ANIMALARIOS.

En nuestro laboratorio de investigacin estamos utilizando Conejos knock out a los cuales les estamos generando anticuerpos de conejo contra una protena HIV-1 para lo cual se utilizarn 5 conejos inmunizados por inyeccin intradrmica de las almohadillas plantares. Debemos transportar a dichos ratones a una clnica de Madrid donde el investigador principal trabaja por las tardes y necesita realizar una inmunoprecipitacin Queremos saber las tcnicas cuantitativas y cualitativas para medir dichos anticuerpos. En relacin al supuesto anterior conteste a las siguientes preguntas. 1. Qu es un animal Knock out? el ratn knock-out es el que tiene interrumpida o delecionada una o parte de una secuencia gnica, entonces no genera una protena concreta; mientras que el animal knock-in es aquel al que se le ha sustituido una secuencia gnica por otra diferente o modificada. La tcnica para generar ratones knock-out es compleja y resulta de una combinacin de la tecnologa de DNA recombinante, de cultivos celulares, de clulas stem embrionarias (clulas ES) y de la manipulacion de embriones de ratn. 2. Cules son las fases del ensayo inmunohistoqumico para que nuestro conejo genere anticuerpos si hemos de administrar antgenos a nuestro conejo? El antgeno se inyecta normalmente mezclado con adyuvante, el cual: - Protege el antgeno de ser catabolizado rpidamente Produce una estimulacin de la respuesta inmunitaria

inespecficamente. Se administran varias inyecciones al animal, separadas por varias semanas. Generalmente se ponen 3 inyecciones para que la cantidad de Ac fabricada contra nuestra enzima sea mayor. Una inyeccin cada 4 semanas. La memoria inmunolgica hace que en la 2 inyeccin se fabriquen ms Ac, as sucesivamente hasta un punto en el que desciende. A la dcima semana se desangra el conejo.

3.

Cmo

se

obtiene

el

suero

del

conejo?

En el suero hay muchos tipos de protenas adems de los anticuerpos. El suero contiene multitud de anticuerpos diferentes contra diferentes molculas, incluso en animales sper inmunizados contra un antgeno, los anticuerpos circulantes contra ese antgeno no superan la dcima parte del total. Los anticuerpos contra nuestro antgeno presentes en el suero no son de un slo tipo: hay multitud de ellos, que reconocen diferentes partes del antgeno (anticuerpos policlonales). Proceso de obtencin del suero:

Se desangra el animal y se separa el suero de las clulas sanguneas, la sangre se coagula en 12 h, se centrfuga y separamos, nos quedamos con el plasma que tiene Ac y otras protenas. Generalmente no molestan los dems Ac y para identificar una protena se usa el suero. Tambin se pueden separar los anticuerpos del resto de los componentes del suero (cromatografa de afinidad usando protena-A). Separo los Ac de las protenas por precipitacin diferencial con sulfato amonico 40-60%, los Ac precipitan. Se pueden purificar los anticuerpos dirigidos contra nuestro antgeno por

cromatografa de inmunoafinidad. Pasamos por la columna algo que separe la protena A del Ac, tampones de pH, extremos cidos, se recoge en un tampn neutro para neutralizar hasta obtener un pH de 7-8

Para obtener Ac monoclonales tenemos q inyectar el Ag varias veces a un ratn, le extraemos el bazo y extraemos clulas plasmtica (linfocito B) y las unimos a las clulas del mieloma (un tipo de linfocito B canceroso). De la seleccin de clones productores de Ac, nos quedamos con los que los produzcan en abundancia y de alta afinidad. Es una gran ventaja ya que no hay reacciones cruzadas y se puede mantener indefinidamente el cultivo. Luego por cromatografa de inmunoafinidad con nuestra protena obtenemos los Ac monoclonales.

