ISSN 0568-3076

agron. 17(2): 7 - 24, 2009

DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES DE PLANTAS DE ORIGEN BITICO

scar Adrin Guzmn-Piedrahita*, Jairo Castao-Zapata* y Bernardo Villegas-Estrada*
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Programa de Maestra en Fitopatologa, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Caldas, Manizales. Correo electrnico: oscar.guzman@ucaldas.edu.co
Recibido: 18 de enero; aprobado: 28 de abril de 2009.

Diagnstico de enfermedades de plantas es un arte. Progreso es el resultado de prctica. Es similar al progreso obtenido jugando golf o tocando violn, asumiendo que uno tiene aptitud para ello. Se requiere mucho tiempo desarrollar destreza. No hay sustituto para la experiencia. Rubert B. Streets, SR; 1972

RESUMEN
Las enfermedades de las plantas ocasionadas por microorganismos infecciosos como hongos, bacterias, nematodos y protozoarios flagelados, y por agentes como virus y viroides, son el producto de la interaccin dinmica entre un patgeno, un hospedante y el medio ambiente. El primer paso para el manejo correcto de una enfermedad es conocer su verdadera etiologa. Se conocen ms de 1.300 especies de hongos que causan enfermedades en los principales cultivos alimenticios, adems de 4.105 especies de nematodos fitoparsitos, 950 especies de virus y 30 de viroides, y alrededor de 100 especies de bacterias fitopatgenas. Existen varios procedimientos para determinar la etiologa de enfermedades de plantas tales como, la observacin directa del agente causante al microscopio compuesto, tcnicas inmuno-enzimticas, bioqumicas y moleculares, y microscopa electrnica. Para un diagnstico correcto, se debe disponer de laboratorios adecuados de Diagnstico Fitosanitario, a los cuales deben enviarse muestras frescas y representativas de plantas que presenten sntomas tpicos de la enfermedad, para poder conocer con exactitud su etiologa. El diagnstico es el fundamento tcnico y cientfico para adoptar medidas de manejo rpido y oportuno.

ABSTRACT
DIAGNOSIS OF PLANT DISEASES OF BIOTIC ORIGIN Plant diseases caused by living infectious microorganisms such as fungi, bacteria, nematodes, and flagellate protozoa, and by agents such as viruses and viroids, are the result of the dynamic interaction between a pathogen, a host and the environment. The first step for the correct management of a plant disease is to know its real etiology. More than 1.300 fungi species which cause diseases in the main foodstuff are well recognized along with 4.105 phytoparasite nematodes species, 950 viruses and 30 viroids species, and around 100 phytopathogenic species of bacteria. There exists a variety of procedures to determine the etiology of diseases in plants including direct observation of the causing agent through the compound microscope, immune-enzymatic, bio-chemical and molecular techniques, and electron microscopy. In order to carry out a correct diagnosis, adequate Phytosanitary Diagnosis Laboratories must be available where fresh and representative plant samples, with typical symptoms of the disease, can be sent in order to know exactly their etiology. The diagnosis is the technical and scientific fundamental to take measures for a quick and appropriate management.

Palabras clave: bacteria, etiologa, hongos, nematodos,

patgeno, viroides, virus.

Key words: bacteria, etiology, fungi, nematodes, pathogen, viroids, viruses.

scar Adrin Guzmn-Piedrahita, Jairo Castao-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada

INTRODUCCIN
Las enfermedades de las plantas son ocasionadas por microorganismos infecciosos o biticos como hongos, bacterias, nematodos y protozoarios flagelados, y por agentes infecciosos como virus y viroides (Figura 1); as mismo, por factores no infecciosos o abiticos, como alteraciones edafoclimticas y toxicidad por plaguicidas, entre otros (Agrios, 2005). La enfermedad es una interaccin dinmica entre un patgeno, un hospedante y el medio ambiente, la cual causa en los hospedantes cambios anormales de tipo fisiolgico y morfolgico. Por consiguiente, enfermedad no es una propiedad del hospedante, sino un producto de la interrelacin del hospedante y el patgeno, bajo un ambiente especfico. La enfermedad
Figura 1.

puede considerarse tambin como las respuestas visibles e invisibles de las clulas y tejidos de las plantas a un agente infeccioso o factor no infeccioso, que resulta en cambios adversos en la forma, funcin o integridad de la planta, interfiriendo con la formacin, traslocacin o utilizacin de nutrientes minerales y agua, de tal manera que la planta afectada cambia en apariencia y rinde menos que una planta sana de la misma variedad (Agrios, 2005). La etiologa se define como la determinacin del agente causante de una enfermedad. Para tal fin, se debe recolectar una muestra fresca adecuada de los tejidos de las plantas que presenten los sntomas tpicos de la enfermedad, que permita realizar un anlisis correcto, para poder establecer las medidas de manejo apropiadas (Agrios, 2005).

