Prcticas Bioqumica

Sheila Gonzalez Huerta 2Biotecnologa

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Reacciones de identificacion de azucares

En esta prctica vamos a detectar la presencia de azcares o no en cuatro soluciones problema A,B,C,D y un blanco de agua. Lo vamos a detectar a travs de cuatro mtodos principalmente

1. Prueba de Molisch
La reaccin de Molisch es una reaccin que tie cualquier carbohidrato presente en una disolucin. Se utiliza como reactivo una disolucin de -naftol al 1% en etanol. En un tubo de ensayo a temperatura ambiente, se deposita la solucin problema y un poco del reactivo de Molisch. A continuacin, se le aade cido sulfrico e inmediatamente aparece un anillo violeta que separa al cido sulfrico, debajo del anillo, de la solucin acuosa en caso positivo. Es una reaccin cualitativa, por lo que no permite saber la cantidad de glcidos en la solucin original.

Mtodo experimental
Preparamos 4 tubos con las soluciones A, B, C y D y un blanco de agua. Cada tubo contiene 1ml al 10% de cada solucin problema. A estos tubos les echamos 5 gotas del reactivo de Molisch. A continuacin aadimos HCl. Si se forma una interfase de color violeta/azulado es positiva la reaccin e indica presencia de azcares.

2. Prueba de Fehling
Se utiliza como reactivo para la determinacin de azcares reductores. Sirve para demostrar la presencia de glucosa, as como para detectar derivados de esta tales como la sacarosa o la fructosa. El reactivo de Fehling consta de : Fehling A: CuSO4 disuelto en H2O Fehling B: NaOH y tartrato Na-K disuletos en agua

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Fundamento de la reaccin En medio alcalino, el cobre procedente del CuSO4 se encuentra en forma de hidrxido cprico, y se forma la correspondiente sal Na2SO4. Cuando el Cu(OH)2 (de color azul) se calienta en presencia de un compuesto reductor se forma xido cuproso (de color rojo ladrillo). CuSO4 +2NaOH Cu (OH)2+Na2SO4 Cu (OH)2+ RCOH Cu2O+RCOOH+H2O (rojo ladrillo) Si hay un compuesto reductor, el Cu cambia su estado de oxidacin de (2+ a 1+), lo que se evidencia por el cambio de color. Esta reaccin se produce en medio alcalino fuerte, por lo que algunos compuestos no reductores como la fructosa que contiene un grupo cetona puede enolizarse a la forma aldehdo dando lugar a un falso positivo.

Mtodo experimental
Se prepara el reactivo de Fehling mezclando cantidades iguales de las disoluciones A y B. A 2 ml de cada una de las disoluciones problemas se les aade 2 ml del reactivo de Fehling. Se agitan bien los tubos y se deja en un bao de agua hirviendo durante 3-7 minutos. La reaccin es positiva al aparecer una coloracin naranja-rojiza y un precipitado rojo ladrillo segn la cantidad de material reductor en el tubo.

3. Prueba de Seliwanoff
La prueba de Seliwanoff es una prueba qumica que se usa para distinguir entre aldosas y cetosas. Los azcares son distinguidos a travs de su funcin como cetona o aldehdo. Si el azcar contiene un grupo cetona, es una cetosa, y si contienen un grupo aldehdo, es una aldosa. Esta prueba est basada en el hecho de que, al calentarlas, las cetosas son deshidratadas ms rpido que las aldosas.

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Mtodo Experimental
Se aaden 3 gotas de disolucin problema a 3 ml de reactivo y se coloca en un tubo durante 15 minutos en un bao de agua hirviendo. La reaccin es positiva al aparecer un intenso color rojo en forma de precipitado que es soluble en etanol.

4. Prueba de Wohlk
Nos permite diferenciar lactosa y glucosa. Para esta prueba se utiliza NH4OH concentrado y KOH al 25%

Mtodo experimental
A partes alcuotas de 1 ml de disoluciones problemas de azcares y blanco de agua, se le aade 1 ml de NH4OH concentrado y 2 gotas de KOH al 25%. Se dejan los tubos en un bao de agua caliente (sin llegar a la temperatura de ebullicin) tras agitarlos adecuadamente para conseguir un perfecto mezclado. En unos pocos minutos aparece una coloracin roja (indicando la presencia de lactosa), mientras que en los tubos que contienen glucosa la coloracin es parda.

