CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION

Harold McNair - Benjamn Esquivel

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PRESIN

Por Harold M. McNair y Benjamn Esquivel H. Department of Chemistry Virginia Polytechnic Institute and State University Blackburg, Virginia ESTADOS UNIDOS

Programa Nacional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico Departamento de Asuntos Cientficos Secretara General de la Organizacin de los Estados Americanos Washinton, D .C .-1973

 C o p y r ig h t 1 9 7 3 b y T he G eneral S ecre taria t o f the O rg a n iza tio n o f A m e ric a n States W ashingto n, D.C.

Derechos Reservados, 1973 Secretara General de la Organizacin de los Estados Americanos Washington, D.C.

Esta m o n o g ra fa ha sido preparada para su p u b lic a c i n en el D e p a rta m e n to de A su n to s C ie n tfic o s d e la S ecretara General de la O rgan iza cin de los Estados A m e rica n o s.

E d ito ra : Eva V . Chesneau Asesor T c n ic o : D r. Francisco Casas D e p a rta m e n to de Q u m ic a F aculta d de Ciencias F sicas y M atem ticas U niversidad de C h ile Santiago, C hile

A Ib hSim
E l p ro gram a de monografas cientficas es ana accta de la vasta labor de la Organizacin de Los Estados Americanos, a cargo del Departamento de Asuntos Cientficos de la Se cretara General de dicha Organizacin, a cuyo financiamiento contribuye en forma importante el P r o gram a Re gional de D e s a r r o l lo Cientfico y Tecnolgico. Concebido por los Jefes de Estado Americanos en su Reunin cele brada en Punta del Este, Uruguay, en 19&7, y cristalizado en las d e li beraciones y mandatos de la Quinta Reunin deL Consejo Interarnericano Cultural, llevada a cabo en \laracay, Venezuela, en 1968, el Program a Regional de D es arro llo Cientfico y Tecnolgico es L a expresin de las aspiraciones preconizadas por los Jefes de Estado Americanos en el sentido de poner la cienca y la tecnologa al servicio de los pueblos latinoamericanos. Demostrando gran visin, dichos dignatarios reconocieron que la ciencia y la tecnologa estn transformando la estructura econmica y social de muchas naciones y que, en esta hora, por ser instrumento indispensable de pro greso en A merica .Latina, necesitan un impulso sin precedentes. E l P r o g ra m a Regional de D es arro llo Cientfico y Tecnolgico es un complemento de los esfue rzos nacionales de los pases latinoamericanos y se orienta hacia La adopcin de medidas que permitan el fomento de la investigacin, la enseanza y la difusin de La ciencia y la tecnologa la formacin y perfeccionamiento de personal cientfico; el intercambio de informaciones, y la transferencia y adaptacin a los pases latino americanos del conocimiento y las tecnologas generadas en otras r e giones . En e,l cumplimiento de estas premisas fundamentales, el programa de monografas representa una contribucin directa a la enseanza de las ciencias en niveles educativos que abarcan importantsimos sectores de la pobiaciny, al mismo tiempo, propugna la difusin deJ saber cientfico. L a coleccin de monografas cientficas consta de cuatro series, en espaol y portugus, sobre temas de fsica, qumica, biologa y mate mtica. Desde sus comienzos, estas obras se destinaron a profesores y alumnos de ciencias de enseanza secundaria y de los primeros aos de la universitaria; de stos se tiene ya testimonio de su buena acogida. Este prefacio brinda aj p ro gra m a Regional de Desarro llo Cientfico y Tecnolgico de la Secretara General de la Organizacin de los Estados Americanos la ocasin de agrad ecer a los doctores Harold M. M cNair y Benjamn E squivel H. , autor es de esta monografa, y a quienes tengan el inters y buena voluntad de contribuir a su divulgacin.

septiembre de 1973

N D IC E Pgina A los Lecto res .......................... .............................. ................ I N T R O D U C C I O N ................................ iii 1 2 2 1 6 9 10 1K 1 19 10

C A P I T U L O P R IM E R O .

D e s a r r o l lo Histrico ...................................................... .. C rom atograf a Lquida " C l s i c a " y Cromatogr afa L quida de Alta P r e s i n ........................................................ C ro m ato grafa {le Gases y Cro m ato grafa Lquida de Alta P r e s i n .................................................................... Mecanismos de Separacin de Diferentes Fo rm as de C ro m ato grafa Lquida ................................................ C A P I T U L O SE GU N DO . IN STR U M E N TA L ................ ...........

F a s e M v i l ..................................................................... . . , . R e g i s t r a d o r e s ........................................................................ Controles de Temperatura . ..................................... ........ Rec olectore s de F r a c c i o n e s ............ . ............ .. Medicin de Flujos . . . . . . ................................................ C A P T U L O T E R C E R O . C O L U M N A S Y FASES E S T A C I O N A R I A S ..................................................................................... C ara c te rstica s G e n e r a l e s .................................................. F a s e s E s t a c i o n a r i a s ............................................................ L is ta de Pro v ee d o res y Fabricantes de Relleno para Colu m na...................... .......................................................... C A P T U L O CUARTO. D E T E C T O R E S ....................................

21 21 22 29 31 32 34

Detector de ndice de R e f r a c c i n ...................................... Detector de Luz U lt ra v io le t a .............................. ............... C A P T U L O QUINTO. ANALISIS C U A L I T A T I V O Y C U A N T I T A T I V O .............................................................................. Anlisis C ualitativo.............................................................. A n lis is Cuantitativo............................................................ C A P T U L O SEXTO. A P L I C A C I O N E S ................ ......................

37 37 40 47

A PN DICE. P R O V E E D O R E S C O M E R C I A L E S D E E Q U IP O Y A CC E SO R IO S P A R A C R O M A T O G R A F A L Q U I D A . . . B ib lio gr afa Recomendada

54 55

1
I N T R O D U C C I N La cr omato grafa es una tcnica queperm ite se para r, a is l a r c iden tificar los componentes de una mez cla de compuestos qumicos. La m uestra es distribuida entre dos fa s es , una estacionaria y otra mvil, de tal forma que cada uno de los componentes de la mez cla es sel ecti va mente retenido por la fase estacionaria La separac in se lleva a efecto en una columna tubular rellena de un slido poroso finamente dividido, el cual puede actuar como fase esta cionaria propiamente dicha o como soporte de una fase estacionaria li quida. Tambin se puede efectuar utilizando como fase estacionaria papel de filtro o un slido finamente dividido colocado en fo rm a de capa fina sobre una placa de vidrio. Estos tres tipos de cr omatografa se basan en ios m is m o s principios fundamentales, y se conocen re sp ecti vamente como cr omato grafa en columna, en papel y de capa fina. En esta monografa slo se. co ns ider ar la cr om atografa en columna. En la cr om ato grafa en columna, la fase mvil puede ser un lquido o un gas , y segn el caso se denominan respectivamente" crom atografa lquida" y 'c ro m atog rafa de g a s e s 1 . Esta fase mvtl fluye a travs del relleno de la columna, ar ras tr an d o los componentes de la mezcla, que son selectivamente retenidos por la fase estacionaria. E l flujo de la fase mvil se mantiene constante a travs de todo el proceso y de esta manera se logra que cada componente de la mez cla sea luido de la co lumna como un compuesto puro, disuelto en la fase mvil, A esta t c nica se le llama 1 crom atografa de eluci n'. De la combinacin de los distintos tipos de fases estacionarias y mviles, se pueden obtener v a rios tipos de crom atografa, segn se indica en la Tabla I.

T abla I.

Diversos Tipos de Cro matogr afa

Fase Mvil

F a s e Estacionaria Slido

Tipos de Cro mato graf a Cro matogr afa Lquido-Slido C rom atograf a Lquido-I.quido Cro mato graf a Gas-Slido Cro m ato graf a G as-Lqu id o

Lquido Lquido Slido Gas Lquido

Otra forma de clas ificar las diver sas tcnicas cromatogrficas es de acuerdo con su mecanismo de separacin, y sta se v er ms a d e lante.

D E S A R R O L L O HISTRICO En 1905, Ram scy utiliz por p rim e ra vez tcnicas cr om atogrficas para sep a ra r m ezcla s de gases y vapores. A l ano siguiente, el bot ni co ruso Tswett emple la cr om ato gra fa de elucin en un experimento que tena por objeto la separacin de la clo ro fila de extractos vegetales. En una columna de vidrio, rellena de carbonato de calcio, Introdujo el extracto vegetal disuelto en ter de petrleo; a continuacin a gr eg m s ter de petrleo y observ que. a medida que el ter pasaba a travs de la columna, se separaban bandas de d iv ersos colores que correspondan a los carotenos, las clorofilas y las xantofilas. De aqu el origen de la palabra cr om atografa que, literalmente, significa " c o lo r e s c r it o " ; hoy este mtodo se lla m a crom atografa lquido-slido. La crom atografa permaneci ignorada durante machos anos hasta que, en 1930, el investigador sueco Tise'lius y sus colabora dore s in tro dujeron dos tcnicas diferentes a la tcnica de elucin, que son el " a n lisis frontal" y el "a n l is i s por desplazamiento"; tcnicas que hoy en da han cado en desuso. En I94J, Martin y Syngc, en busca de una solucin a l p roble m a de deter minar cantidades muy pequeas de aminocidos, introdujeron la ' cr om ato gra fa de re parto ", lo que les vali el premio Nobe l de Qumica en 1952. Esta tcnica evolucion con rapidez, llegando a s er lo que ahora se conoce como cr om ato grafa en papel y una ver si n limitada de cr om ato grafa lquido-lquido en columna. E n ! 95, Martin y James introdujeron la cr omato grafa de gases, la cual se ha convertido en unade las tcnicas analticas ms tiles para el anli sis de gases y compuestos orgnico s voltiles. Se calcula que actualmente hay unos 100 000 crom atgrafos de gases en todo el mundo. A p esar de que el p rim e r experimento sobre crom a to gra fa fue una forma de cr om ato grafa lquida, no fue sino hasta 19&8 que se produjo un avance considerable en esta tcnica que por tantos aos haba p e r manecido olvidada; este avance fue gradual y se debi a la introduccin de altas pres ione s de operacin y de sistemas de deteccin continua. Actualmente, la crom atografa lquida es objeto de nuevas m e jo ra s y cabe p rever que en un futuro prximo su uso s e r muy amplio. C R O M A T O G R A F A L Q U ID A " C L S I C A " V C R O M A T O G R A F A DA DE A L T A P R E S I N L Q UI

. Durante muchos afros se practic la crom atografa lquida en una fo rm a que lla m arem os " c l s i c a 1 y que consiste bsicamente en lo s i guiente (Fig . 1}: en una columna de vidrio, cuyo dim et ro v a r a entre 2 y JO cm, rellena de algn m ateri al, como slice, alumina, azcar, et c., cuyas partculas son por lo genera l de un tamao cercano a los 200 nm, se introduce la muestra disuelta en la fase mvil o disolvente, por medio de un cuentagotas o de una pipeta, y luego se a g r e g a el d i s o l vente, con el cual se eluye la m uestra a travs de la columna. Los ta maos de la m uestra varan entre 0, 1 y I g o ms. E l disolvente o fase

Fig. 1.

Cromatografa liquida "clsica".

3
m vil fluye a t r a v s de la columna p o r efecto de la grav ed ad , p ro du ci n dose apenas una d bil p resi n e j e rc id a por el volumen de la fa se mvil que se a g r e g a a la columna. E l disolven te se re co le c ta en la b as e de la columna en. fr a c c io n e s de dete rm in ado volumen. Uno de los inconvenien tes de esta tcnica es e l l a r g o tiempo de an li sis re q u e rid o , que muchas v e c e s puede s e r de hora s e incluso das; otra des ventaja es que el m a t e r ia l de re lle n o se utiliza por lo g e n e r a l una sola v ez debido a que parte de la m u e s t r a usualmente se a d s o r b e en fo rm a i r r e v e r s i b l e . E l p r o b le m a p rin cip al de este tipo de c r o m a to g ra ffa liquida " c l s i ca" es la identificacin y cuantificacin de los componentes que eluyen de la colum na disueltos en la fase mvil . En ge n e ra l se usa alguna t c nica au x ilia r , como, p o r ej em plo , es p ectro fo to m etrfa , an lisis q u m i co, o sim p le m ente un r e g is t r o g r a v im t ric o , p a ra evaluar el contenido de ca da uno de los componentes de la m ez cla en las fr accion es re co le c tad as. JLa c r o m a t o g r a ffa liquida de alta p re s i n utiliza in stru menta l muy distinto con ventajas significati vas ( F i g . 2). En este mtodo se usan colum nas de d im et ro muy reducido, p o r ejemplo 2 mm, re llen as de m a t e r i a le s e s p e c ia le s pulveru le nto s, cuyas p artc u la s tienen vin tamalio de 30-40 iim y, en ocasio nes, hasta de 10 Um. E s t e tipo de columna es m uy efi caz, p e ro o fre ce una g r a n re sis ten c ia al flujo de la fa se mvil, o sea una gran cada de pre si n. P o r esta ra z n es n e c e s a rio em p le ar sis te m as de bo m beo de alta p res i n (hasta 400 a t m *) que hagan fluir la fa s e m v il a una velocid ad razonable a tr av s de la columna. L a c a n * 1 atm = 14, 7 lb s / p u l g 3.

Fifr. 2.

Cromatografa lquida de alta presin.

tidad de fase esta cionar ia dentro de la columna es pequea, por lo que se r e q u ie r e que la m uestra tambin sea pequea, entre 1 y 10 mg. Si La presin de entrada a la columna no es muy elevada (100 atm o trenos), la m uestra se introduce en la c m a ra de inyeccin mediante una je rin g a de alta presin; a pre sio nes ms el evadas, se utilizan las vlvulas de inyeccin. Un detector, colocado a la salida de la columna, p ro porcio na un re gis tro continuo de la composicin del liquido que sale, lo que p e r m i te obtener un crom a to gra m a s im i la r a los obtenidos en crom a to gra fa de gases y que se utiliza para identificar y cuantificar los componentes de )a muestra . Otra ventaja de este mtodo es el escaso d ete r io ro de la columna a pe s a r de su repetido uso, si bien en algunos casos es n e c e s a rio r e g e n erarla. L a s ventajas de la crom atografa lquida de alta p resi n hacen que actualmente esta tcnica est ganando popularidad. L a figura 3 i l u s tra la resolucin de un gran nmero de compuestos, obtenida con un instrumento de buena calidad. C R O M A T O G R A F A DE C AS E S Y C R O M A T O G R A F I A L Q U ID A D E A L T A P R E S I N Hoy da la c r o m a to gra fa de ga s e s es una tcnica ampliamente d i fundida y ms utilizada que la c rom atogra fa lquida. Teniendo en cuenta

i TI U t O B

Fig. 3. Separacin de un extracto de clulas de hgado de ratn median te cromatografa de intercambio inico y detector de luz ultravioleta. (Procedencia: C.G. Horvath, B.A. Preiss y S.R. Lipsky, A n a l. C h em ., 39, 12, 1U22, 1967. Derechos reservados Analytical Chemistry.) el nmero de personas fam iliarizad as con ella, creem os que es conve niente co m p a ra r la con la cr omato gra fa lquida de alta presin. L a s cara cter stic as salientes de ambas tcnicas se hallan re su m i das en la Tabla II* En la cr om ato grafa de gases es necesario que la m ue stra se volatilice sin descomposicin a fin de que pueda s er a r r a s trada por el gas transportador. Se puede aumentar la volatilidad de la m uestra, incrementando la temperatura de trabajo; sin embargo, el mximo posible de temperatura es de aproximadamente 400 C. Por este motivo, slo los ga ses, y aproximadamente el 15%de los compues tos orgnicos conocidos, pueden ser analizados por crom atografa de ga s e s . E n contraste, la cromatografa liquida requiere que la muestra sea soluble en la fase mvil, y esto hace posible el anlisis de compuestos de muy alto peso m ole cular: orgnicos e inorgnicos, inicos o covaIcntes. C la ro est que es necesario encontrar la fase estacionaria a d e cuada que sep are selectivamente los componentes de lam u e s t ra j lo cual en teora sie m p re es posible, pero en la prctica puede resu lt ar difcil. L o s mtodos utilizados en cromatografa de gases son ms rpidos v sens ibles, el instrumental ms sencillo y en general menos costoso. La cr omato grafa lquida ni es tan sensible ni tan rpida, pero su e s pectro de aplicacin es ms amplio si bien el instrumental es conside-