Enfermedades del pltano con sus respectivos microorganismos o agentes infecciosos. A. Sigatokas negra y amarilla (Mycosphaerella fijiensis arriba y M. musicola abajo), B. Rayado del banano (Banana streak Badnavirus, BSV), C. Moko (Ralstonia solanacearum, raza 2) y D. Cabeza negra (Radopholus similis). (Fotos: Autores).

A.

B.

C.

D.

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IMPORTANCIA DE LAS ENFERMEDADES

Existen aproximadamente 350.000 especies de plantas, de las cuales unas 3.000 son empleadas como alimento por los humanos, constituyendo el 99% de suministro de su alimento. De estas, solo 300 especies son ampliamente cultivadas y solo 11 cultivos: arroz, maz, trigo, sorgo, caa de azcar, papa, yuca, frijol, patata, banano y coco, constituyen el 95% del suministro de alimentos a la humanidad (Castao-Zapata, 1994). Ms de 1.300 especies de hongos causan enfermedades en estos cultivos (Farr et al., 1989). Se conocen 26.646 especies de nematodos, distribuidas entre especies de vida libre (10.681); y parsitos de: invertebrados (3.501), vertebrados (8.359) y plantas (4.105) (Hugot et al., 2001). Estos ltimos causan prdidas anuales del 11 y el 14% en cultivos de importancia como las leguminosas, granos, banano, yuca, coco, remolacha azucarera, caa de azcar, papa, hortalizas y varios frutales, equivalentes a US$80 billones ao (Agrios, 2005). De las 2.290 especies de virus descritas por el Comit Internacional de Taxonoma de Virus, se conocen alrededor de 950 que afectan plantas, equivalente al 41% (ICTV, 2010). Se reportan alrededor de 30 viroides que afectan cultivos importantes como: papa, tomate, lpulo, aguacate y ctricos (Hammond & Owens, 2006). Se conocen cerca de 1.600 especies de bacterias, de las cuales 100 causan enfermedades en plantas, equivalente al 16% (Agrios, 2005). Las enfermedades de importancia econmica producen prdidas en los cultivos en una o varias formas:

1845 caus la destruccin de los cultivos de papa en Irlanda. En Ceiln, hoy Sri Lanka, en 1868, la Roya del caf (Hemileia vastatrix Berk. & Br.) fue responsable de la substitucin del cultivo de caf por el t, cacao y otros, debido a la imposibilidad de cultivar caf en aquel pas. En Brasil, esta enfermedad causa prdidas que oscilan entre el 20 y 30% (Zambolim & Ribeiro do Vale, 1997). En Colombia, la Secadera del maracuy [Nectria haematococca Berk. & Broome, anamorfo Fusarium solani (Mart.) Sacc.], en el Valle del Cauca, caus prdidas del 90 y 100% (Torres et al., 2000). En musceas, la reduccin en el rendimiento por el nematodo Barrenador (Radopholus similis Cobb.) puede llegar hasta un 80% (Moens et al., 2003); mientras que en soya, prdidas del 10 y 30% son ocasionadas por el nematodo Quiste (Heterodera glycines Ichinohe) (Davis & Tylka, 2000). La enfermedad viral de mayor importancia que afecta al frijol en Amrica Latina es el Mosaico dorado amarillo del frijol (Bean golden yellow mosaic Begomovirus, BGYMV), el cual caus prdidas entre el 40 y el100% en Argentina y Bolivia (Morales, 2000). El Moko del pltano y banano causado por Ralstonia solanacearum E. F. Smith raza 2, caus prdidas del 100% en la dcada del setenta en el departamento del Caquet en donde destruy 20.000 ha de pltano (Belalczar et al., 2004).

herbarum (Pers.:Fr.) Link] ha tenido incidencias del 79 y el 100% (Torres et al., 2000), que demeritan la calidad de los frutos.