Conclusin
A Molisch Fehling Seliwanoff Wohlk + + Contiene glucosa B + + + Contiene glucosa C + D + + Contiene lactosa Agua -

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SEPARACION DE LOS LIPIDOS DE UNA MUESTRA BIOLOGICA. REACCION DEL COLESTEROL.

En esta prctica vamos a separar lpidos presentes en una muestra biolgica, en nuestro caso, la yema del huevo, mediante una cromatografa en capa fina. Adems vamos a detectar la presencia de colesterol en dicha muestra a travs de la reaccin de Liebermann y Burchard. REACTIVOS Y MATERIALES Cmara cromatogrfica Placas de silicagel Capilares Cloroformo Metanol Iodo Anhdrido actico cido sulfrico Hidrxido amnico

Mtodo Experimental
Cromatografa en capa fina de lpidos. Para la cromatografa en capa fina se utiliza un soporte de silicagel, extendido sobre una placa de vidrio o aluminio. El desarrollo de la cromatografa se lleva a cabo en una cmara cromatogrfica , la cual debe estar saturada, con la fase mvil eluyente. En este caso se utilizan 100 ml del eluyente cloroformo-metanol-NH4OH (65:25:4). La muestra se coloca a 1,5 cm de la base de la placa sobre una lnea previamente trazada con lapicero sobre la placa. La aplicacin se lleva a cabo con capilares echando 1 gota de la muestra extendida en 1 cm a lo largo de la lnea trazada. Una vez se ha secado la muestra sobre la placa de silicagel, ya est lista para introducirla en la cmara cromatogrfica, en donde el disolvente fluye a travs de la capa fina, produciendo la separacin de los distintos tipos de lpidos. Se deja eluir hasta que el frente haya ascendido 15 cm como mnimo, se saca la placa de la cmara y se seca con secador, estando lista para el revelado. Para el revelado utilizamos vapores de iodo. En la cubeta que contiene en el fondo unos pocos cristalitos de iodo, se introduce el cromatograma y se deja durante unos minutos. El iodo tiende a concentrarse en los sitios donde estn los compuestos lipdicos, por lo que aparecen manchas amarillas sobre un fondo blanco.

Prcticas Bioqumica Reaccin del colesterol Para determinar la presencia de colesterol, en la muestra en estudio, utilizaremos 0,2 ml de la muestra que se evaporar en un bao a 100C. Una vez evaporados los disolventes (cloroformo) se aadir al tubo 2 ml de anhdrido actico y 0,2 ml de cido sulfrico concentrado. Aparece una coloracin violeta que vira a verde esmeralda estable (Reaccin de Liebermann y Burchard) lo cual indica la presencia de colesterol. Para este proceso es necesario la utilizacin de pipetas MUY secas, por lo que han sido previamente introducidas en la estufa.

Resultados
1. Cromatografa de lpidos

Clculo Rf; Rf = distancia de la sustancia/frente de la base mvil

Prcticas Bioqumica 2. Resultados de la reaccin del colesterol Utilizamos una muestra y la ponemos en un bao caliente para que se evapore el lquido y solo nos quede el colesterol. Este procedimiento lo hicimos con pipetas muy secas puesto que sino tardara mucho ms es evaporarse el agua u otros disolventes que pudiera tener la propia pipeta. Una vez evaporado, aadimos anhdrido actico y cido sulfrico concentrado obteniendo de ese modo una coloracin violeta que virar a un verde esmeralda, lo que nos indica la presencia de colesterol en la muestra

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VALORACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE LOWRY

El mtodo de Lowry es un mtodo de valoracin cuantitativa de las protenas. Este mtodo consta de dos etapas: en la primera, los iones Cu2+, en medio alcalino, al igual que ocurre en la reaccin de biuret. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, se produce un cambio en la estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin. En la segunda etapa, el cobre acta como catalizador de la reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por parte de los grupos fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas. El principal constituyente del reactivo de FolinCiocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los fenoles da lugar a un complejo de color azul intenso. La reaccin que tiene lugar entre las protenas y el reactivo se puede representar de la forma siguiente:

MATERIAL Y REACTIVOS Reactivo A: Na2CO3 al 2%, NaOH 0,1M Reactivo B1: CuSO45H2O al 1% Reactivo B2: tartrato sdico-potsico al 2% Reactivo C: Se prepara en el momento de iniciar el ensayo, mezclando A, B1 y B2 en las proporciones 50:0,5:0,5 (en volumen). Reactivo Folin-Ciocalteau: reactivo comercial diluido a 1/4. Solucin patrn de albmina de suero bovino (2mg/ml).

