Boletim de Pesquisa 122 e Desenvolvimento ISSN 1676 - 1340

Maio, 2006

A Contaminao In Vitro de Plantas

Recursos Genticos e Biotecnologia

ISSN 1676 - 1340 Maio, 2006

Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 122

A Contaminao In Vitro de Plantas

L. Pedro Barrueto Cid Miguel Jordan Zimmermann

Braslia, DF 2006

Exemplares desta edio podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia Servio de Atendimento ao Cidado Parque Estao Biolgica, Av. W/5 Norte (Final) Braslia, DF CEP 70770-900 Caixa Postal 02372 PABX: (61) 3348-4739 Fax: (61) 33403666 www.cenargen.embrapa.br e.mail:sac@cenargen.embrapa.br Comit de Publicaes Presidente: Sergio Mauro Folle Secretrio-Executivo: Maria da Graa Simes Pires Negro Membros: Arthur da Silva Mariante Maria de Ftima Batista Maurcio Machain Franco Regina Maria Dechechi Carneiro Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro Supervisor editorial: Maria da Graa S. P. Negro Normalizao Bibliogrfica: Ligia Sardinha Fortes Editorao eletrnica: Maria da Graa S. P. Negro Fabrcio Lopes dos Reis Rodrigues 1 edio 1 impresso (2006): B 268 Barrueto Cid, Luis Pedro. A contaminao in vitro de plantas. / Luis Pedro Barrueto Cid e Miguel Jordan Zimmermann. Braslia, DF: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 2006. 20.p. - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, ISSN 1676-1340 ; 122). 1. Planta cultura in vitro. 2. Planta - contaminao. Micropropagao. I. Zimmermann, Miguel Jordan. II. Srie. 3.

631.53 CDD 21

Sumrio

Resumo................................................................................................................................5 Abstract ...............................................................................................................................6 Introduo ...........................................................................................................................7 Esterilizao do material....................................................................................................8 1.- Tcnicas baseadas em calor ................................................................................8 2 - Tcnicas baseadas em compostos qumicos.....................................................8 Contaminao bacteriana e fngica ...............................................................................10 Uso de antibiticos...........................................................................................................11 Uso de fungicidas.............................................................................................................14 A cultura de tecidos e os fungicidas (xenobiticos).....................................................15 Referncias Bibliogrficas...............................................................................................18

A Contaminao In Vitro de Plantas

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L. Pedro Barrueto Cid

Miguel Jordan Zimmermann 2

Resumo Considerando os diferentes campos onde a cultura de tecidos de plantas atua : floresta, agricultura, floricultura, plantas medicinais, transformao etc., ela uma poderosa aliada do agronegcio moderno. Entretanto, um obstculo inevitvel ao uso desta ferramenta surge no horizonte quando o problema assepsia do explante proveniente do campo. No presente trabalho, apresentada uma breve sinopse sobre este particular, especialmente dirigido para quenes comeam nesta atividade bem como, para laboratrios de cultura de tecidos envolvidos no dia a dia na micropropagao. Esperamos que tal publicao venha a preencher de maneira pratica, til e barata a escassez de informao bibliogrfica especifica sobre este particular.

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Embrapa-Recursos Genticos e Biotecnologia, Braslia DF. Departamento de Ecologia, Facultad de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catolica de Santiago, Chile.

Abstract Tissue culture is a powerful and multipurpose biotechnique, branded to agriculture business that has been widely used for the production and improvement of forest, crop, ornamental and medicinal species as well during plant transformation. However the technique is handicapped by some unavoidable problems such as biotic contamination, when using plant material brought from the field. To this respect, the present report reviews some possible alternatives to attenuate or eliminate this constrain, especially for beginners or tissue culture laboratories, in solving common problems during micropropagation. We hope we can illustrate and resume in an easy and practical way some useful data overcoming by this way the lack of bibliographic information available respect this issue.

