PCR convencional o PCR de punto final versus PCR en Tiempo Real

PCR convencional no es cuantitativo

S Lobos C - U de Chile

PCR clsico

La cantidad de producto no est relacionada con la cantidad de DNA inicial Herramienta cualitativa (presencia o ausencia) El bromuro de etidio es poco sensible, cuando se detecta ya se ha sobrepasado la fase exponencial

Fases de la PCR

Exponencial: En cada ciclo se dobla el producto. Lineal: enlentecimiento, enlentecimiento consumo de componentes componentes, principio de degradacin. Meseta: Parada de la reaccin, agotamiento de componentes, degradacin de productos.

Fases de la PCR
Logartmica

Lineal

Deteccin en la fase de meseta

Problemas de cuantificacin en la fase de meseta

Tcnicas de cuantificacin

Northern Blot

PCR Competitivo o PCR Mimic

Early expression of p53 responsive genes (24h)

Bax CD95/Fas GAPDH

L C 6 8 10 12 M
Martn-Burriel et al. (2004)

Necesidad de PCR en tiempo real

N Necesidad id d d de cuantificar tifi dif diferencias i d de expresin de un mRNA (RT (RT-PCR) Disponibilidad de muy pequeas cantidades de mRNA en algunas g p prcticas laboratoriales: laboratoriales :

Clulas obtenidas de microdiseccin por lser Pequeas cantidades de tejido Biopsias embrionarias Especimenes de gran valor

PCR en Tiempo Real

Nuevos q qumicos Nuevas plataformas instrumentales Deteccin de productos PCR en tiempo real

Permite observar la cintica de la reaccin

Deteccin en la fase exponencial

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PCR en Tiempo Real

Toma los datos mientras se producen. Cuantificacin ms exacta sin necesidad de mtodos laboriosos. Existe E i t una relacin l i cuantitativa tit ti entre t la l cantidad inicial y la cantidad de producto PCR en un ciclo dado.

Curso PCR 2010

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Polymerase chain reaction (PCR)

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Polymerase chain reaction (PCR)

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Polymerase chain reaction (PCR)

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Fluorocromos: Fluorocromos : SYBR Green

Se intercala en el surco menor del ADN de doble cadena y emite fluorescencia. No es equimolecular equimolecular. . Necesaria curva de disociacin.

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Curva de disociacin

T Melting: - Composicin de bases del fragmento g - Tamao del fragmento. -Tm dimeros < Tm fragmento

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Curva de disociacin

Muestras problema

Controles negativos y sin RT

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Ventajas e inconvenientes

PCR con SYBR G Green:

Ms barato Los mismos reactivos sirven para analizar cualquier fragmento La especificidad viene dada nicamente por los primers No es equimolecular Se necesita realizar una curva de disociacin

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Sondas TaqMan

Actividad 5 exonucleasa de la Taq polimerasa. Reporter: Reporter : FAM, VIC. Quencher: Quencher : TAMRA. Importante tm (~70C). Equimolecular. Equimolecular .

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Real Time PCR: Sonda TaqMan

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Polymerase chain reaction (PCR)

Fluorocromo + Quencher (absorbe la energa del fluorocromo cuando est cerca fluorocromo no fluoresce)

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Ventajas e inconvenientes

PCR con Sondas TaqMan: TaqMan:

Ms caro Utilizacin de sondas especficas para cada fragmento a analizar La especificidad viene dada por los primers y la sonda Es equimolecular No necesita curva de disociacin

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Aplicaciones de la PCRPCR-TR

Cuantificacin:
Absoluta Relativa

D t Determinacin i i d de mutaciones. t i Ensayos ++- Diagnstico

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Glosario de trminos

C Cuantificacin: tifi i

Absoluta:
Resultado

final con unidades (carga viral, copias de mensajero, copias de un gen,...). Se S necesita it una curva patrn t absoluta. b l t

Relativa:
Resultado

sin unidades. Proporciona un porcentaje de incremento o disminucin (expresin gnica). Se necesita curva patrn (al menos para prueba de primers). primers).