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Mtodo Experimental
Aadimos a todos los tubos el reactivo C. A continuacin mezclar el contenido de cada tubo y dejarlo reposar 15 minutos en oscuridad. Aadimos a todos los tubos el reactivo de Folin (diluido ), mezclando bien.Se deja reposar 30 minutos en oscuridad para que se desarrolle completamente la reaccin coloreada y por ltimo leemos las absorbancias en el colormetro a 580 nm. Tubo 0 1 2 3 4 5 6 Agua 1 ml 0.9 ml 0.8 ml 0.7 ml 0.6 ml 0.7 ml 0.5 ml Patrn (2mg/ml) 0.1 ml 0.2 ml 0.3 ml 0.4 ml 0.3 ml 0.5 ml Problema Reactivo C 5 ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml Folin dil. 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Abs 580nm

Diluciones recta patrn y absorbancias Diluciones 1/1000 1/100 1/10 1 Absorbancia 580nm 1.223 1.047 1.232 1.836

Recta patrn

Prcticas Bioqumica Diluciones muestra problema y absorbancia Diluciones 1/1000 1/100 1/10 1 Absorbancia 580 nm 0.133 0.033 0.175 0.187

Recta problema

Por interpolacin obtenemos la concentracin de protenas de la muestra problema

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OBTENCION E HIDROLISIS DEL ALMIDON

El iodo, en disolucin acuosa, produce un intenso color azul-violeta con las cadenas de amilosa, debido a que se forma un complejo del iodo con el almidn en el que probablemente el iodo se introduce en el interior de las espiras de amilosa, que en medio acuoso y en condiciones tipo se mantienen bastante rgidas debido a las elevadas tensiones internas por puentes de hidrgeno entre sucesivas espiras. El calentamiento de las muestras hace que la rigidez estructural de las espiras de amilosa se relaje en parte, perdindose la estructura casi cristalina del compuesto, lo que hace que la asociacin con el iodo no sea tan efectiva y se pierda color. La unin entre el iodo y el almidn es considerablemente lbil, suponindose que se trata de una simple asociacin fsica. La longitud de onda de la coloracin obtenida en la reaccin de la amilosa con el iodo parece ser proporcional a la longitud ininterrumpida de la cadena de amilosa que reacciona con el iodo, ya que la dextrinificacin del almidn hace que el color vire del azul al violceo y de este al rojizo, no dando finalmente ninguna coloracin las dextrinas de peso molecular muy bajo.

MATERIALES
Material biolgico: una patata tamao mediano. Instrumental: Rallador , Esptula , Gasa , Estufa y bao Material de vidrio: 1 vaso de precipitados de 500 ml 1 Erlenmeyer de 250 ml 1 Gradilla con 20 tubos de ensayo 1 Varilla de vidrio 1 Embudo

REACTIVOS
HCl 1 N Solucin acuosa de iodo al 0.1 por 100 Almidn.

Mtodo Experimental
A) Preparacin del almidn a partir de patata: Se ralla una patata de tamao mediano a travs de una gasa colocada sobre un vaso de precipitado que contiene 500 ml de agua destilada. El almidn obtenido obtenido se deja precipitar para posteriormente eliminar el sobrenadante, procedindose a continuacin a lavar el almidn recogido 2 veces con agua destilada, decantando despus de cada adicin. El almidn obtenido se deja secar en una estufa a 40C.

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B) Hidrlisis del almidn obtenido e investigacin de los productos de degradacin: Se toman unos 2 gramos del almidn obtenido en la prctica anterior y se ponen en un matraz con 25 ml de HCl 1 N. Se coloca una varilla de vidrio y se hierve para que el almidn se hidrolice, sucesivamente, a dextrinas, maltosa y glucosa. Se tienen dispuestos 20 tubos de ensayo con unas 8 gotas de la solucin de iodo al 0.1 por 100, agregando a cada uno de ellos 0.5 ml del hidrolizado a intervalos de 2 minutos, hasta que ya no se obtenga la coloracin roja correspondiente a la reaccin de las dextrinas con el iodo. Como testigo se utiliza una pequea cantidad de almidn disuelto en agua al que se adicionan 4 gotas de solucin de iodo (color azul que desaparece al calentar).