Introduo A cultura de tecidos alm de desenvolver linhas de pesquisas de carter bsico ligadas fisiologia de plantas, bioqumica, gentica etc, tambm desenvolve protocolos de micropropagao de plantas elite para o agronegcio visando produo de alimentos, fibras e energia (ex. cana/lcool), todo esto, dentro de um contexto de desafios e novas expectativas em relao a uma populao mundial cada vez mais vida de input para dar suporte a uma taxa de incremento populacional cada vez mais desenfreada e aterradora e que, na atualidade empurra a populao mundial para a casa de 6 bilhes pessoas com um incremento anual de aproximadamente 90 milhes de pessoas (SINCLAIR e GARDNER, 1998). Este panorama nos conduz ento, a um agronegcio que precisa pautar-se por melhores e novas tecnologias, para aumentar as safras agrcolas, diminuir custos de produo, reduzir a dependncia externa de tecnologia, enfim, aumentar a eficincia do setor. Nesse sentido, a cultura de tecidos de plantas tem um importante papel a desempenhar pois, de seus protocolos devem surgir plantas mais uniformes, produtivas e livres de toda classe de patgeno. Mas a clonagem de plantas a partir de explantes oriundos do campo, oferece dificuldades prtica no sempre fcil de sobrepor, como por exemplo, assepsia dos explante uma delas. Um pais com as dimenses do Brasil, oferece uma diversidade de climas, micro-climas e plantas que estimulam uma ampla gama de interao microorganismo hospedeiro, por isso, um explante pode alojar uma infinidade de microorganismo localizados externamente ou internamente , tais como bactrias, fungos, vrus, viroides etc, que seno controlados eficientemente antes de inocul-lo no meio nutritivo, iro contaminar o material onde se realiza o cultivo inviabilizando as tentativas de micropropagao, por isso, no apenas imprescindvel esterilizar o explante seno que todo o material e ambiente em contato com ele na cmara de fluxo laminar. A descontaminao do explante bem como todo o processo de assepsia ipsis litteris, um grave desafio no apenas para quem se inicie na cultura de tecidos de plantas seno que tambm, para quem j tem uma longa tradio nesta rea, por isso, o presente survey como uma maneira fcil e simples de oferecer uma informao no sempre disponvel de maneira expedita e econmica.

Esterilizao do material A esterilizao em cultivos in vitro, pode ser realizada atravs de tcnicas fsicas ou qumicas, de forma separada ou combinada a seguir, um relato suscito delas. 1.- Tcnicas baseadas em calor a) Autoclave: Visando a esterilizao dos meios nutritivos, a temperatura de 121C durante 20 minutos, o padro usado para o controle de diversos patgenos. A pesar do calor produzido poucos cmbios qumicos, com excepo de alguns compostos orgnicos, parecem acontecer na composio e solubilidade dos componentes destes meios, ou ao menos, se existiram no parecem afetar o crescimento nem limitar o potencial morfognico de diversos explantes. Por outro lado, h compostos termolabis (ex. antibiticos, giberelinas, entre outros) participando na composio destes meios, mas nestes casos, adicionam-se ao meio j autoclavados atravs da filtragem estril ( usando membranas Millipore ou outra marcas). b) gua quente: Segundo Langens-Gerrits et al. (1998), alcana-se boa desinfestao em explantes de Lilium e Acer via tratamento com gua quente, numa faixa de 42C 45C, (1 o 2 horas), contudo, existe o risco de danificar o tecido. claro que a extenso do dano est associado ao tamanho e especialmente tipo de tecido utilizado, j que, sabidamente sementes, bulbos, etc apresentam maior tolerncia ao calor. c) Calor seco: Conforme Grum et al, (1998) o tratamento de calor seco em feijo (Phaseolus vulgaris), 47-48 C por 3 dias, foi eficaz para a eliminao da contaminao dos pices caulinares. d) Termoterapia: consiste em manter plantas contaminadas em fitotrons ou casas de vegetao a altas temperaturas e umidade por alguns dias, fatores estes que se incrementam lentamente uma vez iniciado o tratamento. Esta tecnologia muito usada na eliminao de vrus (PVX) em batata e ornamentais. Conforme Leonhardt et al., (1998), em parreiras foi possvel a eliminao de vrios vrus atravs desta tcnica, usando uma temperatura constante de 35C por um perodo de 6-8 semanas. 2 - Tcnicas baseadas em compostos qumicos. Os produtos qumicos usados, devem ser avaliados previamente dentro de um esquema fatorial concentrao versus tempo para observar seu impacto sobre o explante. Assim,

