18022 Ktia de Pontes 68665 Flvia Gabriel 68244 Tawani Cristina Boscollo Ragassi

MTODOS DE EXTRAO E CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA

Relatrio apresentado disciplina de Fitoqmica do Curso de Farmcia do Centro Universitrio Hermnio Ometto.

Prof Fernanda Oliveira de Gaspari de Gaspi

ARARAS/SP

11/2013

INTRODUO

A droga vegetal dessecada e triturada pode ser utilizada diretamente como fitoterpico para a preparao de chs ou adicionada a alimentos, ou como p fino para ser encapsulado. Na maior parte das vezes a droga processada de forma a resultar numa soluo extrativa contendo as substncias de interesse teraputico (FONSECA, 2013). Antes de executar uma extrao, deve-se levar em conta uma srie de fatores que interferem nesta operao, tais como as caractersticas do material vegetal, o seu grau de diviso, o meio extrator (solvente) e a metodologia. Na escolha do mtodo extrativo, deve-se avaliar a eficincia, a estabilidade das substncias extradas, a disponibilidade dos meios e o custo do processo escolhido, considerando a finalidade do extrato que se quer preparar (SIMES, et al, 2004). Em anlises fitoqumicas, quando no se conhece o contedo do material a ser analisado, costuma-se submeter o material a sucessivas extraes, com solventes de polaridade crescente, obtendo-se uma extrao fracionada em que as diferentes fraes apresentam compostos de polaridade crescente, como a composio qumica das plantas complexa, ocorre extrao conjunta de vrias substncias farmacologicamente ativas ou no, portanto deve-se definir com preciso o que se deseja obter, levando-se em conta os fatores envolvidos no processo extrativo, pode-se escolher o mtodo e o solvente que sero empregados (SIMES, et al, 2004). Existem vrios mtodos de extrao slido/lquido tais como, a extrao a frio que compreende a turbolizao, a macerao (simples e dinmica) e a percolao, a extrao a quente em sistemas abertos que inclui a infuso e a decoco e a extrao a quente em sistemas fechados que so a extrao sob refluxo e em aparelho de Soxhlet (SIMES, et al, 2004). O processo de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao isolamento de substncias ativas podem ser monitorados por ensaios direcionados para a avaliao da atividade biolgica, os mtodos cromatogrficos so os procedimentos de separao e

isolamento mais utilizados atualmente. Servem tanto para fins de identificao e anlise de misturas e de substncias isoladas (SIMES, et al, 2004). Em geral, a tcnica cromatogrfica envolve vrias etapas como, montagem da coluna ou placa (disposio adequada da fase estacionria ou suporte e preparao da fase mvel); aplicao da amostra; desenvolvimento (passagem de um solvente escolhido (fase mvel) atravs da fase estacionria); revelao/visualizao (localizao das diferentes zonas de separao dos compostos) e/ou extrao das substncias retidas na fase estacionria (SIMES, et al, 2004). A cromatografia em camada delgada (CCD) consiste no sistema cromatogrfico em que a separao dos componentes de uma mistura ocorre atravs da migrao diferencial sobre uma fase estacionria composta por uma fina camada de adsorvente aplicado sobre um suporte plano, o qual pode ser constitudo de diversos materiais como vidro, alumnio ou polister. A fase mvel constituda por diversas misturas de solventes e permanece no interior de um recipiente ou cuba de material transparente e inerte, geralmente vidro, permanecendo vedada onde se deposita a placa cromatogrfica em posio vertical sob uma atmosfera saturada da fase mvel (BRASIL, 2010). A CCD uma tcnica amplamente utilizada para fins de anlise, tanto de extratos vegetais brutos quanto para avaliar o resultado de um processo de separao. As placas para CCD podem ser confeccionadas nos prprios laboratrios, o mtodo de preparao manual bastante econmico, mas requer certa prtica; pode ser bastante satisfatrio em anlises de rotina, sobretudo naquelas que envolvem os suportes mais comuns, como o gel de slica (SIMES, et al, 2004). A Mentha x piperita L. uma planta conhecida como hortel-pimenta, menta ou hortel-apimentada, pertence famlia Lamiaceae, seu uso medicinal recomendado para o tratamento de nuseas, clicas gastrointestinais, sndrome do intestino irritvel, flatulncias, clculos biliares, ictercia, ansiedade, expectorao e expulso de vermes intestinais. As propriedades medicinais desta planta esto relacionadas com o leo essencial extrado de suas folhas frescas (ASMAR, et al, 2013). A hortel-pimenta um hbrido, originrio do cruzamento de diversas espcies, a espcie de maior interesse econmico na obteno de leos volteis, que so amplamente empregados como flavorizantes, aditivo em alimentos, em produtos de higiene bucal e em

