Los telmeros y la telomerasa: sus mecanismos de accin y los efectos de la alteracin de sus funciones Resumen Las caractersticas moleculares

de los telmeros y la telomerasa se conservan entre la mayora de los eucariotas. Cmo la telomerasa y los telmeros funcin y cmo interactan para promover el cromosoma propiedades cierta-estabilizadores de los telmeros se discuten aqu. 2004 Federacin Europea de Sociedades Bioqumicas. Publicado por Elsevier B.V. Todos los derechos reservados. Palabras clave: telmeros; Telomerasa 1 . introduccin Los telmeros , los complejos ADN-protena en los extremos de cromosomas eucariotas , son protectores contra eventos de inestabilidad promotoras del genoma. Tales eventos pueden incluir la degradacin de las regiones terminales de los cromosomas , la fusin de un telmero , ya sea con otro de los telmeros o con un extremo de ADN roto , o recombinacin apropiado . Estos procesos son potencialmente catastrfico , por ejemplo , las fusiones pueden conducir a la formacin de cromosomas dicntricos , que son inherentemente inestables y dan lugar a desequilibrios en el contenido gentico de dividir la progenie Cellso , o a la prdida de informacin gentica . El ADN telomrico se compone de repetidas en tndem , sencilla , a menudo rico en G , secuencias especificadas por la accin de la telomerasa . Las repeticiones en tndem forman un andamio molecular que contiene muchos sitios de unin para las protenas telomricas , que a su vez nuclean la coalescencia de un orden superior , aunque todava mal definido , complejo de protenas telomricas de proteccin , incluidas las de ADN de secuencia especfica protenas telomricas vinculantes. El complejo protena- ADN resultante en el telmero es dinmica ; durante la interfase , las protenas de los telmeros con destino se intercambian dentro y fuera de los telmeros individuales a tasas del orden de minutos o menos , dependiendo de lo que se examinan los componentes de protenas [ 1 ] . 2 . Telomerasa : enzima que polimeriza y protector La replicacin completa del ADN telomrico requiere la telomerasa , una ribonucleoprotena celular RNP inversa especializada transcriptasa ( RT ) . La enzima ncleo contiene la protena De TERT , que tiene un dominio de homologa de RT , as como otra esenciales dominios conservados , y el componente de ARN , TER . Al copiar una secuencia de plantilla a corto plazo de su intrnseca

Fraccin de ARN , la telomerasa sintetiza el ADN telomrico strand funcionamiento 50 a 30 hacia el extremo distal del cromosoma , extendiendo as que . Extensin Regulado de los extremos del ADN cromosmico se produce para compensar el acortamiento que resulta de la accin de nucleasas y el terminal incompleta La replicacin del ADN . A multi- componente '' '' homeostasis del telmero sistema evita , por una parte , la sobre- extensin de los telmeros . Interacciones protenaprotena entre las protenas telomereassociated son importantes para esta funcin , que acta en cis en un telmero [ 2 ] . Por el contrario , el sistema de la homeostasis telomrica acta para promover la extensin telomrica cada vez que un telmero se vuelve corto , manteniendo as el tracto de repeticiones telomricas dentro de un gama bien definida en las clulas que contiene telomerasa . Funciones de la telomerasa en su calidad de RT celular utilizando un mecanismo que resulta en la sntesis de la corto , repetido Secuencia de ADN que se encuentra en los telmeros . Slo un corto regin de el ARN de la telomerasa , el dominio de plantillas , se copia . la RNA de la telomerasa est vinculada a una alta afinidad por los dominios conservados de ter que se encuentran fuera de su dominio RT homologa ( [ 3 ] , y las referencias en l ) . Estos y otros ARN-protena interacciones entre de TERT y TER son crticos para la telomerasa funcin . En varias especies , la telomerasa es dimrica y dentro de el complejo dimrico , sus ARNs interactan unos con otros en un moda que , al menos bajo ciertas condiciones experimentales , puede ser de vital importancia para la actividad enzimtica [ 4-6 ] . TER tiene una estructura de ncleo secundario que se conserva entre los eucariotas en general . El ncleo contiene motivos que no slo se unen de TERT sino que tambin incluyen secuencias y elementos