concentraes baixas de um agente desinfetante com tempos de tratamentos muito curtos, favorecem a sobrevivncia dos explantes, mas no necessariamente sua desinfestao. No caso inverso, o controle do patgeno pode ser muito eficiente porm, a viabilidade dos explantes reduzir-se significativamente, provocando perdas do material, e no caso deste ser raro ou escasso creia-se uma dificuldade muito sria para a continuao do trabalho. O grau de desinfestao e a resposta do explante pode variar conforme o material usado. Teng et al., (2002), comparando a resposta de dos espcies de Panax desinfestao constaram que o material que foi levemente desinfestado, mostrou uma menor infestao com boa formao de calos e embriognese. Por outro lado, Prachi et al., (2002) verificaram que o cido saliclico (AS)-gerado pelo explante, nas condies in vitro empregadas por eles, induziu resistncia ao patgenos em calos de jengibre quando um filtrado de Fusarium oxysporum foi adicionado aos calos no meio de cultivo. Inclusive, agora estamos conhecendo a ao do cido ascrbico pela sua atividade antiplasmidial, a qual, permite abrir amplas pesquisa neste campo, j que anular a virulencia plasmidial, a todas luzes um fato de grande importncia (Ambile-Cuevas, 2003). Isto revela a gama de respostas que so possveis a propsito dos explantes quando colocados perante um processo de assepsia. Dentre os produtos ms comuns usados na assepsia dos explantes, est o hipoclorito de Na (NaHClO) usado geralmente na ordem do 2% ou mais, entre 5-30 min. Sua grande vantagem a solubilidade em gua e portanto, sua fcil remoo evitando efeitos residuais txicos que puderam provocar pardeamento (browning) via oxidao fenlica, sendo as quinonas resultantes, altamente txicas para o metabolismo celular, de a que, a incorporao ao meio de PVP ( polivinilpirrolidona) seja uma pratica desejvel quando o browning um problema grave. No processo da assepsia o hipoclorito de Na pode usar-se s ou numa seqncia que implique usar outros compostos tais como gua oxigenada, (H2O2);Cloreto de Hg, lcool etc. O perxido de hidrogeno (H2O2) pode ser usado numa faixa de 10-12%, sendo alm do mais, fcil em remover. Pelo contrario, cloreto de Hg (HgCl2) ms difcil de eliminar e sua eficincia depende do tecido por exemplo, embries de caf so muito sensvel a sua presena, J folhas de caf so mais resistente e pode ser usados em nveis de 0.1-1.0% por 1 minuto. Imerses rpidas em etanol so tambm usadas, embora o tempo de imerso deve ser muito critico pela sua toxicidade, especialmente em explantes menores.

O etanol pode ser usado na sua formulao comercial, cerca de 90 %, ou numa diluio de 70 % de 1 a 3 minutos. Os explantes oriundos de plantas de campo, sempre so um problema respeito a sua assepsia. No caso de macieiras o uso de 0.1% 8-HQS (8-hidroxi-quinolinol-sulfato) por 24 horas, reduziu a infeo e o browning numa faixa entre 50 90 % (HANZER et al., 2005). Semelhantemente Leonhardt et al. (1998), indicaram que a eliminao de vrios vrus em parreiras foi possvel por tratamento dos pices com uma soluo de Chinosol al 1g/l , por 3 min, o qual igualmente baseado em HQS. Outros produtos, menos citados no controle de enfermidades em plantas, porm, bastante usados em animais, so os nuclesidos anlogos. Jordan et al., (1983) reportaram explantes livre do mosaico da batata (PVX), a partir de pices caulinares contaminados, quando cultivados em mdio com Virazole (1--D-ribofuranosil-1,2,4triazole-3-carboxamida). Na var. Urgenta, o efeito pude-se observar j aos 15 dias de cultivo em faixas de 5-10 mg/l, atingindo-se mais de 70% de pices sem sintomatologia, e de 100%, usando nveis de 25 ou 50 mg/l em outras variedades testadas. Concentraes ms altas no mostraram resultados consistentes em quanto a decontaminacin embora si afectan el crecimiento y desarrollo de los explantes. PPM (Plant Preservative Mixture) um composto quimico que foi encontrado eficaz para reduzir a contaminao dos explantes da ornamental Paeonia duffruticosa (BERUTO et al., 2004) e respeito a sua ao, se inibitrio ou no sobre a morfognese, foi verificado que apenas uma alta concentrao (10 ml/l) inibieu a organognese em melo (Cucumis melo L.) e petunia (Petunia hybrida H.) porm, no assim em tabaco (Nicotiana tabacum L.) cuja andrognese no foi afetada, sugerindo que a influncia do PPM sobre morfognese depende da espcie (COMPTON e KOCH, 2001).

