Activacin De Macrfagos

Los macrfagos son clulas fagocticas pertenecientes al sistema inmunitario que participan tanto en la respuesta innata como en la adaptativa. En presencia de M-CSF, su estmulo mitognico especfico, proliferan, mientras que el tratamiento con estmulos activadores como el IFN- o el LPS hace que detengan su proliferacin, se activen y pasen as a ejercer sus funciones especficas. En este contexto, existen dos tipos de citocinas con capacidad de activar al macrfago, las llamadas citocinas de tipo Th1 y las de tipo Th2. Las citocinas de tipo Th1 como el IFN- inducen en los macrfagos un patrn de activacin llamado "clsico" cuya finalidad es provocar una respuesta de tipo proinflamatoria que acabar por eliminar la presencia de agentes patgenos. Por el contrario, las citocinas de tipo Th2 como la IL-4 inducen una activacin "alternativa" en los macrfagos, cuya finalidad es la de llevar a cabo la reparacin y remodelacin tisular tras la respuesta proinflamatoria. En este estudio hemos observado, por primera vez, que la activacin alternativa del macrfago cumple tambin la dicotoma proliferacin/activacin observada bajo estmulos clsicos e inhibe la proliferacin del macrfago en el umbral entre las fases G1 y S del ciclo celular. En este sentido, hemos visto que tanto el IFN- como la IL-4 inducen un alargamiento en el tiempo de la cintica de activacin de la MAPK ERK-1/2, encargada de regular la proliferacin del macrfago en respuesta al M-CSF. Esta MAPK es regulada por la fosfatasa MKP-,1 quien se encarga de defosforilarla. As, en presencia del M-CSF, MKP-1 se induce para regular a ERK-1/2 mientras que el IFN- y la IL-4 bloquean su expresin de forma dependiente de STAT. La inhibicin directa de MKP-1 mediante tecnologa de RNA de interferencia induce tambin un alargamiento de la actividad de ERK1/2 y, en consecuencia, una parada de la proliferacin, corroborando as los resultados obtenidos previamente. Tambin hemos analizado el estado de activacin de los complejos cdk2/cicE, encargados de la progresin del ciclo celular entre las fases G1 y S. Hemos visto que, mientras que el M-CSF induce la expresin de la ciclina E y, en

consecuencia, la activacin del complejo cdk2/cicE, tanto el IFN- como la IL-4 inhiben a ambos, explicando as el mecanismo utilizado por estas citocinas para mantener la parada en G1. Este bloqueo de la actividad cdk2/cicE es llevado a cabo gracias a la accin del inhibidor de cdk p21Waf1. Sin embargo, aunque ambas citocinas inducen la expresin de esta protena, utilizando clulas knockout para p21Waf1 hemos demostrado que slo la parada inducida por la IL-4 es dependiente de esta protena, lo cual sugiere que el IFN- y la IL-4 utilizan vas de sealizacin distintas para ejercer funciones celulares similares. Por otro lado, hemos analizado tambin la implicacin de la va de las MAPK en la activacin alternativa del macrfago. En este aspecto hemos demostrado que, aunque la expresin de los principales genes responsables de dicha activacin es dependiente de STAT6, la accin de JNK1 ejerce un efecto sinrgico sobre su induccin, ya que la inhibicin de esta quinasa resulta en una disminucin de la expresin de dichos genes. El mecanismo mediante el cual JNK1 ejerce esta funcin no est an del todo claro. Sin embargo, los resultados obtenidos mediante ensayos de inmunoprecipitacion de cromatina sugieren que JNK1 podra estar fosforilando a determinados cofactores en las zonas promotoras de algunos genes, colaborando as con la actividad del factor de transcripcin STAT6.

Desarrollo Del Concepto De Activacin Del Macrfago

Los fagocitos mononucleares son producto de un proceso denominado monocitopoyesis que comienza con la generacin de precursores mieloides en la mdula sea, el bazo y el hgado fetal a partir de clulas pluripotenciales estimuladas con interleucina (IL)-3. Los precursores mieloides comunes para el linaje granuloctico y monoctico, al ser estimulados con el factor estimulante de colonias de granulocito-macrfago (GM-CSF) y el factor estimulante de colonias de macrfago (M-CSF) e interactuar con el estroma de los rganos hematopoyticos dan lugar a los promonoblastos y generan la

