Microbiologa General

Aislamiento e identificacin de Microorganismos

Para qu aislar microorganismos? Para qu identificar un microorganismo ?

Caracterizacin vs. Identificacin

1. Pruebas bioqumicas 2. Pruebas Moleculares

Identificacin presuntiva Identificacin final

Aislamiento e identificacin de microorganismos

Procedencia Caractersticas Expectativas Tratamiento inicial Siembra Aislamiento Identificacin

Mtodos convencionales Mtodos moleculares

Tratamiento inicial

Enriquecimiento (selectivo o no) Calentamiento Filtracin Homogeneizacin, etc

Siembra

Seleccin de medios de cultivo Inculo Observacin microscpica

Aislamiento

Agotamiento por estras, diluciones seriadas, etc

Subcultivo

Macroscpicos

Criterios de pureza Microscpicos

Cultivo puro

Identificacin

Muestras

Agua

Microorganismos indicadores Coliformes P. aeruginosa

Alimentos

Deteccin de B. cereus en leche en polvo,miel, arroz Deteccin de S. aureus en alimentos procesados y leche cruda Aislamiento de Lactobacillus spp de productos fermentados

Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo

Seleccin de esporas Calentamiento Enriquecimiento Agotamiento por estras Mossel Colonias aisladas (Man (-), Lecitinasa (+)) Repique Tinciones Cultivo puro

Morfologa de las colonias

Forma y tamao de las colonias: Irregular, puntiforme Bordes: liso, rugoso. Elevacin: Convexo, elevado, umbonado, liso. Color: pigmento, opaca, translucida, brillante. Textura: Mojada, mucosa, seca.

Bacillus subtilis

Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae

Forma de la colonia y tamao: irregular Bordes: ondulado Elevacin: umbonada Color: Blanca crema Textura : seca

Tpico aspecto sobre la caja de petri

Pruebas bioqumicas para la identificacin de Bacterias

Exoenzimas y Endoezimas

I M Vi C* Indol Rojo de Metilo Vohes Proskauer Citrato

Identificacin de bacilos entricos Bacilos cortos, Gram negativos, no formadores de esporas y fermentadores de glucosa.
Miembros Patgenos: Salmonella y Shigella Patgenos ocasionales: Proteus y Klebsiella Flora normal: Escherichia y Enterobacter

Test de produccin de Indol

Determina la capacidad de un microorganismo de degradar triptfano

Triptofanasa Triptofano Indol + Acido Piruvico + amoniaco

Butanol Indol + p-dimetilaminobenzaldehido Halo rojizo en la superficie del tubo

HCl
Reactivo Kovac

E.coli

El triptofano se adiciona al medio en una Concentracin 1%. Es una peptona derivada de la casena.
Se adicionan 10 a 12 gotas del reacc. de KOVACS.

positivo

negativo

Accin de la triptofanasa

Rojo de Metilo
Para identificar bacterias que metabolizan glucosa con produccin de altas concentraciones de cidos.
Sirve para diferenciar E.coli de Enterobacter El medio tiene glucosa al 10% y Rojo Fenol

E. coli : estabiliza el pH bajo producto de la acidificacin del medio Enterobacter: Convierte los cidos en productos finales neutros como 2,3 butanediol y acetoina lo que resulta en una elevacin del pH en in valor de 6.

pH 4 vira al rojo (test positivo)

Positive positive negative control.

pH 6 sigue indicando presencia de acido pero a una concentracin insuficiente para producir el viraje

Voges-Proskauer (VP)
Para identificar microorganismos capaces de producir acetoina y 2,3butanediol como resultado de la degradacin de glucosa. Positivo para Enterobacter aerogenes
Barritt's A (alpha-napthol) y Barritt's B (potassium hydroxide) se adicionan al cultivo y se agita ligeramente. Rojo positivo Glucosa + O2 Acetoina + a-naftol piruvato a-acetolactato 40% KOH Complejo rosado (creatina + diactetilo) acetoina 2,3 butanodiol

Etanol Absoluto

Left: uninoculated control Right: negative (copper color)

Left: uninoculated control Right: positive (red color

Left is Barritt's A (alpha-napthol) and right is Barritt's B (KOH--potassium hydroxide).

Citrato
Para determinar la capacidad de un m.o. de utilizar la enzima citrato permeasa para usar como fuente de carbono el citrato nicamente. Simmon's citrate agar: Es un medio definido que contiene citrato de sodio como fuente carbonada. Si el citrato se utiliza se producen compuestos que alcalinizan el medio. El indicador de pH , azul de bromotimol, cambia de verde a pH neutro (6.9) a azul a pH mayores que 7.6.

