Bioquimia

Volumen Volume

29

Nmero Number

Enero-Marzo January-March

2004

Artculo:

Fagocitosis: mecanismos y consecuencias Segunda parte

Derechos reservados, Copyright 2004: Asociacin Mexicana de Bioqumica Clnica, AC

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Artculo de revisin Inmunologa

Fagocitosis: mecanismos y consecuencias Segunda parte

Oscar Rojas-Espinosa,* Patricia Arce-Paredes**
RESUMEN
Ellie Metchnikoff, en 1880, descubri que la funcin de las clulas fagocticas era esencial para la supervivencia de todas las especies del reino animal. En los organismos unicelulares como los protozoarios, la funcin fagoctica es el nico medio por el cual estos organismos adquieren su alimento. La funcin fagoctica de estas clulas se mejora a lo largo de la evolucin y se mantiene en los animales ms evolucionados, aunque aqu la funcin de los fagocitos deja de ser preponderantemente nutricional para constituirse en un eficiente mecanismo de proteccin no especfico contra agentes infecciosos y de eliminacin de clulas muertas o seniles. Cada etapa del proceso fagoctico (la migracin, el reconocimiento de lo que puede y debe ingerirse, la endocitosis y la destruccin de partculas) se descubre cada vez ms complicada; da a da se identifican ms componentes moleculares y se establecen ms interacciones y rutas metablicas. Aunque el proceso de la fagocitosis no est esclarecido en su totalidad, ahora tenemos una mejor idea de cmo se reconocen las partculas que deben eliminarse y de los mecanismos subsecuentes que llevan a su destruccin. En este artculo, se hace una revisin concisa del proceso de la fagocitosis y se enfatiza su importancia como mecanismo de proteccin en los vertebrados, sealando, aunque de manera somera, aquellos aspectos que en la actualidad son objeto de mayor estudio, incluyendo estructura celular, la existencia y funcin de las protenas de adhesin, los receptores para endocitosis, las protenas G, las cascadas de sealizacin, la maduracin de los fagosomas, y la generacin de los metabolitos txicos del oxgeno y el nitrgeno. Palabras clave: Fagocitosis, clulas fagocticas, bioqumica, neutrfilos, macrfagos.

ABSTRACT
In 1880 Ellie Metchnikoff established the phagocytic cells function as an essential process for the survival of animal species. In the unicellular organisms, such as the protozoa, the phagocytic function is the only means through which these organisms acquire their next meal. The phagocytic function improves through evolution and remains so in the more evolved species, although here the primary function of phagocytes is no longer a nourishment-related activity but it turns into an efficient mechanism of protection against infectious agents and of elimination of senescent or abnormal cells. Every step of the phagocytic process (migration, adhesion, endocytosis and particle destruction) appears each time more complex, and new molecules and mechanisms are continuously discovered. Although the whole phagocytic process is not yet fully understood, now we have a better panorama on the way phagocytic cells recognize those particles that must be eliminated and the mechanisms following thereafter. In this article a concise review is made on the phagocytic process and its importance as a protection mechanism of vertebrates, pointing out those aspects receiving major attention at the present, including cell-structure, adhesion proteins, phagocytosis-endowed receptor molecules, signalling pathways and participant molecules, maturation of phagosomes, and the role of the nitrogen and oxygen-derived intermediaries as potent antimicrobial toxins.

Key words: Phagocytosis, phagocytic cells, biochemistry, neutrophils, macrophages.

* Doctor en Ciencias, Departamento de Inmunologa ** Ingeniero Bioqumico, Departamento de Ingeniera Bioqumica Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, Instituto Politcnico Nacional. Correspondencia: Dr. Oscar Rojas-Espinosa Departamento de Inmunologa, Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, Instituto Politcnico Nacional. Carpio y Plan de Ayala, Colonia Santo Toms, 11340 Mxico, D.F., Mxico. e-mail: rojas_espinosa@hotmail.com

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Financiamiento: Coordinacin General de Estudios de Posgrado e Investigacin (CGPI) del IPN. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) Recibido: 09-10-2003 Aceptado: 03-12-2003

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LA QUIMIOTAXIS Ya mencionamos que la reaccin inflamatoria en un sitio de lesin tisular, promueve la acumulacin de clulas fagocticas en ese sitio. En lesiones de tipo agudo, las clulas predominantes son los leucocitos PMN; en lesiones crnicas, sobre todo en aqullas en donde operan los mecanismos de la inmunidad celular, las clulas predominantes son los fagocitos mononucleares (monocitos/macrfagos: MN/Mfs). La ocurrencia de traumas en las superficies protectoras del cuerpo (mucosas o queratinizadas), por muy pequeas que sean, permiten la entrada de microorganismos. En un medio ambiente tan rico en componentes nutritivos, los microorganismos empiezan a proliferar y al hacerlo generan y liberan productos de su metabolismo que en cantidades pequesimas, del orden de nanogramos o aun de femtogramos (1 x 10 -12 - 1 x 10 -15 g), se difunden en los tejidos circundantes y son capaces de modificar la fisiologa de las clulas fagocticas al interaccionar con receptores especficos sobre ellas induciendo su migracin hacia el sitio de lesin (Figura 7) . Dentro de ciertos lmites, este fenmeno de migracin o quimiotaxis, es ms marcado mientras mayor es el grado de lesin y mientras mayor es la concentracin de los factores quimiotcticos liberados al microambiente tisular (las altas concentraciones de factores quimiotcticos generalmente son txicas para las clulas). El estudio de diversos productos microbianos naturales con actividad quimiotctica, condujo al descubrimiento y a la posterior sntesis comercial del tripptido fMLF, un agente con alta actividad quimiotctica. La desnaturalizacin de componentes tisulares propios por efecto del trauma o la infeccin, tambin puede generar la formacin de factores con actividad quimiotctica. Otros factores con actividad quimiotctica (estudiados usando la cmara de Boyden en alguna de sus mltiples versiones) son los intermediarios o productos que resultan de la activacin del complemento (C5a, los fragmentos de C3 hidrolizados por proteasas y plasmina, y el complejo C5b, 6, 7), los factores quimiotcticos para neutrfilos y monocitos (quimiocinas) producidos por los linfocitos T activados, y otras molculas. La interaccin entre los factores quimiotcticos y sus receptores sobre las clulas fagocticas no slo inicia la migracin dirigida de las clulas, tambin induce la liberacin de enzimas y de metabolitos del oxgeno (ver cambios bioqumicos), sin embar-