progenie monocito-macrfago. Los promonoblastos se diferencian a monoblastos y stos a promonocitos que ulteriormente se convierten en monocitos, que abandonan la mdula sea, entran al torrente sanguneo y se dirigen a los diferentes tejidos por el influjo de quimiocinas y factores atrayentes. En los tejidos los monocitos se convierten en macrfagos residentes con un fenotipo determinado por el microambiente tisular, la matriz extracelular (MEC), y los productos de secrecin y molculas de superficie de las clulas vecinas. Esta especializacin contribuye al desarrollo de su heterogeneidad, la cual se ha definido como la propiedad de los macrfagos de expresar amplios rangos de fenotipos morfolgicos y funcionales. La AM fue descrita inicialmente como un estado alterado en el cual se presentaba un incremento en la actividad bactericida de macrfagos esplnicos de ratones inmunizados e infectados con bacterias facultativas intracelulares como Listeria monocytogenes, Brucella abortus y Mycobacterium tuberculosis en comparacin con los macrfagos de ratones no inmunizados. Los macrfagos resistan la infeccin, y aunque este estado fue definido como no especfico, dependa de la generacin de una respuesta inmune adaptativa, en la cual linfocitos sensibilizados, y en presencia de antgenos determinados, producan factores solubles, linfocinas, capaces de modificar la funcin de los fagocitos mononucleares. Con el trmino macrfago activado se pretenda describir los cambios intrnsecos en la resistencia, pero adems los macrfagos esplnicos y hepticos recolectados de animales infectados tenan una apariencia particular, descrita como perfeccionamiento de sus capacidades fagocticas y digestivas. Los macrfagos activados, en contraste con los no activados, se caracterizaban por los cambios de la membrana plasmtica que incluan un aumento en el contenido de colesterol, de fosfodiesterasa alcalina 1y disminucin de la ecto-5nucleotidasa; un incremento en la capacidad de adherirse a sustratos de vidrio y plstico, en la fagocitosis y la pinocitosis, y, por ende, en el nmero de fagolisosomas y vesculas endocticas. Tenan la capacidad de reconocer y destruir clulas singnicas neoplsicas.

Adems, en respuesta a la inflamacin o a la infeccin microbiana in vivo, o a linfocinas in vitro, secretaban altas cantidades de proteinasas neutras(11), que incluan el activador de plasmingeno, elastasa y colagenasa, presentaban un incremento en las actividades de las hidrolasas cidas, y un alto consumo de oxgeno durante la fagocitosis. En un comienzo algunos asumieron que una manifestacin de activacin implcitamente indicaba la presencia de otras, razn por la cual slo se limitaban a hacer la medicin de una de ellas. Con el tiempo, y debido al incremento de la evidencia que mostraba que la expresin de un rasgo no implicaba la presencia de otros, se pens que la activacin ocurra en pasos definidos, y que stos eran determinados por las funciones que los macrfagos deban cumplir. Sin embargo, debido a que la modulacin de las caractersticas monocticas variaba con el sistema experimental usado para describir el fenmeno, se propuso referirse a los macrfagos describiendo los procesos que lo identificaban: activados bactericidamente, tumoricidamente, fagocticamente, metablicamente, haciendo nfasis en la manera como la activacin era inducida, de acuerdo si sta lo era por inflamacin, mediada por clulas T, B o linfocinas in vitro. Las ambigedades que surgieron con el uso de esta estrategia, no permitieron la generacin de un concepto generalizado del macrfago activado asociado a determinadas modificaciones morfolgicas, funcionales, bioqumicas y moleculares, y por lo tanto, el fenmeno de activacin slo poda ser considerado como un cambio en el fenotipo del macrfago. Se consider que el estado de activacin era producto tanto de la historia celular del macrfago, en trminos de su origen, diferenciacin, maduracin y ambiente en el cual se desarrollaba, como de factores inmunolgicos producidos por los linfocitos T estimulados con antgenos o mitgenos, entre ellos los factores activadores del macrfago (MAF) que incluan la interleucina-2 (IL-2) y el interfern gamma (IFN-). Esta ltima linfocina estimulaba la actividad tumoricida inespecfica de los macrfagos, induca o

incrementaba las reacciones citocidas contra microorganismos intracelulares y generaba un aumento en la expresin de antgenos del complejo mayor de histocomplatibilidad clase II (MHC II) en la superficie celular. El descubrimiento de que las clulas T contribuan a la AM, elaboraban citocinas, y la identificacin del IFN- como la citocina capaz de activar al macrfago contribuy al establecimiento posterior del concepto de que la calidad e intensidad de la AM dependa de la naturaleza de las seales generadas por el inductor y de la citocina moduladora. Se definieron entonces dos estados de activacin, en el primero de ellos, iniciador, los macrfagos exhiban un aumento en la expresin del MHC II, la presentacin antignica y el consumo de oxgeno en respuesta al IFN-. Sin embargo, se contaba con la evidencia de que otros factores como los interferones tipo I y el Factor de Necrosis Tumoral (TNF-) podran ser considerados como inductores de este estado, pues podan estimular tambin a los macrfagos para controlar el crecimiento bacteriano y presentar funciones tumoricidas. Los macrfagos en un estado iniciador respondan a un estmulo secundario para alcanzar un segundo estado de activacin denominado completo, definido por un alto consumo de oxgeno, la inhibicin de parsitos intracelulares facultativos, la lisis de clulas tumorales y una mxima secrecin de mediadores de la inflamacin, que incluan el TNF-, la prostaglandina 2 (PGE2), IL-1e IL-6, productos reactivos del oxgeno (ROIs) y el xido ntrico (ON). Los agentes capaces de producir la segunda seal incluan lipopolisacrido (LPS), bacterias gram positivas inactivadas por calor, steres de forbol, GM-CSF y di- y tri-pptidos de muramilo. En conclusin, aunque directamente incrementaban una o varias funciones, ambas seales sinergizaban para dar una ejecucin mxima de las mismas. El descubrimiento de diferentes subpoblaciones de clulas T y la aparicin del paradigma Th1/Th2 sugiri que el predominio de clulas Th1 (productoras de IFN- e IL- 2) o Th2 (productoras de IL-4, IL-5 e IL-10), podra favorecer un tipo de activacin y la generacin de