preparaes farmacuticas, no tratamento de problemas respiratrios e gastrintestinais, o leo apresenta aes antimicrobiana e espasmoltica e considerado o responsvel pelas atividades carminativa e eupptica da planta. Est presente na maioria das farmacopeias, que preconizam um teor de mentol entre 30 e 55%, de mentona entre 14 e 32% e valores limites quanto aos teores de pulegona e mentofurano, componentes indesejveis pela ao hepatotxica, entre outras (SIMES, et al, 2004).

OBJETIVOS

Realizar diferentes mtodos de extrao como a macerao, macerao dinmica e por Soxhlet e, analisar as substncias encontradas atravs de cromatografia em camada delgada identificando-as atravs do Rf de cada mancha.

MATERIAIS E MTODOS

Mtodos de extrao

Macerao

Pesou-se 10 g de Porophyllum ruderale em um Bquer de 250 ml, adicionou-se 100 mL de soluo hidroalcolica 70% com o auxlio de uma proveta, envolveu o Bquer com papel alumnio e cobriu com papel filme, identificou o mesmo com os dados do grupo. Deixou em repouso por 7 dias, filtrou utilizando papel filtro e funil de vidro. Envasou em vidro mbar e identificou corretamente.

Macerao Dinmica

Pesou-se 10g de Guaran em p em um Bquer de 250 mL, adicionou-se 50 mL de soluo hidroalcolica 70% com o auxlio de uma proveta, submeteu a agitao constante por 15 minutos. Filtrou com auxlio de papel de filtro e funil de vidro, reservou-se o filtrado. Adicionou-se ao resduo 50 mL de soluo hidroalcolica 70% com o auxlio de uma proveta, agitou constantemente por 15 minutos. Filtrou e reuniu-se os filtrados. Repetiu-se os procedimentos de agitao e filtrao com o resduo. Reuniu-se os filtrados. Concentrou em rotaevaporador, envasou em vidro mbar e identificou corretamente.

Extrao em aparelho de Soxhlet

Pesou-se 20 g de folhas frescas, acondicionou no cartucho prprio para aparelho de Soxhlet , adicionou-se 200 mL de clorofrmio no balo de fundo redondo. Submeteu a aquecimento por 40 minutos, retirou-se o extrato obtido. Concentrou em rotaevapordor, envasou em vidro mbar e identificou corretamente.

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

1 Parte

Preparou-se trs cubas cromatogrficas, sendo duas com a fase mvel (FM) tolueno:acetato de etila (93:7) e uma com a FM hexano:acetato de etila (96:4).

2 Parte

Preparou-se a placa cromatogrfica de fase fixa de slica gel G, com o auxlio de uma rgua, conforme especificaes que seguem: total de altura 12 cm; largura 5 cm; linha do solvente 1 cm; linha de frente (LF) 10 cm; dividiu (acima da LF) em extrato de hortel (Menta x piperita), soxhlet, leo voltil e mentol, mediu-se uma distncia de aproximadamente 1 cm entre eles.

3 Parte

Preparou-se

revelador

Anisaldedo,

sendo

cido

actico

glacial:cido

sulfrico:aldedo ansico (50:1:0,5). Aps preparado transferiu para um borrifador.

4 Parte

Preparou-se o revelador Vanilina sulfrica. Dissolveu 1 g de vanilina em 100 ml de metanol, adicionou-se 4 mL de cido clordrico e 5 mL de cido sulfrico. Aps preparado transferiu para um borrifador.