Figura 7. La reaccin inflamatoria temprana promovida por infeccin se caracteriza por la acumulacin de leucocitos polimorfonucleares que son atrados al sitio de infeccin por factores quimiotcticos derivados de los microorganismos. La figura en el panel superior muestra la histologa de la piel, 10 minutos despus de la inoculacin en punto con S. aureus. La presencia de un pequeo cogulo de sangre en el sitio lesionado es la nica evidencia de la reaccin inflamatoria. Cuatro horas despus de la infeccin (panel inferior) la acumulacin de leucocitos PMN es extensa tanto en la lesin como en la dermis subyacente.

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go, las concentraciones de los factores que inician las funciones de migracin y de secrecin de las clulas son muy diferentes; la quimiotaxis ocurre a bajas concentraciones de los quimioatractantes (ng-fg), la secrecin sucede a concentraciones 10 a 50 veces mayores. La quimiotaxis requiere de energa (ATP) y de la presencia de calcio y magnesio, lo cual indica que se

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Figura 8. Citoesqueleto en macrfagos del peritoneo de ratn. Preparaciones teidas con un anticuerpo anti-tubulina marcado con fluorescena (100X).

Cuadro V. Protenas componentes del citoesqueletoa. Estructura Microtbulos Protena Tubulinas y ( en centrmero) Actina Prot. asociadas MAPs Quinesinas Dinenas Miosinas Timosina 4 Profilina CapZ Gelsolina ADF, cofilina, actoforina y depactina Plectina

Microfilamentos

Filamentos intermedios

Vimetina y vimetin-like filaments

*Adems de las sealadas, otras protenas como tropomiosina, calmodulina, cadherina, MARKS y varias GTPasas, proteincinasas y fosfatasas, participan en la regulacin de la actividad del citoesqueleto.
a

Basado en las referencias 36-41

trata de un proceso metablicamente activo. Como todas las funciones celulares que implican movilidad, la quimiotaxis depende de la existencia y funcin de las estructuras contrctiles de las clulas que constituyen el citoesqueleto.

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Aunque se conocen muchas protenas asociadas al citoesqueleto, las estructuras constitutivas del mismo ms conspicuas son los microtbulos, los

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microfilamentos y los filamentos intermedios (Figura 8 y Cuadro V) . Los agentes que destruyen los microtbulos (colchicina, vinblastina, vincristina) inhiben la quimiotaxis a concentraciones relativamente elevadas (10 -4 a 10 -5 M). La citocalasina B, la cual deprime la funcin de los microfilamentos, inhibe reversiblemente la quimiotaxis y la movilidad celular a concentraciones mayores de 1.0 g por mL. Estos agentes, a concentraciones bajas pueden tener el efecto contrario, incrementando la movilidad y la quimiotaxis. Recientemente, Vicente-Manzanares y cols 36 publicaron una extensa revisin sobre citoesqueleto, sus componentes y funciones, cuya lectura recomendamos ampliamente. Microtbulos Los microtbulos son estructuras relativamente grandes, rgidas y cilndricas construidas a base de 2 monmeros de - y -tubulina. Cada microtbulo est compuesto por 13 filamentos ordenados en forma paralela y acomodados como un tubo de longitud variable cuya luz mide unos 150 de dimetro. Los microtbulos forman una red compleja en todas las clulas nucleadas. Tambin existen en cilios, flagelos, y en la cola de los espermatozoides (y participan en el movimiento activo de estas estructuras), as como en los husos mitticos donde son responsables del movimiento de los cromosomas durante la mitosis.37 Los microtbulos citoplsmicos generalmente se encuentran en un estado de rpido ensamblaje y desensamblaje, un proceso que depende de la presencia de Ca++ y de cAMP. El ensamblaje de los microtbulos es inhibido por alcaloides, los cuales se fijan con gran afinidad a la tubulina. Varias protenas asociadas participan en la funcin de los microtbulos, entre ellas las protenas MAPs (Microtubule Associated Proteins ) que promueven su polimerizacin, y protenas de las familias de las quinesinas y dinenas, que utilizando ATP como fuente de energa funcionan como motores que impulsan el movimiento de vesculas y organelos sobre y a lo largo de los microtbulos. 36 Los microtbulos tambin participan en el movimiento y distribucin de protenas de la membrana celular ya que el tratamiento de las clulas con alcaloides o con agentes que alteran los microtbulos, altera tambin la distribucin de las protenas de membrana inducida por lectinas o por anticuerpos. La asociacin de las protenas membranales con el

