Contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em alimentos

Profa Leila Larisa Medeiros Marques

Definio
COLIFORMES TOTAIS: grupo de bactrias constitudo por

bacilos gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos, no formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na presena de sais biliares e que fermentam a lactose com produo de aldedo, cido e gs a 35C em 24-48 horas. O grupo inclui os seguintes gneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella.
FECAIS OU COLIFORMES TERMOTOLERANTES: so coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produo de cido e gs temperatura de 44,5 0,2C em 24 horas. O principal componente deste grupo Escherichia coli, sendo que alguns coliformes do gnero Klebsiella e Citrobacter tambm apresentam essa capacidade.

COLIFORMES

Definio

Coliformes- significado em alimentos

Totais: Utilizado para avaliar as condies higinicas, sendo

que altas contagens significam contaminao psprocessamento, limpezas e sanificaes deficientes, tratamento trmicos ineficientes ou multiplicao durante o processamento ou estocagem. Termotolerantes: empregado como indicador de contaminao fecal, ou seja, de condies higinicosanitrias, visto presumir-se que a populao deste grupo constituda de uma alta proporo de E. coli, que tem seu habitat no trato intestinal do homem e de outro animais. Alm de indicar possibilidade de presena de outros patgenos entricos.

Tcnicas
Plaqueamento (slido): aplica-se a amostras de matriasprimas, alimentos e raes, devendo ser utilizada quando o limite mximo tolerado 100 UFC/g ou mL. NMP (lquido) em alimentos: aplica-se a amostras de matriasprimas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite mximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL. NMP (lquido) em gua e gelo: Aplica-se a amostras de gua e de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. O valor obtido em NMP/100mL.

Pesquisa de coliformes: mtodo em placas. Amostra: acar cristal, morango, coxinha e hambrguer

gar cristal violeta (VRBA)

sais biliares e cristal violeta que inibem Gram+; Vermelho neutro (indicador)- revela a fermentao da lactose.

Caldo verde brilhante bile 2% lactose

Bile bovina e corante verde brilhante que inibem Gram+.

Caldo EC
Sais biliares inibem Gram+; Mistura de fosfatos impedem a acidificao do meio.

gar eosina azul de metileno (EMB)

Eosina e azul de metileno so corantes inibidores de Gram +. Com a

fermentao da lactose e produo de cido, ocorre precipitao desses corantes que fornecem o brilho verde metlico caracterstico da E. coli.

Plaqueamento sobrecamada

15 mL

Em posio invertida

Prova presuntiva para coliformes totais Prova confirmativa para coliformes totais Prova confirmativa para coliformes termotolerantes

Selecionar 3 colnias tpicas e 3 atpicas para investigar

Cada colnia para um caldo verde brilhante

45C/24 a 48h

Para cada tubo positivo no caldo verde brilhante passar para um tubo de caldo EC

Caracterizao da E. coli
De cada tubo EC positivo

Tcnica de esgotamento por estrias

Expresso dos resultados

R =(C x c x d)/r R = Resultado C = nmero de colnias contadas c = nmero de colnias confirmadas r = nmero de colnias repicadas d = diluio utilizada
Resultado final= Rt (colnias tpicas) + Ra (colnias atpicas)

Exemplo de resultado final

Diluio 10-2 = 30 colnias contadas, das quais 20 eram tpicas e 10 atpicas.
Para confirmao, foram repicadas 5 colnias de cada tipo. Quatro colnias tpicas e duas atpicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. Aplicando-se a frmula, teremos para colnias tpicas: RT = 20 x 4 x 100/5 = 1.600 Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas:

RA = 10 x 2 x 100/5 = 400
O resultado final ser igual soma das colnias tpicas e atpicas confirmadas: Resultado final = RT + RA = 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 103 UFC/g ou mL.

Exemplo de resultado final

Diluio 10-2 = 30 colnias contadas, das quais 20 eram tpicas e 10 atpicas.
Para confirmao, foram repicadas 5 colnias de cada tipo. Quatro colnias tpicas e duas atpicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. Aplicando-se a frmula, teremos para colnias tpicas: RT = ? Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas:

RA = ?
O resultado final ser igual soma das colnias tpicas e atpicas confirmadas: Resultado final = RT + RA = ????????????? UFC/g ou mL.

Exerccio
1. Na placa de VRBA e diluio 10-2 = 20 colnias contadas, das quais 15 eram tpicas e 5 atpicas; Para confirmao, foram repicadas 3 colnias de cada tipo para tubos verde brilhante e depois para tubos EC; 2. Todos os tubos de caldo verde brilhante repicados deram positivos para a confirmao de coliformes totais; 3. Para confirmao de coliformes termotolerantes, obtiveram-se dos 3 tubos repicados de colnias tpicas, 2 positivos; e das 3 atpicas repicadas, 1 positiva. 4. Na pesquisa de E. coli, dos 3 tubos EC repicados (tanto de tpicas quanto atpicas), 1 placa EMB tpico deu positivo e 1 atpico positivo. Diante destes resultados, pergunta-se: 1. Qual o valor para coliformes a 35C? 2. Qual o valor para coliformes a 45C? 3. Qual o valor de E. coli/mL?