T ab la II, C a r a c t e r s t i c a s de la C r o m a t o g r a f a de G as es y de la C r o m a t o g r a f a Lquida de Alta P r e s i n

M u e s tr a s

C r o m a t o g r a f a de G a s e s Voltil

C r o m a t o g r a f a L q u id a de A lt a P r e s i n Soluble

Req uerim ientos de la m ue stra Tip os de m uestra

Gases y 15% de los compuestos o r g n i cos; hasta un peso m ole cular de 500 HT - 10"l s g

M o l c u la s o rg n ic a s e i n o r gn ic as de pes o m o le cular inte rmedio y alto

Cantidad Mnima detectable Tiempo de anlisis Resolucin

1O -6 - 1O*9 g Minutos - ho ras 5000 platos t e r ic o s por m e tro de columna US$ 2000 - 25 000

Minutos 1000 platos t e r i cos p o r metro de co lumna S$ 500 - 8000

Costo

rablemente m s costo so. No obstante, es p o s ib le p r e v e r que, c o n fo r me aumente el volumen de las ventas, se re d u cirn los costos. Cabe ahora h a c e r s e la siguiente pregunta: E xiste re alm e nte competencia entre la c r o m a to g ra fa de g a s e s y la c r o m a t o g r a fa lquida de alta p r e sin? L a resp uesta es no, puesto que a m bas tcnicas se complementan. M EC A N IS M O S DE S E P A R A C IO N D E D IF E R E N T E S FO R M A S D E C R O M A T O G R A F IA L Q UID A H ay cuatro mtodos o f o r m a s de r e a l i z a r c r o m a to g ra fa lquida, c a da uno basado en diferentes m e ca n is m o s de s ep arac i n de los co m p o nentes de la m ue stra. Mediante un cambio de columnas es posible u tilizar cada uno de ellos. C r o m a t o g r a f a L q u i d o -L q u id o E l m eca n is m o de separa ci n en c r o m a t o g r a fa lq uido-l q uid o, o m eca n is m o de distr ibuc in Como tambin se lla m a, se b a s a en la d i s tinta solubilidad que presenta una m ol cula de la m u e st ra en la fa s e m vil y en la fa s e es ta cio naria . De a h que los comp uesto s m s solubles en la fase e s ta cio n aria sean selecti vam en te retenidos por ella en tanto que los menos solubles son tr ansp ortad os m s r pidamente p o r la fase mvil. L a c r o m a t o g r a fa lq uido-l q uid o se utiliza p ara compuestos m o d e radamente p o l a r e s , cuyo peso m o le c u l a r es i n fe r i o r a 1500. L a s c o lu m nas comnmente utilizadas son de I a 2 m de longitud y de 2 a 3 rara de

d i m e t ro interno; la cada ce p res i n es de p o r m e t ro de columna a ] m l/ m in de flujo.

ap ro xim adamente

41 atm

E l m ay o r inconveniente de esta tcnica os la solubilidad de la fase esta c io n a r ia en la fa s e m vil y el d e t e r io r o de la columna. Una fo r m a de r e s o l v e r l o es satu rando la fa se m v il con la fase estacio naria por m ed io de u n a p r e o o lo m a a que contenga un alto porcentaje de fase esta cio naria . O tr a fo r m a es utilizando m a t e ri a le s que contengan la fase esta c io n a r ia qum ic am ente unida a un s oport e, a modo de m a t e ria l de relleno de la columna; esto ev ita la p rd id a de fa se estacio naria y hace in necesario el uso de preco lumnas p a r a s a t u r a r la fa s e mvil. P o r otr a part e, la c r o m a t o g r a fa lq ui do-lq uid o re q u ier e un control cuidadoso del flujo y de la te m p eratu ra p a ra poder identificar un c o m puesto dete rm in ado en funcin del tiempo de elucin* que es c a r a c t e r s tico, en las condiciones de flujo y te m p eratu ra utilizadas, det c o m p u e s to deter m inado. C r o m a t o g r a f a L q u ido -S lido E l m e c a n is m o de s e p a ra c i n de la c r o m a to g ra fa lq u id o -s lid o , o de ad s orci n , se b a s a en la competencia que existe entre las m o l cu las de la m u e s t r a y las de la fase m vil o disolvente por ocupar los sitios a c tivos en la s u p e rfic ie de un slido. Alg unos de los slidos utilizados con m s fr ecue ncia son almina y g e l de slice. E ste tipo de c r o m a t o g r a fa es el m s til y se ap li ca a m o l culas de p olarid ad b aja o alta, cuyo peso m o le c u la r sea in fe r i o r a 1000, L a s c o lumnas utiliz adas v a r a n entre 0 em y 2 m de longitud y entre 2 y 3 m m de d i m etro interno; la cada de p res i n es de aproximadamente 41 atm p o r m e t ro de columna a I m l/m in de flujo. En muc has o casio nes, debido a una fuerte a d sorci n o retencin de los componentes de la m u e st ra en el slido activo, es n e c e s a rio a u m e n tar la polar id ad de la fa s e m v il en fo rm a constante y uniforme, con lo cual se lo g ra un incre m ento de solubilidad en los componentes de la m u e s t r a en la fa s e m v il . A esta variant e se le denomina elucin por gradiente o p r o g r a m a c i n de la fa s e mvil. A m e n o s que se utilicen r e llenos de columna que contengan la fa s e e s ta cio n aria qumicamente uni da a un soport e slido es muy d if cil en c r o m a to g ra fa lqui do-l q uid o efe ctu ar una p r o g r a m a c i n de la fa s e m v il debido a l p r o b le m a de la solu bilid ad de la fa s e e s ta cio n aria en la fase m vil . C r o m a t o g r a f a Lq uida p o r Exclusin E s te tipo de c r o m a to g ra fa , conocido tambin como cro m a to g ra fa de p erm ea ci n o c r o m a to g ra fa de fi ltraci n, efecta la s ep araci n de a c u e rd o con el tamafio de las m o l culas. L a columna se re llen a de un gel, cuyos poros son de tamaio s im i la r al tamalio de las m o l cu las de la m u e st ra. Las m ol culas pequeftas

L la m a d o tambin tiempo de retencin.

pueden penetrar dichos poros y quedan retenidas en tanto que las g r a n des no. E l in tervalo de p esos m o le cu lare s en que se puede t r a b a ja r por c r o m a to g ra fa de exclusin v a r a desde 2000 hasta v a r i o s m illones . L a s columnas utilizadas pueden tener hasta 4 m de longitud y la cada de p resi n es por lo gen eral de 10 atm por met ro de columna a ! m l/m in de flujo. E sta tcnica es muy aplicada al caso de p olm e ro s y o t r o s co m p u es tos do alto peso m o le c u la r, pero su resolucin no es buena y el tiempo de anli sis puede r e s u lt a r largo. P o r otra parte conviene mencionar que el tiempo de elucin es proporcional al peso m o le cu lar. C r o m a t o g r a f a p o r Intercambio Inico La separa ci n por in te rcam bio inico s e b a s a en la competencia en tre la fa s e m vil y la m u e st ra inica por los sitios o grupos activos de una resina intercam bia dora de iones. E ste tipo de s ep araci n se ap lica a compuestos de un intervalo de pesos m olecu lare s muy amplio, y ejem plos car a c t e rst ic o s de stos son los pptldos y los aminocidos. Las columnas v a r a n entre 1 y m de la rg o y 2 y 3 m m de dimet ro interno, que producen cadas de p resi n de 55 a 135 atm, depe ndien do de la velocidad de flujo de la fa se mvil. En la fase m v il se puede v a r i a r la fu erz a inica o el pH para obtener la elucin de los componen tes de la m ez cla en un tiempo razonable. Esta fo rm a de cro m a to g ra fa es la nica que se puede a p li c a r a especie s inicas.

2
INSTRUM ENTAL
E l instrumental propio de la crom a to gra fa de alta presin an no ha alcanzado el gr ado de perfeccionamiento del usado en cr om ato gra fa de ga s e s , sin e m b a r g o es posible obtener instrumentos que se pueden con s i d e r a r bastante refinados. En efecto, hay disponible una amplia gama de ellos en cuanto a costo, versatil id ad y complejidad. En el apndice de esta monogra fa se da una lista de los prin cipales fabr icantes de instrumentos y a c c e s o r io s de c r o m a to gra fa lquida. E n todo tipo de instrumental y no slo respecto a los crom atgrafo s de fa se lquida, hay ciert as c a r a c t e rs t ic a s de ndole general que deben e v a lu a rs e al co n s id er ar un dado instrumento ya sea con fines de adqui sicin o de f o r m a r s e una idea sobre la utilidad que puede p re s ta r. D i chas ca r a c t e rst ic a s son: a) V ers atilid ad . El instrumento debe s e r apto para r e so lv e r y t r a b a j a r con m u e stras de diferente tipo, debe p r e s t a r s e a las distintas tcnicas crom a to gr fica s y r e a li z a r el mximo de ope raciones, tales como, p ro gra m aci n de fase mvil, reco le cci n de fr accion es a la s a lida de la columna, etc. P a r a ello el instrumento debe esta r equipado con los siguientes aditamentos: Sistema de ope racin de alta pre si n D i v e r s o s detectores Sistema para re co lec tar fracciones a la salida de la columna P r o g r a m a d o r e s de fase mvil o disolvente i tambin llamados g e n e r a d o r e s de gradiente) C on troles de tem peratu ra para la columna y el detector C on tro les de flujo.

b> Rapidez. P a r a obtener rapidez en el an lisis es necesari o con tar con m ateriale s de relleno de columna de alta eficiencia y que el in s trumento posea sistemas de bombeo de alta presin p a ra la fase mvil. Durante mucho tiempo los an lisis efectuados por medio de la c r o m a tograf a lquida fueron en exce so lentos; hoy, sin em bargo, se hacen an lis is tan rpidos como los que se llevan a efecto por crom a to gra fa de gas es . c) Rep roducibilidad y Estabilidad. Son caracterstica s esenc iales si se q uiere obtener del instrumento un funcionamiento efectivo a largo plazo. E l instrumento debe p ro v e e r un control adecuado so b re los p a r m etros de operacin, tales como el flujo de la fase mvil, la tem pe ratura, presin, composicin de la fase mvil, etc. , y para ello debe esta r provisto de controles de te mperatura y flujo, sistema de bombeo de alta presi n, p r o g r a m a d o r e s de fase m vil, detectores, etc.

d) Sensibilidad. [In buen instrumento, a ms de t r a b a j a r con p e queas cantidades de m ue stra, d e b e g e n e r a r seales de intensidad a p r e ciab le s. La sens ibilidad de todo c rom a t gra o de lquidos depende s o b re todo del s is te m a de deteccin que utiliza. Con los adelantos r e g i s t r a dos en el diseo de detectores, ah ora es posible detectar componentes de la m u e stra en el intervalo de los nanogramos. Un estudio detallado de las car a c t e rst ic a s citadas p e r m i t ir e l e g i r el instrumento que m e jo r se adapte al tipo de trabajo que se quiere efectuar. FASE M VIL Aunque la fase mvil no es parte del instrumental propiamente d i cho, el control de la presi n, el flujo y la composicin de la m is m a , son muy importantes; de ah que en este captulo se traten los as pectos g en erales y las car a c t e rst ic a s de la fa s e mvil. En lo que atae a las c a r a c t e rs t ic a s que debe p r e s e n t a r toda fase m vil para s e r til en c r o m a to g ra fa lquida, cabe citar: D i s o lv e r la m uestra No d e g r a d a r o d is o lv e r la fase esta cionar ia T ene r baja viscosidad Ser compatible con el tipo de detector utilizado.

E s es encia l que la m u e stra sea soluble en la fase m vil p a ra que pueda s e r transportada a tr av s de la columna. Cuando se introducen m u e stras en disolucin, puede o c u r r i r precipitacin de la m u e stra den tro de la c m a r a de inyeccin o en la columna si el disolvente d <? la m u e s tra y la fa se m vil son muy diferentes en polaridad. Esto c a u s a r a p r dida de resolucin en la s ep araci n y por lo tanto ambos se deben s e le c c io n a r con cuidado. Cuando se lleva a cabo cro m a to g ra fa lq uido-lquido, la fase m vil puede d is o lv e r la fa s e esta cio naria . P a r a evitarlo se satu ra la fase m v il con la fa s e esta cio naria , ya sea con anteri oridad a su in troduc cin a l instrumento o mediante el uso de una preco lum na que, p or lo g en eral, consiste en una seccin corta de tubo, relleno de algn soporte slido poroso, de los utilizados en c r o m a to g ra fa de gas es , que contiene un alto porcentaje de fase esta cio naria . A tr avs de esta p reco lum na se hace p a s a r la fa se m vil antes de que entre a la columna y a s se evita la prdida de fa se esta cio naria . L a baja vis co s id ad de la fa s e mvil es muy importante en la e fi c ie n cia de la separa ci n, ya que la vis co sid ad influye en el efecto de t r a n s fe rencia de m a s a entre la fa s e m vil y la fase es ta cio naria . La figu ra 4 mue stra el efecto que tiene el cambio de v isco sid ad , al c am b iar la te mperatu ra, so b re la sep araci n de algunos a z c a r e s en una columna de c r o m a to gra fa de perm ea cin. P o r ltimo, la fa s e mvil debe s e r compatible con el detector e m pleado, lo cual es p artic ula rm ente importante en el caso de p r o g r a m a -

Fift. U. Efecto de la temperatura sobre la viscosidad de l a fase mvil y resolucin. clones de la fase m vil , puesto que el cambio de composicin de sta puede afe ctar el funcionamiento del detector. I_.a fig u r a 5 m u e stra los componentes b s ic o s de u n c ro m a t c g ra fo de lquidos. Son componente d eseab les en el instrumento, si bien no es encia les, los siguientes: Controles de tem peratu ra p ara la columna y el detector R ec olecto res de fraccion es P r o g r a m a d o r e s de fase mvil M e d id o r e s de flujo.

Con excepcin de columnas y detectores, se tr atarn brevem ente en este capitulo cada una de las partes es en c iales y a c c e s o r i a s . Rec ipientes de A lm acenam iento de la F a s e M vil Se pueden utilizar recipientes de vidrio, a c e r o inoxidable o p l sti cos in ertes, de una capacidad entre I y 3 lit r o s, que en la m ay o ra de los cas os es suficiente volumen para todo un da de operacin.

Cmara

Fig. 5. Representacin bsica de un cromatgrafo de lquidos de alta presin. Muchas vece s, en especial con fases mviles polares, hay una m a r cada tendencia del oxgeno y otros gases a dis olv erse en el lquido. Si estos gases se desgasifican dentro del instrumento y forman burbujas pueden afectar seriamente el funcionamiento del detector y la eficacia de la columna. P o r este motivo, es necesario re m ove r de la fase m vil los gases disueltos. Actualmente, en muchos instrumentos, el r e c i piente mis m o est condicionado para efectuar dicha remocin. Una fo rm a es ap licar vaco sobre el recipiente que contiene la fase mvil, mientras se agita el lquido con un agitador magntico. Si esto no es suficiente, se procede adems a calentar ligeramente el lquido en tan to que el espacio lbre del recipiente se purga con nitrgeno o con algn otro gas inerte menos soluble. Sistemas de Bombeo Las columnas utilizadas en cromatografa lquida moderna estn rellenas de mat eriales especiales de partculas muy pequeas, lo cual hace que la resistencia al flujo de la fase mvil sea muy elevada. Por esta razn, se requiere un sistema de bombeo que haga fluir la fase mvil a un flujo razonable, pues de lo contrario los anlisis ser an excesivamente lentos. Los aspectos ms importantes de todo sistema de bombeo son: P r e s i n mxima de operacin Intervalo de volmenes obtenibles Reproducibilidad y constancia del flujo Cara cte rsti cas del flujo

Tambin son importantes la resistencia a lquidos corrosivos, la f a cilidad para efectuar el cambio de fases mviles y la limpieza del sistema.