2. Reduccin de la calidad del producto cosechado. La Roa del maracuy [Cladosporium

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1. Reduccin en el rendimiento de las plantas. Se puede generalizar que las enfermedades

de las plantas reducen el potencial de produccin en los pases desarrollados en un 15 y 20% y an hasta en el 100%, como el caso del Tizn tardo de la papa [Phytophthora infestans (Mont.) de Bary], que en

3. Contaminacin del suelo. El aumento de inculo de un patgeno en el suelo lo torna eventualmente inapropiado para la siembra de un cultivo susceptible en particular y requiere de medidas directas de manejo, como tratamiento qumico del suelo, u otra medida como rotacin de cultivos (Castao-Zapata, 1994). Un buen ejemplo en pasiflorceas es N. haematococca, que produce clamidosporas, las cuales pueden sobrevivir en el suelo por varios aos. Los nematodos Quiste de la soya y la papa (H. glycines y Globodera rostochiensis

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(Wollenweber) Behrens, respectivamente) producen quistes que les permiten sobrevivir por ms de 20 aos en el suelo (Perry & Moens, 2006).

4. Prdidas de poscosecha. En el departamento de Boyac se ha registrado la Antracnosis de la curaba [Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & H. Schrenk, anamorfo Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. en Penz] como responsable del 50% del ataque de frutos (Jcome & Barreto, 1984).
patgenos de plantas, especialmente hongos, producen toxinas como las aflatoxinas causadas por especies de Aspergillus P. Mich. ex Link:Fr., en maz y otros productos almacenados. Por ejemplo, la aflatoxina B1 es producida por tres especies estrechamente relacionadas: A. flavus Link:Fr., A. parasiticus Speare y A. nomius Kurtzman, Horn & Hesseltine. Se conocen unas 300 toxinas fngicas (Carrillo, 2003).

5. Formacin de productos txicos. Los

para que se tornen susceptibles. Algunos factores biticos o abiticos pueden causar prdidas indirectas, predisponiendo a las plantas a ataques subsecuentes por otros patgenos como los nematodos, que atacan las races de plantas y permiten la entrada de otros microorganismos (Castao-Zapata, 1994). El proceso de colonizacin de Fusarium oxysporum Schlechtend.:Fr., en presencia de Meloidogyne javanica (Treub) Chitwood, ha sido estudiado de tal manera que hay mayor colonizacin de los tejidos de las plantas por Fusarium, a medida que aumenta el nmero de individuos de Meloidogyne (Perry et al., 2009). Las enfermedades que afectan las plantas pueden ser causadas por diferentes microorganismos o agentes, los cuales se describen a continuacin.

Hongos. Esta palabra proviene del griego sphongos,

6. Incrementos en el costo de produccin.

Los patgenos causan enfermedades que resultan en reduccin del rendimiento y calidad, lo cual provoca un incremento en los costos de produccin como el caso de la Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis Morelet) del banano, cuyos costos de control varan entre US$700 y 900 ha/ao, representando cerca del 13,8% de los costos totales de produccin del cultivo y el 46% de los costos de los agroqumicos (Chica et al., 2004).

que significa esponja (Harper, 2010). Las hifas miden entre 2 y 10 m de dimetro hasta varios centmetros de longitud. La mayora de las especies estn compuestas por filamentos tubulares que pueden ser cenocticos o septados, cuyo conjunto se denomina micelio. Los componentes principales de las paredes celulares de los hongos son celulosa, pectona y quitina, y se distinguen por la carencia de clorofila, posesin de ncleos y nuclolos con membranas bien definidas (eucariotas). Su reproduccin se realiza mediante esporas de origen sexual o asexual (CastaoZapata, 1994).

7. Costos de manejo. El costo de la aspersin

semanal de un cultivo de maracuy con productos cpricos para manejar la Bacteriosis [Xanthomonas campestris (Pammel) Dowson pv. passiflorae Pereira] se refleja posteriormente en un incremento de precio al mayorista, al intermediario y, finalmente, al consumidor. A mayor nmero de aspersiones, mayor es el incremento en los costos de manejo (Botero et al., 2006; Castillo & Granada, 2005).

8. Predisposicin a otras enfermedades.

Segn Paul Sorauer (1905), los patgenos afectan plantas solamente si el medio ambiente las predispone

significa bastn pequeo cuyo tamao oscila entre 1 y 2 mm (Harper, 2010). Estos microorganismos son unicelulares, cuyo material gentico (ADN) carece de una membrana celular y por ello no est organizado en un ncleo (procariotas). Sus clulas consisten de citoplasma que contienen ADN y ribosomas pequeos (70S). El citoplasma est rodeado por una membrana y una pared celular. La mayora de bacterias fitopatgenas tienen forma de bastn o bacilo y poseen flagelos, usualmente en los polos, y fimbrias o pili (Vidaver & Lambrecht, 2004; Agrios, 2005).

