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ANIMALES MODIFICADOS GENTICAMENTE: (I) TCNICAS DE OBTENCIN

MA DE LOS NGELES PEARANDA1, FERNANDO ASENSIO2
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Doctora en Veterinaria Doctor en Veterinaria Hospital General Universitario Gregorio Maran, Madrid

1. INTRODUCCIN

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Desde el principio de los tiempos, el hombre ha intentado modificar las caractersticas de los animales domsticos intentando incrementar aquellas que mejoraban sus condiciones como animales de compaa, de produccin, de trabajo o de abasto, mediante la seleccin de los ms aptos y el cruzamiento de los ejemplares que presentaban mejores caractersticas: mayor produccin de leche o carne o ms fuerza y resistencia. Se seleccionaban aquellos ejemplares con caractersticas deseables, aparendolos entre s y con su descendencia, para perpetuar los rasgos de inters, recurriendo al mestizaje cuando se adverta la aparicin de caractersticas fenotpicas indeseadas debido a la consanguinidad. Hoy en da, gracias a la reproduccin asistida y a la biotecnologa, se planifican y dirigen los procesos reproductivos, se transmiten los rasgos deseados y se acelera la mejora gentica. El intervalo intergeneracional puede reducirse sensiblemente gracias a la combinacin de la inseminacin artificial, que es la ms antigua y utilizada de las tcnicas de reproduccin asistida, con las tcnicas ms recientes como son: el estro sincronizado, la superovulacin, la extraccin de vulos de hembras sexualmente inmaduras aun fuera de la poca de cra, o la produccin de Figura 1: La oveja Dolly y su embriones in vitro y la transferenprimera cordera Bonnie. cia de embriones. Adems, es posi(Fuente: Roslin Institute). ble seleccionar el sexo de la proge-

En ganadera, la transgnesis ofrece un mtodo ms rpido de mejora gnetica que las tcnicas de seleccin y reproduccin tradicionales

nie con semen sexado para la inseminacin; se puede realizar la seleccin gentica de individuos mediante marcadores moleculares asociados a caracteres de inters. Tambin se puede modificar el genoma de los organismos: introduciendo genes de inters (organismos transgnicos); modificando los genes (organismos transgnicos knockins); o eliminando o silenciando genes concretos (organismos transgnicos knockouts). Y se puede llevar a cabo la clonacin de animales por transferencia nuclear de clulas somticas, germinales o embrionarias. En este trabajo, y en su continuacin que aparecer en el prximo nmero, se pretende hacer una revisin de las tcnicas de Ingeniera Gentica que se emplean actualmente para la obtencin de OMGs (Organismos Modificados Genticamente), con el objetivo de explicar de una manera sencilla y clara las bases conceptuales de cada una de ellas, sus ventajas e inconvenientes y su utilidad prctica.

2. LA INGENIERA GENTICA
El enorme avance de la investigacin biotecnolgica en los ltimos aos ha favorecido el desarrollo de tcnicas que permiten introducir, eliminar o modificar de forma especfica un gen, o determinados tipos de genes, en el genoma de un organismo para producir seres vivos (animales, plantas y microorganismos) con nuevas y mejores caractersticas. Este tipo de tcnicas, se encuadran dentro de lo que se denomina Ingeniera Gentica y los seres vivos que as se obtienen son los llamados Organismos Modificados Genticamente. La Ingeniera Gentica incluye un conjunto de mtodos que permiten aislar y fraccionar el DNA, y ensamblar los fragmentos obtenidos con otras molculas de DNA. El resulta-

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do de estas manipulaciones se conoce como DNA recombinante y es un DNA hbrido que contiene el fragmento de DNA de inters que se desea expresar en una clula, unido a un DNA vector mediante un enlace covalente. Los genes de inters (contenidos en fragmentos de DNA) se obtienen cortndolos de su cadena de DNA originaria mediante enzimas de restriccin. Posteriormente, se unen al DNA que acta como vector mediante enzimas ligasas. A continuacin, se describen las tcnicas utilizadas para la generacin de animales modificados genticamente: la transgnesis y la transferencia nuclear.

