CURVAS DE CALIBRACIN PARA PROTENAS Y AZCARES REDUCTORES.

INTRODUCCIN Existen dos facetas de calibracin en el anlisis cualitativo, la calibracin instrumental y la calibracin metodolgica. La calibracin instrumental se realiza con estndares que no contienen el analito y se utiliza para asegurar el funcionamiento del instrumento empleado. La calibracin metodolgica se realiza con estndares que contienen el analito para establecer una relacin entre las caractersticas fisicoqumicas del analito y las seales del instrumento. En un proceso analtico se relaciona la seal y caractersticas del analito, de modo que la calibracin se realiza al obtener la seal de respuesta como funcin de la concentracin conocida del analito. Se representan los datos obtenidos y se obtiene la grfica de la seal corregida frente a la concentracin del analito. Lo normal es que la grfica tienda a una lnea recta, donde a medida que aumenta la concentracin (Fig.1), la seal de respuesta es mayor (pendiente positiva). En el modelo de curva de calibracin lineal, la pendiente vendr dada por la ecuacin matemtica: y = mx + b Siendo m la pendiente, x la concentracin e y la seal de respuesta. La sensibilidad de calibracin es la pendiente de la curva de calibrado. Por tanto en una curva de calibrado lineal la sensibilidad es siempre la misma y no va a depender de la concentracin, ya que para que se cumpla y = mx + b, las concentraciones deben tener una incertidumbre insignificante. Exactitud Es el grado de concordancia entre el resultado de una determinacin o la media de n resultados y el valor verdadero del analito en la muestra en cuestin. Toda medida tiene un fallo, por lo que el valor verdadero no lo conocemos, pero nos podemos aproximar a l utilizando los siguientes materiales: Material de referencia: material o sustancia, en el cual una o ms de sus

propiedades estn suficientemente bien establecidas para que sea usado en la

calibracin, la estimacin de un mtodo de medicin o para asignar valores a los materiales. Material de referencia certificado (MRC): material en el que los valores de una o

ms de sus propiedades estn certificados por un procedimiento tcnicamente validado.

Determinacin de protenas y azcares reductores Existen diversos mtodos que permiten cuantificar la concentracin de protena presente en las muestras biolgicas, basados en las propiedades que muestran las protenas en solucin. Los mtodos ms usuales son: Reaccin de Biuret. Mtodo de Lowry. Mtodo de Bradford. Mtodo del cido Bicinconnico (BCA). Absorcin en el ultravioleta. Mtodos inmunolgicos.

Siendo uno de los ms utilizados el mtodo Bradforf por ser un mtodo rpido, reproducible y sensible.

Para la determinacin de azcares segn el mtodo Miller, los azcares reductores pueden reducir al cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) bajo determinadas condiciones. Cuando el cido 3,5-dinitrosa- liclico es reducido en presencia de calor, por los azcares reductores que entran en contacto con l, se desarrolla un cambio de color parecido al caf (con variaciones de amarillo hasta caf). El cambio de coloracin puede entonces determinarse por lecturas de densidad ptica, ledas por espectrofotometra a una determinada longitud de onda. La concentracin de los azcares reductores totales liberados en la muestra se determina haciendo una interpolacin en la curva patrn del azcar utilizado, graficando la absorbancia en funcin de la concentracin. OBJETIVO GENERAL El alumno ser capaz de elaborar diferentes curvas de calibracin y entender su importancia. OBJETIVOS ESPECFICOS Obtener una curva de calibracin para azcares reductores Obtener una curva de calibracin para protena por el mtodo Bradford

MATERIALES Y EQUIPO Micropipetas de 1000, 200 y 20 L Puntas para micropipeta azules y amarillas Tubos eppendorf Gradillas para eppendorf Vasos de pp de 1 litro Vasos de pp de 250 mL Reactivo DNS Reactivo Bradford Parrilla de calentamiento Espectrofotmetro con celdas Vortex

DESARROLLO EXPERIMENTAL Y TERICA.

Antes de comenzar con el desarrollo experimental es importante tomar en cuenta las siguientes recomendaciones: La micropipeta debe de mantenerse siempre en posicin vertical durante todo el proceso de pipeteo, nunca inclinada. Todas las micropipetas tienen dos topes: 1) Primer tope para tomar el volumen calibrado. 2) Segundo tope para expulsar de forma ms eficiente el volumen tomado yse usa solo cuando se est expulsando el contenido. . Procedimientos para medir correctamente un volumen con una micropipeta 1. Seleccionar la micropipeta adecuada para medir el volumen deseado (que est dentro del intervalo establecido para la micropipeta). 2. El volumen requerido se fija girando el mbolo. Se debe girar suavemente (evitar estar cambiando constantemente los volmenes, para evitar descalibrar las micropipetas). 3. Colocar una punta desechable en el vstago de la micropipeta; asegurando que est bien sujeta, ejerciendo un ligero movimiento de torsin y presionando. Tener cuidado de no presionar mucho porque esto hace que la punta quede atorada fuertemente dificultando retirarla. 4. Tomar la muestra presionando suavemente el mbolo con el pulgar hasta el primer tope. 5. Introducir la punta de la micropipeta en la muestra no ms de 3 mm de la superficie de lquido, manteniendo la micropipeta en posicin vertical. 6. Succionar el lquido, relajando suavemente y controlando la presin con el dedo pulgar, sin permitir que el mbolo suba por s solo. Se espera un par de segundos con la punta introducida en el lquido. 7. Retirar la punta de la muestra. 8. Introducir la punta de la micropipeta en el tubo o frasco donde se va a verter, colocando la punta contra la pared del tubo, sin sumergirla en la solucin. 9. Presionar el mbolo lentamente, llevndolo hasta el primer tope, continuando inmediatamente hasta el segundo tope, para expulsar la totalidad del lquido que est en la punta. 10. Con el mbolo totalmente presionado se retira cuidadosamente la micropipeta, deslizando la punta a lo largo de la pared del tubo. 11. Llevar el mbolo a la posicin inicial, controlando con el dedo (sin permitir que el mbolo suba por s solo).