Contaminao bacteriana e fngica Em principio existiriam trs alternativas para contornar a contaminao. A primeira, o uso de meristemas. Mas este procedimento laborioso at demais, pelo que, no muito pratico. A segunda, usar compostos qumicos (hipoclorito Na, antibitico, fungicida etc) e a terceira simplesmente usar plantas estreis, quando por exemplo, coletamos ramos do campo e depois de uma assepsia externa, os galhos ( sem folhas) os fazemos brotar dentro de uma cmara mida, e a partir de aqui, extramos os explantes: folhas ou gemas, mesmos assim, uma assepsia convencional requerida como j

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mencionado anteriormente. Por enquanto, nos referiremos ao problema de contaminao bacteriana e depois em outro item, contaminao fngica.

Uso de antibiticos. A contaminao bacteriana tem sido abundantemente relatada em trabalhos de fitopatologia de plantas. Entre estas bacterias esto: Erwinia ananas (abacaxi); Erwinia carotovora (batata); Pseudomonas syringae (soja); Xantomonas campestri (feijo); Pseudomonas cepacia (cebola), enfim a lista comprida e complexa demais, porque X. campestri, por exemplo, tambm pode ser encontrada em outras culturas (ROMEIRO 1995). Por esta abundncia de bactrias em plantas, no de estranhar que em USA, por exemplo, o uso de antibiticos na agricultura comeara por volta de 1955 com o uso de sulfato de estreptomicina e agora mais recentemente com o uso de oxitetraciclina para controle de: E. amylovora, Pseudomonas spp. e , a qual inclusive, tem sido injetada no tronco das rvores (MCMANUS et al., 2002). Em funo desta constatao que o uso de antibiticos, como estratgia teraputica, na cultura de tecidos de planta e no mbito agronmico ainda persistente, a pesar de que, existe um olhar de desconfiana em torno a seu uso pela questo da induo de resistncia plasmidial. Agrava tal desconfiana, o fato que em agricultura, a quantidade de antibitico ou quimioterpicos usados esta sendo maior que no campo da sade humana (AMABILE-CUEVAS, 2003) e alm disso, uma dosificao no exata de antibiticos pode provocar a morte de frutos e vegetao como tem ocorrido em plantaes de nogais, requerendo-se depois, vrios anos para recuperar dita atividade e por isso mesmo com tremendas perdas econmicas (JORDAN, 2006) 3 . Os antibiticos na sua definio clssica so substncias produzidas por microorganismos que inibem ou matam outros microrganismos. Em relao as bactrias, os antibiticos, podem ser agrupados conforme seu modo de ao: inibidores de sntese de: parede celular (cefotaxima, penicilina), protenas (cloranfenicol, gentamicina, canamicina, estreptomicina, tetraciclinas, puromicina, cicloheximida), DNA (Enoxacin), RNA (actinomicina D, rifampicina). Tambm existem os que alteram a permeabilidade inica das membranas, mitocndrios, (valinomicina, gramicidina A). Por outro lado, eles tambm podem ser agrupados conforme sua estrutura qumica: aminoglicosdeos (canamicina, neomicina, estreptomicina, gentamicina, G 418), quinolonas (enoxacin,
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ZIMMERMANN, Miguel Jordan. Arquivos eletrnicos [mensagem pessoal]. Mensagem recebida por < lpedro@cenargen.embrapa.br >. Em 2006.