Citrato permeasa Glucosa + O2 Ac. piruvico + Ac. Oxalacetico + CO2 Exceso de Sodio + CO2 + H2O Na2CO3 (producto alcalino que eleva pH vira de verde a azul)

Enterobacter cloacae: positive Escherichia coli: negative Klebsiella pneumoniae: positive

Catalasa*
Para determinar microorganismos que producen la enzima catalasa. Micrococcaceae como Staphylococcus catalasa positivos, Streptococcaceae, Streptococcus Enterococcus catalasa negativo. H2O2 es producido por bacterias aerobias o facultativas mediante reacciones no enzimticas de reduccin de flavoprotenas o por accin enzimtica de radicales

superxido. H2O2 puede daar las bacterias, la enzima catalasa presente en algunas bacterias lo transforma en agua y oxgeno.
Se adiciona perxido de hidrogeno sobre una gota o ansada de cultivo sobre un porta objeto. Un burbujeo indica la presencia de la enzima.

2H2O2

Catalasa

2H2O+ O2

Oxidasa*
Para identificar bacterias que contengan la enzima citocromo oxidasa (respiracin). Oxidase negativa Enterobacteriacae y Pseudomonadaceae, Neisseria oxidasa positiva.

La enzima citocromo oxidasa cataliza el transporte de electrones de un donor hacia el aceptor final de la respiracin (oxgeno). En este test un donor de electrones artificial (phenylenediamine) se usa para Reducir la citocromo Oxidasa.
Si la enzima esta presente se observar una coloracin purpura. El test se debe leer a los 15 segundos pues el reactivo puede cambiar de color con el paso del tiempo.

oxidasa (+) Pseudomonas oxidasa (-) E. coli Neisseria

Reduccin de nitrato*
Muestra la capacidad de un m.o. de reducir nitrato (NO3) a nitrito (NO2), nitrgeno molecular (N2) o amoniaco, usando la enzima nitrato reductasa.
Nitrato (NO3) puede ser reducido por diferentes compuestos incluso por respiracin anaerobia o por denitrificacin. El medio de cultivo contiene nitrato de potasio como sustrato. Determinacin de Nitrito NO2-: Reactivo GRIESS-ILOSVAY 1. Solucin A: acido sulfanico 2. Solucin B: a-naftilamina

Determinacin de Amonio (NH4+): Reactivo de NESSLER

REACCION POSITIVA: aparicin instantnea de una coloracin rojo cereza Que no se produzca color puede indicar dos cosas: (1) el nitrito no se redujo (2) se redujo a otros compuestos. Para distinguir esta situacin se adiciona Zinc. Si hay nitrato en el medio se va a reducir a nitrito y el medio se tornar rojo mostrando una reaccin negativa. Si al adicionar Zn no sucede nada, se redujo a otros compuestos.

Test del nitrato

Pseudomonas aeruginosa: no hay cambio de color, negativo Escherichia coli: cambio de color a rojo, positivo Corynebacterium xerosis: no hay cambio de color, negativo

Reagent A: Sulfanilic Acid

Reagent B: alpha-naphthylamine

Triple Sugar Iron Agar (TSI)*

Enterobacterias y otros bacilos intestinales Gram negativos

Para diferenciar bacterias basado en su habilidad para fermentar glucosa, lactosa y/o sucrosa. TSI contiene tiosulfato de hierro, sustrato para la produccin de sulfuro de hidrogeno y sulfato ferroso. Rojo fenol. Fermentacin de carbohidratos vira de rojo a naranja a amarillo en presencia de cidos. Se siembra en profundidad con una aguja y luego se estra el pico de flauta.

Azcar

Productos cidos

pH

(Amarillo)

Peptonas

Amoniaco (NH3)

pH

(Rojo)

Fermentacin (medio cido) + Tiosulfato de Sodio

SH2 (gas)

SH2 + iones frricos

Sulfuro ferroso (precipitado negro insoluble)

Agar inclinado alcalino (rojo) y superficie recta acida (amarilla) con o sin produccin de gas (ruptura o no del agar)

nicamente fermenta glucosa

Agar inclinado alcalino (rojo) y superficie recta alcalina (rojo) o sin cambios

No ocurre fermentacin de carbohidratos

Agar inclinado acido (amarillo) y superficie recta acida (amarilla) con y sin produccin de gas (ruptura o no del agar)

Puede ocurrir fermentacin de lactosa o sacarosa o ambos

Test de la Descarboxilasa
Muestra la capacidad de un m.o. para descarboxilar un aminocido. En esta reaccin se remueve el grupo carboxilo (COOH) de un aminocido produciendo amina y dixido de carbono. El indicador de pH (purpura de bromocresol) es adicionado con unas gotas de aceite mineral que crean un ambiente de anaerobiosis para promover la fermentacin. Se necesita un ambiente cido porque la enzima solo funciona en estas condiciones. pH alcalino el indicador cambia a purpura (positivo).