De acu erd o con las c a r a c t e r s t ic a s de funcionamiento y de diselio, se pueden c o n s id e r a r bsicam ente dos tipos de bombas: B o m bas m e c n ic a s , y B o m b a s neumticas. las hay de dos tipos distintos:

En Lo que atafie a las p r i m e r a s , 1. 2.

B o m b a s r e c p r o c a s (pistn o d ia fr a g m a ! B o m b a s de d esplazam ie nto continuo.

La figura 6 m u e s t ra en fo r m a esquem tica cada uno de estos tipos de bo m b as .

Fig. 6. Diferentes tipos de bombas, a ) Bomba reciproca; b ) bomba tipo jeri nga o de desplazamiento continuo, y e ) bomba neumtica. (Reproduci da de "Basic Liquid Chromatography" por Nina Hadden y F. Bauman, f i g . 2-2 D g . 2-1, 1972. Cortesa de Varian Associates, Palo A lt o , C a l i f o r n i a . ) B o m b a s r e c p r o c a s . Son bo m b as que des plazan flujos de volumen constante en fo r m a no continua, sino m s bien pulsante. La m x im a p res i n que se puede obtener v a r a segn el diseo, p ero en ge n e ra l es de a p ro x im a dam e n te 00 atm, L a f o r m a como o pe ran e s t a s b o m b a s es la siguiente: Mediante el m o vimiento de un pistn o d i a fr a g m a , y a tr avs de un sis te m a de vlvulas que alte rnadam ente se a b r e n y se c ie r r a n , se llena y se vaca, de modo alternativo, una pequera c m a r a . El volumen que enva la bomba en cada pulso se ajusta v aria nd o la distancia a que se d es p laza el pistn o d i a fr a g m a . Una de las des venta jas de este tipo de bom ba es que el flujo se o b tiene en fo r m a de pulsos y no en fo rm a continua y uniforme. L o ante r i o r puede c a u s a r prd id a en la efi caci a de la columna e in estabilidad del detector y p o r lo tanto es n e c e s a r i o e l im i n a r dichas pulsaciones m e diante algn s is te m a a m o rtig u ad or. Una fo r m a sencilla y conveniente de l o g r a r l o es colocando una seccin l a r g a de tubo cap ilar (6 m de largo

x i m m de d im et ro ) entre la bo mba y la c m a ra de inyeccin; este tu bo c a p il a r s e deja fl ota r l ib re m en te y a s f a b s o r b e las pulsa cio n es p r o ducidas por la b om ba. E l flujo de v olu m en constante, a p e s a r de las v a r ia c i o n e s en la cafda de p r e s i n a tr av s de la columna, co nstitu ye la ventaja p rin c ip a l de e s tas b o m bas. P o r lo g e n e ra l, se utilizan m a n m e t ro s d el tipo Bourdon p a ra m e d ir la p re s i n a la cual est trabajand o la bomba; estos m a n m e t r o s ta m bin ayudan a a m o r t ig u a r , en p arte, las p u ls a c io n e s . Una ventaja m s de estas bo m bas es la capacidad de a l im e n ta r de m odo con tinuo el s iste m a. B o m b as de desplazam ie nto continuo. L l a m a d a s tambin bo m b as de m bolo o bombas de tipo j e r i n g a , son aq u e llas en que un m bo lo o pistn es desplazado en f o r m a continua y un iform e por un m o to r de p re c is i n , c o m p rim iend o el liquido contenido en una c m a r a de un cierto volumen; el Ifquido fluye luego a tr av s de una a b e r t u r a en la m is m a c m a r a y se obtiene a s f un flujo de vo lum en constante que puede v a r i a r segn s e d e s p lac e el m b o lo a m a y o r o m e n o r velo cid ad. E l flujo desplazado por esta s bo m bas es un ifo rm e y continuo, o sea l ib r e de pulsacio nes, p ero la capacidad de la bom ba es limitada y p ara re ll e n a r la c m a r a es n e c e s a r i o s u s p en d er momentneam ente su o p e racin. E ste s is te m a de bombeo es el p r e f e r i d o cuando se r e a li z a n p r o g r a m acio n es de fase m v il, ya que, re galand o el v olu m en d es p laza d o por dos bombas que contengan lquidos d ife rentes, es p o s ib le g e n e r a r p r o g r a m a c i o n e s de fa se m vil de cu alq u ier tipo. P o r ltimo, cabe m enc io nar que los flujos d e s p la z a d o s p o r estas bo m b as v a r a n entre 0, 5 y 200 mi/h a p re s io n e s de hasta 340 atm. Su costo re la tiv o es el ev ad o y s ie m p r e existe c ie rt a dificultad al r e l l e n ar la bo mba con una nueva fase m vil. B o m b a s neumticas. ( V e s e la Fig. 6). E n este s is te m a de b o m beo el lquido es d esplazado mediante la p r e s i n e j e r c id a por un gas in erte a alta p resi n, ya sea en fo r m a d ire cta s o b r e ei Ifquido o bien so b re el recipiente c o m p r im i b le que lo contiene. L a p re s i n m x i m a obtenible est lim itad a p or la p r e s i n del gas m is m o y por el m a t e r i a l de f a b r ic a c i n del s is te m a. L o s flujos o b te nidos estn l i b r e s de pulsa cio nes y son de p r e s i n constante, lo cu al s i g n i fica que 8i la cada de p r e s i n de la columna c am b ia, el flujo tambin cam biar. L a s desventa ja s de estas bom bas son la capacidad lim itad a en el volumen total que pueden b o m b e a r (al igual que las b o m b a s de d e s p l a zamiento continuo) y la difusin que pre senta el gas en el lquido. Este ultimo p r o b le m a se puede r e s o l v e r utilizando algn tipo de inte r a s e entre el ifquido y e l g a s , evitando el contacto d ir e c t o e n t r e e l l o s , obien , ms fc il an, desechando las ltim as porcio nes de lquido que han sid o s atu rad as p o r el gas.

En este tipo de bom bas existen algunas de diseo es pecia l que e m plean s is te m as a m p li fic a d o r e s de p resi n, lo que permite obtener p r e siones do hasta 400 atm utilizando bajas p resio ne s de gas. Sea cual sea el tipo de bomba emple ado, conviene co loc ar un filtro entre la bomba y la c m a r a de inyeccin p a r a evitar que partculas e x tr aas bloqueen el sis tem a; este filtro debe tener la capacidad de r e t e ner part culas ex tra as sin p ro du cir una cada de pre si n excesiva. Cuando se utilizan bombas que d esplazan flujos de volumen constan te, es recom endable e m p le a r una vlvula o sello de se guridad que libere la p res i n del s is te m a cuando ha a lc a n z a d o un limite su p erio r a l n o r m a l . E s to p o d ra s u ce d er si por alguna razn el s is te m a se bloquea y la b o m b a contina desplazand o cL m is m o vo lumen e in crementando continua mente la presi n. A d v ie rt a el lector que algunos instrumentos utilizan sis te m as de bom beo m s co m p le jo s que ios aqu d e s c rito s en muchos c aso s, p r o g r a m a d o r e s de fa s e m vil. C m a r a s de Inyeccin E s ta parte del instrumento exige cuidadoso diseo puesto que debe r e s i s t i r altas p re s io n e s, tener un vo lumen pequeo y sus cavidades d e ben s e r bien b a r r i d a s por la fa s e mvil. Es en esta s c m a ra s donde se introduce la m u e stra que luego es a r r a s t r a d a a la columna. Hay tres m o dali dad es distintas de in trod ucir la muestra: por medio de j e r i n g a s de alta presin; p or m ed io de v lv u la s in yecto ra s, y suspendiendo el flujo momentneamente.

Cuando se hace p o r med io de je r i n g a s (Fig . 71, se r e q u ie r e que la p res i n sea menor de J00 atm. En este caso, la m u e stra se in troduce p erfo rand o, con la aguja de la jerin ga, un disco o sello, que sea capaz de r e s i s t i r altas p res io n e s y la accin disolvente de la fa s e mvil. E x is te n s e llo s p e r fo r a b le s fabrica do s de d iv e r s o s m a t e r i a le s , como ' vit n", ' s i l i c n ' , " b u n a " , e t c ., resiste ntes a la m a y o r a de ios d i s o l ventes. Cuando se o pera a p res io n e s m ay o res de 100 atm, se utilizan v lvulas in yecto ras cuyo funcionamiento se m u e st ra en la figura 8. En c a s o d e c a r e c e r de este tipo de v lv ulas, se puede r e c u r r i r a la tcnica de suspen sin del flujo, que consiste en in t e r r u m p ir la presi n, deteniendo la bomba; se e s p e r a a que el flujo cese antes de r e m o v e r el sello p e r f o ra bie y se deposita la m u e s t ra en la c m a ra de inyeccin o en la parte s u p e rio r de la columna, se re insta la el sello p e r f o r a b l e y a continuacin se r e st ab lece e flujo. Mediante esta tcnica no hay prdid a de eficie n cia en la separaci n, ya que las velocidad es de difusin en lquidos son muy b a j a s . L a s ventajas y desventa ja s de las distintas tcnicas de introduccin de la m u e s t r a se hallan re su m id as en la T a b la 111.

Fig. 7. Inyeccin utilizando una ieringa. (Pro cedencia:.!. Cazes, J . Chem. E d u a ., 4 3 ^ 5 6 7 , 1966. Reproducida con permiso.)

Fase M v il

Fig. 8. Inyeccin utilizando una vlvula inyectora. muestra; b) inyectando.

a) Tomando la

Tabla III.

Tcnicas de Introduccin de la Muestr a

V ariables P r e s i n mxima R eproducibilidad Va r i acin en el ta mao de la muestra Introduccin de v o lmenes pequeos Tie mpo requerido Automa ti za ci n

Jeringas 100 atm Buena F c il Fcil Segundos Difcil

V lvulas 300 atm Excelente Difcil Muy difci l Segundos F c il

Interrupcin de Flujo -Buena Fcil Fcil Minutos

P r o g r a m a d o r e s de F a s e Mvil Esta tcnica, que equivale a la programacin de temperatura en crom atografa de gas es , consiste en cam biar la composicin de la fase m vil conforme transcu rre el anlisis. P o r lo general, se utilizan dos disol ventos de diferente polaridad y se varia el porcentaje del disolvente ms polar en la mez cla binaria. JLas ventajas que ofr e ce esta tcnica son: Anlis is ms rpidos M e jo r e s sep araciones M ay or sim etra en los picos M e jo r detectabilidad.

P o r otra parte, sus desventajas son: Difcil de efectuar en cr om ato gra fa liquido-liquido Necesidad de re generar la columna Incompatibilidad con el detector en ciertos casos.

JLa pro gram aci n de la fase mvil puede hac erse de div ersa s f o r m as, dependiendo de cmo se efecte el mezclado de los d is olv en tes. l_a figura 9 m uestra algunas de estas fo rm a s. En general, la form a expo nencial es la ms fcil. Desde el punto de vista de i instrumental, el p ro gra m ado r de fase m vil es un dispositivo muy complejo que puede re su lt ar tan costoso como el instrumento m is m o. Bs icamente hay pro gra m ado res de dos clas es: 1) P r o g r a m a d o r e s que efectan el mez clado en una c m ara , d e s pus de lo cual el lquido pasa a la bomba, la que enva la mezcla a la columna. Este tipo de p ro g ra m a d o r es muy sencillo y barato y no re quie re equipo especial alguno, si bien presenta ciertas limitaciones pues con l slo son fciles de efectuar programacione s exponenciales. 2) P r o g r a m a d o r e s de mezclado en corriente. Requiere dos bo m bas, que por lo comn son del tipo de desplazamiento continuo y desplazan

Composiclon d e la o Polaridad

Fase

Mvi l

a)

Programacin por etapas

tiempo

b)

Programacin exponencial

c)

Programacin lineal

Fig. 9 .

Diferentes formas < J e programacin de la fase mvil.

cantidades determinadas de cada liquido, lo que permite generar cual quier forma de gradiente. Estos programadores son mucho ms v e r stiles, pero tambin mucho ms costosos.

REGISTRADORES
Su funcin es re pres en ta r en un regis tr o gr fico la seal dada por el detector. Gen eralmente se utilizan re gis trad ores potenciomtricos de 1 10 m V . O tras caracterstica s des eables de los re gis trad ores son respuesta rpida de la pluma y velocidad varia ble del papel. C O N T R O L E S DE T E M P E R A T U R A En muchos casos el control de te mperatura que requiere la co lum na no necesita s er sup erior a 2" C; sin em bargo, para trabajos d e m s preci si n o cuando se re aliza cr om ato grafa lquido-lquido es nec esa rio un control ms refinado. P o r otra parte, muchos anlisis se llevan a cabo a temperatura ambiente, y es por esto que muchos instrumentos carecen de dispositivos de control de temperatura. P a r a tra b a ja r a te mperatu ras sup erio res a la del ambiente, se uti lizan baos de agua o de otro lquido, con regulacin de temperatura, o bien hornos de tipo elctrico. L a s caracterstic a s de estos tipos <ie control de te mperatura se descri ben en la Tabla IV. Tabla IV. Control do Tem pera tu ra

C arac ters ticas Fluido circulante Control E stabilizaci n Control a te m peraturas cercana s a la temperatura ambiente Control a te mperaturas elevadas C am bio de columnas Deteccin de fugas P o s ib l e utilizacin para control de temperatu ra del detector

Baos de Lquidos Agua, etilenglicol, etc. 0, 001 - 0, 5 C Lenta Bueno

Hornos A ir e 0, 2 - 5*C Rpida Malo

Buen o-med io Difcil Difcil Po s ib le

Bueno Fcil Fcil No posible

E l control de te mperatura del detector depende del tipo empleado, ya que mientras algunos no lo requieren, otros necesitan un control s u mamente minucioso. R E C O L E C T O R E S DE FRACCIONES Uno de los m ay o res atractivos de la crom a to gra fa lquida es la f a cilidad con que se pueden reco lectar los componentes de la muestra ana lizada. P o r cierto que p ara que este aspecto tenga utilidad prctica se requieren columnas es p ecia le s, capaces de trab ajar con muestras g r a n

des, y detectores que no d egra den o destruyan los componentes ya s e parad os. Hay disponibles reco le cto res automticos y manuales bien como accesorio s o como componentes del instrumento. Cuando el objeto sea la sep arac i n de cantidades pequeas d e m u e s t r a , la recoleccin manual es la ms conveniente. M EDICIN DE FLUJOS En cr om ato gra fa liquida existen d iv e r s a s tcnicas por medio de las cuales es posible m edir el flujo a tr avs de la columna. En p r im e r lugar, cabe men cio nar los mtodos gr av im t rico y v o l u mt rico, que consisten respectivamente en p e s a r o m ed ir el volumen de la fase mvil re colectada durante un cierto lapso de tiempo. E sto s mtodos son sencillos y exactos, pero no son muy r pidos y adem s no dan una lectura continua. Otros mtodos utilizan dispositivos mecnicos con este propsito. Existen, por ejemplo, los m edid ore s de flujo, que consisten en un p e queo tubo de vidri o de seccin cnica, en cuyo in terio r una pequela e s f e r a metlica flota dentro del lquido por efecto de la fr iccin que produce el paso de ste dentro de dicho tubo. L a al tu ra a la que se mantiene la e s f e r a da una indicacindel flujo obtenido. E s te d is p o s it i vo no es muy popular, pues no es muy exacto y ad em s re q u ier e calibracin. Otro tipo de dispositivo es el llamado medid or de burbuja, que cons ta de un tubo de vid ri o de volumen conocido a travs del cual fluye la fase mvil. L a form a cmo se mide el flujo es introduciendo una b u r buja y midiendo el tiempo de su r e c o rrid o a travs del tubo. E ste m todo es muy rpido, exacto y p reciso, y no r e q u ie r e calibracin. Como se dijo ya, todo lo re fe re nte a columnas tratado en los captulos que siguen. y detectores s er

