Sunteți pe pagina 1din 3

Imunoelectroforeza Metoda imunoelectroforezei, din punct de vedere metodologic, const n asocierea electroforezei n gel, cu metoda dublei difuzii. Principiu.

Iniial se realizeaz separarea electroforetic n gel, a componentelor unui amestec proteic, i ulterior, n acelai gel se difuzeaz lateral un imunoser precipitant specific. Fiecare component antigenic, care dup electoforez se afl ntr-o anumit poziie n gel, reacioneaz separat cu anticorpii corespunztori. Se formeaz linii de precipitare, specifice ca poziie, diferitelor componente proteice ale probei de cercetat. Pentru o bun evideniere a arcurilor de precipitat, gelul trebuie s fie lipsit de sarcin electric, apos i transparent. Gelul de amidon permite o bun separare a componentelor proteice ale unui amestec, dar nu este transparent. el mai bun este gelul de agaroz !."#. Prin micrometoda Sc$eidegger, gelul se repartizeaz pe o lam de microscop. %ceast variant este larg folosit deoarece are avanta&ul rapiditii. Materialele necesare sunt cele enumerate la metoda electroforezei. 'or li se adaug ser monospecific sau polispecific i tanele pentru tierea godeurilor. Modul de lucru (. Pregatirea lamelor este similar cu cea descris la metoda electroforezei. - Stanarea, la &umtatea lamei )sau la *+, din lungimea ei- a unui godeu cu diametrul de , mm. - Se repartizeaz (/-*! 0l antigen )ser din proba de cercetat- colorat cu albastru de bromfenol. olorantul se leag de albumina din ser i permite evidenierea procesului de migrare a proteinelor. Stanarea a dou anuri longitudinale, de * mm lime, la distan de / mm, de o parte i alta a godeului central. *. Migrarea n campul electric este similar cu cea electroforetic )/ m%1/!2+lam-. Se ntrerupe c3nd spotul albuminei colorate a&unge la ( cm de captul lamei. 4up migrare, se scoate gelul din anurile longitudinale i se repartizeaz antiserul, care poate s fie monospecific sau polispecific )antiproteinele totale ale componentelor din amestecul antigenic-. Serurile imune se prepar pe capr, iepure, cal. Fiecare component al amestecului antigenic reacioneaz cu anticorpii corespunztori i formeaz arcuri de precipitare. ele mai bune antiseruri sunt cele obinte pe iepure, apoi cele obinute pe capr, deoarece atat unele c3t i altele produc comple5e imune insolubile n e5cesul de antigen i lrgesc progresiv zona de precipitare. Serurile imune preparate pe cal, n e5ces de antigen, solubilizeaz comple5ele formate. 'amele se aeaz n camere umede ) de sticl sau material plastic-, n care se gsete $3rtie de filttru mbibat n ap cu adaus de uSo6 )in$ibiroe al fungilor- i se pstreaz la temperatur constant p3n a * a zi. 'a ,7!, precipitarea este mai rapid. 8emperatura optim pentru formarea precipitatelor este de ("!. %rcurile de precipitare ale proteinelor serice cu un antiser polispecific apare la intervale diferite de timp, n funcie de concentraiile celor doi reactani.