El almidn, en mi prctica, comienza a hidrolizarse en el tubo 7 de los 20 utilizados y se observa como empieza a adquirir un color rojizo hasta que en el 10 ya es completamente rojo.

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DETERMINACION DEL pH OPTIMO PARA LA ACTIVIDAD FOSFATASA ACIDA

La mayor parte de las enzimas poseen un pH caracterstico al que su actividad es mxima; por encima y por debajo de ese pH la actividad disminuye. En esta prctica se va a determinar el pH ptimo al que acta la fosfatasa cida, la cual cataliza la siguiente reaccin: p-Nitrofenol + FosfatoFosfatasa cidapO 2 H-Nitrofenilfosfato + La determinacin de la actividad de la fosfatasa se realiza midiendo la cantidad de p-nitrofenol liberado por accin de la fosfatasa cida. El p-nitrofenol, como se expone en otra prctica, posee un color amarillo caracterstico en disolucin alcalina, que posee su mximo de absorbancia a 400 nm. Con objeto de averiguar el pH ptimo al que tiene lugar la hidrlisis del p-nitrofenilfosfato por accin de la fosfatasa se incuban a 30C, en diferentes tubos, cantidades fijas de enzima y de sustrato, a diferentes valores de pH. En el tubo cuyo pH sea ptimo para la accin de la fosfatasa, la cantidad de p-nitrofenilfosfato hidrolizado ser mayor, y, por tanto, el p-nitrofenol liberado ser ms elevado. REACTIVOS Fosfatasa cida Tampn Tris/ClH Tampn Ctrico/Citrato p-Nitrofenilfosfato Na2CO3 (0,1 M)

Mtodo Experimental

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Preparar la siguiente serie de tubos: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 Blanco pH 2 3 4 5 6 7 8 9 Tampn 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,8 ml Fosfatasa cida 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml Absorbancia (400 nm) 0 0 0 0.025 0.310 0.343 (act. mx.) 0.099 0.031

1. Representacin grfica

2. Calcular los moles de p-nitrofenol liberados por minuto cuando la enzima funciona en condiciones de pH ptimo, a partir de la ecuacin: A = c l (A = absorbancia, = 14176 M-1 cm-1 , c = concentracin y l = 1cm).

..

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EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD FOSFATASA ACIDA

La velocidad de la mayora de las reacciones aumenta al incrementar la temperatura y las reacciones catalizadas enzimticamente no son una excepcin. La velocidad de una reaccin enzimtica alcanza un mximo y luego, rpidamente disminuye debido a la desnaturalizacin de la enzima, puesto que la velocidad de desnaturalizacin aumenta conforme se incrementa la temperatura. En esta prctica se va a estudiar la estabilidad trmica de la fosfatasa cida a 30C y 60C y a diferentes tiempos de incubacin (0-15 minutos). p-Nitrofenilfosfato + H2O p-Nitrofenol + Fosfato REACTIVOS Fosfatasa cida Tapn Tris/HCl (0,2M pH 7) Tampn Ctrico/citrato (0,2 M pH 5) Solucin de p-nitrofenilfosfato (30 mM) Na2CO3 (0,1M)

MTODO EXPERIMENTAL Preparar la siguiente seria de tubos:

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Una vez preparados los tubos se siguen los siguientes pasos: 1.- Los tubos 1, 2, 3, 4, y 5 se ponen en un bao a 30C. Los tubos 6, 7, 8, 9, y 10 se ponen en un bao a 60C. 2.- A los tiempos de incubacin establecidos para cada muestra (Tubo 1 y tubo 6 al minuto 1, etc.) se sacan del bao y se enfran en el agua del grifo, reservndolos a temperatura ambiente hasta tener todos los tubo (despus de los 15 minutos). 3.- Una vez que ya hemos incubado todas las muestras para ver el efecto de la temperatura sobre la fosfatasa cida determinaremos su actividad como en otras prcticas: -Adicionar a todos los tubos, incluido el blanco y el control, 0,2 ml de p-nitrofenilfosfato (sustrato) 30 mM - Incubar todos los tubos a 30C durante 20 minurtos - Parar la reaccin con 3 ml de Na2CO3 0,1M - Leer al color desarrollado, en todos los tubos, a 400 nm, despus de haber ajustado el espectrofotmetro con el blanco

