?

Regn: Plantae
Increngatura: Tracheobionta
Divizia: Magnoliophyta
Clasa: Magnoliopsida
Subclasa: Asteridae
Ordin: Solanales
Familia: Solanaceae
Genul: Solanum
Specia: S. lycopersicum
Denumirea binomiala
Solanum lycopersicum
(sinonim Lycopersicon esculentum )

The UglyRiped Tomato (roşia cea urâtă) The Tomato (ea, Roşia…)
Roşia de grădină Roşia de cultură mecanizată

Definiţii:
Roşia = (bacă) fruct de mărime medie, acid, de culoare roşie cu nuanţe de la galben la roşu intens
Coacere = dezvoltare completă, maturare
Maturare = atingerea stadiului maxim de dezvoltare NATURALĂ completă: reprezentată prin celule
mature, complete, cu vacuole mari, pline
Maturare în sens general = a ajunge la limita timpului său (Having reached the limit of its time)
Fully grown or developed. Also: Due for payment… adică “complet dezvoltat“= sămânţa- viitoarea plantă
Antonime pentru maturare (cu sens de coacere): verde, imatur, nedezvoltat

Întrebare: De ce ne plac roşiile proaspăt culese din grădină?


Răspuns: pentru că au gust bun.
Întrebare: de ce au altfel de gust?
Răspuns: sunt culese când sunt coapte.
Întrebare: ce înseamnă fructe coapte natural?
Răspuns: fructe mature.

Afirmaţie: Compuşii de genul nucleotidelor, amino acizilor, proteinelor şi carbohidraţilor sunt produşi
metabolici comuni tuturor organismelor. Alături de aceşti metaboliţi primari, plantele produc substanţe
specifice, denumite metaboliţi secundari. Aceste substanţe sunt expresia specializării unor celule şi se
formează ca rezultat al acţiunii unor proteine particulare prin sinteza, metabolismul şi catabolismul
compuşilor endogeni astfel încât sinteza lor este dependentă de un stadiu anume de dezvoltare a celulei
şi/sau de tipul de specializare a acestora.
Acumularea metaboliţilor secundari are loc atât la nivel intra- cât şi intercelular iar sinteza şi
depozitarea lor are loc, în majoritatea cazurilor, în structuri diferite: mezofil, cortex, perişori glandulari
specifici, canale secretorii, etc. Nivelul de acumulare este influenţat de trei capacităţi celulare distincte:
capacitatea de sinteză
capacitatea de depozitare
capacitatea de metabolizare a compuşilor pe parcursul proceselor de transport şi
detoxificare
În plantele intacte, sinteza metaboliţilor secundari este definită de localizare (nivel celular sau
subcelular), separarea temporală între reacţii (ritm sezonier, ritm diurn), tipul de izoenzime implicate în
transferul precursorilor, diferenţieri locale, căi specifice de sinteză, iniţierea enzimatică specifică căii de
sinteză, sinteza unor locusuri autonome (anumite sinteze reclamă organite celulare specifice- de exemplu
cloroplaste, amiloplaste, etc.), de integritatea membranei celulare, etc.
Tradus în româneşte acumularea de substanţe biologic active (vitamine, proteine, enzime, etc.) este direct
influenţată de gradul de maturare al fructului.

De ce consumăm roşiile?

Printre multe altele (ca-s bune, ca-s faine, ca-s vii, ca-s colorate şi vesele, de plăcerea gustului, de musai că
spune mama, din obişnuinţă, că cică-s afrodisiace, etc)….le mâncăm pentru conţinutul lor în:

Licoperină- pigmentul roşu (rol antitumoral, anticancerigen)


Pigmentul roşu a fost evidenţiat în cantităţi mari numai la indivizii recoltaţi la maturitatea deplină (fructe
roşii). Spre deosebire de soiuri, hibrizii tradiţionali se caracterizează prin conţinut redus de licoperină
naturală.
Vitamina C
Are rol în fotosinteză. Este derivată din glucoză, pe calea de sinteză a acidului uronic
Ascorbatul se sintetizează primul, la nivelul peretelui celular, ca primă barieră de apărare împotriva
ozonului. Ascorbatul de la nivelul peretelui celular şi oxidaza ascorbică sunt implicate în controlul creşterii
celulei. Prezenţa unei concentraţii mari de ascorbat şi oxidază ascorbică în celulă contribuie la
extensibilitatea peretelui celular. Ascorbatul are rol dovedit şi în controlul diviziunii celulare prin
influenţarea trecerii de la etapa G1 la etapa S, în ciclul celular.
Vitamina A
Vitamina A este alcătuită din 3 molecule biologic active - retinol, retinal (retinaldehida) şi acid retinoic.
Fiecare dintre aceşti compuşi sunt derivaţi din molecule precursoare de β-carotenă (o moleculă din grupa
carotenoidelor- pigmenţii portocalii) ceea ce face ca β-carotenele să fie denumite provitaminele vitaminei
A.