sistema de los microtbulos puede ocurrir de manera directa o a travs de los microfilamentos o de los filamentos intermedios. Microfilamentos Los microfilamentos son estructuras construidas a base de subunidades idnticas o muy similares a la actina del msculo esqueltico. 38 La actina se encuentra organizada en la forma de largos cables de 50 de dimetro, compuestos por unidades de monmeros de actina (actina G). Los monmeros de actina tienden a polimerizar para formar actina F y la polimerizacin est regulada por diversas protenas, como la timosina 4 que secuestra a los monmeros de actina, la profilina que evita la polimerizacin espontnea y la protena CapZ que estabiliza los polmeros ya formados evitando que se incorporen o se remuevan ms monmeros de actina. Otras protenas reguladoras de la polimerizacin de la actina incluyen a la gelsolina, y las protenas ADF, cofilina, actoforina, depactina y otras, que promueven el desensamblaje de la actina. En las clulas, los microfilamentos estn asociados con la miosina citoplsmica 39 y con la tropomiosina . 40 Los microfilamentos existen en 2 formas distintas: una red laxa de fibras cortas asociada a las estructuras de la superficie interna de la membrana plasmtica (sensibles a citocalasina B) y manojos de fibras que corren por debajo de la membrana, adyacentes a ella. Ambos tipos de microfilamentos son contrctiles y juegan un papel importante en todo tipo de movimiento celular, incluyendo cambios de forma, movimiento al azar y dirigido, endocitosis, secrecin de productos, etc. Filamentos intermedios Los filamentos intermedios reciben este nombre por su dimetro que es intermedio entre el de los microfilamentos y el de los microtbulos. Se forman por la polimerizacin tetramrica de largos filamentos compuestos por uno de tres tipos de protenas: las queratinas (en epitelios), las vimetinas (en leucocitos y fibroblastos, desmina en clulas musculares) y los neurofilamentos (en clulas del sistema nervioso). Los filamentos intermedios confieren resistencia estructural y alta plasticidad a la clula que le permiten soportar altas tensiones externas como las que ocurren cuando las clulas pasan a travs de uniones intercelulares durante la diapdesis.41

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Otras protenas asociadas al citoesqueleto

ORE

Aparte de la miosina y la tropomiosina citoplsmicas, otras protenas mayores como MARKS, gelsolina y profilina , interaccionan con la actina modulando su actividad. El contacto de neutrfilos con quimioatractantes promueve, en pocos segundos, ciclos de polimerizacin y despolimerizacin de la actina. La polimerizacin de la actina G para formar la actina F, proporciona a la clula la arquitectura reticular dinmica necesaria para soportar todas las funciones celulares. Las seales que se originan al interaccionar un ligando quimiotctico con su receptor membranal se conectan con el citoesqueleto a travs de la actina F. El ordenamiento lineal de la actina F requiere de la participacin de las otras protenas citoplsmicas accesorias. La gelsolina y la profilina, por ejemplo, se encuentran asociadas de manera no covalente con la actina monomrica en las clulas en reposo. La estimulacin quimiotctica de las clulas provoca que estas protenas se disocien y entonces ocurre la polimerizacin de la actina. Despus, cuando el estmulo quimiotctico ha cesado, la gelsolina y la profilina se reasocian con la actina promoviendo su despolimerizacin. Las altas concentraciones de calcio inhiben la asociacin de la profilina con la actina mientras que las bajas concentraciones la promueven. La funcin de estas protenas modula la actividad del citoesqueleto y permite su interaccin con lpidos y protenas de la cara interna (citoplsmica) de la membrana.42,43 Las protenas que forman parte del citoesqueleto de las clulas fagocticas se enlistan en el cuadro V. Aspectos bioqumicos de la quimiotaxis El uso de quimioatractantes sintticos (como el fMLF) radiactivos, ha permitido saber que el movimiento celular se inicia inmediatamente despus del contacto del quimioatractante con receptores especficos presentes en la membrana. El diisopropil-fluorofosfato (DFP) y los p-nitrofenil-etil-fosfonatos (inhibidores de esterasas con serina en su sitio activo), deprimen la respuesta quimiotctica de los leucocitos PMN slo cuando stos estn en presencia del quimioatractante pero no cuando los PMN, o el quimioatractante son tratados separadamente, o preincubados con los inhibidores. Esto sugiere que en la respuesta quimiotctica participa, entre otras protenas, una serina-esterasa, la cual existe como zimgeno, insensible a fosfonatos, en las clulas en reposo. Uno de

PMN en reposo

Urpodo

Lamelipodio

Figura 9. La quimiotaxis de las clulas fagocticas es un fenmeno dinmico altamente complejo. Se inicia en la membrana con seales qumicas que se transducen al citoplasma promoviendo la funcin del citoesqueleto (ver texto). En presencia del agente quimiotctico, las clulas se orientan y se desplazan dejando ver un extremo caudal globular llamado urpodo y un extremo frontal aplanado llamado lameilopidio.