9n antiser monospecific trebuie s evidenieze un singur arc de precipitare. %ntiserul polispecific trebuie s evidenieze, prin arcuri distincte de precipitare, c3t mai multe componente ale amestecului antigenic )Fig. (:-. Citirea olorarea lamelor - 'amele se spal *6 de ore n ap fiziologic, cu sc$imbarea apei la *-, ore, pentru indeprtarea proteinelor care nu au reacionat specific, apoi n baie de ap distilat (-* ore. - 9scare cu $3rtie de filtru i apoi incubare la ,7!. 4up uscare pe lam rm3ne o pelicul fin, aderent. olorarea cu amestecul amidosc$;arz-azocarmin. - Splare cu ap de robinet, uscare ntre dou $3rtii de filtru i apoi la temperatura camerei. <5aminarea lamelor se face pe faa opus gelului. 9tilizarea metodei imunoelectroforetice. Imunoelectroforeza cu imunoseruri antiser uman este larg folosit n laboratorul clinic, n scopul obinerii informaiilor cu privire la modificrile cantitative ale unor componente serice, n special pentru precizarea izotipului unor componente monoclonale ) n cazul mieloamelor-. 4e e5emplu metoda electoforezei confirma e5istena unor componente gamaglobulinice mononucleate, dar nu ofer posibilitatea identificarii clasei lor. Imunoelectroforeza identific clasa creia i aparine componenta monoclonal, deoarece n mielom, arcul respectiv de precipitare este deformat. Pentru proteinele serice umane, pe lama de imunoelectroforez se identific liniile de precipitare i se compar cu numarul i cu aspectul lor dat de serul normal de referin . %pari ia unor modificri ale unei linii de precipitare cunoscut sugereaz e5istena unor variaii cantitative ale proteinei corespunztoare. el mai adesea linia de precipitare este mai lung i mai clar, sau mai groas. %lteori se bifurc n *-, linii, sau se diminua p3n la dispariie. 'ipsa liniei de precipitare nu semnific absena componentei antigenice corespunztoare, ci numai diminuarea sa cantitativ. %lteori absena liniei de precipitare semnific o cretere important a cantitii proteinei respective. 4e aceea se impune repetarea probei cu diluii ale serului de cercetat. Imunoelectroforeza este o metoda ilustrativ, util in cercetarea bioc$imic pentru evidenierea arcurilor de precipitare date de componentele antigenice ale unui amestec, dupa separarea lor n c3mp electric. <ste o metoda absolut necesar pentru producerea de antiseruri monospecifice, deoarece permite controlul puritii lor, pe baza evidenierii liniilor de precipitare dup contactul serului monospecific, cu amestecul antigenic comple5. Se detecteaz prezena anticorpilor nedorii n ser i astfel se identific antigenele necesare pentru absoria lor. Pentru ca rezultatele s fie c3t mai concludente cu privire la caracterul monospecific al serului este necesar obinerea pe organisme ale unor specii diferite. =n serul uman normal s-au identificat peste 7/ de proteine, dintre care (/ au fost izolate n stare de nalta puritate. <le reprezint >:# dintre proteinele serice totale. ?estul de 6#, este

alctuit din cel puin :! de proteine@ enzime, $ormoni proteici, factori de coagulare a s3ngelui, etc. %naliza imunoelectroforetic a serului sanguin uman permite detectarea a peste *! de linii de precipitare, dac se folosete un ser polispecific obinut pe iepure, capr, berbec, etc. %vanta&ele metodei imunoelectroforetice - Metoda permite determionarea numarului de componente ale unui amestec antigenic, care reacioneaz cu anticorpii din imunoser i produc o linie de precipitare. - <videniaz componentele antigenice prezente n cantiti mici. - <videniaz distinct c$iar componetele cu greutate moleculara identic , deoarece formeaz arcuri de precipitare distincte. %rcurile de precipitare a dou proteine se suprapun numai n cazul n care cele * componente au aceeai mobilitate electroforetic, au aceai vitez de difuzie, iar raporturile cantitative antigen+anticorp la care se formeaz comple5ele imune sunt deasemenea identice. ?ealizarea simultana a acestor , condiii are o probabilitate foarte mic. Aumrul arcurilor de precipitare trebuie considerat ca minim, pentru numrul componentelor antigenice ale unui amestec comple5, deoarece nu toate componentele unui amestec vor forma linii de precipitare. 4e cele mai multe ori, antiserul nu conine anticorpi corespunztori pentru toate componentele antigenice ale amestecului respectiv. Aumrul arcurilor de precipitare formate de un amestec antigenic, cu imunoserul polispecific corespunztor, depinde de organismul pe care s-a obinut imunoserul. Imunoserul este un produs biologic i e5ist mari variaii de rspuns la stimularea antigenic, nu numai de la o specie la alta, ci i de la un organism la altul, n cadrul aceleai specii. 4in acest motiv, pentru a detecta c3t mai multe componente antigenice ale unui amestec este necesar s se foloseasc imunoseruri obinute pe diferite specii de animale. 4ezavanta&e. omponentele antigenice care trebuie identificate ntr-un amestec trebuie s aib proprieti antigenice, adic s induc sintez anticorpilor in organismul imunizat. Metoda imunoelectroforetic este mai ales calitativ i permite numai o apreciere semicantitativ a componentelor, prin modificri ale liniilor de precipitare.