Pesquisa de coliformes: Nmero mais provvel (NMP) Amostra: leite em p, leite pasteurizado, gua, acar refinado

NMP
Tcnica do nmero mais provvel ou tcnica dos tubos mltiplos-

estimativa da quantidade de Mo presentes na amostra; Pelo nmero de tubos positivos em cada uma das diluies empregada determina-se o Nmero Mais Provvel por grama de produto, tendo como base a tabela estatstica de Hoskins para trs, cinco ou dez tubos; Por esta tcnica pode-se obter informaes sobre a populao presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a populao real de coliformes (teste confirmativo) e sobre a populao de coliformes de origem fecal (coliformes termotolerantes)

NMP
a) Teste presuntivo para coliformes totais visa detectar a

presena de microrganismos fermentadores de lactose. Meio utilizado: lauril sulfato triptose. Princpio: turvamento e produo de gs, evidenciado pelo tubo de Durham. b) Teste confirmativo para coliformes totais-meio caldo verde brilhante lactose Bile 2%. Princpio: turvamento e produo de gs por bactrias gram negativas, caractersticas do grupo coliforme. c)Teste confirmativo para coliformes termotolerantesutilizao do meio de cultura seletivo Caldo EC e incubao em 44-45C. Princpio: turvamento e produo de gs, evidenciado pelo tubo de Durham. c) Teste completo para pesquisa de E. coli - provas bioqumicas.

Poder tamponante

Inibem Gram+
Inibe Gram+

Inibe Gram+

NMP srie 3 tubos

Para cada EC+, um EMB

2 colnias caract. de cada EMB em tubo de AN

NMP srie 3 tubos (leite)

Para cada EC+, um EMB 2 colnias caract. de cada EMB em tubo de AN De cada tubo AN

Exemplo
10-1

Tubos positivos
3 3 1

10-2

10-3

Em todos os tubos e placas de TODAS as etapas, identificar o nmero da equipe, o nome da amostra e o mais importante a DILUIO que est ou a DILUIO precedente !!!!!

Combinao tubos positivos 3:3:1 = 460 UFC/g ou mL, com 95% probabilidade de estar entre 90 e 2000 UFC/g ou mL

 A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP

para inculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL.

OBS: Para obter o NMP/g ou mL, para sries de 3 tubos, com inculos de 1,0, 0,1 e 0,01

g ou mL, e respectivos intervalos de confiana 95%, dividir por 10 os valores da Tabela 1 correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na anlise.

NMP- gua e gelo

Quando o limite de aceitao for <2,0/100mL, usar srie de

5 tubos.
Quando o limite de aceitao for <1,0/100mL, usar srie de

10 tubos.

Caracterizao da E. coli
De cada tubo EC positivo

Tcnica de esgotamento por estrias

Padres microbilgicos
Produto Tolerncia para amostra indicativa Coliformes Totais ou a 35C
Ausncia em 100mL 4NMP/mL

Tolerncia para Legislao amostra indicativa Coliformes Termotolerante s ou a 45C

Tcnica a ser utilizada

gua para consumo humano Leite pasteurizado C Leite em p

Ausncia em 100mL 2NMP/mL

Portaria 518, 2004 IN 51, 2002

NMP srie de 10 tubos NMP srie de 3 tubos- amostra pura NMP srie 3 tubos- amostra diluda Plaqueamento

10NMP/g

RDC 12, 2001

Acar cristal

102UFC/g

RDC 12, 2001

Fonte: MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004

Testes bioqumicos para coliformesidentificao da E. coli

1. 2. 3. 4.

Prova do Indol; Vermelho de metila-VM; Voges-Proskauer-VP; Citrato.

1. Prova do Indol
Triptofano triptofanase
desaminao

Indol + cido pirvico + amnia

+ p-dimetilaminobenzaldedo +HCl + lcool (reativo de Kovacs)

Composto quinoidal (vermelho)

CH2 do anel pirrlico da molcula do indol + o aldedo em meio cido= quinona

2. Vermelho de metila-VM
cido lctico cido actico Glicose fermentao cido frmico cido mista cido succnico cido etlico INDICADOR: Vermelho de metila escala de 4,4 a 6,0. pH 4,4 cor vermelha - prova positiva pH 6,0 cor amarela (acetona) - prova negativa

3. Voges-Proskauer-VP
Glicose

Fermentao butilenoglicol

2 c. pirvico
descarboxilao Agente oxidante Diacetila

Acetilmetilcarbinol + -naftol +KOH 40% (acetona)

Catalisador Diacetila + ncleo guanidina do -naftol OBS .: cor cobre resultado negativo condensao

Composto Vermelho

4. Citrato
ciclo de Krebs

Indicador de pH: azul de bromotimol pH 8,4=colorao azul-da-prssia pH 6,9= colorao verde pH 6,0= colorao amarela ;

Citrato citratase
ciclo da fermentao do citrato

Citrato CO2 + sdio

piruvato + CO2 carbonato de sdio

pH alto

Amnia como fonte de N