3. TRANSGNESIS
La transgnesis es un procedimiento biotecnolgiLos ratones fueron los primeros animales en los que se co por el que se introduce un gen forneo (transgn) consigui la transgnesis en el genoma de un ser vivo. En la transgnesis se busca que el transgn se integre en la lnea germinal En ganadera, la transgnesis ofrece un mtodo ms (gametos) de una manera estable, asegurando as que rpido de mejora gentica que las tcnicas de selecese nuevo gen incorporado pueda ser heredado por la cin y reproduccin tradicionales. Permite la introducdescendencia. cin de genes nuevos y deseables en los animales En los animales superiores, la informacin gentidomsticos sin tener que recurrir al cruzamiento entre ca se transmite por reproduccin sexual. Es lo que se los mismos. conoce como transmisin gentica vertical. Sin embarUn transgn es una construccin de cido desoxigo, en 1981, Gordon y Ruddle demostraron la interribonucleico (DNA) que contiene: una secuencia que gracin y transmisin estables (a travs de la lnea gercodifica una protena especfica que es la que aporta minal) de genes inyectados en proncleos de cigotos la mejora gentica deseada (exn); una regin que de ratn obtenidos por fecundacin in vitro. Eran confiere a esta secuencia la capacidad de expresarse los primeros ratones transgnicos. Es decir, se trataba de forma ubicua o en tejidos especficos (promotor); de una transmisin gentica horizontal, que se denoy una serie de secuencias aisladoras y reguladoras que min transgnesis. protegen y modulan la expresin del gen introducido. El paso siguiente consisti en probar que tambin Para conseguir una buena expresin del gen de intese podan obtener ratones transgnicos que incorpors, es necesario incluir todas las secuencias que raran en su genoma un gen (transgn) de otra especie. modulan su expresin, de manera que se necesita un As, en 1982, Palmiter y col. obtuvieron ratones transvector que admita grandes transgenes. Para ello, se han gnicos gigantes al inyectar en el proncleo de un desarrollado los transgenes genmicos, basados en cigoto de ratn el gen de la rata que codifica la horcromosomas artificiales de levaduras y bacterias, que mona del crecimiento. Incluso, estos mismos investison capaces de transportar grandes fragmentos de DNA gadores, obtuvieron tambin ratones transgnicos en los que se pueden incluir gigantes cuando el transgn introdutodos los elementos reguladocido, que codificaba la hormona del res del gen. Estos transgenes crecimiento, era de origen humason los YACs y los BACs (crono. mosomas artificiales de Los ratones fueron los primelevaduras y cromosomas ros animales en los que se consiartificiales de bacterias, resgui la transgnesis pectivamente) A los experimentos con De las tcnicas utilizaratones, siguieron los mismos das para la produccin procedimientos con conejos, de animales transgniovejas y cerdos, en un intencos, es decir, para to de aumentar su tamao introducir el transgn (Hammer y col., 1985). en el genoma, destaSin embargo, este avance can las siguientes: no tuvo aplicacin zoo Microinyeccin tcnica porque la presenpronuclear de transcia del transgn modifigenes en pronclecaba la fisiologa del os de vulos fertilianimal transgnico, prozados (cigotos). duciendo efectos colate Vectores virales, rales perjudiciales para su que transfectan las desarrollo. clulas integrando Ratn nude (desnudo), modificado genticamente.

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3.1 MICROINYECCIN PRONUCLEAR

En esta tcnica, la introduccin del transgn se realiza mediante la microinyeccin de esta construccin de DNA en el proncleo de un ovocito fertilizado (figura 2). El procedimiento sera el siguiente: Se extraen vulos de hembras en las que se ha inducido una superovulacin y han sido fertilizadas in vivo, o bien se fertilizan posteriormente in vitro. Utilizando un microscopio, con una micropipeta, se inmoviliza el vulo fecundado y se inyecta en uno de sus proncleos una solucin que contiene muchas copias del transgn. Posteriormente, estos vulos fecundados y microinyectados se introducen en madres receptoras, previamente sincronizadas hormonalmente, para gestarlos, aplicando la tcnica de la transferencia de embriones. Finalmente, los recin nacidos son examinados para ver si en ellos se ha producido la incorporacin del transgn. La microinyeccin es un mtodo para generar animales transgnicos muy ineficiente, debido a que conlleva la integracin aleatoria del gen forneo en el genoma receptor con las siguientes consecuencias: El transgn se introduce en el genoma receptor de forma aleatoria, por lo que slo en un pequeo porcentaje se sita en el lugar adecuado para conseguir una buena expresin en el animal transgnico. No todos los animales que nacen han incorporado a su genoma el transgn (no son transgnicos, por tanto). El gen exgeno puede insertarse en un lugar errneo, por ejemplo en medio de un gen del genoma receptor, interrumpindolo y causando su mutacin y, con ello, la muerte del embrin o alteraciones en el animal transgnico nacido. Se produce un patrn variable de expresin del gen exgeno en la progenie transgnica, a menudo en mosaico.