Bacterias. Palabra que deriva del griego bakterion, y

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Mollicutes. Nombre proveniente del latn mollis

(suave) y cutis (piel), son bacterias que carecen de pared celular pero estn provistas de una membrana celular trilaminar. Incluyen los llamados anteriormente fitoplasmas y espiroplasmas, que son organismos celulares ms pequeos con un tamao de 0,3-1,2 m de dimetro y se autorreplican (Fletcher & Wayadande, 2002).

Nematodos. Provienen de los vocablos griegos nema (hilo) y eids u oidos (con aspecto de), son definidos como animales filiformes con cuerpo sin segmentos y ms o menos transparentes, cubierto de una cutcula hialina, la cual est marcada por estras o anillos; son redondeados, poseen boca y carecen de apndices; aunque las hembras adultas de algunos gneros son abultadas, como Meloidogyne Goeldi y Heterodera Schmidt (Siddiqi, 2000; Perry & Moens, 2006). La mayora son microscpicos, con una longitud entre 300 y 1.000 mm, y entre 15 y 35 mm de dimetro (Agrios, 2005; Luc et al., 2005; Perry & Moens, 2006).
Los nematodos parsitos de plantas tienen un estilete hueco, tambin llamado lanza, pero hay algunos con estilete slido modificado. El estilete es usado para perforar o penetrar las clulas de la planta, y a travs de l se extraen los nutrientes desde la clula (Luc et al., 2005; Perry & Moens, 2006).

Virus. Proviene del latn virus, que significa veneno. Los virus son agentes infecciosos compuestos de una o varias molculas de cido nucleico (ADN o ARN de cadena sencilla o doble) cubiertas por una o varias capas de protena o lipoprotena capaces de replicarse en las clulas de un hospedante susceptible (Hull, 2009). Su tamao oscila entre 20 y 70 nm de dimetro para los virus isomtricos y 150 a 2.200 nm de longitud para virus con forma de varilla. La traduccin del genoma (para producir protenas) o transcripcin y replicacin (para producir ms cido nucleico) ocurre dentro de las clulas del hospedante usando su maquinaria metablica (Adams & Antoniw, 2010).
virus que significa veneno y del sufijo oid que significa imperfecto o incompleto. A diferencia de los virus, los viroides son molculas de cido ribonucleico (ARN) de cadena sencilla que ocasionan enfermedades en varias especies de plantas. Sus genomas son de 239 a 401 nucletidos de ARN circular de cadena sencilla; adems, no codifican protenas (Hammond & Owens, 2006).

Viroides. Proviene de la unin de la palabra latina

PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES DE PLANTAS

Protozoarios flagelados. Provienen de las races 1. Clave para el diagnstico de agentes griegas proto (primero) y zoo (animal), y del latn causantes de enfermedades
flagellum, que significa flagelo, pero ms largo y capaz de realizar movimientos (RAE, 2010). Una secuencia para iniciar el diagnstico consiste en seguir la clave de French y Hebert (1982): A1 Manchas y Chancros B1 Signos de patgenos visibles al microscopio estereoscpico. C 1 Signos de hongos: Realice preparaciones microscpicas de las estructuras con tincin cuando sea apropiadoI

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Los protozoarios flagelados son microorganismos unicelulares con uno o ms flagelos largos y delgados en algunos o todos los estados de su ciclo de vida. Los fitopatgenos pertenecen al gnero Phytomonas (Kinetoplastida: Trypanosomatidae); tienen cuerpo en forma de huso con extremos aguzados, entre 12 y 18 m de longitud y 1 a 2,5 m de ancho y con un flagelo de 12 a 18 m de largo; su ncleo est situado a un tercio del extremo anterior; se multiplican en el floema, y son transmitidos por hempteros fitfagos (Agrios, 2005).

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C2 Signos de bacterias (exudado o manchas hmedas): Realice preparaciones microscpicas para observar flujo bacterial en campo oscuro, luego efecte tincin de Gram..II B2 Ausencia de signos de patgenos. C1 Incube la muestra en cmara hmeda y luego regrese a A1...III C 2 Mosaicos, moteados u otros sntomas virales posibles. C3 Decoloracin y otros sntomas de desnutricin. A2 Marchitez B1 Sistema radical afectado. C1 Presencia de nematodos o sus sntomas. C2 Pudricin radical, tratar como A1 B2 Sistema vascular descolorado. C1 Prueba de flujo bacterial en agua, luego efecte tincin de Gram ..II C2 Ausencia de flujo, hacer corte para observar hongos...I