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RESULTADOS
30C Control 0.251 1 (1min) 0.202 2 (2min) 0.225 3 (5 min) 0.207 4 (10min) 0.202 5 (15min) 0.175 Absorbancia 400nm 60C 6 (1min) 0.113 7 (2min) 0.025 8 (5min) 0.077 9 (10min) 0.083 10 (15min) 0.063 Aborbancia 400nm

1.- Calcular los moles de p-nitrofenol liberados por minuto para cada tiempo a las distintas temperaturas. A 30C 1 min ---------------2 min ---------------5min ---------------10 min -------------15min -------------142.65 moles/min 158.89 moles/min 146.18moles/min 142.65 moles/min 123.58 moles/min

A 60C 1 min ---------------2 min ---------------5min ---------------10 min -------------15min -------------79.80 moles/min 17.655 moles/min 54.378 moles/min 58.61 moles/min 44.91 moles/min

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2.- Representar grficamente el log del % de Actividad Residual frente al tiempo en minutos (se considera el 100% de actividad la obtenida en el tiempo 0). (%Actividad residual = absorbancia cada tubo/absorbancia control x100) Tubos 1 -------------------------------------------------2 -------------------------------------------------3 -------------------------------------------------4 -------------------------------------------------5 -------------------------------------------------6 -------------------------------------------------7 -------------------------------------------------8 -------------------------------------------------9 -------------------------------------------------10 -----------------------------------------------%Act.Residual log (%Act.Residual)

80.47% ---------------------- 1.9 89.64% ---------------------- 1.95 82.47% ---------------------- 1.91 80.47% ---------------------- 1.9 58.57% ---------------------- 1.76 45.01% ---------------------- 1.65 9.96% ----------------------- 0.99 30.06% ---------------------- 1.48 33.07% ---------------------- 1.52 25.1% ------------------------ 1.4

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DETERMINACION DE LOS PARAMETROS CINETICOS (Km y Vmax) DE LA FOSFATASA ACIDA PARA EL p-NITROFENILFOSFATO COMO SUSTRATO.
La actividad enzimtica se ve afectada por varios factores, uno de los cuales es la concentracin de sustrato. La constante de Michaelis (Km) se define como la concentracin de sustrato para la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. La inhibicin se define como la disminucin de la velocidad de la reaccin catalizada por una enzima, provocada por la presencia de determinadas sustancias denominadas inhibidores. Hay tres tipos diferentes de inhibicin reversible: competitiva, no competitiva y acompetitiva. En presencia de un inhibidor competitivo se modifica el valor de Km pero no el de Vmax. En el caso de un inhibidor no competitivo se modifica el valor de Vmax pero no el de Km. Y en presencia de un inhibidor acompetitivo se modifican ambos parmetros. La constante de inhibicin (Ki) es la constante de disociacin del complejo enzima-inhibidor, e indica la afinidad de la enzima por el inhibidor. Para determinar el valor de Km y de Vmax de la fosfatasa cida para el p-nitrofenilfosfato, se incuba la enzima con diferentes concentraciones del sustrato (p-nitrofenilfosfato) y midiendo el pnitrofenol liberado en cada caso. La determinacin del valor de Ki para el fosfato se realiza incubando la enzima en las condiciones anteriores (con distintas concentraciones de sustrato) y en presencia de una concentracin fija de inhibidor (fosfato). REACTIVOS Tampn ctrico/citrato 0,2 M pH 5 p-Nitrofenilfosfato Na2CO3 (0,1M) KH2PO4 (15 mM)

Mtodo Experimental
Primero realizamos las diluciones correspondientes:

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.. En ausencia de inhibidor

Tubo

Tampn

p Nitrofenilfosfato (Sustrato)

[p-nitrofenilfosfao] final (mM)