Figura 2. Microinyeccin de DNA en ovocito fertilizado. A) pipeta de sujecin; B) ovocito fertilizado en el que se evidencian los dos proncleos (rojo y verde); C) pipeta de inyeccin, a travs de la cual se inyecta la solucin que contiene el DNA del transgn de inters en uno de los proncleos.

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en ellas su genoma previamente modificado (virus recombinantes). Transferencia de DNA exgeno mediada por esperma durante la fertilizacin (SMGT, spermmediated gene transfer). Inyeccin, en la cavidad de blastocistos, de clulas madre embrionarias (ES cells, embrionic stem cells) y/o clulas germinales embrionarias (EG, embrionic germ cells), previamente modificadas genticamente mediante la tcnica de gene targeting. Transferencia nuclear (NT, nuclear transfer) con clulas somticas, ES o EG que previamente han sido modificadas genticamente. Tambin se puede facilitar la entrada del transgn en las clulas mediante otras tcnicas como el uso de liposomas y de la electroporacin. Adems, en la actualidad, estn en desarrollo nuevas tcnicas para generar transgnesis, como el uso de transposomas (secuencias de DNA capaces de autoreplicarse e integrarse aleatoriamente en sitios adicionales del genoma) y la tecnologa del RNA interferente (RNAs de doble cadena que inhiben genes endgenos). De esta ltima tcnica hay una animacin interesante en: http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

Figura 3. Tcnica de gene targeting sobre clulas ES de ratn. La explicacin de esta tcnica de modificacin dirigida del genoma viene en la pgina 19 del texto. El Nobel de Medicina y Fisiologa de este ao 2007 ha sido concedido a Martin Evans, Mario Capecchi y Oliver Smithies por sus trabajos de obtencin, cultivo y manipulacin gentica de clulas ES, que les permitieron obtener el primer ratn Knockout.

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En ocasiones, el transgn microinyectado no es heredable porque no se inserta en la lnea germinal del animal transgnico. No se pueden encontrar dos animales transgnicos fundadores con el transgn insertado en el mismo lugar, por lo cual, para conseguir animales homocigticos para este gen exgeno slo pueden ser fabricados mediante el cruce de los nacidos de un nico animal fundador (en el caso de la vaca, la produccin de una lnea homocigtica a partir de un nico fundador requiere alrededor de 5 aos). La microinyeccin de DNA en cigotos es una de las tcnicas ms extendidas en la generacin de ratones transgnicos. Sin embargo, esta tcnica tiene un xito limitado en mamferos superiores, debido a problemas especficos inherentes y a su baja eficacia. As, para producir un Figura 4. Produccin de ratones modificados genticamente mediante SMGT nico animal fundador, son necesarios cerca de 1000 cigocelular en la que se encuentren, incluyendo clulas tos en el caso de los bvidos, 300 cigotos en el de los quiescentes y embrionarias, y cualquiera que sea el vidos y 200 en el de las cabras. Por ello, el coste de tipo celular. Los vectores lentivirales han demostrado produccin de animales de granja mediante microinque transducen clulas madre embrionarias humanas yeccin pronuclear de DNA es altsimo y, en la prcy embriones de ratn y rata pre-implantacin. En el tica, inabordable. caso de los cerdos, se ha conseguido la expresin ubicua de los genes portados por vectores lentivirales en 3.2 VECTORES VIRALES los distintos tejidos del animal y con una correlacin lineal entre la expresin del transgn y el nmero de Un mtodo alternativo es la transgnesis viral: el provirus que se ha integrado en el uso de virus recombinantes para genoma. introducir genes en el embrin. Los En animales de granja, la eficienvectores retrovirales han sido estucia de la transgnesis con vectores diados extensamente para terapia lentivirales es 50 veces superior a la gnica humana. Estos vectores han que se consigue con la microinyecdemostrado transferir eficientemencin pronuclear de DNA. Su mayor te genes en embriones murinos, bovilimitacin es que no pueden transnos y porcinos. Sin embargo, los portar transgenes con ms de 8-9 kb retrovirus estn sometidos a modifide DNA y, adems, los sitios en los cacin epigentica y la expresin que se produce su integracin de retroviral se corta durante la embrioforma preferente son regiones codignesis o es breve despus del nacificantes de los genes de las clulas miento. que infectan. Se ha conseguido una mejora susEl procedimiento podra ser as: tancial con el uso de vectores deriembriones pre-implantacin son vados de lentivirus, que proceden de expuestos in vitro a soluciones una familia de retrovirus complejos. concentradas de virus recombinanEstos vectores tienen la capacidad de tes (virus a los que previamente se atravesar la membrana nuclear y les ha introducido el gen de inters), alcanzar el genoma de las clulas, o son incubados sobre una monocacualquiera que sea la fase del ciclo