2. Secuencia para realizar un diagnstico correcto

Para realizar un diagnstico correcto se recomienda seguir la secuencia propuesta por Rubert Streets (1972): a) Identifique la planta hospedante, adicionando el nombre de la variedad. b) Sntomas en el campo. Utilice su propia informacin o use la proporcionada por quien enva la muestra. c) Condiciones de cultivo. Informacin del tipo de suelo, prcticas de riego, fertilizacin y aplicacin de plaguicidas. d) Sntomas en detalle. Observacin de manchas, aublo foliar, pudricin de semillas o frutos, cancros en las ramas o tallos, pudricin o agallas en las races, etc. e) Observacin en aumento bajo. Observacin con una lupa de alto aumento en el campo o un estereoscopio en laboratorio de la superficie de las lesiones o tejidos muertos; esto permitir observar la presencia de esporas, cuerpos fructferos de hongos o exudados bacteriales. f) Observacin en aumento alto. Observacin a travs del microscopio compuesto para detallar las estructuras anteriores. g) Aislamiento . Aislar el microorganismo sospechoso en condiciones aspticas de laboratorio. h) Patogenicidad. Si el patgeno observado es el causante de la enfermedad, pero no existen informes previos, entonces se debe recurrir a los postulados de Robert Koch, establecidos en 1876: 1. Debe haber una asociacin constante entre el organismo y el hospedante enfermo.

A3 Pudriciones B1 Tallo o raz, tratar como A1 B2 rganos de reserva (tubrculos, races) C1 Realice preparaciones microscpicas y obser ve para hongos, con tincin cuando sea indicadoI C 2 Hag a pre paraciones para obser var bacterias en campo oscuro (microscopio de contraste de fase), luego realice la tincin de Gram..II C3 Inocule tejidos sanos con los afectados cuando la pudricin es avanzada; luego observe como C1 y C2.........IV

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2. Se debe aislar el patgeno sospechoso del hospedante enfermo y obtenerlo en cultivo puro. 3. Se debe inocular un hospedante sano con el cultivo puro del organismo sospechoso y reproducir los sntomas tpicos de la enfermedad. 4. Se debe reaislar el patgeno en cultivo puro a partir del hospedante inoculado y enfer mo y sus caractersticas deben ser exactamente iguales a las observadas en el cultivo obtenido en el segundo postulado. i) Diagnstico. Si el patgeno en observacin es identificado con manuales especializados, o cuando los postulados son demostrados, el patgeno aislado es el responsable de la enfermedad. j) Recomendaciones. Despus de diagnosticar correctamente el agente causante de la enfermedad, el agricultor se preguntar: qu puedo hacer acerca de la enfermedad? y cul es el manejo? Especificar la mejor medida de manejo de cada enfermedad est fuera del alcance de cualquier libro. La respuesta correcta a estos interrogantes se obtiene consultando referencias selectas, fundamentalmente a travs de la buena experiencia que tenga el fitopatlogo, pues como lo expres Rubert Streets, no hay sustituto para la experiencia. Si no se encuentra algn organismo o agente asociado a la enfermedad, se asume que es causada por un factor ambiental, el cual puede interferir con las funciones fisiolgicas normales de las plantas.

en platos de poliestireno, utiliza la habilidad de los anticuerpos (inmunoglobulinas) producidos por el sistema linftico de un vertebrado de sangre caliente (conejos, ratones, etc.) para reconocer un antgeno especfico (protenas, eptopes o determinantes antignicos), es decir, el agente, sustancia o microorganismo extrao inyectado en el torrente sanguneo del mismo; por lo tanto, la reaccin ser especfica de cada anticuerpo para su respectivo antgeno (Dewey, 2002).

4. Tcnicas bioqumicas y moleculares

La identificacin de bacterias se ha basado en combinaciones de pruebas fisiolgicas y bioqumicas, mientras que la identificacin de hongos se ha realizado con base en caractersticas morfolgicas, tales como tipo de espora, forma y color. Sin embargo, en los ltimos 40 aos, los avances en la bioqumica microbial y biologa molecular han permitido la expansin de los mtodos de diagnstico y procedimientos de identificacin de diferentes patgenos de plantas (Bridge, 2002). La deteccin de actividades fisiolgicas y bioqumicas se realiza fundamentalmente sobre medios slidos o lquidos, y se basa en la apariencia del crecimiento o un cambio de color. Estas pruebas involucran la adicin de sustratos apropiados al medio, junto con un sistema que permite la deteccin bien sea de su degradacin o de uno de los productos asociados con ella (Bridge, 2002). Las bacterias han sido identificadas por sus funciones metablicas, tales como su habilidad para metabolizar ciertos sustratos mediante el sistema API (Analytical Profile Index) para diferenciar cepas de Erwinia y Pseudomonas. Adicionalmente, el anlisis de protenas solubles mediante electroforesis en geles ha sido adoptado para hongos y bacterias (Strange, 2003). La principal herramienta de diagnstico molecular de microorganismos fitopatgenos es la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en