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los primeros estudios realizados con PMN de conejo, permiti calcular que existen unas 500 molculas de proesterasa por clula. Los PMN se trataron primero con DFP fro para inactivar las serina-esterasas presentes en estado activo, despus las clulas se lavaron exhaustivamente, se activaron con C5a en presencia de DFP radiactivo, y luego se midi la cantidad de DFP consumido. La afinidad de los receptores celulares por el quimioatractante fMLF est alostricamente regulada por la actividad de protenas G;44 la unidad efectora del complejo terciario (segundo mensajero) podra ser una fosfolipasa, una protein-cinasa, una metil transferasa, o alguna otra. En las membranas de los PMN humanos el receptor para fMLF existe en 2 estados de afinidad que son interconvertibles. Las dosis bajas del quimioatractante y los receptores de alta afinidad favorecen la transmisin de seales quimiotcticas; las dosis altas y los receptores de baja afinidad inician la produccin y secrecin del anin superxido. Las clulas en movimiento y la direccin del mismo, se pueden distinguir con relativa facilidad. Las clulas que se desplazan sobre una superficie en respuesta a un estmulo quimiotctico muestran un frente aplanado (lamelipodio) y un extremo caudal globular (urpodo); las clulas en reposo, muestran su caracterstica forma redonda (Figura 9).

La opsonizacin es un fenmeno que mejora el proceso de la endocitosis y que requiere de la interaccin de las partculas ingeribles con factores del suero de

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Agente quimiotctico

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Cuadro VI. Factores del suero con actividad de opsoninaa. IgG1, IgG2, IgG3 IgM en presencia de Ca++ (slo en el ratn) C3b y C3bi Globulinas alfa-1, alfa-2, beta-1 Protena C-reactiva Fibronectina (?) Colectinas (protena enlazadora de manosa, MBP) Protena surfactante A, SP-A (en lquido pleural)
a

Regulacin de la actividad de los receptores para opsoninas Johnson y cols.48 observaron que el cultivo de macrfagos sobre superficies recubiertas con fibronectina, incrementaba la capacidad de estas clulas para endocitar partculas de agarosa opsonizadas con C3b y con C3bi, y encontraron que la fibronectina se enlazaba a las esferas de agarosa cuando stas se encontraban recubiertas con C3b, C3bi o C3d, pero no cuando se encontraban recubiertas con suero descomplementado. Sugirieron que el dominio C3d portaba el principal sitio de unin de la fibronectina y que sta era una opsonina. Sin embargo, ya antes se haba demostrado que la fibronectina promova el enlazamiento pero no necesariamente la ingestin de partculas por los fagocitos;49 esto puso en duda el papel de la fibronectina como una autntica opsonina. No obstante, aunque la fibronectina no actuase exactamente como una opsonina, sus fragmentos de hidrlisis liberados por proteasas de neutrfilos son quimiotcticos para monocitos, promueven la activacin de receptores para C3 y Fc, e incrementan la actividad bactericida de los monocitos.50 Por su parte, Wright y Silverstein51 encontraron que los receptores para Fc son constitutivamente promotores de endocitosis, mientras que los receptores para C3 (C3b, C3bi y C3d) no lo son. Los MN humanos normales y los Mfs peritoneales de ratn, adhieren partculas opsonizadas con C3 pero no las ingieren con la avidez que lo hacen los MN inflamatorios y los Mfs peritoneales de ratn activados con el ster forblico del cido mirstico (PMA) o sus anlogos.52 Wright y cols.53 proponen que in vivo, la actividad de los receptores para C3 (y derivados) podra estar regulada por protenas plasmticas del tipo de la fibronectina. In vitro, los receptores para C3 podran activarse cuando los fagocitos (MN) se adhieren a superficies cubiertas por fibronectina o cuando las partculas opsonizadas con C3 han previamente interaccionado con fibronectina en solucin. El hecho de que la fibronectina tambin se adhiera a bacterias, a fibrina y a colgena desnaturalizada, sugiere algn papel de la fibronectina en la promocin de la endocitosis, quiz por reorientacin de los receptores para C3 (CR1 y CR3) o por incrementar su expresin membranal. Otro mecanismo de regulacin de la actividad de los receptores para C3, se infiere del trabajo de Griffin y Griffin54 quienes encontraron que los LcT activados, elaboran factores solubles que interaccionan con receptores especficos sobre la membrana de los MN incrementando su capacidad para endocitar par-

Basado en las referencias 45, 50, 56

diversa naturaleza denominados opsoninas. Las opsoninas incluyen anticuerpos (fundamentalmente IgG), componentes del complemento, y algunas otras protenas presentes en el suero, en el moco y en el fluido pleural45 (Cuadro VI). El papel de las opsoninas como promotoras de fagocitosis est relacionado con la presencia de receptores para ellas en la membrana de las clulas fagocticas. En el caso de los anticuerpos, por ejemplo, stos funcionan como opsoninas una vez que han interaccionado con determinantes antignicos homlogos presentes en las partculas ingeribles. Los leucocitos PMN y los MN de la mayora de las especies, tienen receptores especficos para la regin Fc de las inmunoglobulinas IgG1, IgG3, IgG2 e IgG4, en ese orden de abundancia; lgicamente, el tratamiento con pepsina del anticuerpo destruye su actividad opsonizante. Aparte de los anticuerpos IgG, ninguna otra clase de inmunoglobulina muestra actividad opsonizante, aunque se ha descrito en el ratn una poblacin de anticuerpos IgM monomricos que funcionan como opsoninas en presencia de Ca2+. En 1977, Kaplan46 observ que los macrfagos de ratn endocitaban eritrocitos de carnero (GRc) de manera diferente segn stos estuvieran opsonizados con IgG o con C3b. Encontr que los receptores para Fc y para C3b se encontraban distribuidos homogneamente en la superficie celular. Los GRc-IgG se ingirieron por medio de finas extensiones de la membrana celular las cuales fijaron firmemente a las partculas en estructuras en forma de copa; slo despus las partculas fueron realmente endocitadas. Los GRc-C3b, en cambio, parecieron hundirse directamente en el citoplasma celular, sin la participacin de extensiones membranales. Estos patrones de endocitosis, sin embargo, no son absolutos: Johnson y Eskeland,47 por ejemplo, tambin observaron la endocitosis de partculas de agarosa recubiertas con C3b o con C3bi, a travs de estructuras membranales en forma de copa.