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ofloxacin); -lactamicos (penicilina, carbenicilina, ampicilina, cefalosporina); glicopeptdeos, (vancomicina); polimixinas (B-E), (REED e TANPRASET, 1995). No uso de antibiticos no se pode deixar de considerar o papel da colorao Gram da estirpe bacteriana: se positiva ou negativa, de a que, antibiticos de grande espectro de ao (Gram + e -), sejam importantes inicialmente devido, a que os laboratrios de cultura de tecidos rotineiramente no dispem de informaes taxonmicas das bactrias contaminantes. Diferente o caso de Agrobacterium tumefaciens, que sabidamente Gram negativa, e freqentemente combatida nos protocolos de transformao com cefotaxima ou carbecilina, e mais recentemente, com timentin, um derivado da penicilina (NAUERBY et al., 1997). Um ideal de antibitico poderia apresentar caractersticas como por exemplo: estabilidade frente as variaes de pH, ser sistmico, no apresentem efeitos colaterais (afetar germinao, sntese de clorofila, etc.), ser solvel em gua e no ser afetados por ions, anions ou cations, (FALKINER, 1990). Conforme j apresentado, os antibiticos podem afetar a processos sensvel dentro da bactria (sntese de protena, cidos nuclicos), e como a nvel molecular estes processos so parecidos com os da clula vegetal, torna-se necessrio ficar atento a problemas de fitotoxicidade, o qual, tambm decorrncia da concentrao usada. A contaminao bacteriana normalmente aparece nas placas como uma mancha redonda, lisa, brilhante de cor branco ou bege, podendo emergir da periferia do explante ou, em qualquer lugar do meio, quando por conseqncia inadequada manipulao na cmara de fluxo laminar (Fig.1).

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Fig. 1. Contaminao bacteriana aparecida numa placa petri ( 90 x 10mm) aps ser autoclavado o meio SP, e distribudo nas placas. Neste procedimento, normalmente aps o meio ser vertido nas placas estas ficam abertas por alguns minutos, ocasio em que pode eventualmente consumar-se alguma contaminao. No presente, caso a cultura tem aproximadamente 5 dias de idade e a contaminao apareceu como descrita.

Em geral, para a cultura de tecidos de planta os -lactamicos podem ser mas recomendados pela sua menor toxicidade, (atacam parede celular bacteriana, sendo que, alguns deste grupo apresentam mais resistncia -lactamase (cefotaxima, cefoxitin), que outros antibiticos (penicilina) (POLLOCK et al., 1983). As dose in vitro em que estes antibiticos podem ser usados podem variar entre 100 a 500 mg/l. A cefotaxima a 100 mg/l presente em meio SP, foi encontrada no afetar germinao, formao de razes ou crescimento das mesmas quando presente in vitro, em sementes de: aipo, (Apium graveolens), beringela (Solanum melongena L.), cebola (Allium cepa, L.), tomate (Lycopersicon Lycopersicum)) e gemas axilares de mandioca, (Manihot esculenta, C.) inclusive mais, o crescimento em muito casos teve um efeito sinergista respeito ao controle, (BARRUETO CID e DURZAN, 2003). Paradoxalmente tambm, existem registros dando conta sobre este efeito sinergista da cefotaxima sobre organognese