demostrado ser crtica para la funcin de la enzima , tal como fue revisado en otra parte [ 3 ] ( ver . Fig. 1 ) . Un ejemplo de la importancia de la estructura del ARN se ve en los experimentos de cambio de un elemento estructural en el ARN ( cuya naturaleza vara de especie a especie ) que acta como una barrera a la sntesis ms all de la plantilla . Mutaciones de ARN en este elemento puede provocar la sntesis de la lectura a travs , en la que las porciones de la ARN de la telomerasa ms all del lmite normal de plantilla se copian , tanto in vitro como in vivo . De TERT se une a este elemento ; dicha unin , que se producen como lo hace a una regin del ARN cerca de la plantilla, puede depender de cmo se lleva a cabo esta funcin de barrera . Sin embargo, varios otros mutaciones en los elementos estructurales y de secuencia de la telomerasa ARN centrales causan efectos que han sido ms difciles de conciliar con un mecanismo que implica nicamente de TERT - TER unin . algunos de estas mutaciones causan deficiencias en enzimtica detectable actividad . Por ejemplo , las mutaciones puntuales especficas en el mbito de plantillas pueden anular la actividad enzimtica [ 7 ] . cierta base cambios en la plantilla , de manera que en la actualidad parece idiosincrsica , causan un uso incorrecto de la plantilla de ARN , tales como Misincorporation ADN base y extensin mispair o alto tasas de sntesis de deslizamiento . Esto se ha observado en Tetrahymena , Kluyveromyces lactis y Saccharomyces cerevisiae telomerasas . Estos errores conducen a la sntesis de ADN telomrico teniendo cantidades significativas de secuencias de ADN imprevistos ( revisado en [ 8 ] ) . En la telomerasa de la levadura en ciernes K. lactis , algunas mutaciones en el pseudoknot conservada disminuyen o incluso la ablacin actividad enzimtica de la telomerasa ; otras mutaciones pseudoknot causan copia incompleta de la secuencia de la plantilla , de tal manera que slo una regin truncada de la plantilla se utiliza y, en consecuencia mutado ( truncados) repeticiones estn presentes en los telmeros , causando defectos de crecimiento celular [ 9 ] . Por lo tanto , bases de ARN de telomerasa juegan papeles importantes en la funcin de la enzima . La capacidad mxima de la telomerasa para sintetizar la secuencia de ADN telomrico es correcta

es necesario no slo para contrarrestar el desgaste de los telmeros de terminal , pero tambin para sintetizar el ADN telomrico correcta sitios de unin para las protenas telomricas de proteccin especficos de secuencia . La telomerasa tambin acta para evitar fusiones cromosmicas . la alargamiento de la malla de la mayor parte de los telmeros en una clula por la telomerasa puede ser desacoplado de su capacidad para proteger de fusiones de cromosomas , en levaduras y clulas humanas [ 10-13 ] ( ver . Fig. 1 ) . La telomerasa en clulas de levadura puede ser reticulado para telomrica ADN , incluso en tiempos en el ciclo celular cuando no es competente para polimerizar ADN en el cromosoma termina [ 14-16 ] . Juntos , estos resultados plantean la posibilidad de que la telomerasa ayuda fsicamente tapa de los extremos cromosmicos y de ese modo puede ayudar a proteger contra los telmeros fusiones. Aunque no se detect inicialmente en las clulas que se someten senescencia en la cultura, la actividad de la telomerasa se puede encontrar incluso en estas clulas . Esto se ha observado con tales clulas despus de que se han sido a pases en cultivo o cuando estn frescas , y antes de que hayan sido pases . Actividad de la telomerasa se inform a ser fcilmente detectable en los fibroblastos de pollo primarias y en clulas endoteliales humanas primarias pronto despus de la eliminacin Del pjaro / humano , sino para convertirse en disminuido considerablemente despus de cultivo in vitro se puso en marcha [ 17,18 ] . Fibroblastos humanos cultivados eventualmente se someten a la senescencia , antes de que sus telmeros se acortan progresivamente , y ya que las clulas entrar en senescencia en la cultura , focos de dao de ADN se acumulan especficamente en los telmeros [ 19 ] . Por lo tanto , la baja cantidad de telomerasa en estas clulas es insuficiente para evitar su eventual telmero senescencia destapado o celular . Complementando el magro