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tculas opsonizadas con complemento. Estos factores solubles probablemente correspondan a las quimiocinas MIP (Macrophage Inflammatory Protein), MAP (Monocyte Chemotactic Protein) e IL-18, o a otras citocinas activadoras de macrfagos. ENDOCITOSIS La endocitosis, el mecanismo por el cual las partculas penetran a las clulas; usualmente ocurre a travs de receptores localizados en regiones de la membrana revestidas por clatrina. El proceso comprende la invaginacin de la membrana plasmtica alrededor del material extracelular, formando una vacuola fagoctica. En la mayora de los casos, la vacuola se fusiona, reversiblemente, con los lisosomas para dar origen a la vacuola digestiva o fagosoma. Esta fusin permite el contacto de la partcula fagocitada con las hidrolasas lisosomales del fagocito. Como resultado de esta actividad, continuamente se remueven porciones de la membrana plasmtica para formar la envoltura de la vescula endoctica. En cuanto al destino de este material membranal, inicialmente se supuso que la membrana celular incorporada en los fagosomas era rpidamente destruida por las enzimas lisosomales, sin embargo, la velocidad de incorporacin de membrana durante la endocitosis era muy alta en comparacin con la velocidad de su degradacin. Tambin se sugiri que el material membranal simplemente se incorporaba y se retena en la membrana del fagolisosoma pero esta proposicin no se sostuvo cuando se demostr que las membranas lisosomal y plasmtica diferan grandemente en su composicin qumica, enzimtica y antignica. Adems, ya que toda la membrana plasmtica est comprometida con la formacin de vesculas fagocticas, gran parte de la membrana debera perderse de la superficie celular al mismo tiempo que los lisosomas deberan aumentar su tamao en proporcin a la cantidad de membrana interiorizada. Como esto no sucede, Tulkens y cols.55 propusieron una hiptesis que ha prevalecido hasta la fecha. Segn esta hiptesis, durante el proceso de fusin fago-lisosomal, los componentes transportados por las vesculas podran: (a) mantenerse ligados a los componentes de la membrana celular, (b) permanecer en solucin, o (c) ligarse a la fraccin de membrana lisosomal, segn las afinidades particulares entre ligandos y membranas. Enseguida, cuando las dos vesculas (fagosoma y lisosoma) se separasen, los componentes endocitados o sus productos de hidrlisis podran ser reciclados al exterior junto con la membrana celular, o podran ser retenidos en los lisosomas para

ser procesados y posteriormente integrados al citoplasma. De esta manera, aquellos ligandos que tuvieran gran afinidad por componentes de la membrana celular, seran retenidos firmemente por la membrana y reciclados junto con ella a la superficie celular. Los ligandos sin una afinidad particular por la membrana externa, podran ser retenidos en los lisosomas, como ya se coment antes. Aunque Tulkens acepta que esto es quiz una sobresimplificacin del fenmeno, la hiptesis es aplicable a la endocitosis de molculas solubles y de partculas, una vez que stas han sido digeridas en la vacuola fagolisosomal. Receptores mediadores de endocitosis La ingestin de microorganismos por las clulas fagocticas ocurre a travs de dos tipos de receptores: los receptores para constituyentes propios de los microorganismos (Pattern-Recognition Receptors), y los receptores para opsoninas.56 Los primeros incluyen a los receptores para manosa (MR), los receptores para mananas e integrinas (DEC-205), y los receptores para lipopolisacridos (ScR, Scavenger Receptors ), adems de otros, mientras que los segundos, incluyen a los receptores para la protena fijadora de manosa (MBPR, Mannose-Binding protein Receptor), la cual tambin es reconocida por el receptor para C1q, los receptores para la protena surfactante A (SPR2), los receptores para inmunoglobulinas IgG (FcR), y los receptores para complemento C3b (CR1) y C3bi (CR3) (Cuadro VII). TRANSDUCCIN DE SEALES La mayor parte del conocimiento sobre las vas de sealizacin que conducen a la fagocitosis proviene
Cuadro VII. Receptores relacionados con fagocitosisa. Receptor MR DEC 205 ScR (CD14) MBPR SPR 210 FcRI FcRII FcRIII CR1 (CD35) CR3
a

Ligando Carbohidratos con manosa Mananas e integrinas CD11b/CD18 Lipopolisacridos (LPS) Protena enlazadora de manosa (MBP) Protena surfactante A IgG2a IgG1 e IgG2b IgG3 C3b, C3bi C3bi

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Basado en las referencias 1, 56, 63