12. Sacar la punta de la micropipeta, presionando el expulsor de puntas o tirando de ella. En algunos casos se puede usar la misma punta, para homogenizar la mezcla, una vez adicionado el volumen, se introduce la punta en la mezcla y se baja y sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope.

Preparacin de reactivos requeridos en el laboratorio de bioconversiones y obtencin de las curvas de calibracin. Preparacin de reactivos a) Reactivo de Bradford Disolver 10 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 5 mL de etanol al 95%. A esta solucin se le aaden 10 mL de cido fosfrico al 85% (w/v). La solucin resultante se diluye a un volumen final de 100 mL. Las concentraciones finales en el reactivo son 0.01% (w/v) de azul brillante de Coomassie G- 250, 4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de cido fosfrico. Una vez terminado el reactivo se debe verificar el color, debe ser caf. Si tiene un tono azulado no es adecuada y se desecha, debiendo preparar nuevamente. Filtrar el reactivo cuando sea necesario, conservar en frasco mbar bajo refrigeracin hasta su uso. b) Reactivo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) 1. Preparar una solucin de 100 mL que contenga 2 g de NaOH disuelto. 2. Agregar 2g de cido 3,5-Dinitrosaliclico con agitacin constante 3. Agregar 40g de Tartrato sdico-potasio tetrahidratado. 4. Agregar 0.4 g de fenol. 5. Agregar 0.1g de Sulfito de sodio. 6. Aforar a 200 mL con agua destilada. 7. Guardar en obscuridad y en frasco mbar. Dejar reposar 15 min, en caso de uso inmediato. ES IMPORTANTE tener cuidado con los volmenes que se manejan, por que el volumen final no debe ser mayor a 200 mL. OBTENCIN DE LAS CURVAS DE CALIBRACIN. a) Azcares Reductores

1. Para la obtencin de la curva de calibracin de azcares reductores se utilizar como estndar la Glucosa para ello se realiza la curva patrn de Glucosa (o el azcar reductor ms adecuado en funcin de lo que se vaya a determinar) en un rango de concentracin de 0 a 2.0 g/L. 2. Las diluciones se prepararn, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 1. 3. Una vez que se preparan las diluciones se debe realizar el procedimiento para azcares reductores.

*Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotmetro. CUANTIFICACIN DE AZCARES REDUCTORES TOTALES POR EL MTODO DE DNS 4. Agregar 100 L de la solucin problema (solucin de glucosa a 1 mg/mL o de sacarosa a 6 mg/mL ya digerida, tabla 1) . 5. Agregar 300 L del reactivo de DNS preparado. 6. Ebullir 5 minutos y dejar enfriar (10 minutos aproximadamente). 7. Agregar 600 L de agua destilada. 8. Agitar en vrtex a temperatura ambiente. 9. Leer la absorbancia registrada en el espectro de UV-Visible a 540 nm (cuidar que no pase ms de 30 min para su lectura). 10. Elaborar la curva patrn en donde se grafique en el eje de las ordenas (ejey) promedio de la absorbancia determinada a 540 nm y en el eje de las abscisas (ejex) el promedio de la concentracin de Glucosa determinada en g/L. 11. Determina la ecuacin de la lnea recta que relaciona a los dos parmetros: y = mx + b

En donde y representa la absorbancia determinada a 540 nm. x representa la concentracin de maltosa determinada en g/L. La curva patrn ser correcta cuando se obtenga una R2 mayor o igual a 0.98, con lecturas de absorbancia entre 0 y 1. DIGESTIN CIDA PARA LLEVAR A CABO LA CUANTIFICACIN DE AZCARES NO REDUSCTORES 1. Tomar 200 L de la muestra correspondiente a cada tubo. 2. Agregar 200 L de HCl (Preparado con dilucin 1:2). 3. Agitar en vrtex para homogenizar 4. Ebullir 10 minutos y enfriar en hielo. 5. Agregar 200 L de NaOH (Preparado al 25%). 6. Agregar 60 L de HCl (Preparado al 5%). 7. Seguir con la metodologa de cuantificacin de azcares reductores. b) Determinacin de Protena. 1. La determinacin de protena de una solucin enzimtica con el mtodo de Bradford, se determina por medio de una curva tipo con albmina de huevo (AH) y el reactivo de Bradford. 2. Curva tipo: preparar diferentes concentraciones de AH de 0 a 200 g/mL, a partir de una solucin de 200 g/mL, (Tabla 2). 3. Agregar en un tubo eppendorf limpio la cantidad de solucin de AH y agua que se indica para obtener un volumen final de 0.25 mL de muestra.

4. Posteriormente adicionar 0.75 mL de reactivo de Bradford, y dejar en reposo EXACTAMENTE 5 minutos, inmediatamente despus leer la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con el blanco de reactivos o agua (el que no contiene protena). INFORME 1. Generar las grficas correspondientes para las curvas de calibracin de azcares reductores por el mtodo DNS. 2. Generar las grficas correspondientes para las curvas de calibracin de protenas por el mtodo de Bradford. 3. Discutir los resultados obtenidos. REFERENCIAS Bradford, M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254. Miller G., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31: 426-428.