cantidades de la telomerasa en las clulas humanas en cultivo primario , por sobreexpresin forzada de TERT pueden mantener las clulas multiplicando en la cultura. Incluso un alelo de la telomerasa hypomorphic que no hace provoca el acortamiento de los telmeros neta es capaz de prolongar la duracin de la vida celular en cultura [ 10 ] . Por el contrario , inundando con eficacia la pequea cantidad de telomerasa endgena funcional , a travs de la sobreexpresin de un mutante catalticamente punto muerto de la protena de TERT , provoca la senescencia prematura y la apoptosis de los fibroblastos o queratinocitos humanos primarios ( [ 10 ] , y . Fig. 2 ) . La apoptosis aumenta de manera similar a la sobreexpresin de un punto no funcional mutante catalticamente competente pero biolgicamente de la telomerasa ( [ 10 ] , y . Fig. 2 ) . Estos resultados sugieren que , a pesar el acortamiento de los telmeros eventual , destapar y senescencia que sobreviene , incluso la baja cantidad de telomerasa en estas clulas es parcialmente protector. En conjunto, estos resultados plantean la posibilidad de que las clulas normales no pueden ser verdaderamente telomerasa -negativos in vivo, sino, ms bien , tienen bajas cantidades de telomerasa que sirven a una funcin de los telmeros - protectora. 3 . La otra vida hasta entonces secreta de la subunidad de TERT telomerasa De TERT , la subunidad de la protena cataltica de la telomerasa , es un gran ( > 100 kD ) contienen protenas conservadas dominios fuera de su RT dominio . Un inhibidor de la actividad de la telomerasa , la humana PINX1 protena , fue identificado por primera vez en clulas de mamfero por Lu y sus colegas y ha demostrado inhibir la telomerasa in vitro y para unir la protena de TERT in vitro [ 20 ] . Extendiendo el anlisis de PINX1 a la levadura condujo a la sorprendente encontrar que, in vivo , de TERT puede formar una alternativa , enzimticamente inactiva compleja que carece de ARN de la telomerasa . Este complejo contiene de TERT que contiene , en cambio, PINX1 , que sustituye el ARN de la telomerasa mediante la unin a un dominio de protena de TERT que se superpone con el dominio de unin al ARN . Este de TERT -

Complejo PINX1 es incapaz de sintetizar ADN telomrico , desde que carece de la ARN de la telomerasa . En la levadura , se encontr que PINX1 y la telomerasa ARN se unen al mismo dominio de de TERT . Adems, la evidencia de que el ARN de la telomerasa y PINX1 tanto competir por la unin in vivo de TERT se encontr [ 21 ] . Debido a PINX1 es una protena nucleolar en la levadura , la unin de TERT a PINX1 se espera que tenga el efecto de secuestrar de TERT en el nucleolo , lejos del sustrato de ADN telomrico de telomerasa enzimtica . Las clulas humanas normales han de TERT distribuido en el nucleolo y nucleoplasma , pero en clulas de cncer humano de TERT localiza principalmente en el nucleoplasma , y est generalmente no se detecta en el nucleolo [ 22 ] . La evidencia de que PINX1 es un supresor de tumores se ha comunicado [ 20 ] y es se encuentra a menudo a disminuir en cantidad en los cnceres humanos . Por lo tanto , hemos propuesto que el mecanismo por el cual PINX1 acta como un supresor de tumor es para secuestrar la telomerasa en el nucleolo , y que la prdida de este mecanismo de regulacin promueve la tumorignesis mediante la liberacin de la de TERT a disposicin de la nucleoplasma , donde se puede llevar a cabo el mantenimiento de los telmeros funciones ( ver . Fig. 3 ) . El hallazgo de que la protena grande de TERT , con su ampliamente conservadas dominios fuera de su dominio RT , pueden formar un complejo diferente de la RNP enzimticamente funcional abre la posibilidad de que incluso ms complejos de ter o de TER, pueden existir en las clulas . 4 . Las respuestas celulares a los telmeros aberrantes