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Glosario de trminos

Referencia:

Seal utilizada para normalizar el experimento.

Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX). Activa: endgena ( (housekeeping housekeeping) ) o exgena (construccin).

Calibrador:

Muestra q que usamos p para comparar p las dems.

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Glosario de trminos

Standard (patrn):

Muestra de concentracin conocida que nos permite construir la curva de calibrado. Ct es el ciclo en el cual se detecta un incremento significativo de Rn (fluorescencia). El sistema empieza a detectar la seal asociada al incremento exponencial de producto PCR (Fase exponencial)

Threshold Th h ld (umbral): ( b l)

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Aplicaciones de la PCRPCR-TR
Glosario de trminos. Cuantificacin:

Absoluta Relativa R l ti

Determinacin de mutaciones. Ensayos ++

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Mtodos de cuantificacin
Curva estndar Delta Ct Mtodo de Pfaffl

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Curva estndar

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Curva estndar

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Curva Patrn

y=ax+b y= y ax+b. ax+b .Y Y=Ct Y= Ct, Ct ,X X=log log [DNA] [DNA]. Relaciona cada concentracin con su Ct. Propia de cada pareja de primers primers. . La pendiente depende de la eficiencia de los primers y no debera cambiar entre experimentos:

100% (a= (a=-3.32). 75% (a= (a=-4). Aceptable:Aceptable: -3 -4. a> -3 contaminacin por fluorescencia.

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Curva Patrn

Correlacin ( (R2) ):

R2=1 (perfecta). R20.97 (0.99). Seleccionar el umbral donde R2 sea mxima. Mantener el umbral entre experimentos. Al menos 2 rplicas por muestra. Desviacin estndar 0.38 Curva absoluta: muestra de [ conc conc] ] conocida. Diluciones 1/5.

N de rplicas:

Muestra:

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1. Cuantificacin Absoluta

Validacin de la curva patrn: p

La precisin de la cuantificacin depender de la precisin de los patrones. Patrones:

DNA plasmidial. plasmidial. DNA genmico. genmico Productos PCR. Grandes oligonucletidos comerciales. Copias/ng de RNA Copias/ng Copias/g tejido tejido, copias/ml sangre sangre. Copias/genoma. Copias/ clula.

Resultado final relativo a una unidad de inters:

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1. Cuantificacin Absoluta

Posibles curvas de calibrado (Expresin gnica):

Productos de RTRT-PCR u oligonucletidos:

Rpido, conocimiento preciso de [DNA]. Inestable, problemas en la reamplificacin. reamplificacin. Muy estable, sin problemas de amplificacin, talla similar a transcritos. Construccin del DNArec DNArec, , no tiene en cuenta la eficacia de la RT. Mimetiza la situacin real de retrotranscripcin (aadir RNA background background). ). Muy inestable, clonacin complicado, purificacin, problemas de almacenamiento.

DNA recombinante:

RNA recombinante:

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1. Cuantificacin Absoluta

P t crticos Puntos ti de d la l curva patrn: t

DNA o RNA puro y muy concentrado. Exactitud en la medida de la concentracin inicial (7 veces). Pipeteo apropiado: dilucin del DNA o RNA original hasta concentraciones similares a las muestras biolgicas (106-1012). Estabilidad de las muestras patrn (RNA).

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2. Cuantificacin Relativa

Curva patrn:
Sencillez en la preparacin. La cantidad de producto (n veces) se refiere a la obtenida en el calibrador (1x) (1x). No hay unidades. Se puede utilizar cualquier tipo de patrn para la obtencin.

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2. Cuantificacin Relativa

P t crticos Puntos ti de d la l curva patrn: t

Dilucin adecuada del RNA o DNA patrn. La utilizacin de las mismas muestras en placas distintas permite comparar resultados. Se pueden utilizar patrones DNA para anlisis de RNA. Se necesitan curvas patrn para el gen de estudio y el control endgeno.

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