5 Parte

Com o auxlio de um capilar aplicou-se as amostras e o padro (extrato de hortel (Menta x piperita), soxhlet, leo voltil e mentol, respectivamente) nos respectivos pontos de partida. Colocou-se a placa na cuba cromatogrfica e aguardou o desenvolvimento, observou o momento em que o solvente atingiu a linha de frente. Aps o solvente percorrer a placa, observou-a diretamente e tambm na luz UV.

Encaminhou a placa para a capela e com o auxlio do borrifador, aspergiu de maneira uniforme sobre a camada de slica, cerca de 10,0 mL do revelador. Aps a nebulizao aqueceu-se a placa cromatogrfica em estufa a 105 o C, por 10 minutos. Realizou-se esses procedimentos para os dois reveladores: Anisaldedo e Vanilina sulfrica. Anotou-se os resultados obtidos.

RESULTADOS

Foi realizado o mtodo de extrao, atravs da macerao, macerao dinmica e extrao em aparelho de Soxhlet e em seguida, foi feito a cromatografia em camada delgada, com dois reveladores, a Vanilina sulfrica e o Anisaldedo, onde os resultados obtidos foram:

Tabela 1: Distancia percorrida em Cromatografia em Camada Delgada com revelador Vanilina sulfrica Mcerao Mancha 1 Mancha 2 Mancha 3 Mancha 4 Mancha 5 Mancha 6 Mancha 7 Mancha 8 1,2 cm 4,6 cm Cor Amarelo Azul Rf 0,12 0,46 Soxhlet 1 cm 4 cm 4,9 cm 9 cm Cor Amarelo Azul Azul Verde Rf 0,1 0,4 0,49 0.9 leo Voltil 0,7 cm 1 cm 1,6 cm 3,7 cm 5,1 cm 7,2 cm 8,6 cm 9,3 cm Cor Cinza Lils Amarelo Azul Azul Azul Roxo Azul Rf 0,07 0,1 0,16 0,37 0,51 0,72 0,86 0,93 Mentol Cor Rf -

Tabela 2: Distancia percorrida em Cromatografia em Camada Delgada com revelador Anisaldedo Macerao Mancha 1 Mancha 2 Mancha 3 Mancha 4 Mancha 5 Mancha 6 Mancha 7 Mancha 8 0,8 cm 1,3 cm 2,4 cm 2,7 cm 3,4 cm 3,8 cm 4,5 cm Cor Verde Verde Verde Verde Azul Azul Azul Rf 0,08 0,13 0,24 0,27 0,34 0,38 0,45 Soxhlet 0,15 cm 1,1 cm 1,5 cm 2,1 cm 2,5 cm 4,2 cm 4,9 cm 8,8 cm Cor Verde Verde Verde Verde Verde Verde Verde Verde Rf 0,015 0,11 0,15 0,21 0,25 0,42 0,49 0,88 leo Voltil 1,9 cm 2,1 cm 2,8 cm 4,3 cm 8,2 cm Cor Verde Verde Amarelo Verde Verde Rf 0,19 0,21 0,28 0,43 0,82 Mentol Cor Rf -

DISCUSSO

O termo extrao significa retirar, da forma mais seletiva e completa possvel, as substncias ou frao ativa contida na droga vegetal, utilizando, para isso, um lquido ou mistura de lquidos tecnologicamente apropriados e toxicologicamente seguros. Na escolha de um mtodo extrativo, deve-se avaliar a eficincia, a estabilidade das substncias extradas, a disponibilidade dos meios e o custo do processo escolhido, considerando a finalidade do extrato que se quer preparar (MIYAKE, 2013). A macerao destina-se a extrao da matria prima vegetal em recipiente fechado, temperatura ambiente, durante um perodo prolongado, que pode ser horas ou at mesmo dias, onde deve conter agitao ocasional e no h troca do lquido extrator, para o esta tcnica pode-se utilizar como extrator a soluo hidroalcolica 70%. A macerao dinmica consiste na extrao da matria prima, na qual h a renovao do lquido extrator durante o procedimento, podendo-se utilizar tambm soluo hidroalcolica 70% (SIMES et al., 2001). A extrao em aparelho de Soxhlet utilizada na extrao de slidos com solventes volteis, onde h a utilizao do aparelho de Soxhlet. Em cada ciclo da operao, o material vegetal entra em contato com o solvente renovado; assim, o processamento possibilita uma extrao altamente eficiente, empregando uma quantidade reduzida de solvente, em comparao com as quantidades necessrias nos outros processos extrativos, para se obter os mesmos resultados qualitativos e quantitativos (MIYAKE, 2013). Outro processo muito utilizado em separao e isolamento a tcnica de cromatografia, a qual pode ser definida como a separao de dois ou mais compostos diferentes por distribuio entre fases, onde uma das fases permanece estacionria enquanto a outra se move atravs dela. Esse fenmeno chamado de adsoro, que ocorre devido s foras intermoleculares existentes entre os componentes envolvidos no processo. A fase mvel passa pela fase estacionria e os componentes da mistura so distribudos entre as duas fases (BATISTA et al., 2013).

A cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica muito utilizada para fins de anlise, tanto de extratos vegetais brutos, assim como para avaliar os resultados de um processo de separao (SIMES et al., 2001). uma tcnica barata e simples de se fazer, sendo tambm muito importante para a separao rpida e anlise qualitativa de pequenas substancias. apresenta-se como uma tcnica simples, barata e muito importante para a separao rpida e anlise qualitativa de pequenas substncias. Estabelece conceitos importantes obtidos na teoria, como foras de interaes entre as molculas, pureza dos compostos, e no caso de misturas, pode mostrar o nmero de componentes envolvidos nessa substncia (BATISTA et al., 2013). Consiste em cobrir uma placa de vidro, alumnio ou plstico, com um adsorvente adequado e com uma granulao especial. O adsorvente misturado ou no com um aglutinante (geralmente gesso ou amido), suspenso em gua ou outro solvente adequado e depositado uniformemente sobre a placa (manualmente ou por intermdio de aplicadores apropriados). Ao secar, o adsorvente permanece aderido placa que, em geral, deve ser ativada por aquecimento em estufa (INSTITUTO DE QUMICA, 2013). Um dos aspectos mais importantes da cromatografia o de que em um determinado sistema cromatogrfico o movimento relativo de um composto em relao frente do solvente uma propriedade caracterstica e reprodutvel. Nas cromatografias em papel e em camada delgada se expressa este movimento como um valor de "Rf" (Rate of flow). Este definido como a razo entre a distncia percorrida pela mancha e a distncia percorrida pelo solvente, esses valores so reprodutveis em condies idnticas de trabalho (temperatura, solvente, umidade constante) e caracterizam e identificam as substancias. A medida feita desde a linha de base (ponto onde foi aplicada a amostra) at o centro da mancha em estudo. O valor obtido comparado aos tabelados na literatura especializada podendo servir para identificar a substncia em questo (INSTITUTO DE QUMICA, 2013). Um dos adsorventes mais utiluzados na CCD a slica, que muito empregada na separao de compostos lipoflicos como aldedos, cetonas, fenis, cidos graxos, aminocidos, alcalides, terpenides e esterides, No processo de adsoro, as molculas da fase mvel iro se unir superfcie do adsorvente (fase estacionria), atravs das interaes moleculares (FERREIRA; SARAIVA; PEDROSO, 2013). Na fase mvel, o solvente usado para eluir a mistura e promover a separao dos componentes, a escolha deste solvente depende dos materiais a serem preparados, um