Absorbancia (400 mm) 0.174 0.060 0.143 0.132 0.239 0.321 0.750 0.716 -

1 2 3 4 5 6 7 8 Blanco

0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,8 ml

0,5mM 1 mM 2 mM 4 mM 8 mM 10 mM 20mM 30mM 0,5 mM

0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml

Prcticas Bioqumica En presencia de inhibidor

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Resultados
1. Calcular moles de p-nitrofenol liberados por minuto. En ausencia de inhibidor 0.5mM p-nitrofenilfosfato --------------------- 0.02456 moles p-nitrofenol/min 1mM p-nitrofenilfosfato ----------------------- 0.00847 moles pnitrofenol/min 2mM p-nitrofenilfosfato ----------------------- 0.020196 moles p-nitrofenol/min 4mM p-nitrofenilfosfato ----------------------- 0.018644 moles p-nitrofenol/min 8mM p-nitrofenilfosfato ----------------------- 0.033756 moles p-nitrofenol/min 10mM p-nitrofenilfosfato --------------------- 0.04534 moles p-nitrofenol/min 20mM p-nitrofenilfosfato --------------------- 0.10593 moles p-nitrofenol/min 30mM p-nitrofenilfosfato ---------------------0.10112 moles p-nitrofenol/min

En presencia de inhibidor 0.5mM p-nitrofenilfosfato --------------------- 0.0302 moles p-nitrofenol/min 1mM p-nitrofenilfosfato ----------------------- 0 moles pnitrofenol/min 2mM p-nitrofenilfosfato ----------------------- 0.0296moles p-nitrofenol/min 4mM p-nitrofenilfosfato ----------------------- 0.007768 moles p-nitrofenol/min 8mM p-nitrofenilfosfato ----------------------- 0.0223 moles p-nitrofenol/min 10mM p-nitrofenilfosfato --------------------- 0.0213 moles p-nitrofenol/min 20mM p-nitrofenilfosfato --------------------- 0.0319 moles p-nitrofenol/min 30mM p-nitrofenilfosfato --------------------- 0.1562moles p-nitrofenol/min

2. Representar grficamente los moles de p-nitrofenol frente a la concentracin final de p-nitrofenilfosfato tanto en ausencia como presencia de inhibidor. Ausencia inhibidor

Prcticas Bioqumica Presencia de inhibidor

3. Representar grficamente 1/(moles de p-nitrofenol/min) frente a 1/[pnitrofenilfosfato]final tanto en ausencia como en presencia de inhibidor

Ausencia de inhibidor

Prcticas Bioqumica Presencia de inhibidor

4. Calcular Km y Vmax en ausencia y presencia de inhibidor, determinar el tipo de inhibicin y calcular el valor de Ki

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Reacciones de identificacion de cuerpos cetonicos.

Los cuerpos cetnicos acetoacetato, 3-hidroxibutirato y aceona son mettabolitos resultantes de la via de la cetognesis, que tiene gran actividad en situaciones, de falta de disponibilidad de glucosa, como consecuencia de la gran actividad de la lipolisis heptica. El acetoacetato y el 3hidroxibutirato son metabolizables,mienras que la acetona, que se produce por la descarboxilacin del acetoacetato, no lo es. Su hallazgo en la orina, en cantidades elevadas es consecuencia de un descenso importante de los niveles de glucosa sangunea, o de la capacidad de captar glucosa por parte de los tejidos, como en la cetosis diabtica. Por lo que, su deteccin en orina es fundamental en anlisis clnicos, utilizando diversas reacciones bastantes sencillas.

Prueba de Legal
Reactivos y Materiales Nitroprusiato sdicoal 10 % NaOH al 10% Muestras problema

La reaccin es positiva al producirse un intenso color rojo. Esta reaccin no es especifica de la acetona ni del cido acetoactico ya que tambin la dan otras cetonas. Procedimiento A 2 ml de las soluciones problemas (puede utilizarse orina sin ningn tratamieno previo) se les aade 0,5 ml de niroprusiato sdico al 10% y 1 ml de NaOH al 10%

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Prueba de Fromer
Reactivos y Materiales Etanol Salicilaldehido al 10% NaOH en lentejas Muestras problema

Procedimiento A 2ml de la muestra problema 4 y blanco de agua se le aaden 0.5 ml de solucin etanlica de salicilaldehido 10%, se mezcla y se deja caer en cada tubo 3 lentejas de NaOH sin agitar. Se deja el conjunto en reposo en agua a 70C y se observa que en la zona de contacto del NaOH con la disolucin hay una coloracin roja. Esta prueba es especfica de la acetona.

Prueba de Lieben
Reactivos y materiales NaOH 20% Solucion yodo-yodurada Muestras problemas Procedimiento A 1 ml de las soluciones problema y blanco de agua se les aade 0.5 ml de NaOH al 20% y 0.5ml de la solucin yodo-yodurada. Al agitar se puede percibir el olor del yodoformo y aparece un precipitado amarillo.