4. Cmo se produce el Marcaje de Anticuerpos? Los anticuerpos se pueden marcar para permitir su deteccin, lo cual implica la unin covalente al dominio Fc de molculas o tomos fcilmente detectables, tales como: -I125 emisor ! se detecta con contador de centelleo o autoradiografa. - Enzimas que se pegan completas a la regin Fc: - peroxidasa de rbano - fosfatasa alcalina - "-galactosidasa -etc. Deteccin con: * Sustratos que dan lugar a productos coloreados solubles, que se pueden medir en un espectrofotmetro. * Sustratos que dan lugar a productos coloreados insolubles, que forman un precipitado en el lugar en el que se encuentra el anticuerpo, tiles por ejemplo en inmunolocalizacin y western blots. * Sustratos que producen luz * Biotina, luego detectada con avidina/streptavidina (acopladas a algn otro tipo de marcador). La afinidad avidina/streptavidina-biotina es la ms alta conocida, la unin es en la prctica irreversible. * Fluorocromos (por ejemplo Fluorescena y Rhodamina). Deteccin con microscopio de fluorescencia o espectrofluormetro

SUPUESTO N2. 1. Cul es la temperatura de estabulacin del conejo? De 15-21 C 2. Qu es la inmunoprecipitacin? Inmunoprecipitacin Consiste en la separacin de un antgeno de una mezcla compleja mediante precipitacin con el anticuerpo (por ejemplo una protena de un extracto celular).

Pasos a seguir: 1.- Marcaje del antgeno mediante incubacin en un medio que contenga precursores radiactivos del antgeno (OPCIONAL). Normalmente las protenas se marcan mediante incubacin de las clulas con [35S] Metionina 2.- Homogeneizar: rotura de las clulas en un tampn apropiado, usando el mtodo de homogenizacin adecuado en cada caso. 3.- Adicin del anticuerpo al extracto e incubacin para permitir la formacin del complejo antgeno-anticuerpo, en suero policlonales se suelen formar redes, va en funcin de la concentracin de ambos.

4.- Adicin de protena A (constituyente de la pared de S. Aureus, que tiene alta afinidad por las Fc de las IgG) unida a fase slida. Separacin y lavado de sta para eliminar el material no unido. 5.- El complejo antgeno-anticuerpo es normalmente analizado mediante electroforesis seguida de autorradiografa. Pero tambin puede ser usado para estudios enzimticos o de unin de ligandos, western- blots, inmunizar de nuevo un animal, etc.

El resultado de la inmunoprecipitacin depende de: 1. Afinidad del anticuerpo: Para anticuerpos monoclonales se necesitan afinidades del orden de 108 M-1. 2. Abundancia relativa del antgeno: la inmunoprecipitacin es ms sencilla para protenas abundantes, pero es posible para abundancias relativas de hasta 1/1.000.000. cuanto ms abundante mejor. 3. Naturaleza del antgeno: Las protenas insolubles (de membrana) y altamente polimerizadas (citoesqueleto) son difciles de inmunoprecipitar. Necesita anticuerpos de alta afinidad y especificidad, en orden de preferencia: 1. Mezcla de Ac monoclonales: el complejo se une slo por un sitio, por eso hay varios Ac monoclonales, as la protena se une al complejo por distintos epitopos - Ac monoclonal de alta afinidad: slo se une a nuestro Ag - Ac policlonales: precipitan otras protenas junto con nuestro Ag

El ruido de fondo (precipitacin de antgenos diferentes al que se uso para obtener el anticuerpo) es a menudo un problema, sobre todo en el caso de anticuerpos policlonales. Puede deberse a: - Ag q reconoce a mi protena, la reconoce a otras: reacciones cruzadas - Ag policlonales, mi preparacin de Ac est contaminado con Ac q reconocen otras protenas pero no la ma. *Posibles soluciones del ruido de fondo:

1.- Usar la mnima cantidad de anticuerpo y no ms. Habr ms contaminacin cuanto ms bandas hay, son las ms dbiles y al ir diluyendo son las q desaparecen antes.

2.- Aumentar la dureza de los lavados (lavar con tampn pH 9) de las interacciones Ag-Ac se rompen, las 1 son las del ruido de fondo. * Eliminacin de los anticuerpos que producen reaccin cruzada: 1.- Incluyendo en la reaccin de inmunoprecipitacin un exceso de protenas que compitan por estos anticuerpos, por ejemplo albmina bovina (no marcada) para eliminar la interacciones inespecficas o un extracto del mismo organismo obtenido en condicionase en las cuales no se expresa el antgeno de inters. La concentracin de protenas no marcadas pueden aparecer en bandas no marcadas muy dbiles. 2.- Eliminar del suero los anticuerpos que dan lugar a reaccin cruzada mediante una inmunoprecipitacin previa con albmina o con un extracto que no contenga el antgeno de inters.