3
C O L U M N A S Y F A S E S E S T A C IO N A R IA S En todo sistema cr omatogrfico, ya sea en fase liquida a gaseo sa, la columna es el " c o r a z n 1 del sistema puesto que en ella se lleva a efecto la separacin de los componentes de la mez cla en estudio. Se har por tanto una descripcin sucinta de algunas de sus c a r a c t e rst i cas generales , tales como el m aterial de que estn hechas, su longitud, dimetro, ctc. , y luego, con ms detalle, de los mat eriales de relleno, campo ste en que se han logrado avances que han revolucionado la te c nologa de las columnas. Conviene a c l a r a r sin em bargo que todava quedan muchos aspectos que no han sido suficientemente estudiados. Con frecuencia aparecen publicaciones que no son lo bastante explcitas y enocasiones son hasta contradictorias. La cr om atografa lquida de alta p res i n a tra v ies a por una etapa de cambios continuos y lo que hoy parec e s er cierto, puede muy bien no p a re c e rlo maana. CAR ACTERSTICAS G EN ER ALE S Bsicamente la columna consiste en un segmento de tubo de algn m ateri al inerte, de dimetro uniforme y capaz de r e s i s t ir altas p r e s io nes. De entre todos los m ateriale s, el ace ro inoxidable es e) ms us a do. En algunos casos tambin se ha empleado vid rio de paredes g r u e sas, pero tiene el inconveniente de no p erm itir conexiones metal- vid ri o hermticas a altas presiones. Se ha observad o que la superficie de las paredes internas del tubo ejerc e cierta influencia sobre la eficacia de la columna, este efecto e m pero no es muy importante si se utilizan rellenos de columna de alta eficiencia. El m aterial pre fe rido por muchos investigadores es el tubo de ace ro inoxidable de dimetro muy pre ciso y de paredes internas fi namente pulidas f 't r u b o r e stainless ste el"). La longitud de la columna vara entre 15 cm y varios metros y el dimetro, en l a m ay o ra de los casos, entre y 3 mm, aunque puede ser de basta 9 mm. L a capacidad de la columna depende de su longitud, dimetro y m a terial de relleno. En genera l las columnas muy eficaces son de d i m e tro pequeo ( Z- 3 m m) y efectan anlisis muy rpidos; su capacidad en cambio es muy limitada y la muestra debe s er entonces de tamao muy reducido, lo que exige un detector muy sensible. Si se desean r e a li z a r trabajos de tipo preparativo, o sea sep arar y re cu perar los componentes de una muestra en cantidad suficiente para poder utilizarlos posteriormente, se debe r e c u r r i r a columnas con m a -

te ria les de m ay o r capacidad. Dichas columnas efectuarn la separac in en fo rm a ms lenta y con una eficiencia menor que una columna de d i m etro pequeo. Respecto a la fo rm a o geom etra de la columna, por regla general, se p re fi e r e n las re ctas a las de cu alquier otra fo rm a , so bre todo p o r que hay cierta prdida de eficiencia cuando se doblan las columnas. P e s e a esto, cuando sea n e c e s a r i o usar columnas muy l a r g a s , se pueden util iz ar columnas rectas conectadas entre s, o bien columnas enrollad as o de fo rm a en: " U " , " L " , ''Sl; u " 8 " , estas ltimas co nfi gu raciones f a c i l i tan el control de la temperatura. E n t o d o c a s o , r e c u r d e s e que cu alquier estrangulamiento de la columna p ro v o c a r una gran prdid a en su efi caci a y ^ue, n el caso de columnas enro llad as, sta s e r mayor conforme dism inuya el di metro de la columna y aumente el d im et ro d el rollo. Aunque no fo rm an parte de la columna como tal, las conexiones en tre columnas, a s como entre la columna y el detector o e l in ye ctor, d e ben a ms de s er herm ticas , tener un volumen muy pequeo. En los extremos de la columna se coloca un disco de tefln o metal p oro so para evitar que el re lleno de la columna se afloje o pierda. Es n e c e s a r i o que este disco o tapn retenga las partculas del re lleno sin p ro d u cir una cada de p resi n muy gr ande. FASES ESTACIONARIAS L o s m a t e ria le s que se utilizan en c r o m a to gra fa lquida " cls ica " ta les como gel de slic e , almina, zeolit as, celulo sa, e t c ., se utilizan p o co en cro m a to g ra fa lquida de alta p re s i n porque sus part c ula s suelen s e r muy gr andes, de fo rm a i r r e g u l a r , y en muchas ocasio nes sus p r o piedades son d ifciles de re prod ucir . En c r o m a to gra fa lquida de alta presi n, las dimensiones de las p artc u la s de los m at eriale s empleados son muy pequeas, y muchas v e ces estas partc u la s tienen fo rm a r e g u l a r . A algunos de estos m a t e ria le s se les llama 'p e li c u l a r e s " , y otros contienen f a s e s lquidas q u m ic a m e n te unidas a la sup erfic ie del m a t e ria l. En una p ala bra, el m a t e r i a l ideal s e r a aquel que, en el m enor tiempo posible, d ier a la m e j o r resolucin p a ra la separa ci n de la m ez cla ; tu v ie ra la m x im a capacidad de muestra , fu era fcil de introducir en la columna, p ro d u je ra cadas de p res i n p e queas yque, ad em s, fu era de costo reducido. Est dem s d e c ir que este m at erial de relleno ideal no existe en la actualidad, y en d e t e r m i nadas circunstanc ias s e ju s ti fic a s a c r i f i c a r algunas ventajas para obte ner otras. L a s part culas de los p r i m e r o s m a t e ri a le s de relleno porosos (gel de s lic e y almina, p rincip alm ente ) eran m s o menos g r a n d e s , s i m i l a r e s a las de los utilizados en c r o m a to g ra fa lquida ' 'c l s i c a " . E l tamao de partcula es importante porque controla el p r o c e s o de difusin de las m ol culas de la m u e stra hacia adentro y hacia a fu e ra de los p oros de la partcula, A medida que el tamao de la partc u la aumenta, el p ro ceso de difusin se hace ms lento, es d e c ir , la tr a n s fe r e n c ia de m a s a entre la fase m vil y la fase esta cio naria es lenta. Al m is m o tiempo hay que c o n s id e r a r que si se aumenta el flujo de la fa se m vil p a r a obtener

an li sis r pido s , e l p ro c e s o de difusin, que es lento, hace que la c o lumna p ie r d a efi caci a y, por lo tanto, re solucin. Con form e d is m in u ye el tamafio de la partcula, la profundidad de los p oro s tambin d i s minuye y el p r o c e s o de tr a n s fe r e n c ia de m a s a se hace m s rpido, pe rm itiendo obtener an li sis rpidos sin prdidas en la resolucin L a s razones indicadas explican porqu slo se utilizan m a t e ri a le s po r o s o s cuyas part c ula s sean de tamafio m enor a 50 um. O tro s tipos de m a t e r i a l utilizados son los llam ados adsorbentes p e l i c u la re n , tambin conocidos con el nombre de "ad so r b en te s de capa p o r o s a ' , de " p o r o s i d a d sup erficial1 o d e ' centro slido'1. Una r e p r e sentacin esquem tica de stos se m u e s t r a en la figura 10. Consisten en p artc u la s e s f r i c a s , ge n eralm ente v i t r e a s , no p o r o s a s , re cub iertas de una capa, muy fina de un ad sorbente p oro so , c o m o g e l d e s i l c e o a l mina. E l e s p e s o r de esta capa es 1/40 del d im et ro total de la p a r t cula ( a l r e d e d o r de 1 um).

Fij. 10. Adsorbente p e li c u l a r . (Reproducida con permiso de "Columns f o r Modern Anal ytical Liquid Chromatography" por J. J. Kirkland, An a l. Chem., W , 36A-48A, 1971.) L o s dos tipos de m a t e r i a le s adsorbentes mencionados, peliculares y p o r o s o s , aunque difieren en algunas de sus propiedades, tienen m u chas en comn. En efecto, am bos pueden in tro d ucirs e en la columna con cierta facil id ad y d a r lu g a r a columnas muy efi caces; pueden utili z a r s e en c r o m a to g ra fa lq uido -s lid o, dependiendo de la actividad de su s u p erficie, o bien pueden r e c u b r i r s e de alguna fa se lquida y utili z a r s e en c r o m a t o g r a fa lquido-lquido. A s i m i s m o , se pueden unir qum icam ente en su sup erfic ie a alguna fa se lquida y c r e a r un nuevo tipo de c r o m a to g ra fa , ya que el p r o c e s o efectuado con estos rellenos de columna no es exactamente c r o m a to gra fa lq uido -l q u id o o lquidoslido. H ay, a d em s , m a t e ri a le s de relleno del tipo p e li c u la r y poroso p a r a c r o m a t o g r a fa de in tercambio inico. P o r otra p arte, los m a t e r i a le s p o r o so s , cuyas part c ula s pueden s er de f o r m a r e g u l a r o i r r e g u l a r , tienen una g r a n sup erfic ie es p ecf ic a, entre 50 y 500 m 3/g, Y por tanto pueden ace p t ar m u e s t ra s de tamao co n s id erab le , d el ord en de m i l i g r a m o s por g r a m o de relleno, sin que la columna p ie rda mucha eficacia. En contraste , los m a t e ria le s p e l i c u la r e s s o n d e s u p e rf ic ie s especf ic as m e n o r e s , entre 1 y 12 mz/gi aceptan menor tamao de m u e st ra, de 10 a 20 veces m enos que los m a te r ia le s p o r o s o s , y su costo es co nsid erable m ente m s elevado. En la s fig u r a s 11 y 12 se pueden a p r e c i a r las d ifer en cias entre ambos ti pos de re lle n o s .

s il- x

40

u m

Fig. 11. Fotografa de partculas de Sil-X, adsorbente poroso. (Re producida con permiso de "High Performance Liquid Chromatography Packing Materials" por Ronald E. Majors, Am. L a b . , mayo 1972, pg. 28; derechos reservados 1972 por International Scientific Communi cations, Inc.)

Z4PAX "CSP1

24

Fig. 12. Fotografa de partculas de 7-ipax "CSP", adsorbente pelicu lar. (Reproducida con permiso de "High Performance Liquid Chromatog raphy Packing Materials" por Ronald E. Majors, Am. T a b ., mayo 1972,pg. 28; derechos reservados 1972 por International Scientific Communi cations, Inc.)

F a s e s E staci onarias slido

para

Cro m ato graf a Lquido-lq uid o y Lq uido -

A continuacin se d e s c rib ir n algunos de los m at eriale s ms usados en cr om ato grafa lquido-slido, lquido-lquido y de intercam bio inico. Los materi ale s utilizados en cr om ato gra fa de exclusin o de p e r m e a cin se tratarn posteriormente por tener caracterstic a s diferentes. En la T a b la V so encuentran resumidas las c ar act erst ica s de los m ateri ale s porosos ms utilizados en crom a to gra fa lquido-lquido y lq uido -s lid o . P o r a s i l y Spherosi! son equivalentes y consisten en pe queas e s fer as de s ilica gel porosa: pueden co nseguir se en una gran v a riedad de tamaos de partculas y de r e a s especficas . P a r a c r o m a tografa lq uido-slid o, se re comienda P o r a s i l - A y S p h e r o s i lX O A - 4 0 0 , y para cr om ato gra fa lquido-lquido, P o r a s i l - C y Spherosil X O B -0 75 . S i l- X es un gel de slice de fo rm a i r r e g u l a r cuya sup erficie ha sido parcialmente desactivada; se utiliza principalmente en cr om ato gra fa lquido-slido. M e r c k o s o r b , tambin conocido con e l n o m b r e d e L ic h r o s o r b , es un gel de slic e del tipo empleado en c r o m a to gra fa de capa fina, pero de p a r tculas muy pequeas. A las columnas re llenas con este m at erial se les llama columnas " m ic r o -p a k 1 '.

T abla V. A dsorb ente

M ater iales P o r o s o s p a ra C ro m ato gr afa Lq uido-lquido y Lqu ido - 8li do N om b re F orm a Tamao de Partcula <|Jm) D iv e rs o s Diver sos 36-45 10, 20, 30, 40 18-30 Superficie P r o Especfica v e e dor " Diversas Diver sas 300 200 200 1 5 2 3.4 1

Slice Slice Slice Slice A lumina

Porasil Spherosil S i l- X M e rc k o s o r b Almina Woelm Durapak * * OPN Carbowax * * > " 1 - o c tao

E s f r i c a Esfrica I r r e g u la r I r r e g u la r I rr e g u la r

E s f ri c a Es frica E s f r i c a

35-75 35-75 75-125

50 50 50

1 1 1

Slice

< ' Vase la lista de fabrica ntes y p roveed ores en La pgina 9 * * F a s e lquida qumicamente unida. Durapak, es otro m at erial poroso y se halla disponible c o m e r c ia l mente en tres tipos diferentes. Consiste en partculas de P o r a s i l - C en cuya s uperfic ie tienen qumicamente unidas diversa s fas es lquidas, co m o C arb o w a x 400, ^-octano y oxipropionitrilo P o r desgrac ia , la unin S i - O - C es hidrolizable y trmicamente inestable, lo que impide el uso de estos rellenos con fa s e s m vil es acuosas o que contengan ms del 10% de alco holes. L a cantidad de fa se lquida en la fase estacionaria es de aproximadamente 3 a 5% en peso. Todos estos ad sorbentes deben contener un cierto porcentaje m n i mo de fa se lquida con el propsito de desactiv ar los sitios ms activos de su sup erficie: en el caso de la crom a to gra fa lq uido-slido se depo sita un cierto porcentaje de agua (aproximadamente 0,02 a 0, 04 g de agua por cada 100 m de superficiel lo cual es suficiente para d e s a c ti v a r el adsorbente y obtener la m x im a capacidad lineal de muestra. De entre los numerosos ad sorbentes p eliculares cabe sealar como m s importantes los mencionados en la Tabla VI. Se dijo ya que estos m at eriale s son de baja capacidad de muestra, por lo genera l del orden de m ic ro g ra m o s por gram o de adsorbente, pero su alta eficiencia hace posible efectuar anli sis muy rpidos. Todos tienen fo rm a esf r ic a y los ms comunes son los que presentan una capa de gel de slic e s o b r e la superficie de la e s fe r a vitrea. Algunos de ellos tienen una superficie muy poco activa y slo son tiles para crom a to gra fa lquido-lquido, como es el caso del Zipax; otros, como C o r a s il, P e llo sil, Vydac, etc-., se utilizan tanto p a r a cr om ato gra fa lquido-s lid o como p a ra crom a to gr afa lquido-lquido. El C o r as il II contiene una doble capa de gel de sl ic e (eld o b lo de C o r a s il I) y lo mis m o sucede con P e ll o s i l NK y P e llo s i l NN. Actualmente slo un adsorbente p eli cular contiene almina (P e l l u minai y se puede obtener con dos e sp esores de recubrimiento.

T a b la VI.