Carotenoizi- pigmenţii galbeni şi portocalii


Acid glutamic
Alţi 19 aminoacizi

Elemente de tehnologie cu efect asupra alterării gustului


Tramentele fitosanitare (ierbicide, pesticide, insecticide)
La plantele de tomate, metalaxil-ul (compus activ în fungicide) induce variaţiile cantitative şi calitative
asupra conţinutului relativ în apă, pigmenţi, proteine, fenoli şi oxizi polifenolici şi asupra activităţii
peroxidazice în plantele de tomate (ref: Quantitative variations induced by metalaxyl on relative wates
content, pigments, proteins, phenols and on polyphenol oxidase and peroxidase activities of tomato plants)
Auteur(s) / Author(s)
GENNARI M. ; ABBATTISTA GENTILE I. ; CUGUDDA L. ; Rivista di Patologia Vegetale (Riv. Patol.
o
Veg.) ISSN 0035-6441 1983, vol. 19, n 3, pp. 141-149 (13 ref.)
Recoltarea roşiilor
Fructe pentru consum proaspăt

Momentul tehnologic pentru recoltarea tomatelor este stabilit în funcţie de distanţa faţă de piaţa de
desfacere. Pentru desfacerea pe piaţa locală roşiile pot fi recoltate când încep să se coloreze. În cazul
necesităţii transportului şi depozitării pe termene mai lungi, roşiile se recoltează în culoare verde, în
momentul ajungerii fructului la mărimea caracteristică soiului.
Tradus în româneşte : recoltarea în fază de gogonele, fructe imature, cu structuri celulare nedezvoltate
incapabile de sinteza substanţelor aromatice, colorante, bioactive.

recoltare manuală spălarea roşiilor sortarea pe mărimi ambalarea pentru


transport

Fructele verzi sunt sprayate cu Ethrel, cu 48 de ore înaintea scoaterii la vânzare.

reambalarea pentru vânzare


(Ethrel este denumirea comercială a unui produs pe bază de etilenă. Etilena- hormon vegetal cu rol de
inducere a senescenţei.)
Tradus în româneşte: convertirea arificială a pigmenţilor clorofilieni (verzi) în pigmenţi rosii
Tradus în foarte româneşte gogonea vopsită.

Fructe pentru procesare şi industrializare


recoltare mecanizată a plantei bandă mecanică de sortare încărcare în remorcă

Tradus în româneşte: dacă nu ar fi E-urile suplimentare, Ketchup-ul, produs din roşii coapte rezultate după
sortare, trecute spre industrializare dat fiind că reprezintă risc mare de perisabilitate, ar fi superior roşiilor
proaspete. De altfel asta este şi suportul unei campanii publicitare a firmei Heinz: Ketchup against tomato
cruelty .
(vezi: http://www.youtube.com/watch?v=49ePB0m1Q5Y )
(! Poate ar fi interesant de citit si articolul de la adresa http://ro.wikipedia.org/wiki/Marketing_pe_internet)

Ok, cam asta ar fi răspunsul la întrebarea ta.


Acum e târziu dar odată o să-ţi spun ce face totuşi genetica cu roşiile....încearcă să găsească soluţii pentru
încetinirea procesului de coacere care să permită transportul pe distanţe mari (proiectul roşia MacGregor's
al companiei Campbell's Soup Company, Calgene, Inc., in Davis, California), întărirea pulpei prin
transferul unei gene care să determine un conţinut ridicat în lignină a peretelui celular (proiect Sainsbury),
încearcă să găsească o metodă de inhibare a sintezei enzimelor cu rol degradativ, sinteză care apare după
coacerea fructului (proiectul Flavr Savr)- fleşcăirea pulpei roşiei este cauzată de enzima PG
(poligalacturonază)- a fost introdusă o genă care are rolul de a inhiba sinteza acestei enzime, etc...etc.

NUMAI FAPTE BUNE!!!!

Corina Cătană