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del estudio de los receptores para inmunoglobulinas (FcR).57-59 Estos receptores, en los fagocitos humanos, incluyen a FcRI, Fc RII y Fc RIII. Fc RII es una sola cadena polipeptdica con un dominio extracelular, un dominio transmembranal, y un dominio intracitoplsmico con dos regiones ITAM (immunoglobulin gene family tyrosine activation motif ). 57,60 Los receptores FcRI y FcRIII carecen de ITAMs en sus dominios citoplsmicos pero se encuentran asociados a protenas adaptadoras (dmeros de cadenas gamma) que tienen las regiones ITAM requeridas para la transduccin de seales. El entrecruzamiento de los receptores FcRI y FcRIII por sus ligandos correspondientes, promueve la fosforilacin de tirosinas en los dominios ITAM de las subunidades gamma.57 La protein-tirosin-cinasa inicial (PTK) responsable de esta fosforilacin es Lyn, un miembro de la familia Src. Las tirosinas fosforiladas en los dominios ITAM funcionan como sitios de unin de alta afinidad para los dominios SH2 de las proten-tirosin-cinasas Src y Syk. Syk fosforila a la protena p85bp y sta se torna un sitio de captura para la protein-inosin 3 cinasa, PI3-K.61 PI3-P cataliza la formacin de fosfoinositidos fosforilados como PIP3 el cual se enlaza a una protena enlazadora de PIP3 (PIP3bp). sta y otras protenas, a travs de las

GTPasas Rac o Ras, promueven la polimerizacin de la actina. As, la activacin de Syk inicia una serie de cascadas de sealizacin que son causa de activacin transcripcional, rearreglos en el citoesqueleto, y liberacin de mediadores inflamatorios.62-66 El entrecruzamiento de los receptores IgR por sus ligandos, resulta, finalmente, en la polimerizacin de la actina y la fagocitosis, y aunque no se conocen todos los pasos de estos procesos, se sabe que participan varias protenas, entre ellas la proteincinasa PI-3 (PI-3K), GTPasas de las familias Rho (Cdc42 y Rac) y ARF, proteincinasa C (PKC), y otras como WASP, Arp2/3, y Rab.66,67 En algunos casos se ha podido discernir que varias protenas actan de manera jerrquica, como ocurre con las GTPasas de la familia Rho, donde Cdc42 participa en la formacin de filopodias y en la activacin de Rac, Rac estimula el ondulamiento de la membrana y activa a Rho, y Rho estimula la formacin de fibras de adhesin local.68 Estos eventos se ilustran en la figura 10. Los receptores TLR (Toll like-receptors) El descubrimiento de los receptores parecidos a las molculas toll de Drosophila , TLR (Toll like-receptors) en los macrfagos, deriv del estudio de la molcula CD14 presente en estas clulas. Se vio que la molcula CD14 interaccionaba con ciertos lpidos y lipopolisacridos microbianos (LPS de microorganismos Gram-negativos; cido lipoteicoico, LTA, de microorganismos Gram-positivos y lipoarabinomananas, LAM, de micobacterias), estimulando en los macrfagos la sntesis y secrecin de IL-1, IL-6 e IL12. Esto fue un hallazgo desconcertante porque se saba que la molcula CD14 careca de un dominio
Figura 10. El entrecruzamiento de los receptores FcR por sus ligandos, origina una serie de seales en la que participan proteincinasas, GTPasas, ATPasas, protenas adaptadoras y otras protenas asociadas, que culminan con la polimerizacin de la actina, la fagocitosis y el movimiento celular en general (esquema basado en las referencias 57, 58, 61-64, ver detalles en el texto).

Partcula opsonizada con IgG

FcgRIIA

FcgRI g g

FcgRIIIA g g

IP2 Regiones ITAM Y-P Y-P SyK-PTK PI3-K P-Y P-Y Y-P Y-P P-Y P-Y Y-P Y-P PI3-K

IP3

PIP3bp

Lyn (Src-PTK) PTK ZAP-70

Arp2/3 WASP

PI-3K

Rab

GTPasas

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Fosfatidil inositol ACTINA Extensin de seudpodos

ACTINA: Cdc42 (filopodias)

Rac (ondulamiento de membrana) Rho (fibras de adhesin local)

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intracitoplsmico prominente y que por lo tanto no era una molcula transductora de seales. 69 La incgnita se despej cuando se encontr que las clulas de mamfero tambin contenan protenas estructuralmente relacionadas con las protenas Toll de Drosophila , tambin encargadas de neutralizar microorganismos, razn por la cual estas protenas se llamaron TLR (Toll-Like Receptors). En mamferos se han identificado cuando menos diez protenas TLR (TLR1 a TLR10) (Cuadro VIII), todas con un dominio intracitoplsmico y una regin homloga al receptor para IL-1, y por lo tanto, capaces de transducir seales. Ahora se sabe que el LPS se enlaza directamente a TLR4 en una reaccin facilitada por la molcula CD14. Aunque hay vas particulares de sealizacin y activacin celular segn el TLR involucrado, una secuencia representativa de eventos podra ser la siguiente:70 la interaccin del TLR con su ligando promueve el reclutamiento de la protena adaptadora MyD88 con el receptor. El complejo formado, recluta a su vez a alguna(s) de las cinasas asociadas al receptor para interleucina-1 (IRAK1/IRAK4). Durante la formacin de este complejo, IRAK4 se activa ocasionando la hiperfosforilacin de IRAK1, lo cual promueve la asociacin de TRAF6 (TNF-Receptor Associated Factor 6) con el complejo. La asociacin entre IRAK4/IRAK1/TRAF6 causa cambios conformacionaCuadro VIII. Receptores TLR en mamferos y sus ligandosa. Receptor TLR1 Ligando Triacil-lipopptidos (bacterias, micobacterias) Factores solubles (Neisseria meningitides) Peptidoglicanas y lipoprotenas Glicoinositolfosfolpidos (Trypanosoma cruzi) Glicolpidos (Treponema) Porinas (Neisseria) Zimosan (levaduras) ARN de doble cadena (virus) Lipopolisacridos (Gram-negativos) cido lipoteicoico (Gram-positivos) Lipoarabinomananas (Micobacterias) HSP60 y HSP70 (propias del huped) Flagelina (bacterias) Lipoprotenas (diacil-lipopptidos de micoplasma) CpG ADN