3.- Ambas cosas a la vez: 1 inmunoprecipitacin previa mutante y luego aadimos el extracto del mutante en exceso en la protena. *Eliminacin del extracto de las protenas que dan lugar a ruido de fondo. 1.- Inmunoprecipitacin previa usando suero preinmune (obtenido del mismo animal antes de la inmunizacin) o suero de una animal de la misma especie no inmunizado. 2.-Eliminacin de los anticuerpos que se unen a la fase slida, mediante inmunoprecipitacin (estrictamente no es una inmunoprecipitacin, porque no hay Ac) previa slo con fase slida, sin anticuerpo (2 Ac). Las protenas del extracto con afinidad a la fase slida o a la protena A precipitan primero.

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3Qu tipos de inmunoensayo conoce ud? A. MTODO DE DETECCIN DEL ANTGENO A.1. Ensayo con dos anticuerpos en sndwich: Se requieren dos anticuerpos monoclonales diferentes (uno marcado y otro no) o anticuerpos policlonales purificados por inmunoafinidad (un parte marcada y otra no). Un Ac en el soporte y otro que aadiremos posteriormente marcado. Se suelen usar anticuerpos monoclonales, porque en los ensayos no puede haber ruido de fondo. Se pueden usar Ac policlonales pero deben estar purificados por

inmunoafinidad, tendramos el Ac dividido en 2 partes, una marcada y la otra sin marcar, se unen a distintos epitopos del Ag. 1.- Unin del anticuerpo no marcado al soporte. 2.- Bloqueo de sitios de unin libres en el soporte. 3.- Adicin de la muestra de antgeno problema y lavado. 4.- Adicin del anticuerpo marcado y lavado 5.- Revelado del marcador.

A.2. Ensayo de competencia. Se requiere antgeno puro, dos posibilidades: a) Captura del antgeno, con anticuerpo limitante: Una cantidad conocida de antgeno marcado se mezcla con la muestra problema (contiene antgeno fro) y ambas se

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ponen en una placa con anticuerpo unido al soporte. Tras incubar y lavar se mide la radiactividad en cada pocillo, cuanto mayor sea la cantidad de antgeno en la muestra, menor ser la cantidad de antgeno radiactivo que se detecta (hay que hacer una curva de calibrado).

b) Captura del anticuerpo, con antgeno limitante. En primer lugar se une antgeno puro al soporte y se aade luego una mezcla de anticuerpo marcado y muestra (con antgeno a determinar). Cuanto mayor sea la cantidad de antgeno en la muestra problema, menor ser la unin de anticuerpo a la fase slida (hay que hacer una curva de calibrado).

A.3. Ensayo por captura de anticuerpo: La muestra problema se une a la fase slida y se aade luego un exceso de anticuerpo marcado.

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Mtodos para la deteccin de anticuerpo? MTODOS PARA LA DETECCIN DE ANTICUERPO Deteccin por captura de anticuerpo, usando un exceso de antgeno: 1.- Unin del antgeno (en exceso) al soporte slido. 2.- Adicin de la solucin problema conteniendo los anticuerpos y lavado (todos los anticuerpos se unen). 3.- Adicin de un anticuerpo 2 marcado (por ejemplo anti-inmunoglobulinas de conejo, obtenidas en cabra, unidas a fosfatasa alcalina) o de protena A marcada. Lavado 4.- Revelado del marcador. Los anticuerpos tambin pueden ser detectados tratndolos como un tipo ms de antgenos, por cualquiera de los mtodos de deteccin de antgenos ya vistos.

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4. Califique segn la ley 30/2007 las siguientes acciones de graves, muy graves o leves 1. Mutilacin no permitida a un animal como por ejemplo cortarle una oreja a un conejo. G 2. Uso de perros o gatos vagabundos en un procedimientos de experimentacin MG 3. Uso de animales en peleas MG 4. Abandonar a un animal con el resultado de la ausencia de control del mismo o su efectiva posesin L 5. Suministrar documentacin falsa a a los inspectores de la administracin MG 6. Tortura de un conejo para conocer su resistencia a la electricidad MG 7. Reutilizar animales aunque la normativa no lo permita G

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