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de calos de trigo, na dose de 60g/ml (MATHIAS e BOYD, 1986). Nos casos de alta virulncia, grande poder de colonizao e toxigenicidade, combinaes de antibiticos tambm tem sido descritas para contornar o problema da contaminao. Assim, aminoglicosdeos (estreptomicina) com beta-lactamicos (carbenicilina) e rifampicina foram usadas com relativo sucesso em concentraes que variaram de 50 mg/l at 400 mg/l (LEIFERT et al., 1992), em outros casos, a mistura consistiu em rifampicina, cefotaxima e tetraciclina cujas concentraes variaram entre 60, 250 e 25 mg/l respectivamente (GANAPATHI, et al., 1992). Tanprasert e Reed (1998) tambm mostraram que combinaes de antibiticos foram mais efetivos que antibiticos isolados, quando usados em morango na seguinte terapia: timetin, estreptomicina e gentamicina usados respectivamente a 125, 250 e 6.25 mg/ml. Como os antibiticos em geral so termolbeis, existe a necessidade de filtr-lo atravs de membranas (0,2 micras de poro) e incorpor-lo ao meio depois este ser autoclavado, sendo isto, o modus operandis na totalidade dos casos. Ultimamente, a literatura de cultura de tecidos tem alertado sobre um efeito novo dos antibiticos em plantas, qual seja, aquele da hipermetilao do DNA, acarretando mudanas associadas diferenciao em processos tales como a embriognese somtica e organognese conduzindo a variaes epigenticas, bem como em muitos casos, a silenciamento de genes. Esta observaes podem ser criticas especialmente no mbito do processo de obteno de plantas transgnicas, onde antibiticos so usados intensivamente como agentes seletivos (SCHMITT et al., 1997) Finalmente seria bom lembrar que toxigenicidade um conceito ligado s toxinas difusveis produzidas pelas bactrias, sendo as mesmas, protenas termolbeis, purificveis, cristalizveis e geralmente associada a bacterias Gram + , pela sua termolabilidade agentes fsicos como o calor destruem elas (MCCARTY, 1974). A toxigenisidade em plantas um capitulo interessante dentro da fitobacteriose, porm, precisamos conhecer mais ainda sobre esta interfase patgeno hospedeiro.

Uso de fungicidas. Etimologicamente um fungicida uma substancia que mata fungos, sendo que, dependendo de sua especificidade o mecanismo de ao alguns mataram mais que outros. Deste ponto de vista, os fungicidas esto destinados a proteger s plantas. Esta proteo pode ser realizada de duas maneiras. Uma delas a destruio do inoculo antes que se espalhe e forme miclio pela planta generalizando a doena (preveno). A outra

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forma, bloquear a doena quando j instalada na planta, seja local ou sistmica (terapia o cura). Em geral, poderamos classificar os fungicidas como no sistmicos e sistmicos. Esta classificao apenas funo de simplicidade do assunto e com um mero carter pedaggico, pois sua classificao apresenta contornos bem mais complexos. Tomemos o caso das sementes, exemplo: do trigo, que pode ser hospedeira de diferentes fungos: Tilletia carie, Fusarium spp, Ustilago tritici, etc. Aqui a aplicao de um fungicida no sistmico seria adequado porque este ficaria na superfcie retido, visando eliminar ou inibir o fungo, porm, a aplicao simultnea de um fungicida sistmico propiciaria melhor resultado porque alm de anular a transmisso dos patgenos para a parte area, pode colocar plntula sob proteo de ameaas posteriores tais como odios, ferrugens e brusone (AZEVEDO, 2003). Todavia conforme este mesmo autor, Thiram, Captan, Pentaclorobenzeno, Carboxin e Thiabendazole podem ser usados no tratamento de sementes. Conforme Reis et al., (2001), o mecanismo de ao dos fungicidas muito variado. Vejamos alguns exemplos. -Fungicida a base de enxofre. Podem inibir a respirao, interferir na sntese de protenas e formao de quelatos com metais pesados. -Fungicida a base de cobre. O cobre absorvido pelas clulas do fungo se ligar a protenas acarretando um transtorno geral no metabolismo das clulas do fungo. -Fungicidas dialquilditio carbamato (Thiram). So compostos com alta afinidade por metais pesados e sendo assim, ligam-se a metais presentes nas enzimas. -Fungicidas ftalimidas (Captam). So fungicidas que possuem alta preferncia pelos grupos sulfidrila de enzimas das clulas miceliais. -Fungicidas inibidores de sntese de esteris. Os ergoterois so molculas importante da membrana plamtica de muitos fungos, por isso, ao ter este composto bloqueado na sua sntese, no corpo do fungo, as conseqncias para o mesmo sero fatais. -Fungicidas benzimidazois (Benomil). Afetam basicamente diviso celular do fungo, por interferir na formao do fuso mittico.

A cultura de tecidos e os fungicidas (xenobiticos). Em cultura de tecidos o uso de explantes provenientes do campo, creia grandes problemas de contaminao, mesmo, realizando uma assepsia previa inoculao.