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La microinyeccin de DNA en cigotos es una de las tcnicas ms extendidas en la generacin de ratones transgnicos

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En 1989, se describi por primera vez un nuevo mtodo para la generacin de animales transgnicos: la transferencia de genes mediada por esperma (SMGT), que se basa en la capacidad intrnseca de los espermatozoides de unirse e internalizar DNA exgeno que, posteriormente, podr ser transferido al huevo durante la fertilizacin. Esta habilidad de los espermatozoides por capturar DNA exgeno fue descubierta en 1971 (Brackett, 1971), pero el hallazgo, con sus importantes implicaciones, fue ignorado durante cerca de 20 aos. El primer procedimiento de SMGT se realiz en un modelo de animal pequeo, el ratn, y demostr ser muy eficiente. Posteriormente, esta tcnica se adapt a grandes animales, siendo exitosa en la generacin de diversas lneas de cerdos transgnicos. Se considera que la SMGT puede ser utilizada en todas las especies animales con reproduccin sexual mediada por gametos, siendo una tcnica de aplicacin potencialmente Figura 5. Origen de las clulas madre (stem cells), basado en universal. Wobus y col., 2005 En sntesis, la aplicacin de la SMGT consiste en (figura 4): pa de clulas infectadas con estos virus. A continua Obtencin del eyaculado a partir de animales cin de la exposicin a los virus, los embriones infecpreviamente seleccionados. tados in vitro son transferidos a hembras receptoras Conversin de los espermatozoides del eyaculapara completar la gestacin. do en clulas transgnicas mediante la incubacin conjunta del esperma con el plsmido que 3.3 TRANSFERENCIA DE GENES MEDIADA POR ESPERMA contiene el DNA de inters. En este proceso se suceden las siguientes etapas: a) la unin del (SMGT) DNA exgeno a la superficie del espermatozoide; b) seguida de la internalizacin de este Hoy en da, los mtodos ms extendidos para la DNA en el espermatozoide; c) y, posproduccin de animales de granja teriormente, la integracin del transtransgnicos son: la inyeccin direcgn en el genoma del espermatozoita de DNA en uno de los pronclede (hecho que se ha demostrado que os de ovocitos fertilizados; las consno ocurre al azar, sino en lugares trucciones basadas en virus (sobre concretos del genoma). todo retrovirus) como vectores para Inseminacin artificial, con el la introduccin de DNA exgeno en esperma transgnico, de hembras embriones; y la transferencia nuclepreviamente sincronizadas (en cerar (descrita ms adelante) utilizando dos) o inyeccin intracitoplasmtica clulas somticas o embrionarias de esperma (ICSI, intracytoplasmic modificadas genticamente. Todos sperm injection) transgnico en estos mtodos estn afectados por ovocitos para generar embriones que una baja eficiencia, un elevado posteriormente sean transferidos a manejo y la necesidad de la manihembras sincronizadas para gestarpulacin de embriones en estadios los (en ratones). tempranos del desarrollo. Adems, el Obtencin de las camadas, seguiuso de retrovirus presenta dudas en da del estudio de la eficiencia de la cuanto a su seguridad.

La clonacin es una tecnologa que puede ser utilizada para la produccin de un gran nmero de animales genticamente idnticos entre si

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La segregacin gentica produce, a veces, diferencias en la capa. (Fuente: Roslin Institute).

transgnesis en ellas, seleccionando los animales transgnicos fundadores que sern capaces de transmitir el transgn a las sucesivas generaciones.