A dso rbentes P e l i c u l a r e s p a r a C r o m a t o g r a f a L q u id o -lq u id o y L q u i d o - 6 olido Nombre Tamao de Partcula lllml 37 50 37 44 30-44 25-37 37-44 37-44 25-37 25-37 37-50 37-50 Su perficie Especfica Im Vg) 7 14 4 8 12 1 4 8 1 1 7 7 7 8 8 l 1 10-12 8 7 Proveedor*

A ds o rb e n te P e lic u la r

C orasil 1 C o r a s i l II Capa de s lic e Pe los il N N P e l l o s i l NK Vydac Z ip ax Pe llum ina D N C apa de almina P ellu m in a DK P e r m a p h a s e ODS Perm aphase ETH C apa de s l ic e Durapak/Corasil ( C a r b o w a x 400.1 C o r a s i l ODS *

V a s e la lista de fa b ric a ntes y p ro v e e d o re s en la pgina 29.

Se mencion anterio rm ente que hay m a t e r i a le s que tienen la fa se lquida qumicamente unida. Un ti pode estos m a t e r i a le s son los l l a m a dos e s t e r e s s il ic atos, como el D u r a p a k / C o r a s i l y los D u rap ak, m e n cionados en la T a b l a V, que se c a r a c t e ri z a n p o r tener la unin S i - O - C , no muy resistente a la h id r lis is y a la te m peratu ra; el D u rap ak / C o ras il, que contiene C a r b o w a x 400, es m s efi caz que los D urapak, p e ro es de m eno r capacidad de ad s orci n . Otr o tipo de f a s e s lquidas utilizadas son las sil ic onas, que contienen la unin S i - O - S i , muy es ta ble y r e s i s tente a la h i d r lis i s y a la te m p er atu ra. Alg unos de estos ad s orben tes son F e r m a p h a s e ODS, P e r m a p h a s e ETI-1 y C o r a s i l ODS. La term in a cin ODS sig n if ica que la fase liquida qum ic am ente unida es la octa decils ilic on a; el E T H es una sil ic ona de tipo ter. En el ca s o del D u r a p a k / C o r a s il , la fa se liquida est qum icam ente unida a la su p erficie de part c ula s de C o r a s i l , y en el caso de P e r m a p h a s e a la s u p e rfic ie de p artcu la s de Z.ipax. M a t e r i a l e s p a r a C r o m a t o g r a f a de Interca m bio Inico L o s m a t e r i a le s utilizados para c r o m a t o g r a fa de in te r c a m b io cati nico y aninico d ifie re n un poco de los m a t e r i a le s de s c rito s m s a r r i b a . E n p r i m e r lu g a r , cabe cita r los m a t e r i a l e s o re s i n a s p o r o s a s , que consisten en p art cu las rgid as del c o p o lm e ro e s tiren o-d iv in ilbe n cen o en cuya su p erficie y poros se encuentran los grupos n te r c a m b ia d o r e s de iones, estos m a t e ri a le s son de capacidad elevada, g en eralm ente del

orden de microequivalentes por gram o de material. Otro tipo de m a terial es el nter cambiador de iones pelicular o resina pelicular, que consiste de una partcula vitrea d e fo rm a esfrica recubierta de una c a pa muy fina del copolmero estireno-divinilbenceno, la cual contiene los grupos activos; estos m at eriales son de capacidad reducida, menor que los anteriores, y muy eficaces. Un tercer tipo de material consiste en partculas de Zipax, en cuya superficie se han incorporado grupos in ter cambiadores de iones; a este tipo de mat erial se le conoce como r e s i nas superficialmente porosas. En la figura 13 se esquematizan estos tres tipos de m at eriales.

Fig. 13. Diferentes tipos de resinas de intercambio inico, a) Resina porosa; b) Resina superficialmente porosa; c) Resina pelicular. (Repro ducida de "Basic Liquid Chromatography por (lina Hadden y F. Bauman, fig. 2-7, pSg. 5-51, 1972. Cortesa de Varian Associates, Palo Alto, California.) Los grupos presentes en todo tipo de resinas de intercambio inico suelen s er -NR< y - N H S, en el caso de resinas de intercambio animco, que se obtienen comercialmente en forma de cloru ros, y -S 0 3 H en el caso de resinas de intercambio catinico, que se adquieren en forma de sales de sodio. En las Tablas VII y VIII se sealan las caractersticas ms signifi cativas de algunas resinas de ambos tipos. La mayora de las resinas peliculares y superficialmente porosa s pueden utilizarse condisolventes orgnicos. Adems, conviene a c l a r a r que las capacidades que se indi can en las Tablas VII y VIII son ap roximadas, ya que el valor v erdade ro depende de la muestra y del mtodo de separacin. Pellionex A T - 7 9 y A P - 2 1 8 son materiales de caractersticas idn ticas, en los que la nica diferencia es la naturaleza del polmero que re cubre la partcula vitrea. De modo sim ila r, Pellionex C P - 109 y C P - 128 difieren slo en capacidad, que es de 60 y 8-10 peq/g, r e s p e c tivamente. Las resinas Aminex de intercambio aninico y catinico pueden s er adquiridas en div erso s tamaos de partcula (10-20 limi y por otra parte, las resinas Du rrum de tipo D A -X 8 y D A -X 4 slo d ifie ren en su capacidad adsorbente y rigidez. M ater iales para Cro m ato graf a de Exclusin o Pe rm eaci n En la actualidad hay disponible un gran nmero de materiales para esta tcnica cr omatogrfica, que var an de acuerdo con su rigidez y con el intervalo de pesos moleculare s dentro del cual son tiles; en otras

Tabla VII.

Resinas de Intercambio Inico P e li c u la re s y Superficialmente P o r o s as C a rc ter Capacidad Grupo funcional (Meq/g) Provee d or*

Nom bre

Tamao de Partcu la (um> 40 44-53 25-37 25-37 40 44-53 25-37

Pe llic u la r Anion Pe llio nex A T - 79 AF-2 18 Z ip ax SAX Z ip ax W AX Pe llic u la r Cation Pellionex C P - 109 C P - 128 Zipax SCX *

Base fuerte B ase fuerte B ase fuerte B ase dbil Acido fuerte cido fuerte cido fuerte

nr;

10 10 12 12 10 60 8- J0 3

4 7 8 8 4 7 8

- NRj nk

- NHs - SQjH -SCfeH -SQ,H

V as e la lista de fabricantes y pro veedore s en la pgina 29.

Tabla V IL Nom bre

Resinas de Intercambio Inico P o r o s a s C arc ter Capacidad Grupo (meq/g) Funcional P r o vee dor*

Tamafto de Pelcula <Um) 20 Diverso Diverso Diverso

Dur rum D A -X 8 D A -X 4 Aminex Se rie A Du rrum D C - A Aminex Serie A *

B ase fuerte B as e fu e rt e cido fuerte cido fuerte

- NR - NRj s o 3h s o 3h

4 Z 3 5 5

9 4 -6 9 4 -6

Vase la lista de fabricantes y pro veedores en la pgina 29.

palabras, el mat eri al a utilizar en la columna depender del tamaode las molculas que se deban analizar. En p rim e r lugar, mencionaremos los m ateri ale s " blandos ', como "Sephadex", MShepharose" ( P h a rm acia Fine Chem icals, Inc.) que son los geLes de polidextranos y p olia crila m idas, utilizados casi siempre con disolventes a c u o so s ; su capacidad es elevada y no re siste n presio nes superiores a 3 atm. Los limites de pesos m ole cu lares en los cu a les se pueden utilizar, varan desde 700 hasta 200 000 en el caso de ' Sephadex", y desde 700 hasta 150 millones en algunos tipos de biogel. En segundo lugar tenemos los m ateri ale s se m ir rg id o s, como "Styragel" (Waters A ssociates) y " M e r c k o g e l OR" (E. M erck ), p olm e ros de poliestireno y polivinilacetato, respectivamente, que resisten pres ione s de hasta 68 atm, y se suelen utilizar con disolventes no

acuosos. E l intervalo de pesos m o le c u l a r e s en que son tiles oscila entre 250 y 300 m illones para el Styrage l y de 750 a un milln p a r a el M erck o gel OR. P o r ltimo estn los llamados re llenos " r g i d o s " , que se utilizan a cualquier pre si n, y entre ellos se cuenta el M.erckogeUSi (E Merck ! constituido p or partculas i r r e g u l a r e s de gel de sl ice ; el intervalo do pe s o s m o le c u la re s en que es til es de 10 000 a 1 milln. Spherosil y P o r a s il , d es crito s ya al h ab lar de c r o m a to gra fa lquido-lquido y lquido-slido, tienen un lmite comprendido entre 60 000 y 2 millon es, y finalmente las e s f e r a s de v id rio poro so (electro nueleoniest se encuentran en div ersa s fo rm a s y son tiles para t r a b a ja r con p esos m o le cu lare s desde 28 000 hasta 1 200 000. Se ha tratado de a b a r c a r bre vem ente lo refere nte a las columnas y a los m a t e ri a le s de relleno, sin em b a r g o hay que a c l a r a r que no se ha intentado en cada caso ha cer una d escri pcin detallada porque se co n s i dera que e s ta ra fu era del propsito de esta m onografa. E l lector in tere sado en contrar en la b ib lio g r a fa las fuentes de informacin nec e s a r i a s p a ra profu ndi zar en el tema. L is t a de P r o v e e d o r e s y Fabric antes de M ateriales de Relleno pa ra Columnas 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 1 2. W a t e r s Associates P e rk in E lm e r E . M e r c k (A le m ania ! V a r a n A e ro g r a p h Pechiney , Saint Gobain (F ra n c ia ) B i o - R a d L a b o r a t o r ie s Reeve Angel E . I . Du Pont de N em o urs D u rru m C hem ic al Company Separation Group. P h a r m a c ia (Suecia). A pplied Science L a b o ra t o r ie s .

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DETECTORES
Du rante mucho tiempo el d e s a r r o l l o de la c r o m a t o g r a f a en ase lquida se vio ob sta culizado por la falta d e d e t e c t o r e s adecuad os El d e te c to r id eal s e r a ^.quelque s a t i s f i c i e r a los siguientes r e q u is it o s : a l t a mente s e n s ib l e , e s ta b le , de lectu ra continua y de r e s p u e s t a un iv ersa l. Aun hoy d a no existe un detec tor id eal y los que hay d ispo nib le s slo son adecuados p a r a c i e r t a s ap lic a c io n e s en p a r t ic u la r . E l p r o b le m a de d is e a r y de c o n s t r u i r d e tec to res para c r o m a t o g r a f a lquida no ha sido t a r e a fcil y ha re q u e r i d o de una tecno lo ga avan zad a. El p r o b le m a de deteccin en c r o m a t o g r a f a lquida se entiende m e jor si se piensa en el p ro ces o que se d ebe l l e v a r a efecto. H ace falta un c i e r t o d i s p o s i t i v o que m id a en f o r m a continua alguna pro pied ad f i s i co q u m ica de los componentes de la m u e s t r a de la so lucin que los contiene y que g e n e re una se al p ro p o r c io n a l a la co nce ntr aci n de la m u e s t r a , a m ed id a que sta s a le de la columna. P o r d e s g r a c i a , la m a y o r a de las p ro p ie d a d e s de la m u e s t r a que pudie ran m e d i r s e son muy s i m i l a r e s en magnitud y c a r a c t e r s t i c a s a las del dis olv ente (fa s e m v i l ), y esto dificulta el p r o c e s o de deteccin. P a r a r e s o l v e r este p r o b le m a se su giere n dos cam ino s que co nsis ten: uno, en elim in a r el disolven te con a n t e r i o r id a d a l p r o c e s o de deteccin, y el o tro, en m e d ir alg u n a p r o pie d ad de la solucin que contiene la m u e st ra y de alguna fo r m a c o m p e n s a r o s u s t r a e r de la p ropiedad m ed ida aquella fr a c c i n que slo c o r r e s p o n d e al d is olv ente . P o r supuesto que esto no es fcil do hac er porque p a r a l o g r a r una alta sen s ib ilid a d se deben co n t ro la r a d e m s los p a r m e t r o s de o pe raci n sus c e p tib le s de in flu en ciar dichas pro pied ades de la solucin y d e l disolv en te. P o r lo g e n e ra l, este segundo mtodo r e q u i e r e un co ntro l cuidadoso del flujo y de la te m p e r a tu ra . A l c o n s id e r a r un detec to r e n t r m in os de su ap li caci n a un cierto p ro b le m a , o al e v a l u a r l a s cu alidades de un cierto d is eo, d e b e n t e n e r s e en cuenta c i e r tas p ro p ie d a d e s g e n e r a l e s , ta le s como: R es p u es t a. Pu ede s e r u n iv er sa l o s electiv a, segn la capacidad que tenga el detec tor de t r a b a j a r con todo tipo de m u e s t r a s o slo con uno e s p e c f ic o . En g e n e r a l , los d etectores u n iv e r sa le s son ms d e s e a b le s , si bien los s e l e c t i v o s , que suelen s e r m s s e n s i b l e s , efectan m e j o r el a n li s i s de m u e s t r a s c o m p le ja s porque detectan c i e rt o s c o m ponentes a muy b a j a s conce ntr acio nes. Se nsib il id ad. D e fn e s e la s ensib ili da d de un d ete cto r co m o la ra zn entre la seal g e n e ra d a y la cantidad de m u e st ra que produ ce dicha se al . E s te es un t rm in o rela tiv o puesto que a p a r t ir de un m is m o d e te cto r, la seal obtenida puede s e r muy d iferente p a ra d i v e r s a s m u e s t r a s . P o r otra p arte, la sensib ilidad no da u n a i d e a c l a r a a c e r c a de la cantidad m n im a detectable, puesto que s ta puede e s ta r s ev eram en te lim itad a p o r el nivel de ruido d e l in stru mento.

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Ruido. Es la variacin en la seal del instrumento que no es a t r i buida a la muestra y que puede ser producida por fallas electrnicas, variaciones de flujo o temperatura, fluctuaciones en el voltaje, burbujas de ai re atrapadas en el detector, etc. Se llama cantidad mnima detectable a la cantidad de muestra que produce una seal igual al doble del nivel de ruido del instrumento. D l o anterior se deduce porqu un d e tector muy sensible y muy ruidoso p ued en o s er tan til como uno m e nos sensible, pero con un nivel de ruido ms bajo. Linearidad. P a ra utilizar la seal generada por el detector como una medida cuantitativa, dicha seal debe gu ardar una relacin lineal con la concentracin de la muestra; esta propiedad se conoce como l i near idad. El intervalo lineal de un detector se puede definir como la razn en tr e las concentraciones mximas y mnimas respecto a las cuales la respuesta del detector es lineal. Conforme se aumenta la cantidad de muestra, s e l l e g a a u n nivel a partir del cual todo detector se vuelve no lineal. P a ra obtener resultados cuantitativos se re c u r r e a los grficos de calibracin que representan la seal en funcin de la concentracin en el intervalo de concentraciones en que la respuesta del detector es lineal. Estabilidad, Un buen detector debe ser insensible a los cambios de te mperatura y a la variacin de flujo a la vez que ser compatible con programaciones de fase mvil. Los detectores que miden propiedades de la solucin y que requieren compensacin por efecto del disolvente, s u e l e n s e r m s difciles de e s tabiliza r, en especial cuando se realizan p rogram aciones de la fase m vil. Se han probado diver sos detectores cuyo funcionamiento se basa en diver sas propiedades de la solucin, pero la gran m ay ora de ellos slo han tenido un xito limitado y esto ha impedido su adopcin definitiva. Actualmente existen dos tipos de detectores de uso muy g e n e ra liz a do que se describen a continuacin: D E T E C T O R DE NDICE DE R E F R A C C I N Mide la diferencia entre los ndices de refraccin del disolvente puro y de La solucin de la muestra que sale de la columna; de esta manera se detecta cualquier cambio en la composicin de La fase mvil. E a re s puesta de este detector es universal y su sensibilidad es moderada, por Lo peneral del orden de m ic ro gram os o partes por milln.

Desafortunadamente, debidoa la respuesta universal, es muy d i f cil efectuar programaciones de fase mvil con este detector, que a d e ms es sensible a las variaciones de flujo y de la temperatura. P a r a poder o b s erv ar diferencias en el ndice de re frac cin del orden de 1 x 10-" unidades, se requiere un control de te mperatura de 0,0001C.