3. Tcnicas inmuno-enzimticas
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Constituyen una metodologa rpida para identificar patgenos de plantas. El ensayo de inmuno-absorcin ligado a una enzima (ELISA, por sus siglas en ingls) es el ms ampliamente usado por su especificidad, simplicidad y bajo costo. Esta tcnica que se realiza

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ingls) basada en los genes ribosomales. La PCR es rpida, econmica y permite producir un gran nmero de copias de molculas de ADN va catlisis enzimtica, para mostrar diferencias en secuencias de genes del ARN ribosomal (rARN) o ADN mitocondrial (mADN) (Luc et al., 2005; Atkins & Clark, 2004). Para el caso de agentes fitopatgenos como los virus de ARN, es necesario sintetizar una cadena de ADN complementario (cADN) por medio de la enzima transcriptasa reversa (RT) como paso previo. Esta tcnica tiene muchas variaciones como la PCR anidada que consiste en dos PCR sucesivas cuyos amplicones de una reaccin son usados como molde de la siguiente. Otra variacin incluye la captura de partculas virales mediante anticuerpos llamada Inmunocaptura PCR (IC-PCR) cuando las concentraciones de partculas virales son muy bajas (Harper et al., 1999; Webster et al., 2004). La deteccin conjunta de diferentes virus a partir de la combinacin de cebadores especficos para cada uno de ellos es una variacin de esta tcnica llamada RT-PCR mltiple (Ito et al., 2002). Hibridacin molecular mediante sondas: Se basa en la capacidad que tienen los cidos nucleicos de desnaturalizarse y volverse a unir con hebras complementarias en condiciones apropiadas en membranas de nylon o nitrocelulosa (Conci, 1999). Las tcnicas de hibridacin ms utilizadas son el Southern blot , la cual detecta secuencias especficas de ADN, el cual se asla del tejido mediante extraccin y separacin por electroforesis, se purifica y se digiere (fragmenta) con enzimas de restriccin especficas. Northern blot es una variante del mtodo anterior en el que se usa el ARN como objeto de estudio (Corvaln, 2002). Dot blot y Slot blot son procedimientos similares al Northern blot con la diferencia de que las muestras son colocadas directamente sobre la membrana de nitrocelulosa (Dijkstra & De Jager, 1998; Hull, 2002). ARN de cadena doble (cdARN): Es utilizada para el diagnstico de virus fitopatgenos, asociados con la infeccin de virus de ARN monocatenario (csARN),

ya que estos durante su proceso de replicacin forman una cadena doble intermedia con un ARN complementario que sirve de molde para la sntesis de ARN mensajero (Fisher, 2008). Mapas de restriccin: Esta tcnica se basa en que de una molcula de ADN se pueden obtener siempre los mismos fragmentos cada vez que sea expuesta a una enzima de restriccin particular. Una de las tcnicas ms utilizadas es el anlisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin (RFLP, por sus siglas en ingls), en la cual se determinan las variaciones en la constitucin gentica de la poblacin (polimorfismo gentico), demostrando diferencias entre los individuos en cuanto al nmero y longitud de los fragmentos producidos (Granner, 1992).

5. Tcnicas de microscopa de luz

La microscopa de luz permite la observacin de inclusiones virales, es decir, la acumulacin de partculas virales, protenas, material celular modificado o mezcla de estos. Las inclusiones deben observarse a magnificaciones de 1.000X con el objetivo 100X. Se hacen cortes de los tejidos epidrmicos de hojas de muestras frescas y se ponen en contacto con soluciones de tintes como, por ejemplo, calcomina naranja o Azure A. Esto permite la clasificacin de varios gneros de virus (Christie & Edwardson, 1977; Conci, 1999).

