Comunicado 85 Tcnico

ISSN 1414.9850 Maro, 2013

Foto: Iriani Rodrigues Maldonade

Protocolo para determinao de acares totais em hortalias pelo mtodo de DNS

Iriani R. Maldonade1 Patrcia G. B. Carvalho2 Nathalie A. Ferreira3

Os carboidratos, juntamente com as protenas e lipdeos, so os constituintes principais dos organismos vivos e so classificados em mono, oligo e polissacardeos alm de serem fonte abundante de energia. Os monossacardeos so compostos que no podem ser hidrolisados a compostos mais simples como, por exemplo, a glicose (aldose) e frutose (cetose).Os oligossacardeos e os polissacardeos so formados por molculas de monossacardeos unidas por ligaes hemiacetlicas. Os testes de acares so baseados em reaes de xido reduo pelo grupo hidroxlico hemiacetlico do monossacardeo, que pode reagir com ons e formar complexos coloridos (BOBBIO e BOBBIO, 2005) ou por reaes coloridas provenientes da condensao de produtos de degradao dos acares em cidos fortes com vrios compostos orgnicos como fenol e antrona. Os monossacardeos so acares redutores. O teste de DNS (cido dinitrosaliclico) baseia-se na reao entre o acar redutor e o cido 3,5-dinitrosaliclico (cor amarelo), que reduzido a um composto colorido avermelhado, o cido 3-amino5-nitrosaliclico, oxidando o monossacardeo redutor (Figura 1).

Figura 1. Esquema das reaes envolvidas no mtodo DNS.

Pesquisadora, Dra. Embrapa Hortalias iriani.maldonade@embrapa.br Pesquisadora, Dra. Embrapa Sede DPD patricia.carvalho@embrapa.br 3 Tecnloga em Alimentos, MSc., Embrapa Hortalias, Universidade de Braslia (UnB) nathaliealfe@gmail.com
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Figura: Yolanda Boza

Protocolo para determinao de acares totais em hortalias pelo mtodo de DNS

Neste trabalho, so relatadas as informaes necessrias para a determinao de acares redutores totais em hortalias pelo mtodo de DNS com base em modificaes e adaptaes realizadas no laboratrio de Cincia e Tecnologia de Alimentos da Embrapa Hortalias.

Agitar e armazenar a soluo em frasco mbar em refrigerador, por no mximo 30 dias. Soluo de tartarato duplo de sdio e potssio Pesar 15,1 g de tartarato duplo de sdio e potssio tetrahidratado (KNaC4H4O6 . 4 H2O) e dissolver em um litro de gua destilada. Armazenar a soluo em frasco mbar em temperatura ambiente at 30 dias. Soluo de NaOH 2N Pesar 40 g de hidrxido de sdio anidro, diluir em gua destilada e ajustar o volume para 500 mL, em balo volumtrico. Soluo de HCl 2N Medir 85 mL de cido clordrico (HCl) em uma capela, diluir em gua destilada e ajustar volume para 500 mL, em balo volumtrico.

Materiais Necessrios
Reagentes Glicose P.A. cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) Metabissulfito de sdio Hidrxido de sdio (NaOH 2N) Fenol cido clordrico (HCl 2N) Tartarato duplo de sdio e potssio tetrahidratado (KNaC4H4O6.4H2O) Equipamentos e Vidrarias Balana analtica Banho termosttico com circulao de gua Agitador de tubos de ensaio Pipetas graduadas (1 mL, 10 mL e 20 mL) Tubos de ensaio de 16 mL Balo volumtrico de 100 mL Bqueres diversos Frascos mbar Cronmetro digital Espectrofotmetro Cubetas de vidro

Curva padro de acar redutor

Fazer diluies da soluo padro de 1,0 g/L de glicose ou frutose com gua destilada em tubos de ensaio, conforme demonstrado na Tabela 1. Agitar os tubos para homogeneizao, retirar uma alquota de 1,0 mL e fazer o teste de DNS.

Tabela 1. Preparao das diluies da soluo padro de glicose ou frutose a 1,0 g/L. Concentrao de Volume de glicose ou soluo padro frutose (g/L) de glicose (mL) Volume de gua destilada (mL)

Preparo de Solues
Soluo padro de glicose ou frutose a 1,0 g/L Pesar em balana analtica 0,1000 g de glicose ou frutose, em seguida dissolver em aproximadamente 20 mL de gua destilada sob agitao constante, transferir analiticamente para um balo volumtrico de 100 mL, completar o volume com gua destilada e homogeneizar vigorosamente. Esta soluo deve ser preparada e utilizada no dia da anlise. Reagente DNS Para o preparo do reagente DNS, inicialmente pesar 10,6 g de cido 3,5 dinitrossaliclico e 19,8 g de NaOH e dissolver em 1416 mL de gua destilada. Em seguida adicionar 7,6 mL de fenol (fundido 50 C) e 8,3 g de metabissulfito de sdio.