H a y dos m o d e lo s distintos de este tipo de dete cto r, que se ilu s t ra n en l a s f i g u r a s 1 4 y 15. d

Fig. 1. Detector de Indice de refraccin, tipo "desviacin", a) Fuente luminosa; b) abertura; c) lente colimadora; d) cel das analtica y de referencia; e) espejo; f) ajuste ptico de cero; ( ? ) Fotocelda; y h) amplificador. (Reproducida del cat logo "Chromatography", fig. 10, pg. 70, por cortesa de Waters Associates. )

Fig. 1S. Detector de ndice de refraccin, tipo "Fresnel". a) Fuente luminosa; b) Proyector; c) prisma y celdas; d) fo tocelda. (Reproducida de "Modern Practice of Liquid Chromatography" por J.J. Kirkland, fig. 3.13, pg. 118. Corte sa de John Wiley Sons, Inc., Hueva York, N.Y.) U n o de ellos, llamado r efractmetro de desviacin, se basa en el desplazamiento ptico de un rayo de luz, que es proporcional a la dife rencia del ndice de refraccin entre dos lquidos. El otro se funda en el principio de Fresnel, segn el cual en la interfase entre el p r i s m a de vidrio y algn lquido, la cantidad de luz transmitida y reflejada e s proporcional al ngulo de incidencia de la luz y al ndice de refraccin del lquido.

E n el refractmetro do desviacin (Fig. 14), un rayo de luz pasa a travs de u n a a b e r t u r a (a) y e s c o l i m a d o por el lente (b), atraviesa le gola s c e l d a s (e), que contienen, respectivamente, eldisolvente puro y la solucin que sale de la columna, es reflejado por un espejo (d) y enfo cado a travs de un m e c a n i s m o de ajuste ptico cero le), incidiendo m s tarde sobre la superficie de una fotocelda f). El ngulo de incidencia

del rayo de luz sobre la otocelda est determinado por el ngulo de d e s va cinq ue r e s u lt a d e la d iferencia entre los ndices de re fr a c c i n de los lquidos en am bas celdas. C onfo rm e el ra yo ca m bia su ngulo de i n c i dencia sobre la fotocelda, s e g e n e r a una seal, que es am pli ficada y r e presentada grficam ente por el re gis trad or. El es quema ptico de un re frac t m etro de tipo F r e s n e l (Fig. 15) consta de dos rayos de luz colimados y de ig ual intensidad, que pasan a tr avs de un p ris m a e inciden sobre la interfase v id rio -lq u id o de las celd as de re fere n cia y muestra, re spectivamente. Dichas c eld as , de ap roximadamente 3 m ic ro litr o s cada una, consisten en cavidades ovalada s en una pequea pieza de tefln, ubicada entre el p r is m a y una placa de sostn. E l ajuste grueso del ngulo de incidencia de la luz se r e a liz a rotando e l cuerpo del proyector. L a diferen cia de intensidad de la luz transmitida a tr av s de las celdas est en funcin de los ndices de r e fr accin de am bos lquidos y se mide por medio de una fotocelda doble, la cual gen era una seal que es re g is tr a d a grfic am en te. A m b o s modelos miden cambios en el ndice de re fra c c i n hasta de 10"7 unidades. El re frac t m etro de desviacin es menos sen sible a los cambios de tem peratu ra y es ms compatible con La p r o g r a m a c i n d e fase mvil; tiene un intervalo lineal m eno r, es muy sensible a las v i b ra c io n e s o movimientos del instrumento, y sus cavida des o cel das no son tan pequeas como las del re fra c t m e tr o de F r e s n e l . E s te ltimo, en cambio, es considerado ms s e n s ib l e y m enosadecu ado p a r a p r o g r a m aciones de fase mvil, sus celdas son de volumen ms pequeo, es ms sen sible a los cambios de te mperatura y, adem s, es n ec es ario in t e r cam b iar p r is m a s p a r a a b a r c a r por completo el intervalo de ndices de re fracci n. De todo lo anterio r se desprend e que el detec tor de ndices de r e fraccin es un detector de respue sta universal, que r e q u ie r e co m p ensa cin por el disolvente, que es moderadamente sensib le y que no destruye la muestra. Su estabilidad es buena, es sensible a los cam bios de tem per atura y de flujo y la seal que gen era puede s e r p o sitiva o negativa segn que el ndice de re fr a c c i n de la solucin que contiene la mue stra sea mayor o menor que el ndice de re fr a c c i n del disolvente, L a pro gra m aci n de fa se mvil es muy d ifcil , el intervalo lineal es ap roximadamente 3000 y la sens ibilidad vara un poco, de a c u e r do con el fabricante, pero en gen eral es del orden de p artes por milln. D E T E C T O R DE L U Z U L T R A V I O L E T A Su funcionamiento se b asa en la ab s o rci n de luz por parte de la m uestra al pasar a t r a v s de ella un haz de luz m o nocro m tic a u l t r a violeta. E s lgico suponer que la re sp u e sta de este detector s e r s e lectiva, ya que slo se detectarn los compuestos que a bs o rb an luz de la longitud de onda a la que opera el detector. Este fotmetro de luz ultravioleta, como tambin se llama, es r e lativamente insensible a los cambios de flujo y de te m p er atu ra, y s i e m p r e y cuando el disolvente no a b s o r b a en grado a p re c ia b le en la longitud de onda que o pera el fotmetro, s e r muy fc il efectuar p ro gra m acio n e s

de fase mvil. P o r otra parte, podemos d e c ir que, actualmente, e'ste es el detector ms sen sible en crom a to gra fa lquida: en condiciones ptimas se pueden obtener sensibilida des de hasta 0,005 unidades de absorc in, y si el compuesto a b s o r b e intensamente en e! ultravioleta, es posible detectar cantidades de m uestra del ord en de 2 nanogramos. L a mayor parte de los diseos c o m e r c ia le s operan a una longitud de onda de 254 6 280 nm ,* utilizando como fuente de luz ultravioleta una lm p a ra de m e r c u r io de ba ja presin. Un diseo esquemtico de este detector se muesta en la figura 16. E l haz de luz, proveniente de una lm pa ra de m e r c u r io , es p r i m e r a mente colimado y despus se hace p as ar a tr avs de dos celdas , una de e lla s de r e fere n cia o compensacin; los ra yos de luz emergentes se h a cen p a s a r por filtros especf icos con el objeto de obtener la longitud de onda re qu erida (254 6 280 nm). L a intensidad es medida por una fotocelda doble que gen era una seal que, despus de a m p lific a rs e , es r e presentada grficam ente por el r e g is tr a d o r . Dicha seal se puede o b tener como porcentaje de luz transmitida o ab s o rb ida, siendo ms conveniente la segunda i,absorbancia) pues es directamente proporcional a la concentracin de la muestra. De hecho, la nica desventaja de este detector es su respuesta selectiva; sin em bargo , aun para c o m p ues tos que presentan su mximo de absorcin a una longitud de onda distinta de 254 6 280 nm, la sensibilidad es buena.

\ Fig. 16, Detector de luz ultravioleta, a) Fuente luminosa; b) lente colimadora; c) celdas analtica y de referencia; d) ventana de cuarzo; e) filtro; f ) fotocelda. (Reproducida de "Basic Liquid Chromatogra phy" por Nina Hadden y F. Bauman, fig. 6-5, pg. 6-9, 1972. Cortesia de Varian Associates, Palo Alto, California.)

4 1 Un nanometro, nm, equivale a 10' metros.

P a r a evita r p r o b le m a s con la fase m v il y ra ido en el dete cto r, se emple an disolventes de grado de p u re z a es p e c tr o sc p ic a co m o fa s e s m v il e s y se toman las p recaucion es ad ecuad as p a r a que no se fo rm e n b u r bujas en Las ce ldas. Si durante la p ro g ra m a c i n de fase m v il, sta c a m b ia en grado a p r e c i a b l e s u a b s o rc i n en el ultravioleta, es n e c e s a r i o ut iliz ar la c eld a de r e f e r e n c i a con el propsito de co m p ensar esta absorc in. Si el d i s o lv e n te no a b s o r b e o si la a b s o rc i n es constante, la celd a de r e f e r e n c i a se puede d e j a r vacia o bien llena con el disolvente empleado. C o m o se dijo ya, las celd as de cu alq u ier detec tor deben s e r de un volumen pequeo con el objeto de evitar un ensanchamiento de las b a n das de elacin; a s i m i s m o , en este dete cto r, se r e q u i e r e que la luz at ra v i e s e la solucin que contiene la m u e stra por lo menos una c ie rt a longitud mnima. En la m a y o r a de los d etec to res , l a s c e l d a s tienen una longitud de paso de la luz de 1 c m y un vo lu men que v a r a entre 8 y 30 m icrolitros. En r e s m e n e s lcito c o n s id e r a r al detec tor de luz ultr avio leta c o mo el ms sensib le y de uso m s ge n e ra liz a d o en c r o m a t o g r a f a l q u i da, en es p ecia l en el campo de las in vestig acio nes b io q u m ic a s, porque muchos compuestos de in te rs biolgico a b s o r b e n intensamente en la re gi n ultravioleta. L a m u e st ra no re su lt a a l t e r a d a p o r el p r o c e s o de deteccin y el intervalo lineal es de a p ro xim a dam e n te 3 000; este d e t e c to r no es s en s ib le a los cam bio s de flujo o de te m p e r a t u r a y es apto p a r a p ro g r a m a c io n e s de fa s e mvil.

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ANA LISIS C U A L IT A T IV O Y C U A N T IT A T IV O ANA LISIS C U A L IT A T IV O L a s e p a ra c i n e identificacin de d iv e r s o s compuestos en una m e z cla es un p r o b le m a complejo y re q u ie r e , en muchos caso s, el uso de diferentes tcnicas . L a c r o m a t o g r a fa lquida es en esen cia una tcnica de sen ar acin obtener alguna in fo rm acin de tipo cualitativo, en g e n e ra l s ie m p r e se r e q u ie r e d ealguna tcnica no c r o m a to g r fic a p a ra efectuar la identificacin ce r te r a de un compuesto deter minado. Hay algunas tcnicas y p a r m e t r o s puramente crom a to g r fic o s que, en muchas o casio ne s, pueden s e r v i r de gua o de ap ro xim aci n a la identificacin de un compuesto, p e ro debe r e c o r d a r s e que no son confiab le s en gr a d o absoluto. Medidas de Retencin El volumen de fa s e m v il re q u e rid o para eluir un compuesto de la columna c r o m a to g r fic a se llam a volumen de retencin. P o r otra p a r te, se conoce como tiempo de retencin el tiempo tr an s cu rrid o desde la introduccin de la m u e st ra en la columna hasta el momento en que eluye el compuesto en cuestin. La medicin, tanto d elv o lu m en de re te n cin como del tiempo de retencin ( t ) , se inicia desde el momento en que se introduce la m u e stra en la columna hasfca el momento en que a p a re ce el m x im o del pico en la g r fic a traza d a por el r e g is tr a d o r . A h o ra bien, aunque ambas m edid as se ex p res en en diferentes unidades, son equivalentes, puesto que el flujo de la fase m vil se mantiene co n s tante. Cuando las condiciones de ope ra cin se mantienen constantes, los tiempos o volm en es de retencin son re p r o d u c b l e s , p e ro no es fcil m antener in v a ria b le s el flujo, la tem peratura, la cantidad de fa se l quida en la columna, la composicin de la fase mvil, etc, , y por con siguiente es muy difcil re p r o d u c ir datos obtenidos en diferentes lab o r a to rio s . 0 Suponiendo que las condiciones de ope ra cin sean constantes, el tiempo de retencin s e r c a r a c t e rs t ic o de una sustancia dada, p ero no unico, ya que no hay que o lv idar que dos o m s sustancias pueden tener un m is m o tiempo de retencin. L a fo rm a de efe ctuar una identificacin es comparan do los tiempos de retencin de las susta ncias por id en tificar con los tiempos de retencin de sustancias patrones, aunque, c o mo se dijo ya, esto no basta p ara una identificacin certera.
IV no de identificacin.j y aunque es p osib le

Hay d iv er sa s fo rm a s de evalua r los tiempos de retencin que son ms fciles fie re prod uc ir que los tiempos de retencin a b s o lu tos (tu), mencionados antes. En p r im e r lugar, consid erem os el ti e m po de retencin co rregid o o ajustado ( -r), segn se m u e stra de m an e ra g r fic a en la figura i 7; ste es el tiempo de retencin absoluto menos el tiempo de retencin de algn compuesto que no experimenta retencin alguna en la columna. Existen adems los tiempos de retencin r e l a tivos, que son el cociente obtenido de div id ir el tiempo de retencin co rr e g id o del compuesto en cuestin por eltiem po de retencin de algn compuesto patrn, que puede s e r uno de los componentes de la m ez cla . L o s tiempos de retencin, ajustados o c o rr e g id o s , son ms fciles de re prod uc ir que los absolutos, pero los tiempos de retencin rela tiv os, son ms confiables porque slo dependen de la tem peratura, las c a r a c te rstic as de la columna y la composicin de la fa s e mvil.

C om p araci n entre Di fere ntes Columnas L a confiabiLidad en la identificacin cr o m a to gr fica se puede au m en tar si se examina el comportamiento de la m ue stra en d iv e r s a s colum nas, ya que es muy difcil que dos compuestos presenten exactamente un mis m o tiempo de retencin en diferentes columnas. E s ta co m p a ra cin se puede efectuar entre columnas que contienen d iv e r s a s fa ses l quidas, o bien entre columnas de diferentes tipos de crom a to gra fa , tales como, la crom a to gra fa de perm eaci n, la c r o m a to g ra fa lquidolquido, etc. C om p araci n entre M ie m b r o s de Se ries Hom&logas En muchos casos no Be dispone de los compuestos patrn apropiados para efectuar la com parac in de los tiempos de retencin. S se d is p o ne de una mez cla de los m ie m b ro s de una s e ri e homloga , se puede r e g i s t r a r grfic am en te el log aritm o de los tiempos de retencin en fun cin clei nmero de tomos de carbono de cada m ie m b ro . Mediante la extrapolacin del g rfic o obtenido se lo g ra la identificacin de una s u s tancia dentro de una m is m a s e r i e homloga.

C om par acin de las Respuestas de D iv ers o s Detectores L a relacin de las respuestas que presenta un nico compuesto en dos o m s detectores distintos suele s e r caracte rfstica del mismo. P a ra obtener esta relacin, se hace p a s a r el efluente de la columna por vario s detectores conectados, ya sea en seri e o en paralelo, y las r e s puestas se representan grficamente de modo simultneo en un r e g i s t r a d or de v ario s canales, L a s combinaciones posibles son el detector de luz ultravioleta y el de ndice de refraccin, o bien dos detectores de luz ultravioleta que operen a diferentes longitudes de onda. Uno de los a r r e g l o s posibles de esta tcnica se m ue stra en la figura 18.

Fig. 18. Sistema de deteccin mltiple, a ) Cmara de inyec cin; b) columna; c) detector de luz u ltrav io leta ; d) detector de ndice de refraccin; e) recolector de fracciones. Tcnicas A uxiliares L a nica manera de identificar una sustancia con un cien por ciento de seguridad es utilizando alguna tcnica auxiliar, como por ejemplo: la es pectr om etr a de m asas, la resonancia magntica nuclear, etc. Conviene advertir que en muchos casos se requiere ms de una de estas tcnicas para poder identificar la sustancia con certeza. A s im is m o , pero en fo rm a menos segura, es posible utilizar las reacciones qumicas de ciertos grupos funcionales para obtener una in dicacin de la naturaleza de la sustancia problema; en gen eral estas reacciones son sensibles a m ic ro gra m o s de muestra. Muchos an lisis espectroscpicos se llevan a cabo di rectamente con el disolvente usado para eluir la muestra; si la cantidad obtenida para el an lisis es demasiado pequea, se recomiendan columnas de. m a yor capacidad.