3.4 GENE TARGETING

La mayora de las tcnicas utilizadas para la introduccin de DNA exgeno en clulas producen una integracin aleatoria en el genoma celular del DNA introducido, con los consiguientes inconvenientes que se han descrito en el apartado 3.1. La tcnica de gene targeting evita esos problemas, al generar una modificacin gentica dirigida, especfica y controlada, basada en la introduccin o en la eliminacin de DNA en lugares precisos del genoma, utilizando la recombinacin homloga de esas secuencias de DNA forneas con los genes autctonos. Esta tcnica requiere la utilizacin de clulas madre embrionarias (ES cells, embrionic stem cells), que son pluripotentes y que, una vez modificadas genticamente, son inyectadas en blastocistos para generar embriones quimera. En este punto, antes de seguir con el gene targeting, conviene aclarar algunos aspectos sobre el origen de las clulas ES, siguiendo el esquema de la figura 5: El cigoto y los estadios de divisin celulares tempranos, hasta el estadio de mrula, son definidos como totipotentes, porque pueden generar un organismo completo.

En el estadio de blastocisto, slo las clulas de la masa celular interna (ICM, inner cell mass) son pluripotentes, es decir, mantienen la capacidad de generar las tres capas embrionarias primarias (ectodermo, mesodermo y endodermo) as como las clulas germinales primordiales (PGCs, primordial germ cells) que son las clulas precursoras de los gametos masculinos (espermatozoides) y femeninos (vulos). Las clulas ES derivan de la ICM del blastocisto y tienen la capacidad de diferenciarse in vitro en clulas de todos los linajes celulares somticos y tambin en clulas germinales masculinas y femeninas. En tejidos y rganos adultos, existen clulas madre multipotentes y clulas progenitoras para reemplazar las clulas perdidas o daadas. En la actualidad, se desconoce en qu medida las clulas madre adultas pueden transformarse en clulas de otros linajes (transdiferenciarse) o qu factores pueden aumentar su capacidad de diferenciacin. La tecnologa de gene targeting necesita el establecimiento del cultivo de clulas ES. Estas clulas tienen, por una parte, la capacidad de autorenovarse en cultivo manteniendo su pluripotencialidad y, por otra, la capacidad de diferenciarse en todas las clulas somticas y germinales (gametos). Por ello, las modificaciones genticas introducidas en clulas ES generan individuos con gametos que llevan la modificacin gentica y que, por tanto, pueden generar descendencia que porte esa modificacin. Una importante limitacin para el uso de esta tcnica es que estas clulas ES no se han conseguido cultivar, hasta el momento, en animales de produccin. Por ello, el gene targeting casi slo se realiza de forma exclusiva en ratn, especie para la que s existen lneas de clulas madre embrionarias establecidas. La tcnica de gene targeting tiene las siguientes fases (figura 3): a) Obtencin de embriones de ratn en fase de blastocistos. b) Aislamiento de clulas ES de los blastocistos. c) Cultivo in vitro de las clulas ES. d) Introduccin de la modificacin gentica, mediante gene targeting, en las clulas ES en cultivo. e) Seleccin de clones individuales de las clulas ES

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Figura 6. Inyeccin de clulas ES en blastocistos. A) pipeta de sujecin; B) blastocisto en cuya cavidad se inyectan clulas ES que previamente han sido modificadas genticamente (en el dibujo son las de color amarillo); C) pipeta de inyeccin, a travs de la cual se inyectan las clulas ES.

Figura 7. Enucleacin de un ovocito (Fuente: Roslin Institute).