les en uno o ms de estos factores, ocasionando su separacin del complejo IRAK1/TRAF6 del receptor y su traslocacin a la membrana donde interacciona con otro complejo preformado compuesto por TAK1 (TGF- activated kinase), TAB1 (TAK1-binding protein-1) y TAB2. Esta interaccin induce la fosforilacin de TAB2 y TAK1, los cuales entonces se traslocan al citosol junto con TRAF6 y TAB1. TAK1 es subsecuentemente activado en el citoplasma para activar a su vez al inhibidor de B (IB). El IB inactivo secuestra al NF-B en el citoplasma pero su activacin induce su fosforilacin y degradacin con la consecuente liberacin de NF-B. El NF-B liberado pasa al ncleo donde se asocia a promotores de genes codificantes de citocinas (Figura 11). La importancia de los TLRs en la inmunidad innata se deduce de situaciones como la observada en los ratones C3H/HeJ, donde una mutacin homocigtica en tlr-4 est relacionada con defectos de sealizacin y con alta susceptibilidad a infecciones por microorganismos Gram-negativos. Rafts y caveolas Adems de la entrada de microorganismos a las clulas fagocticas a travs de receptores para opsoninas y de receptores de reconocimiento de patrn, algunos de ellos al menos, tambin pueden penetrar a los fagocitos a travs de rafts y de caveolas71 (Figura 12). Los rafts son microdominios lipdicos presentes en las membranas plasmtica y endosomal de todas las clulas eucariticas. Estas regiones se encuentran enriquecidas en colesterol, glucoesfingolpidos y glucolpidos con fosfatidil inositol a travs de los cuales se enlazan a las membranas celulares. Las caveolas por su parte, son una variedad de rafts, localizadas en la membrana plasmtica que adoptan una forma de botella y que adems de los lpidos antes mencionados tienen unida al colesterol una o ms protenas de la familia de las caveolinas (caveolinas 1, 2 y 3) que se encuentran recubriendo la superficie citoplsmica de la caveola. Las caveolinas transportan colesterol del reticuloendoplasma donde se produce, a la caveola y regulan la actividad de las protenas de sealizacin (tirosin cinasas) que se encuentran en la caveola. Una revisin muy comprensible sobre caveolas, caveolinas y su funcin fue publicada recientemente por Schlegel y Lisanti.72 Algunos de los microorganismos que penetran a las clulas a travs de rafts y caveolas son bacterias (Escherichia coli, Mycobacterium bovis BCG, Campylobacter jejuni), virus (SV40, sarampin, influenza) y

TLR2

TLR3 TLR4

TLR5 TLR6 TLR9

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No se han identificado con certeza los ligandos naturales para TLR7, TLR8 y TLR10.
a

Basado en las referencias 69, 70

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LPS

CD14

TLR-4

MyD88 IRAK-4 IRAK-1 IRAK-1 TRAF6 TRAF6

IRAK-1 IRAK-1 TRAF6 TRAF6

TAK-1 TAK-1 TAB-1 TAB-1

TAB-2

TAB-2 TRAF6 TRAF6 I I B B II B B NFB

TAK-1 TAK-1 TAB-1 TAB-1 IKK1 IKK1 IKK2 IKK2

CITOCINAS

mARN NFkB Prom Prom Gene Gene

NCLEO

Figura 11. El LPS se enlaza con alta afinidad a CD14, una protena glicosilada unida a fosfatidilinositol de la membrana de los macrfagos, y a la protena TLR4. Esto conduce a la activacin de la protena transmembranal TLR4 y a la iniciacin de una cascada de sealizacin intracelular. La sealizacin desde TLR4 hasta el complejo transcripcional de NF-B e IB ocurre a travs del reclutamiento del factor de transcripcin MyD88, de las quinasas asociadas al receptor para IL-1, IRAK-4 e IRAK1, del factor 6 asociado al receptor para el factor de necrosis tumoral (TRAF-6) y de las quinasas inductoras de NF-B (IKK1 e IKK2). Estas quinasas fosforilan a IB ocasionando su rpida degradacin y la liberacin de NF-B, el cual entonces pasa al ncleo donde se enlaza a secuencias promotoras especficas de genes inmunomoduladores, promoviendo la sntesis de citocinas y de molculas coestimuladoras que regulan la actividad de las clulas T y B, mediadoras de la inmunidad especfica (esquema basado en las referencias 69, 70).