ANLISIS C U A N T IT A T IV O El anlisis cuantitativo de mezcla s de sustancias s iem p re ha siclo fcil de efectuar mediante cualquier tcnica crom ato gr fica con r e s u l tados vlidos. En la actualidad el anlisis cuantitativo por medio de la cr om ato grafa lquida de alta presin es tan confiable como el r e a l i z a do por crom atografa de gases. En general, todo anlisis etapas: cuantitativo puede d iv id ir se en va ria s

Muestreo Separacin y deteccin Integracin de las seales Clculo de la composicin Interpretacin estadstica.

La etapa de m uestre o no puede s er descrita con la debida propiedad en esta mono gra fa, y slo se mencionar que es una etapa crtica, so bre todo en cierto tipo de m ue stras, como son las de o rigen biolgico, Si la mue stra requie re alguna prep aracin o tratamiento previo, ste debe r e a liz a r s e con todo cuidado. La segunda etapa puede s e r la fuente de muchos e r r o r e s debidos a mltiples factores. P o r ejemplo, puede haber descomposicin o a d s o r cin i r r e v e r s i b l e de los componentes de la m ue stra en la columna, ya sea por efecto de la fase mvil o del m aterial de relleno de la columna. L a sensibilidad, linearidad y especificidad del detector son tambin muy importantes. E l tamao de la mue stra debe esta r dentro del intervalo lineal del detector; los cambios de flujo, de te mperatura y las fallas electrnicas pueden afectar las caracterstic a s de la respuesta del d e tector; por otra parte, el detector puede s e r completamente "ciego" a un determinado tipo de m ue stras o bien su sensibilidad v a r i a r para c o m puestos de diferente estructura. P o r estas razones se recomienda te ner cuidado al in terpretar los resultados. La te rc e r a etapa, integracin de las seales, se lleva a c a b o por d i v e r s a s tcnicas que var an en cuanto a complejidad y exactitud. E l p r o psito de esta etapa es tra n s fo rm a r de alguna fo rm a la intensidad de las seales emitidas p or el detector en medidas que puedan re la c io n arse con la cantidad de muestra. L a s seftales obtenidas, en la m ay o ra de los detectores, aparecen en el re g is tr a d o r como picos de fo rm a a p r o ximadamente 1 gau ssiana", cuya altura o r e a se utiliza como una m e dida de tipo cuantitativo. A continuacin se d e s c r i b ir cada una de las tcnicas manuales e instrumentales que se conocen p ara integr ar las r e a s de los picos. a) Altura dei pico. Aunque el r ea es una medida ms precisa, la altura se emplea mucho porque es muy simple de obtener, aunque es mucho ms sensible a varia ciones instrumentales. Si se mantienen constantes las condiciones de operacin del instrumento y se efecta una buena calibracin, es posible obtener datos cuantitativos muy a c e p tables .

Si los picos estn completamente distorsionados o a s im t r i c o s , o si la columna est s o b r e c a r g a d a de m u e st ra o la cantidad de la m uestra est fu era del Intervalo lineal del detector, no debe utiliz arse esta t c nica. Si hay d esvia cin de la lnea b ase, la altura del pico se obtiene interpolando la lnea b ase entre el principio y el fin de cada uno. b) A l t a r a p o r el ancho a la mitad de la altura. Cuando los picos son s im t rico s tienen ap ro xim adamente la fo rm a de un tringulo, y es por esto que el r e a se mide multiplicando la altu ra del pico por el ancho medido a la mitad de la altu ra. No es conveniente usar el ancho m e d i do en la b a s e del pico, ya que por lo g e n e ra l los picos tienen ciert a ten dencia a c o l e a r 1 o, dicho en otr a form a, a extender sus finales. E s ta tcnica es sencilla y si bien no da una medida muy exacta del r ea real, el r e a medida es proporcio nal a la cantidad d e m u e s t ra . La p re c i s i n de esta tcnica depende de la sim etra del pico y de la r e l a cin entre su al tu ra y ancho; en g e n e r a l slo se recomiend a para picos s im trico s, cuyo ancho, a la mitad de la altu ra, pueda m e d ir s e con cierta p recisi n. c) T riangu la ci n. E s te mtodo consiste en t r a z a r tangentes a a m bos lados del pico hasta f o r m a r un tringulo con la lnea base y luego a p licar la f rm u la de la b a s e multiplicada por la mitad de la altu ra . E s te mtodo es menos p re c i s o que el an t erio r y est sujeto a e r r o r e s al t r a z a r las tangentes. d) C o r t a r y p e s a r . Este mtodo es lab o rio s o y lento, pero es b a s tante p r e c i s o . Bsic am ente lo que se hace es d eter m in a r el peso por unidad de r e a del papel utilizado en el r e g is t r a d o r , r e c o r t a r despus los picos tr a za d o s en el papel del r e g i s t r a d o r y p e s a r l o s , y de esta forma se d eterm in a su rea. L a p recisi n de este mtodo en gen eral es buena, p ero depende de muchos fac to res, como son el cuidado que hay que te ner al r e c o r t a r tos picos, la homogeneidad del papel, etc. e) Plan m etr o . U tiliz a r planmet ros para m ed ir r e a s no ofrece ventaja alguna a p r e c ia b l e s o b r e los mtodos an t e rio re s . E l pro ceso es lento, depende mucho de la habilidad p ers o n al y su p recis i n excede a la del mtodo de la triangulacin. Con picos a s im tric o s se e x p e ri m e n ta una l i g e r a ventaja so b re otros mtodos manuales , y si el propsito es obtener m e j o r e s datos conviene hac er v a r ia s mediciones. f) Integra dore s de diaco. ste es quizs elm to do ms convenien te de m e d ir r e a s ; el in te g r a d o r tr a n s fo rm a la seal que re cibe el r e g i s t ra d o r en una s e r i e de tr azos en el papel que se pueden re la c io n ar con las r e a s de los picos. L a p recis i n es muy buena, y slo ofrece cierta dificultad en cas o s de picos no resueltos por completo o que p r e senten una desvia cin de la lnea base. L a p recis i n del in tegrador depende en cierto grado de la precisin del re g is t r a d o r , y su costo no es muy elevado si se consider a la utili dad que pre sta .

g) Integradores electrnicos. Los mtodos de integracin e le c t r nica proporcionan datos de una preci si n en muchas ocasiones superi or a la del m is m o crom atgrafo. L a seial que recib e el re g is tr a d o r es t r a n s forma da directamente en unidades relacionadas con el r ea y la concen tracin. P o r d e s g ra c ia el costo suele ser igual o muy superior al de un crom at gra fo de mediana calidad, sin em bargo, si el nmero de m u e s tr as a tratar es elevado, se justifica la inversin econmica. Ta m bin se emplean sistemas de computacin; muchos de estos in s trumentos proporcionan o son capaces de presentar directamente r e s u l tados y datos completos del an lisis, tales como tiempos de retencin, r e a s , factores de co rr eccin, porcentajes de com posicin, etc. La cuarta etapa en el an lisis cuantitativo es el clculo de la co m posicin de la m uestra que se lleva a cabo por los siguientes mtodos: a) bt el N orm aliz a ci n de las reas C alibracin externa Uso de un patrn interno.

Normaliz aci n. E ste mtodo puede a p lic a r se con o sin factores de corr ecci n, dependiendo de la p re cisi n requerida y de la mue stra. En esencia, relaciona las r e a s obtenidas con elpo rcen taje de composicin de la m ezcla, como se indica en la figura 19.

% A1~ ? ----- ------------ 100 1 Ar ea T o t a l

Esta tcnica requiere que todos los componentes de la m ez cla sean eluidos y que la respuesta del detector sea igual para todos ello s, con dicin sta que por lo comn no se cumple y que da lugar a que la n o r malizacin de r e a s lleve implcito el uso de factores de c o rrecci n o de respuesta, como tambin se llaman. L a resp uesta de d iv er so s c o m puestos puede v a r ia r de acuerdo con el detector empleado; por esto, para l o g r a r m e jo re s resultados, es n e c e s a rio obtener los fac tores de respuesta de los div ersos compuestos que constituyen la m ez cla.

Los facto re s de re spuesta, re la tiv os a un cierto compuesto ele r e feren ci a, se calculan por medio de Ja formula

donde < 4 . y x son las r e a s obtenidas para el compuesto de r e fe rencia y el compuesto pro b le m a, respectivam ente; W r y Wx son las concentracio nes de cada uno de ello s, y f r es el factor de re spuesta asignado a 1c o m puesto de re fere n cia . De ah que la frm ula

proporcione el resultad o del an li sis . C a lib ra c i n externa. Consiste en c o m p a ra r el r e a co rrespo nd ie n te a cantidades conocidas de la sustancia p ro b le m a con el r e a obtenida para la m is m a sustancia en la mezcla y cuya concentracin se. desea determ in ar. Se pro cede inyectando en el c r o m a t gra fo cantidades e x a c tas (?! y 0 3) del compuesto p ro ble m a y se obtienen las r e a s de los p i cos ( f 1 y r'2) corr espondie nte s o cada una de las cantidades inyectadas. A p artir de estos datos se hace un g r fic o de calibr acin, en que se representa la concentracin en funcin del r e a del pico; a continuacin se inyecta un cierto volumen de la m u e stra de composicin d esco no ci da, re lacionando el r e a {x) obtenida para el compuesto objeto del a n lis is con el gr fic o de calib racin, como se indica en la figura 0.

rea a

%
Fig. 20. Mtodo de calibracin externa. (Reproducida de "Basic Liquid Chromatography por Nina Hadden y F. Bauman, fig. 8-14, pSg. 0-15, 1972. Cortesia de Varan Associates, Palo Alto, California.)

C la r o est que este mtodo es muy sensib le a e r r o r e s en la inyeccin de los patrones y de la m u e s t ra proble ma. Pa trn interno. E s t e mtodo es menos suscepti ble a e r r o r e s t c nicos y co mpensa, en algunos c aso s, e r r o r e s producidos durante la p re p a ra c i n de la m u e s t ra . Consiste en c o m p a r a r la rela ci n entre r e a s obtenidas del compuesto p ro ble m a y del patrn interno con d i v e r sas concentraciones del compuesto p ro ble m a, como se o b s e r v a en la fig u r a Z\ . A la m e z c la p ro b le m a se le a g r e g a una cantidad conocida de una sustancia que s ir v e de patrn interno y se d eterm in a la re lac i n de las r e a s (m uestra /patr n). Se efecta a s l a l e c t u r a de la composicin de la m uestra en el g rfic o de calib racin , puesto que se conoce la can tidad de m u e st ra patrn.

%
Fig. 21. Mtodo de patrn interno. (Reproducida de ' Basic Liquid Chromatoflraphyn por Mina Hadden y F. Bauman, fig. 8-13, pg. 9-1U, 1972. Cortesa de Varan Associates, Palo Alto, California.) La sustancia utilizada como patrn interno debe s e r s i m i l a r al c o m puesto ana lizad o, e s ta r pre sente en concentraciones s i m i l a r e s , tener un tiempo de retencin cercano al del compuesto p ro b le m a pero sin i n t e r f e r i r con l, s e r inerte y no f o r m a r parte de la muestra . E l mtodo del patrn interno no r e q u ie r e inyectar volmenes de m u e st ra con mucha p recisi n; ad em s muchos otros e r r o r e s , com o por ejem plo, re cupera ci n de la m u e stra y v ar iacio n es in stru m enta le s, se ven compensados porque tanto el compuesto p r o b le m a como ci patrn interno se an ali zan en las m is m a s condiciones.

P o r ultimo, en el caso que se desee, se puede llevar a efecto un anlisis estadstico de los datos obtenidos para determinar el lmite de su confiabilidad.

45

APLICA C IO NE S

A pesar de que la cr om ato gra fa liquida de alta presin es una t c nica relativamente nueva, se cuenta ya con numerosas publicaciones en la literatura qumica que describen muy d iv er sa s aplicaciones. En la mayorfa de los ca sos, stas consisten en determinaciones de sustancias cuyo anlisis por otra tcnica crom ato gr fica resulta muy difcil o i m posible. E s tas sustancias comprenden: a) Compuestos inicos, como aminocidos, sales inorgnicas, cidos org nico s, etc.

b) Compuestos de alto peso m o le c u la r, como p o l m e ro s , hidrocarb uro s polinucleares, productos naturales, etc. c) Compuestos term olbiles y no voltiles, como vitaminas, p es tic i das, es te ro id es, plastificantes, drogas y un nmero muy grande de otros productos farmacuticos.

Vamos a r e fe rirn o s tan slo a unos pocos ejemplos, que esperam os den una idea de la potencialidad de esta tcnica analtica. En lo que atae a los p roblem as relacionados con la contaminacin ambiental, la cr om ato grafa lquida de alta presin se utiliza para la determinacin de algunos pesticidas (insecticidas, larvicid as, h e r b i c i das, etc. ) cuya determinacin tambin es posible (no en el caso de algunos) por medio de la cr om ato gra fa de ga ses. L a figura 22 muestra la

Fig. 22. Anlisis de insecticidas, a) DDT; b) trithion; c) metoxiclor; d) paration; e) metil-paration. (Reproducida de "Basic Liquid Chroma tography" por Nina Hadden y F. Bauman, pg. 9-27, 1972. Cortesa de Varan Associates, Palo Alto, California.)

determinacin de cinco insecticidas mediante l a c r o m a to gra fa lquido lquido. P o r otra parte, tambin es posible la determinacin de h i d r o carburos arom ticos polinucleares (F ig . 23), que son contaminantes atmosfricos muy importantes; este mismo anlisis por medio de c r o matografa de gases requie re condiciones extrem as de temperatura.

C ondiciones
C o lu m n a . P o ro *a p h a s e OD F a s e m v il: p r o g r a m a d a d e s d e
2 1.1 % C tfa C H / H a O h a s ta

ino% CHaOH a 2i/min

T e m p e ra tu ra 50" G
P re s i n : a tm F l u j o : 1 m l/ n r m D e t e c t o r t u lt r a v io le t a T ie m p o . m in u to s

Fit;. 23. Separacin de hidrocarburos aromticos polinucleares, a) Benzeno; b) naftaleno; c) bifenilo; d) fenantreno; e) antraceno; f) fluoranteno; g) pireno; h) desconocido; i) criseno; j) desconocido; k) benzo (e) pireno; 1) benzo (a) pireno. (Procedencia: J.A. Schmidt y R,A. Henry, J .C h r o m a to g . S c i .> 9, 649 , 1971. Derechos reservados 1971 por Preston Technical Abstracts Co.) E l an lisis de vitaminas por crom a to gra fa de g as es es muy difcil y re qu iere, por lo genera l, la formacin de algn compuesto voltil de el la s. En contraste, en cromato gr a fa lquida, como indica i a f ig u r a 2 4 , el anlisis de cuatro compuestos vitammicos es posible en un corto tiempo. Un campo de investigacin en el que con frecuencia se plantea el proble m a de anali zar compuestos no voltiles y de alto peso molecular es el bioqumico. Se han efectuado determinaciones de constituyentes de cido nucleicos (nucletidos, n u cle s do s ), y a m anera de ejem plo, se ilustra en la figura 25 la determinacin de las cuatro b a s e s n itro ge nadas de los cido s nucleicos por medio de la crom a to gra fa de in ter cam bio inico. En el campo bioqumico cabe mencionar ad em s la determinacin de asteroides, que s iem p re h ap res en tad o dificultad para efe ctuarse por medio de ia cr om ato gra fa de gases debido a la descomposicin, a d s o r cin ir r e v e r s i b l e , etc. El p ro ble m a observ ado cuando se emplea la

Fig. 2*i. Anlisis de compuestos vitamnicos, a) Acetato de vitamina A; b) vitamina E; c) vitamina D; e) vitamina A. (Procedencia: Liquid Chromatography Application Ho. 1. Cor tesa de Chromatrouix Incorporated.)
C o n d ic io n e s

Fig. 25. Separacin de bases nitrogenadas de cidos nucleicos, a) Uracilo; b) guanina; c) citosina; d) adenina. (Procedenciar J.J. Kirkland, J . C h r c m a t o g . S a i , , 8, 73, 1970. Derechos reser vados 1970 por Preston Technical Abstracts Co.)

cr o m a t ografa Ifquidaha 3 d o el d e deteccin, ya que slo e l detector de luz ultravioleta e s lo bastante sensible para po n e r de manifiesto estos c o m p u e s t o s a bajas concentraciones; l amentablemente, n o todos los esteroides a b s o r b e n e n la regin ultravioleta. Esto ha dado lugar a la f o r m a c i n d e c o m p u e s t o s derivados de los esferoides que a b s o r b a n en el ultravioleta (2, 4 dinitro-fenilhidrazonas) a fin de hacer posible el a n lisis .