solvente que faz com que todo o material aplicado se mova totalmente com a frente do solvente muito polar, j um que no movimenta o material atravs da placa no suficientemente polar (FERREIRA; SARAIVA; PEDROSO, 2013). A mistura mais usada a de acetato de etila com ter de petrleo ou hexano, solventes razoavelmente baratos, volteis e de regular ou baixa toxicidade (ADO, 2013). O hexano um solvente muito utilizado, uma de suas caractersticas principais possuir alto poder extrativo e rpida evaporao, uma de suas principais aplicaes a extrao de leos vegetais ou animais, cujas vantagens so: elevado poder de solvncia para um grande nmero de sementes oleaginosas; facilmente separado do leo ou gordura, facilitando o processo de recuperao do solvente; possui alta pureza e livre de resduos, no afetando a qualidade dos produtos obtidos (SECRETARIA DA SADE, 2013). muito utilizado na extrao de substncias lipoflicas e leos volteis (SIMES et al., 2001). Uma das principais caractersticas do solvente tolueno a sua rpida evaporao, combinando com um alto poder de solvncia. Estas caractersticas peculiares o recomendam para uma gama variada de aplicaes. Seu ponto de fulgor oferece relativa segurana, em funo de sua volatilidade moderada (SECRETARIA DA SADE, 2013). No final de todo o processo cromatogrfico, necessrio a utilizao de solues reveladoras, as quais permitiro a visualizao dos compostos analisados. Dentre as mais utilizadas esto s solues cidas alcolicas de anisaldedo e vanilina, so reveladores universais para a deteco de uma grande variedade de compostos orgnicos, promovendo assim, diferentes cores, dependendo do analito (VIRGOLINO et al., 2013). A associao vanilina/cido sulfrico ou vanilina/cido clordrico pode ser usada para visualizao de catequinas, alcalides, flavonides, componentes de leos essenciais, esterides e fenis. J a associao anisaldedo/cido sulfrico pode ser usada para visualizar antioxidantes, esterides, prostaglandinas, carboidratos, fenis, glicosdeos, parte aglicona de saponinas, componentes de leos essenciais ou terpenos, antibiticos (macroldeos e tetraciclinas) e micotoxinas tricotecenos (ADO, 2013). A principal substancia extrada da planta Mentha x piperita L., conhecida popularmente como hortelo-pimenta so os leos volteis, amplamente empregados como flavorizantes, aditivos em alimentos, em produtos de higiene bucal e em preparaes farmacuticas, no tratamento de problemas respiratrios e gastrointestinais. O leo apresenta

aes antimicrobianas e espamolticas e considerado o responsvel pelas atividades carminativa e eupptica da planta (SIMES et al., 2001). O mentol o principal componente do leo essencial responsvel pelo agradvel aroma e pela ao teraputica. Tanto o leo essencial como os flavonides so os responsveis pelos efeitos antiespasmdico, colertico, colagogo, antiflatulento,

antipruriginoso, antiemtico e analgsico das mucosas proporcionados por esta espcie. Os taninos da Hortel proporcionam um efeito adstringente til nos casos de diarreias (FARMACAM, 2013)

CONCLUSO

A partir dos resultados obtidos, pode-se observar que na CCD onde se utilizou o revelador Vanilina sulfrica, a melhor extrao foi a de leos volteis, onde obteve-se oito manchas, com diferentes variaes de cores e Rf com variao entre 0,07 0,93 cm. A segunda melhor extrao foi a de Soxhlet, representada por quatro manchas cores diferentes e com Rf de 0,1 0,9 cm, e por ltimo, a macerao com duas manchas nas cores azul e amarela, com Rf de 0,12 e 0,46 cm respectivamente. Nessa anlise no se obteve nenhum resultado para o mentol. Na CCD com revelador Anisaldedo, o mtodo mais satisfatrio foi o de Soxhlet, representado por oito manchas, todas de colorao verde e com Rf nas variaes de 0,15 0,88 cm. A macerao foi a segunda mais satisfatria, pois obteve sete manchas de cores azul e verde, com variao de Rf de 0,08 0,45 cm. Na extrao de leos volteis, pode-se observar o aparecimento de cinco manchas, nas cores verde e amarelo, e com Rf de 0,19 0,82 cm. Assim como na revelao por Vanilina sulfrica, o mentol no obteve resultado algum. Os testes foram satisfatrios quando utilizados as tcnicas de macerao, extrao por Soxhlet e leos volteis, o que no ocorreu com o mtodo de mentol, o qual no obteve nenhum resultado com os reveladores utilizados.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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SIMES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVIK, P. R. Farmacognosia da planta ao medicamento. Porto Alegre: UFRGS, 5 ed, 2004. SIMES, Cludia Maria Oliveira et al. Farmacognosia da planta ao medicamento. 3. ed. Porto Alegre: Editora Universidade/ufrgs/ed. da Ufsc, 2001. VIRGOLINO, Mariana de Mates et al. REAES COMPOSTOS GERADOS NA REVELAO POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA COM ANISALDEDO E VANILINA. Disponvel em: <http://www.prp.unicamp.br/pibic/congressos/xxcongresso/resumos/000242.pdf>. Acesso em: 20 nov. 2013.