0,10 1,0 9,0 0,20 2,0 8,0 0,30 3,0 7,0 0,40 4,0 6,0 0,50 5,0 5,0 0,60 6,0 4,0 0,70 7,0 3,0 0,80 8,0 2,0 0,90 9,0 1,0 1,00 10,0 0,0
Fonte: Laboratrio de Cincia e Tecnologia de Alimentos da Embrapa Hortalias

Protocolo para determinao de acares totais em hortalias pelo mtodo de DNS

Determinao da curva-padro Plotar, em planilha ou calculadora cientfica, a concentrao de glicose (g/L) no eixo Y e a absorbncia (ABS) obtida com o teste de DNS no eixo X, conforme exemplo mostrado na Figura 2, e calcular a equao da reta.

aquecer em banho maria a 100C (em ebulio) por 5 minutos. Resfriar o tubo em banho de gelo por 5minutos. Adicionar 16 mL da soluo de tartarato duplo de sdio e potssio. Fazer a leitura da absorbncia em espectrofotmetro a 540 nm, aps zerar o aparelho com o branco. O branco consiste em substituir o volume de amostra ou soluo de glicose por gua destilada (1,0 mL) e realizar o teste de DNS. OBS. A amostra deve ser diluda convenientemente de maneira que a sua concentrao seja, no mximo, 1,0 g/L.

AR(g.L-1)

Clculo
A partir da equao da reta, calcular a concentrao de acar redutor na amostra. Deve-se considerar nos clculos as diluies efetuadas na amostra, multiplicando o resultado por esse fator. Exemplo: Em 10 g de batata-doce homogeneizada e diluda para 50 mL com gua destilada, temos: ABS (absorbncia) = 0,780 Concentrao final da soluo = 1,3894 * 0,78 + 0,0762 = 1,16 g/L Concentrao final em Base mida = (1,16 g * 50 mL)/1000 mL = 0,0058 g AR/g batata ou 0,58% (p/p).

Figura 2. Exemplo de curva padro de acar redutor (AR) em g/L. Equao da reta: Concentrao AR(g/L) = 1,3894 * ABS + 0,0762 (R = 0,9965).

Preparo da amostra
Pesar 100 g da hortalia e homogeneizar em mixer ou liquidificador por 3 minutos. Retirar uma alquota de 10 g e adicionar gua destilada at completar 50 ou 100 mL, em balo volumtrico. O volume final depender da concentrao de acares presente na amostra, portanto o volume final poder variar de acordo com o tipo da hortalia. A concentrao final de acares redutores da amostra deve ficar entre 0,1 e 1,0 g/L, conforme a curva de calibrao. A amostra diluda dever ser centrifugada a 15.000 rpm por 15 minutos. Retirar 1,0 mL do sobrenadante e fazer o teste de DNS. Caso a amostra contenha acares no-redutores como a sacarose, necessrio fazer hidrlise da amostra. Neste caso, retirar 2,0 mL do sobrenadante e adicionar 2,0 mL de HCl 2N e aquecer em banho maria em ebulio por 10 minutos. Resfriar a amostra em banho de gelo e acrescentar 2,0 mL de NaOH 2N e agitar. Retirar 1,0 mL do sobrenadante e fazer o teste de DNS.

Referncias
BOBBIO, F. O.; BOBBIO, P. A. Qumica de Alimentos. So Paulo: Varela, 2005. CECCHI, H. M. Fundamentos tericos e prticos em anlise de alimentos. 2.ed. Campinas: Unicamp, 2003. p. 73. MALDONADE, I. R.; RODRIGUEZ-AMAYA, D.; SCAMPARINI, A. R. P. Carotenoids yeasts isolated from the Brazilian ecosystem. Food Chemistry, London, v. 107, n. 1, p. 145-150, Mar. 2008. MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, Washington, US, v. 31, n. 3, p. 426428, Mar. 1959.

Teste de DNS: procedimento de determinao de acares redutores

Pipetar 1,0 mL da amostra em um tubo de ensaio e adicionar 1,0 mL do reagente DNS. Agitar e

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