C ondicl.ones I m * 2, I mrn 1$. IIC P o b re 7 .PAX F a s e m v il: hopean F r e a i h : 4 1 atm F lu jo* m l/ m in T e m p e r a tu r a : arribient D e te c to r: u ltr a v io le ta T ie m p o : en m inutos C olu m na:

0 1S Fig. 26. Anlisis de esteroides libros, a) Progesterona; b) testosterona; c> 1 9-nortestosterona; d) 11-cetoprogcsterona. (Procedencia: J.A. Schmidt y R.A. Henry, J . C h r o m a t o g . S o i . 3 9, S17, 1971. Derechos reservados 1971 por Preston Technical Abstracts Co.)

Fig. 27. Separacin de esteroides como 2,M dinitro-fenilhidrazonas. a) Dehidroepiandrosterona; b) androstcrona. (Procedencia: J.A. Schmidt y R.A. Henry, J . C h r o tn a t o g . S c i . , 9, 516, 1971. Derechos reservados 1 9 7 1 por Pres ton Technical Abstracts Co.)

L a s figu ras 26 y 27 muestran la determinacin de este ro id es libre s y en forma de hidrazonas. Ntese que los este ro id es no contienen g r u pos c rom fo ros que ab so rb an en el ultravioleta y que los d eri vados casi no son detectados por un detector de re sp uesta univer sa l, como el n dice de re frac ci n a bajas concentraciones.

Fig. 28. Separacin de los componentes de una tableta analgsica, a) Cafena; b) aceto p-amino fenol; c) as pirina; d) salicilamida. (Procedencia: R.A. Henry y J. A. Schmidt, Chromatographia, 3, 116-120, 1970.) E l a n li sis de medicamentos es tambin una aplicacin muy in t e r e sante. L a figura 28 ilustra la determinacin de ios componentes a c t i vos de una tableta ana lgsica. De modo sim ila r se han efectuado an lisis de barb it u rico s, anticonceptivos, etc. Cuando el compuesto que se desea analizar es de muy alto peso m o lecu lar, el mtodo a seguir es la crom a to gra fa de perm eaci n o de e x clusin. E s posible tambin combinar dos o mas tcnicas c r o m a to gr fica s para efectuar s eparacio nes difciles. A s , por ejemplo, se puede e f e c tuar p rim e ro una separac in, de acuerdo con el peso m o le cular de los constituyentes de la m ezcla , y despus, en cada una de las fracciones obtenidas, una separa ci n lquido-liquido o lq uido -s lid o para obte ner compuestos puros. L a crom a to gra fa de perm ea cin ha encontrado aplicaciones muy tiles en el estudio de p o l m e r o s , facil itndola determinacin de la d i s tribucin de pesos m o le cu lare s, y en la investigacin de productos n a

turales para efectuar separaciones de acuerdo con el peso molecular. U n caso de determinacin de pesos moleculares en polmeros seobserva en la figura 29, donde se muestra el anlisi6de muestras de poliestireno. Condiciones

Fis?. 29. Separacin de una muestra de poliestireno . a ) Fraccin peso molecular 1 800 000; h) fraccin peso molecular 91 800; c ) fraccin peso molecular US00. (Reproducida de 'Basic Liquid Chromatography" por Nina Hadden y F. Bauman> f i g . 5-12, pg. 5-51, 1972. Cortesa de Varan Associates, Palo Alto, C a lifo rn ia .)

P o r ultimo, mencionaremos un tipo interesante de separacin^ l l a mado separacin de acuerdo con el tipo qumico. Su finalidad no es la separacin de compuestos individuales, sino de grupos diferentes de sustancias presentes en la mezcla. T al es el caso mostrado en l a f i gura 30, en que se han separad o los d iv ersos grupos constituyentes de una gasolina de alto octanaje^ a saber hid r o c arb u ro s saturados, h i d ro carb u ro s monoaromaticos e hidroc arb u ro s d ia r o m tic o s .

E s de esperar que con los ejemplos ofrecidos acerca de la utilidad de esta tcnica el lector se sienta motivado a aplicarla en problemas de su inters

Condiciones
75 c m ^ 2 ,4 m m 1 0 < 3 > C a rb ow ax 600 s o b re " B io s il" A A F a s e m v il: 2, 2, 4 t r im e t il pentano P r e s i n : 4b atm Flu jo* 50 m l/ h o ra D e te c to r; n d ic e de r e fr a c c i n T ie m p o : en m inutos Colum na:

0 6 Fig. 30. Separacin de diferentes tipos de hidrocarburos en una mues tra de gasolina, a) Hidrocarburos saturados; b) hidrocarburos monoaromticos; c) hidrocarburos daromticos. (Reproducida de ' Application tips" por Robert Stevenson, No. 58, abril 1970. Cortesa de Varan Associates, Palo Alto, California.)

A P N D IC E P r o v e e d o r e s C o m e r c i a le s de Equipos y A c c e s o r i o s p a ra C r o m a to g r a fa Lquida A pp lie d Science L a b s . , Inc. P . O. Box 440 State C o lle g e , Pa . 16801 (814) 238-2406 B io -R a d L a b o r a t o r ie s 3 2nd and G riffi n Avenue Richmond, C a lif. 94804 (415) 234-4130 C h ro m atro n ix Incorporated 2 743 Ninth Street B erk eley , Calif. 94710 (415) 841-7221 E . I . du Pont de N e m o u r s & Co. , Inc. 1007 M ark et Street Wilmington, Del. 19898 (02) 774-2421 H ew 1 ett - Pa c ka r d A vond ale Division Route 41 Avondale , P a . 19311 (215) 268-2281 P e r k i n - E l m e r C orp. ( N e a te r Fau st) 702- G Main A venue N o r w a lk , Conn. 06 852 (203) 762-1000 7 Ph il ip s E lectron ic Instruments 750 S, Fulton Avenue Mount Vernon , N. Y. 10550 (914) 664-4500 P h a r m a c ia Fine C h e m ic a ls , Inc. 800 Centennial Avenue P is cata w ay , N. J. 08854 (201) 469-1222 R eeve A n g e l & Co. , Inc. (B rid ew ell Place) Clifton, N . J . 07014 (201) 777-4825 SupeLco, Inc. Supelco P a r k Bellefonte , Pa . (814) 359-2732

8.

9.

10.

16823

11.

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12.

BIB LIO G R AFA R E C O M E N D A D A (1) HADDEN, N. y c o l a b o r a d o r e s . B a s ic Liquid Chromatography, V a r i a n A e r o g r a p h , Walnut Cre ek, C alif. , 260 pags. (1972)

(2| K I R K L A N D , J'. J. (edit or). M odern P r a c t ic e of Liquid Chro m atog raphy, W il e y -In t e rs c ie n c e , Nueva Y o rk , N Y , 454 pags. (1971) (3 1 S N Y D E R , L. R. y K I R K L A N D , J. J. Introduction to Liquid Chroma tography, W ile y -I n t e rs c ie n c e , N ueva Yo rk , N Y iinedito) (4) G1DDINGS, J. C. Dynamics of Chromat og raphy , Dekker, Nueva Yc.rk, N Y . , 323 pags. I 1965). SCOTT, R. P. W. Nueva Y o rk , N . Y . Liquid Chromat og raphy , (inedito). W il e y -In t e rs c ie n c e ,

(5)

(6 i P E R R Y , S . G . , A M O S , R. y B R E W E R , P . I. P r a c t ic a l Liquid C h r o mat ography, Plen um P r e s s , Nueva Yo rk , N. Y. , 244 pags. (1972) (7) W A L K E R . J . Q . , JACKSON, J r . , M. T . y M A Y N A R D , J. S. Chro mat ogra phy Systems. Maintenance and Troubleshooting, Acad em ic, Nueva Y o rk , N. Y. , 289 pags i 1972). B R O W N , P . R. High P r e s s u r e Liquid Chromatography: Biochemical and B io m edic al A pplications, A cad em ic , Nueva Yo rk , N Y. (1972)

(8)

Nota.

Se reco miend a al in vestig ador consultar citadas en las re fe r e n c ia s 1-3.

en es p ecia l las

obras

C O L E C C I O N DE M O N O G R A F I A S C I E N T I F I C A S Publicadas Serie de matemtica N I. La Revolucionen las Matemticas E s c o la r e s , por el Consejo Nacional de M aestr os de Matemticas de los Estados Unidos de A m rica. Espacios Vectoria les y Geom etr a Analtica, por Luis A. Santal. Estructuras A lg e b r a i c a s , por Enzo R. Gentile. H is to ria de las Ideas Modernas en la Matemtica, por Jos Babini. A lg ebra Lineal, por Orlando V illa m a y o r . A lg ebra L in ea r e Geo m etra Euclidiana, p or Alexandre Augusto Martins Rodrigues. E l Concepto de Nm er o, por C s a r A. Tre jo . Funciones de V a ri a b le Compleja, por Jos I. Nieto. Introduccin a la Topologa Genera ), por Juan Horvth. Fun^Ses Reais, por D jairo G. de Figueiredo. Probabilid ad e Inferencia Estadstica, por Luis A. Santal. Estructuras A lg e b r a i c a s , II, por Enzo R. Gentile. La Revolucinen las Matemticas E s c o la r e s (Segunda Fasel, por Howard F. Fehr, John Camp y H oward Kel lo gg. E structu ra s A lg ebraicas , III, (Gru pos Finitos), por Horaci o O 'B r ie n .

N N* N N* N* K" N* N* Na N" N' N

2. 3. 4. 5. 6. 7. ti. 9. JO. 11 12. 13.

N 14. ie de fi N N N* NN* N" N" N N 1 2.

3. 4. 5. 6, 7. 6. 9.

Concepto Moderno del Ncleo, p or D. Alian Bro m ley. P a no ram a de la Astronom a Moderna, por F lix Cernuschi y Sayd Codma. La Estructura Electrnica de los Slidos, por Leopoldo M. Falicov. F sica de Partculas, por Igor Saavedra. Experimento, Razonamiento y Creac in en F sica, por F lix Cernuschi. Semiconductores, por George. Bemski, A c e le ra d o re s de P a rtc u la s , por Fernand o A lb a Andradc. Fsica Cuntica, por Onofre Rojo y H. Mclntosh. La Radiacin C sm ica, por Gastn R. M e j a y C arlo s A gu irr e .

ie de qi N N" N* N N* N N" N N* l 2. 3. 4. 5.

7. K. 9.

Cintica Qumica Elemental, por Harold Behrens L e Bas. Bioenergtica, por Isaas Raw y W alt er Cotli. M acro m o lculas, p or A le ja n dro Paladini y M. Burachik. M ecanism od e las Reacciones Org nicas, por Jorge A . R rieux. Elementos Encadenados, por Jacobo Gm ez L a r a . Enseanza de la Qumica E xperimental, por F ran cisc o Gi ral. Fotoqumica de G a s e s , por R a l f- D ie t e r Pcnzhorn. Introduccin a la Geoqumica, por Flix G o nzle z-B o no rio. Resonancia Magntica N uclear de Hidrgen o, por Pe dr o Joseph-Nathan.

N 10.

C ro m ato gr afa Liquida de A lt a M c N a i r y Benjamn E s q u ivel H.

P r e s i n ,

por

Harold

M.

Se rie de biologa La Gentica y la Revolucin en las Ciencias Bio lgic as, por Jos Luis Reissig. N 2. B a s e s E co l gicas de la Explotacin Agro p ecu aria en la A m e rica Latina, p o r G u ille r m o Mann F. N" 3. L a Taxonom a y la Revolucin en ias Ciencias Biolgicas , por E l a s R. de la Sota. N 4. Pr in c ip io s B s ico s para la Enseanza de la Biologa, por Osw aldo F r o t a - P e s s o a , N ' 5. A V id a da Clula, por Renato B asil e. N 6. M ic r o o r g a n ism o s , por J . M . G u t i r r e z -V z q u e z . N" 7. Pr in c ip io s G en erales de M icrobio lo ga, por Norb erto T . P a lle ro n i. N" 8. Los V i r u s , por Enriqueta P i z a r r o - S u r e z y Gamba . N ' 9. Introduccin a la Eco lo g a del Bentos M arin o, por Manuel Vegas V lez. N 10. Bio sn tesis de Pr ote nas y el Cdigo Gentico, por Jorge E. Allende. N" I I . Fundamentos de Inmunologa e Inmunoqumica, p or Flix Crdoba A lv a y Serg io E s t r a d a - P a r r a . N 12. B acterifagos, p or Rom ilio E spejo T. En prepara ci n Serie de matemtica Es tru ctu ras A lg e b r a i c a s , IV, (T e o r a de Cuerpos!, por D a r o J. Picco. E s tru ctu ras A lg e b r a i c a s , V , (E st ru ctu ra de A lg e b r a s ) , por Artibano Micali. Serie de fsica Introduij&o & C r is t a lo g r a fa , por Ivonne M ascare nhas. A s t r o f s ic a , por C a r l o s Jaschek y M erc e d e s C. Jaschek. Ondas, p or Enrique G av i la y O s c a r B r e s s a n . E l L s e r , por M a r i o G a r a v a g lia . Clculo de E r r o r e s , Aplic aci n y T e o r a , por Wolfgang Meckbach. O cea no grafa F s i c a , por L uis E. H e r r e r a . Serie de qumica Productos N atu rales V egetales, por Venancio Deulofeu y c o l a b o r a dores. E s ter eo q u m ica Org nica, por Juan A . G arbari no. C ro m ato gr afa en P a pel y en Capa Delgada, p or X o rg e A. Domnguez. Momento P o la r, por P e d r o Lehman. Actividad Optica, D i s p e r s i n Rotatoria ptica y D icro s m o C irc u la r en Qumica Org nica, por P i e r r e Cra bb. Modernos Aspec to s de la C orro s i n , por T. M ark ovic y E . G . Len Lpez. N I.

r a fia , por Alejandro J. Arva. Espec "o s c o p ia In fr arro ja , por Jess M orcillo Rubio. Fotometra de Lla m a por Emisin y por Abs orcin Atmica, poj Juan Ram re z MuTioz. Cromatografa de Gas es , por Harold M. M c N a ir y Benjami Esquive! H. I n t r o d u j o i Espectrometra de M a s sa das Substancias Organicas por Ctto R, Gottlieb, Los Esteroide s, por Josef E. H erz. Tcrmoqumica Moderna, por Jaime Cases. Serie de biologa Biogeografa de A m ri ca Latina, por Angel L. C ab rera y Abrahari Willink. Fermentaciones, por Carlos del Ro E. Tra nsfere ncia de Mater ial Gentico, por Manuel Rieber. Relacin Husped - Par sit o, por Manuel Rodrguez Leiva. Procesos Microbianos A ero bios de Importancia Industrial, po Carlos Casas - Campillo. Micologa, por Marga rita Silva-Hutner y W illiam G. M erz. Microbiologa de Suelos por Luis Longeri Spada. Biologa de Antibitioos, por Itala Suassuna.

Nota.

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