6. Tcnicas de microscopa electrnica

Permite la observacin del macerado de tejidos de plantas infectadas con virus, con el fin de detectar y medir el tamao de partculas virales a travs del Microscopio Electrnico de Transmisin, usando la tcnica de tincin negativa con acetato de uranilo. Tambin con la ayuda de antisueros especficos se aplica la tcnica de inmuno-microscopa electrnica (ISEM, por sus siglas en ingls) para atraer partculas virales a las rejillas de observacin en caso de

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existir relacin antignica (Morales et al., 2006). El microscopio electrnico permite magnificar entre 200.000 y 600.000 veces el tamao de las partculas.

o base del tallo. Por consiguiente, la muestra debe corresponder al sitio real de ataque de la enfermedad (Figura 2F). Revise la presencia de lesiones, agallas, cancros (heridas) u otros sntomas que puedan tener las races, tallos, ramas o frutos, para escoger las partes de la planta que presenten los sntomas caractersticos de la enfermedad (Figura 2G). Si sospecha que es un hongo el que est causando la enfermedad, cercirese de que est esporulando sobre el tejido vegetal. Si cree que es una bacteria, observe si hay marchitamiento de la planta, pudricin de races o cuello de la planta o lesiones foliares sin estructuras reproductivas (Figura 2H). No recolecte tejidos con exceso de humedad por lluvia, riego o roco y tampoco en descomposicin, ya que cuando estos son empacados en cajas de cartn, el exceso de humedad favorece el crecimiento de microorganismos secundarios que deterioran y contaminan la muestra dificultando el diagnstico (Figura 2I). Procure tomar fotos de plantas completas con los sntomas de la enfermedad, al igual que de plantas sanas, y envelas rpido al laboratorio (Figura 2J). En plntulas y plantas de porte bajo o anual, se recomienda extraer la planta completa con las races y suelo que la rodea, luego colquela en una bolsa de plstico y sujeta con cinta, o envuelta en papel peridico o caja de cartn, para evitar que el suelo se desprenda de las races (Figura 2K). En arbustos, rboles anuales, bianuales y perennes, las races gruesas (primarias y secundarias) y delgadas (terciarias y cuaternarias) NO deben ser lavadas con agua para retirar el suelo. Estas se envuelven en papel absorbente o toallas de papel, para luego empacarlas en una bolsa de plstico o caja de cartn (Figura 2L). Si los tejidos enfermos son tallos y ramas, se cortan trozos del tejido afectado y en los extremos se puede colocar parafina para evitar la prdida de humedad

IMPORTANCIA DE LAS MUESTRAS EN EL DIAGNSTICO CORRECTO DE ENFERMEDADES

Para un buen diagnstico no basta con observar los sntomas; en lo posible, debemos apoyarnos en laboratorios de Diagnstico Fitosanitario, los cuales requieren del envo de muestras frescas, representativas de plantas enfermas, o partes de ella como: races, tallos, hojas, flores o frutos (Dees et al., 1986; Hansen & Wick, 1993; ICA, 1996; Putnam, 1995) (Figura 2A), que presenten los sntomas tpicos de la enfermedad, para poder conocer con exactitud la etiologa de la enfermedad bajo estudio (Ocampo et al., 1994; Horst, 2001). El diagnstico es el fundamento tcnico-cientfico para adoptar medidas de manejo rpido y oportuno (ICA, 1996). Una muestra ptima debe mostrar el tejido de la planta realmente enfermo (Figura 2B). La muestra colectada debe tener tejido sano y enfermo, es decir, todos los estados de desarrollo de la enfermedad, mostrando los sntomas iniciales y finales de la enfermedad (Figura 2C). La cantidad de material vegetal recolectado debe ser adecuado, que permita analizar el tejido enfermo y dejar muestras para anlisis posteriores. Si las plantas son de porte bajo o arbustos, seleccione al menos cinco plantas completas con el problema e incluya una planta con apariencia normal o sana para comparacin (Figura 2D); si son rboles, seleccione nicamente la(s) parte(s) del rbol que tenga(n) los sntomas, es decir, hojas, partes del tallo, flores o races afectadas (Figura 2E). Las hojas marchitas o necrticas no necesariamente contienen el patgeno, debido a que puede ser el resultado de la accin de este en el sistema radical