Prueba de fenilalanina-desaminasa Para identificar accin de la enzima phenilalanina-deaminasa. Usado para distinguir Morganella, Providencia, y Proteus (phenilalanina-deaminasa positiva) gneros de otros miembros de Enterobacteriaceae (phenylalanine deaminase negativa). El medio contiene el aminocido fenilalanina. La enzima remueve el grupo (NH2) y libera amonio (NH3). Se obtiene acidofenilpiruvico, que puede ser detectado por la adicin de un agente oxidante (Cloruro Ferrico al 10%). Un cambio de color al verde indica una reaccin positiva.

Negativo

Positivo

Prueba de ureasa
Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea, formando dos molculas de amoniaco por accin de la enzima ureasa Indicador de pH: rojo fenol. Presencia de amoniaco aumenta el pH y vira a rosa oscuro

Urea + 2 H2O

CO2 + H2O + 2 NH3

(NH4) CO3

1. No inoculado 2. Proteus vulgaris: Positivo 3. Escherichia coli: Negativo

Prueba de hidrlisis de caseina

Determinar la capacidad de producir enzimas proteilicas capaces de hidrolizarla casena

Agar leche. Contiene caseina la cual le da el color blanco. Algunas bacterias secretan caseasa, la cual rompe la molcula de casena en pequeos polipentidos los cuales atraviesan la membrana celular. Esta reaccion de hidrlisis, aclara el area alrededor de la colonia.

Bacillus subtilis es positivo para la enzima caseasa.

Prueba de licuefaccin de Gelatina*

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo preoteltico (gelatinasas) que licuan gelatina

Protena + H2O

Polipptidos

Polipptidos + H2O

Aminocidos individuales

Escherichia coli: negativa (gelatina como solido) Pseudomonas aeruginosa: positiva (gelatina degradada)

Prueba de hidrlisis de Almidn

Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidn mediante enzimas del tipo amilasas -amilasa Almidn

H2O

dextrinas + maltosa polisacridos disacrido

glucosa monosacrido

lugol

El almidn en presencia de Iodo imparte coloracin azul indicando ausencia de amilasa (Resultado Negativo) Si el almidon fue hidrolizado, se vera una zona clara alrededor de las colonias (Resultado Positivo)

Fermentacin de carbohidratos (rojo fenol)

Se adiciona un azcar al medio: Lactosa, sacarosa o glucosa Propsito: Se usa para determinar fermentacin de ciertos azcares y produccin de gases. Se usa para identificar bacterias entricas Gram negativas.

Durante el proceso de fermentacin el aceptor final de electrones es una molcula orgnica. Un tubo (Durham) es colocado dentro del medio invertido con el propsito de capturar gases liberados durante la fermentacin. El indicador cambia al amarillo por debajo de pH 6.8 y cambia al rojo por encima de pH 7.4. Si el microorganismo no fermenta el carbohidrato pero usa la peptona se va a acumular amonio, esto elevara el pH.

1- Control sin inocular 2- Amarillo: Utilizacin del azcar, produccin de cido sin gas. 3- Amarillo y produccin de gas. 4- Fermentacin negativa. Oscurecimiento del medio de cultivo producto de utilizacin de peptonas y liberacin de amonio. 5- Negativo

Fermentacin de glucosa orgamismos

1. Control 2. S. aureus 3. P. vulgaris 4. P. aeruginosa 5. E. coli

resultados
Negative Acid Acid, Gas Negative Acid, Gas

Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo

Seleccin de esporas Calentamiento Enriquecimiento Agotamiento por estras Mossel Colonias aisladas (Man (-), Lecitinasa (+)) Repique Tinciones Cultivo puro Identificacin y Caracterizacin Catalasa Fermentacin de azcares Hemlisis Deteccin de genes de virulencia (toxinas-PCR hblA, B, C, D.)