protozoarios (Plamsodium falciparum), pero las especies mencionadas seguramente no son las nicas que pueden hacerlo.73 Todava se desconocen las cascadas de sealizacin y las consecuencias que derivan de la interaccin de los microorganismos con los rafts y las caveolas de las clulas fagocticas pero seguramente tienen que ver con la induccin de la respuesta inflamatoria. MADURACIN DE LA VACUOLA FAGOSOMAL Poco despus de la internalizacin de la partcula ocurre la despolimerizacin de la actina F que en un principio queda asociada al fagosoma, y la recin desnudada membrana vacuolar se hace accesible a los endosomas tempranos.74 Luego, a travs de una serie de eventos de fusin y de fisin, la membrana vacuolar y su contenido maduran, fusionndose con endosomas tardos y finalmente con lisosomas para formar el fago-

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lisosoma. La velocidad de la fusin fagolisosomal vara ampliamente dependiendo de la partcula ingerida pero, en la mayora de los casos, es completa a los 30 min.75-77 Tambin se ha propuesto que la naturaleza de la superficie de la partcula ingerida modifica la velocidad de maduracin del fagosoma y que las superficies hidrofbicas de las micobacterias, por ejemplo, interfieren con la fusin de los fagosomas con otros organelos.78 La fusin fagolisosomal no necesariamente implica la fusin completa de las membranas, el paso del contenido lisosomal a la vacuola fagoctica puede ocurrir a travs de puentes acuosos estrechos que slo permiten el intercambio limitado del contenido vacuolar, fenmeno que permite preservar la identidad especfica de cada organelo, y que es congruente con el concepto de reciclamiento de la membrana.79,80 Varias protenas participan en la maduracin del fagosoma, dentro de ellas, las anexinas. Estas protenas se enlazan a fosfolpidos en una forma dependien-

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E. coli M. bovis BOG C. jejuni

V. Sv40 V. Sarampi n V. Influenza

P. falciparum

raft

Caveola

Caveolina(s)

Transducci n de se ales (GTPasas, PKs, Fosfatasas, MPs, TFs)

Efectos

ORE

Figura 12. Algunos microorganismos penetran a las clulas fagocticas a travs de micro-regiones lipdicas llamadas rafts. Estas regiones contienen altas concentraciones de colesterol y de glicoesfingolpidos. Algunas veces las micro-regiones lipdicas aparecen como invaginaciones en forma de botella (caveolas) cuya superficie citoplsmica est recubierta por protenas de la familia de las caveolinas. Los microorganismos que utilizan esta va de entrada son bacterias, virus y protozoarios. Las caveolinas participan en el transporte de colesterol del citoplasma a la membrana y regulan la actividad de las protenas de sealizacin presentes en la caveola (proteincinasas). A travs de cascadas de sealizacin, en las que intervienen GTPasas, proteincinasas (PKs), fosfatasas, protenas motoras (MPs), y factores de transcripcin, las seales iniciadas en las caveolas se traducen en diversos efectos, entre ellos la polimerizacin de la actina y la activacin del citoesqueleto. En la ilustracin se sealan algunos de los microorganismos que pueden penetrar a travs de rafts y caveolas (esquema basado en las referencias 76-78).

te de calcio y funcionan como puentes entre la mem:rop odarobale FDP brana y el citoesqueleto.81 Otras protenas como las GTPasas rab5, rab7 y rap1 (protenas G pequeas), VC ed AS, cidemihparG se asocian secuencialmente a los fagosomas, conforme stos maduran La presencia de estas protenas es necesaria para que ocurra la fusin de arap los fagosomas con otros organelos que tambin las contienen. As, la presencia acidmoiB de rab5 arutaretiL en los fagosomas :cihpargideM permite su fusin sustradode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c con los endosomas tempranos, ricos en rab5, mientras que la adquisicin posterior de rab7 por los fagosomas, permite su fusin con los endosomas tardos, abundantes en rab7 y rap1.82-84 Como resultado de su interaccin con el compartimento endosomal, los fagosomas no slo presentan cambios en la composicin de su membrana, tamm2d3gr 1p(h)3c

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bin muestran cambios en su contenido; por ejemsustradode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c plo, adquieren tempranamente catepsina H, una enzima abundante en los endosomas tempranos, y cihpargidemedodabor ms tardamente catepsina S, una enzima distintiva de los endosomas tardos. 85 Conforme maduran, los fagosomas se mueven sobre los microtbulos y esto les permite interaccionar con los componentes del sistema endosomal; el trfico de los fagosomas sobre los microtbulos est dirigido por una serie de protenas como la dyneina, la dynactina y la kinesina. 86 Una revisin detallada del sistema endosomal, sus componentes y su funcin, aparece en un artculo publicado por Clague en 1998 87 y puede servir de base para los interesados en esta rea de investigacin.

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CAMBIOS METABLICOS ASOCIADOS A LA ENDOCITOSIS Como resultado de su contacto con partculas ingeribles, ocurren en las clulas fagocticas una serie de eventos asociados a cambios morfolgicos y bioqumicos que incluyen la adherencia de la partcula y su englobamiento, la formacin de la vacuola digestiva y la desgranulacin lisosomal, con liberacin de enzimas y otros componentes dentro de la vacuola digestiva. En general, los eventos morfolgicos asociados con vacuolacin y desgranulacin parecen ser muy similares en PMN y en macrfagos, sin embargo, los monocitos pueden tener la capacidad de sntesis continua de nuevos grnulos en su activo complejo de Golgi, la capacidad de desechar productos bacterianos por exocitosis y la capacidad para sobrevivir al acto fagoctico, en contraste con los PMN que generalmente mueren.
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Volumen 29 No. 1 Enero-Marzo 2004. pp 18-31

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