Las mutaciones de la plantilla de ARN de la telomerasa pueden causar secuencias de ADN telomrico correspondientemente mutadas que se aaden a los telmeros in vivo . Las respuestas de las clulas a dichas mutaciones no se parecen a las respuestas provocadas por dao en el ADN , tales como roturas de la doble hebra de ADN . En S. cerevisiae , tales telmeros mutantes resultan en un fenotipo de arresto de clulas pre - anafase en la que los cromosomas no se separan , o muestran retraso en la separacin . Focos dao en el ADN que contiene Ddc1 o Ddc2 aumento en la frecuencia en tales clulas sobre el fondo . Si estos focos reflejan fusiones cromosmicas y sobrevienen rotura de los cromosomas dicntricos resultantes, o si los focos se forman en los propios telmeros aberrantes , no se distingua . Sin embargo , las dependencias genticas para esta telomerasa mutante detencin inducida plantilla - difiere de la de una convencional Respuesta al dao del ADN , a diferencia de una respuesta al dao del ADN, el detencin no se ha mejorado por la ausencia de Mec1 , Mec3 , Ddc1 , Ddc2 o Mad1 [ 23 ] . Slo cuando tanto el dao en el ADN los puestos de control y de cabezal vas de control fueron interrumpidos simultneamente qu las clulas no pueden obtener la respuesta arresto al mutante plantilla telomerasa ( D. Smith y EHB , unpub cido ) . Esto sugiere que ambas vas contribuyen a la arresto Cellso levadura en respuesta a mutantes repeticiones de ADN telomrico y que las dos vas pueden funcionar al menos algo redundante en este papel. En interesante contraste con estos resultados , una mutacin en la protena de los telmeros - protectora Cdc13p , que se une la porcin terminal de una sola hebra de levadura telomrica ADN [ 24 ] , provoc una detencin con los requisitos genticos que pareca una respuesta al dao del ADN , es decir, la detencin poda ser aliviado mediante la supresin de slo el punto de control de ADN [ 23 ] . En las clulas de cncer humano , destapado de los telmeros es causada por expresin de un ARN de la telomerasa con una plantilla mutante

[ 25 ] . En estas clulas , focos dao en el ADN se puede ver claramente en la formacin de los telmeros a s mismos , la protena p21 dao en el ADN es inducida , y aumenta la apoptosis . Sin embargo , una vez ms , la gineta dependencias de la IC para este respuesta celular difieren de la de un Respuesta al dao del ADN : no se requiere p53. Esta falta de un requisito para p53 para la respuesta apopttica celular contrasta con la dependencia de la p53 que se inform para un tipo diferente de aberracin de los telmeros en las clulas humanas : el agotamiento de los la telomrica TRF2 vinculante protena de los telmeros por la sobreexpresin sin de una forma negativa truncada , dominante de TRF2 . en ese caso , la apoptosis mostr una dependencia de p53 [ 26 ] . En resumen, los resultados anteriores sugieren que los diferentes tipos de aberraciones moleculares en los telmeros pueden iniciar de sealizacin dentro de las clulas de manera diferente el uno del otro , o de dobles roturas de ADN de cadena . Eventualmente , la corriente abajo subsiguiente acontecimientos parecen converger en una respuesta al dao del ADN comn. Cmo estas respuestas celulares a las amenazas a los telmeros integridad se desencadenan y coordinado sigue siendo un importante pregunta mecanicista. Agradecimientos : apoyo a este trabajo fue proporcionada por NIH subvenciones GM26259 y CA96840 , LVMH / Parfums Christian Dior SA , y La Fundacin Steven y Michele Kirsch . Agradezco a Inna Botchkina para llevar a cabo los experimentos que se muestran en la figura . 3 .