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impida su traduccin), estamos produciendo una inactivacin gnica y generando un animal knockout. Este animal permite estudiar qu ocurre cuando se elimina un gen concreto y, as, conocer su funcin. Knockins: si se introduce una mutacin en un gen o se sustituye un gen por otro. En ocasiones, la modificacin gentica que introducimos puede causar la letalidad del embrin. Para evitarlo, se puede controlar la expresin de la modificacin gentica introducida en lugar y tiempo: Knockouts o knockins especficos de tejido. En ellos la modificacin slo se expresa en los tejidos que nos interesa, utilizando promotores especficos de tejido (por ejemTabla 1. Animales clonados mediante transferencia nuclear a partir de ncleos plo que el gen se exprese en hgado de clulas donantes de naturaleza embrionaria, fetal o adulta (revisado por y no en adipocitos). Meissner y col., 2006). Knockouts o knockins condicionales o inducibles. En ellos conen cultivo y realizacin de rplicas para mantener trolamos el momento de la expresin de la modistock congelado a -80C y para screening de DNA ficacin gentica. Por ejemplo, una vez que el genmico. animal ya haya nacido (con lo que evitamos la f) Screening de DNA genmico de los clones de cluposible muerte embrionaria por la modificacin las ES, para comprobar cul ha conseguido introintroducida). ducir la modificacin gentica en el sitio deseado, as como anlisis del cariotipo y de la presencia de micoplasmas. g) Generacin de los embriones quimera: se inyectan las clulas ES, que portan la modificacin gentica deseada, en la cavidad de un blastocisto (figura 6). h) Transferencia de estos blastocistos resultantes, con ES modificadas y ES originales, a hembras sincronizadas para gestarlos. i) Estudio de las quimeras generadas (animales con dos tipos de clulas: algunas con la modificacin gentica, porque proceden de las microinyectadas en los blastocistos, y otras no). j) Realizacin de cruces entre machos y hembras heterocigotos para el gen modificado, con el fin de obtener homocigosis en dicho gen. Los tipos de modificaciones genticas que se pueden obtener por gene targeting son: Knockouts o inactivacin gnica. Si se bloquea la expresin de un gen concreto (eliminando un fragmento del mismo o introduciendo una mutacin en su secuencia que Figura 8. Esquema de la generacin de Dolly (basado en EIBE,1998)

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4. TRANSFERENCIA NUCLEAR

En la transferencia nuclear (NT) se utiliza el ncleo de una clula procedente del animal que queremos clonar para introducirlo en un ovocito receptor previamente enucleado (figura 7). Este ovocito se activa elctricamente, o por otros mtodos, para que reprograme al ncleo y ste comience la generacin de un embrin que tendr un 98-99% de la informacin gentica procedente del ncleo del animal a clonar y un 1-2% procedente del DNA conteniFigura 9. Polly (clonada y do en las mitocondrias y otras orgatransgnica) junto a sus hermanas nelas presentes en el citoplasma del (Fuente: Roslin Institute). vulo receptor. Consecuentemente, el organismo resultante no ser un clon exacto del animal donante del ncleo. Durante el desarrollo, el contenido gentico de cada clula se mantiene, con unas pocas excepciones, idntico al que tena el cigoto. Por lo tanto, las clulas diferenciadas (adultas) poseen en su ncleo toda la informacin necesaria para gene5. GLOSARIO DE TRMINOS rar un organismo completo. Esto es lo que se conoce como totipotencia Alelo. Cada una de las formas nuclear. En sus inicios, la transferenalternativas de un gen dado concercia nuclear (NT) se desarroll como nientes al mismo carcter. En una un medio de comprobar, de forma clula diploide, los miembros de un experimental, este concepto de totipar allico ocupan posiciones potencia, mediante la clonacin de correspondientes sobre un par de cromosomas homanimales a partir de clulas adultas. Los ncleos de logos. Si estos alelos son genticamente idnticos estas clulas adultas se reprograman con la informa(estn en homocigosis), la clula o el organismo son cin que hay en el citoplasma del ovocito, de manehomocigticos; si son diferentes (estn en heterocigora que se silencian algunos genes y comienzan a funsis), se trata de organismos heterocigoticos. Tres o ms cionar otros, producindose la parada de la fase adulta alelos de un gen dado constituyen una serie alelomrpara encenderse la embrionaria. Esta reprogramacin fica. permite que las clulas donantes de los ncleos para Blastocisto. Blstula. Fase de diferenciacin la NT puedan ser fetales, embrionarias o somticas embriolgica, originada a partir de la mrula, consis(tabla 1). tente en una esfera hueca formada por una sola capa Como es posible obtener un nmero ilimitado de de clulas indiferenciadas que forman el blastodermo. clulas somticas a partir de un animal, la clonacin Clula diploide. Clula que tiene el nmero norconstituye una tecnologa que puede ser utilizada para mal de cromosomas caracterstico del organismo al la produccin de un gran nmero de animales gentique pertenece (2n). camente idnticos entre s (clonacin reproductiva), Clula germinal. Cada uno de los gametos o sus aunque difieran en algo de su progenitor donante del clulas formadoras. ncleo. Muchos animales de granja, tales como vacas, Cigoto. Clula formada por fusin de los gametos. cerdos y ovejas, han sido clonados de forma satisfacSinnimo: huevo. toria utilizando esta tcnica. La oveja Dolly (figura 1), Clonacin. Produccin de individuos genticaen 1996, fue el primer animal clonado a partir de una mente idnticos clula somtica adulta (clula de la glndula mamaria DNA recombinante . DNA hbrido obtenido de una oveja de 6 aos, Wilmut y col., 1997, figura 8). mediante la unin covalente de un fragmento de DNA, Las lneas celulares obtenidas a partir de clulas que se desea expresar en una clula, a un DNA vecsomticas permiten la manipulacin de los genomas tor. de los animales de granja in vitro, lo cual permite Enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin crear clulas transgnicas de ovejas, cerdos y vacas son endonucleasas que reconocen una secuencia entre cuyos ncleos, posteriormente, pueden ser transferi4-8 pares de bases en el DNA. El sitio de reconocidos a un ovocito enucleado para generar un animal