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(deshidratacin). Estas muestras pueden empacarse en sobres de manila, papel grueso parafinado o cajas de cartn (Figura 2M). Hojas, yemas y flores afectadas se envan secas o sin humedad exterior, extendidas en medio de papel toalla, servilletas, papel peridico o bolsas de papel absorbente. Despus, se pueden envolver en papel aluminio o protegerlas dentro de bolsas plsticas, procurando que no se daen en el transporte (Figura 2N). Si se trata de frutos, tubrculos y bulbos enfermos, se seleccionan como muestra aquellos que presenten sntomas iniciales e intermedios de la enfermedad. Cuando se requiera, dejarlos secar al ambiente para eliminarles el exceso de humedad y evitar su dao. Posteriormente, se envuelven en papel toalla, servilletas, papel peridico o bolsas de papel absorbente; y cuando sea posible, envolverlos en papel aluminio para luego empacarlos dentro de una caja de cartn o bolsa de plstico (Figura 2O). Tejidos que se sospechen estn afectadas por virus y mollicutes no deben estar muertos o demasiado afectados; las hojas deben presentar sntomas como amarillamientos, mosaicos, clorosis o necrosis foliar, deformaciones y manchas anulares; las flores con variegacin y deformaciones, y los frutos con necrosis y deformaciones (Figura 2P). El tejido vegetal se envuelve en papel toalla, servilletas, papel peridico o bolsas de papel absorbente. Para evitar que se daen deben colocarse dentro de dos lminas de cartn, despus empacarlas en papel aluminio y, luego, en bolsa de papel. Nunca en bolsa plstica. Las muestras de diferentes plantas deben empacarse por separado, no deben mezclarse. As mismo, no deben refrigerarse ni congelarse, y preferiblemente se deben enviar al laboratorio inmediatamente (Figura 2Q). De un lote donde se va establecer un cultivo y se quiere recolectar una muestra para anlisis de nematodos, las arvenses (malezas) y residuos deben ser retiradas del sitio. Recolecte las muestras segn las condiciones de suelo, muestreando por separado reas

de diferente topografa (plana, ondulada, pendiente), reas de diferente cultivo (maz, frijol, caf) y reas de diferente textura (arenosos, arcillosos, limosos) (Figura 2R). La muestra debe estar conformada por 40 submuestras/ha, tomadas a la profundidad de las races alimenticias (entre 5 y 30 cm) con un paln. Para cubrir todo el terreno, la distancia entre sitios donde se tomen las submuestras debe ser similares, por ejemplo, cada 7 m (Dees et al., 1986) (Figura 2S). En cultivos anuales o perennes la muestra se recolecta del plato de 20 plantas que estn bien distribuidas en una hectrea. En cada planta, se recolecta una submuestra por punto cardinal (Oriente, Occidente, Norte y Sur) a una distancia que vara segn el rea de races en el plato del rbol (ejemplo: 0,5; 1,0; 1,5 y 2,0 m para frutales como guayabo y ctricos; 10, 20, 30 y 50 cm, para pltano y pitahaya) y a una profundidad entre 5 y 30 cm, se toman 200 g de races y suelo de cada planta, y se depositan en un balde. Despus de recolectar las 20 submuestras, se mezclan bien para conformar una muestra compuesta de 2 kg de suelo y races que se depositan en una bolsa de plstico (Figura 2T).

CONSIDERACIONES PARA TENER EN CUENTA DESPUS DE LA RECOLECCIN DE LA MUESTRA

1. Evite que los tejidos se deterioren por el calor, metiendo la muestra en una caja de icopor con hielo, nevera o en un lugar fresco, ya que el diagnstico se dificulta cuando las muestras llegan al laboratorio marchitas, maltratadas o podridas. 2. La muestra debe ser entregada tan rpido como sea posible al Laboratorio de Diagnstico (mximo en dos das). En caso extremo, debe colocarse en un refrigerador o en un cuarto fro, entre 4 y 8C, para evitar su deterioro y enviarla al da siguiente. 3. Las muestras de suelo o races para anlisis de nematodos fitoparsitos deben conservar humedad para evitar su muerte.

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4. La muestra recolectada debe ir acompaada del respectivo protocolo completamente diligenciado. En el caso de no tener el formato, se debe anotar en una hoja la informacin general de la finca, las

caractersticas principales de la muestra que se va a procesar, los aspectos generales del cultivo, las condiciones edafo-climticas, los diferentes productos qumicos que se haya aplicado, entre otros.

Figura 2.

A. Muestra vegetal. B. Muestra ptima. C. Componentes de una buena muestra. D. Cantidad ptima de una buena muestra. E. Muestras de plantas de porte bajo, arbustos o rboles. F. Muestras indicando el sitio real de infeccin. G. Muestras con presencia de lesiones agallas o cncros. H. Muestras con signos del agente causante. I. Muestras con exceso de humedad. J. Sntomas de enfermedades en plantas completas. K. Muestras de races de plntulas y plantas de porte bajo o anuales. L. Muestras de races de arbustos, plantas anuales, bianuales y perennes. M. Muestras de tallos y ramas. N. Muestas de yemas y flores. O. Muestras de frutos, tubrculos y bulbos. P. Muestas afectadas por virus y fitoplasmas. Q. Empaque de muestras afectada por virus y Mollicutes. R. Recoleccin de muestras para nematodos. S. Recoleccin de submuestras. T. Recoleccin de muestras en cultivos anuales y perennes. (Fotos: Autores).

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