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Razes, sementes, gemas ou folhas de plantas deste origem , normalmente esto pesadamente contaminados por fungos. Por exemplo, sementes de Annona crassiflora provenientes do campo, so extremadamente difceis faz-las germinar sob condies in vitro, tanto pela contaminao fngica, bem como, pelo longo perodo de germinao, o qual pode variar entre 250 a 300 dias para atingir a plena germinao do lote (RIZZINI, 1973). Um problema inerente ao uso destes xenobiticos, como estiliz-los, j que muitas vezes se ignora sua resistncia s altas temperatura do autoclave (120 C), por outro lado, normalmente eles formam suspenso e no uma soluo com gua de a a dificuldade tambm para esteriz-los por filtrao atravs de membranas. Em alho (Allium sativum, L.), Benlate 500 (Benomil) ofereceu um bom controle da contaminao, depois de ser autoclavado conjuntamente com o meio nutritivo bsico (BARRUETO CID, 1991). Tambm o Benlate 500 (autoclavado) em nossas praticas de micropropagao de mandioca, usado junto com a cefotaxima (filtrada) a 100 mg/l por 30 minutos, sob agitao, depois que, micro estacas provindas do campo, so esterilizadas com hipoclorito de Na ao 2 % por 10 minutos tambm sob agitao. Na assepsia de rizomas um tratamento preliminar com fungicida (Captab & Dithane: ambos 5 g/l por varias horas) e depois outro com antibitico, (Imipenem: 12,5 mg/l), foi eficaz para reduzir drasticamente a percentagem de contaminao tanto fngica como bacteriana (KRITZINGER et al., 1998). Uma forma de testar a eficcia de um fungicida autoclav-lo com o meio nutritivo e depois inocular o fungo, previamente isolado, presente no explante. Na comparao com o controle, presena de fungo, porm, sem fungicida, observaremos os resultados. Para este simples experimento no h, necessidade de contar com a identificao preliminar do fungo, condio esta normalmente difcil de satisfazer pelo especialista em cultivo de tecidos. Como j mencionado, em geral os explantes provenientes do campo, j possuem o contaminante no interior do tecido, mesmo que, o explante no apresente sintomas visvel. o que se desprende depois de observar a contaminao do explante no meio nutritivo, a pesar de que, foi realizada a assepsia de praxe (uso de hipoclorito de sdio) Fig. 2.

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Fig. 2. Contaminao fngica emergindo de explantes foliares de Lisianthus em casa de vegetao, cultivados em placa Petri (90x10mm) contendo meio SP, aps 5 dias de idade. Preliminarmente, os explantes foram submetidos a hipoclorito de Na 2 % x 10 minutos. Observar que em alguns explantes as manchas so pretas e em outros brancas.

que esta assepsia de praxe apenas superficial, no penetrando o tecido, portanto, no atingindo o inoculo interiormente, Agora, se presente o fungicida adequado no meio, o alastramento da contaminao neste e no explante, ser impedida. Seria o caso de um fungicida no sistmico ou de ao tpica (Captan, Thiram), esperando sua vez de agir para inibir o tubo germinativo do esporo ou o incipiente miclio, de passagem, o bom lembrar que os fungos estdios. Uma outra abordagem para contornar a contaminao fngica como j citado no caso bacteriano, fazer brotar ramos da planta dentro do laboratrio num ambiente de alta umidade, e coletar os brotos novos. apresentam-se sob a forma de miclio, esclercios, esporos e osporos, sendo assim, ter que selecionar-se o fungicida mais compatvel com estes

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Na eventualidade que o fungicida seja sistmico: Benomil, Tiofanatometlico, Triadimefon, etc, espera-se que este vai ao encontro do fungo no interior vitaminas do meio nutritivo. Respeito eficcia do fungicida, vai depender de muitos fatores, entre eles, a dosagem, a qual est relacionada com a fitotoxicidade, porque como j mencionado anteriormente, os fungicidas tem uma ao bioqumica a nvel celular e a estrutura bsica da clula e a mesma no fungo que na planta (mitocndrio, ribossomos, microtbulos etc. ) por isso ento , e ao igual que no caso dos antibiticos, o uso destes compostos deve ser o mais racional possvel. do explante, seja via apoplasto ou simplasto, antes que este comece sua reativao estimulado pelos sais e

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