El coste de produccin de animales de granja mediante microyeccin pronuclear de DNA es altsimo y, en la prctica, inabordable

transgnico mediante transferencia nuclear: clonacin a partir de una clula transgnica. Polly (figura 9) es la primera oveja transgnica producida por transferencia nuclear (Schnieke y col. 1997). Fue generada a partir de fibroblastos fetales que fueron previamente modificados genticamente mediante la adicin del gen humano que codifica el factor IX de coagulacin, introducido en un vector que portaba un promotor que diriga la expresin a la glndula mamaria. Polly excretaba el factor IX de coagulacin humano en su leche. Por otra parte, si un embrin obtenido por NT de clulas somticas se detiene en fase de blastocisto y de l se obtienen clulas ES, stas pueden cultivarse in vitro para diferentes usos potenciales (clonacin teraputica): terapias de reemplazo y regeneracin celular; investigacin mdica; e, incluso, se puede realizar la modificacin gentica de estas clulas ES para corregir un defecto gentico del individuo donante.

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miento se llama sitio de restriccin, y la enzima rompe un enlace fosfodister en la hebra de arriba y otro enlace fosfodister en la hebra complementaria. Enzimas ligasas. Cada uno de los miembros de la clase enzimas que catalizan la unin de dos molculas de DNA por acoplamiento, con la liberacin de pirofosfato a partir de ATP. Exn. Fragmento de DNA en los organismos superiores, capaz de expresarse en una protena a travs del sistema DNARNAmprotenas. Los exones se localizan en los genes, separados por otros fragmentos que no se transcriben (intrones). Fenotipo. Expresin o manifestacin externa de un genotipo en un ambiente determinado. Gen. Fragmento de DNA que constituye la ms pequea unidad funcional. Genoma. Conjunto de genes que especifican todos los caracteres potencialmente expresables de un organismo dado, sin connotacin alguna de la naturaleza allica de los genes integrantes. Genotipo. Constitucin gentica contenida en los cromosomas de un individuo, referida a todos o a parte de los caracteres diferenciales. Por lo general, se refiere a la composicin especfica allica de un gen particular o serie de genes en cada clula de un organismo, aunque puede referirse al genoma total. Haploide. Organismo, clula o ncleo con un juego sencillo de cromosomas. El nmero haploide se designa por n. Las clulas reproductoras, formadas como resultado de la meiosis, son haploides. La fusin de dos de estas clulas restaura el nmero diploide normal. Lnea germinal. Conjunto de las clulas de un individuo que tienen la capacidad de llevar a cabo la meiosis y dar origen a gametos. Promotor. Secuencia de DNA situada en el comienzo 5-terminal de un gen, al que se une la RNA polimerasa para la iniciacin de la transcripcin. Proncleo masculino. Ncleo del espermatozoide, ya introducido en el citoplasma del vulo, y antes de que tenga lugar su fusin con el ncleo de ste. Transgnesis. Incorporacin de genes forneos al genoma de una clula receptora.

Polly, la primera oveja transgnica producida por transferencia nuclear, excretaba en su leche el factor IX de coagulacin humano

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