subpoblaciones de macrfagos definidas. Sin embargo, el nfasis sobre las funciones inflamatorias y citotxicas de los macrfagos activados mantuvieron la percepcin de que slo citosinas Th1, como IFN-y TNF-, promovan la AM, mientras que las Th2, como IL-4 e IL10, bloqueaban o revertan su induccin, un fenmeno denominado desactivacin, requerido para limitar las respuestas inflamatorias durante la reparacin del tejido. La desactivacin promovida por IL-4 se evidenci en monocitos humanos estimulados con LPS por la supresin de la produccin de TNF-, IL-1 y PGE2. IL-10 tambin inhiba la produccin de TNF-, IL-1e IL- 1 en monocitos estimulados con LPS. Adems, en macrfagos peritoneales inducidos con periodato y tioglicolato, IL-10 inhiba la produccin de IL6y la liberacin de ROIS e intermediarios reactivos del nitrgeno (RNIS). Debido a que el TNF-, los ROIS y los RNIS eran antagonizados por IL-4, IL-10, el Factor Transformante del Crecimiento (TGF-) y el Factor Desactivante del Macrfago (MDF), estas citocinas fueron denominadas desactivadoras del macrfago. Otras observaciones que mostraban que IL-4 induca la expresin de algunas molculas MHC II en monocitos humanos y de Ia en macrfagos peritoneales murinos, incrementaba la presentacin antignica en macrfagos murinos derivados de mdula sea y aumentaba la actividad tumoricida macrfagos murinos peritoneales inducidos con tioglicolato, sugeran que IL-4 no era propiamente desactivadora. Ulteriormente, se report la induccin de expresin y actividad del receptor de manosa (MMR) en macrfagos peritoneales con IL-4, regulada negativamente por el IFN-, lo que llev a proponer, segn estos hallazgos, que IL-4 estimulaba la expresin de un fenotipo alternativo al de los macrfagos activados con IFN- y LPS, pero no su desactivacin. Se evidenci que el pretratamiento con IL-4 incrementaba la produccin de IL-12 y TNF-en clulas mononucleares de sangre perifrica en respuesta a LPS o Staphylococcus aureus, y que poda regular positivamente quimiocinas como CCL17, 18 y 22 y enzimas intracelulares como la arginasa (Arg), estableciendo un patrn funcional diferente al inducido por el IFN-. Lo

anterior erosion el concepto de macrfagos inflamatorios versus suprimidos generados por citocinas Th1 y Th2, respectivamente, y conllev al surgimiento de los trminos activacin clsica y alternativa, enfatizando el contraste entre las caractersticas morfolgicas y funcionales de los macrfagos que presentan un determinado tipo de activacin. ACTIVACIN CLSICA Y ALTERNATIVA, UN ESFUERZO POR DEFINIRLAS Actualmente se denomina activacin clsica del macrfago a la inducida por exposicin al IFN-, el TNF-, o a inductores de ste tales como ligandos de receptores tipo Toll (TLR) (CpG DNA, poli (I:C), LPS, peptidoglicano y seales endgenas de HSP de 60 y 70 Kda). Los macrfagos activados clsicamente, denominados M1, tienen la capacidad de detonar mecanismos efectores: muerte de parsitos intracelulares, lisis de clulas tumorales, produccin y secrecin de IL1, IL-6, IL-12, IL-18, TNF-, CCL3, CXL9 y CXCL10, produccin de ROIS, generacin de ON en murinos, cambios fagolisosomales y aumento en la expresin de MHC II, CD86 y de la presentacin antignica asociada con clulas Th1. Hasta el momento no se ha consolidado una definicin clara de activacin alternativa debido a que se ha observado que los efectos de IL-4 en la generacin de un fenotipo de macrfago activado alternativamente se solapan de manera parcial con los inducidos por IL-13, IL-10, glucocorticoides y TGF-, por lo que algunos autores los consideran como activadores alternativos. In vitro, sus efectos, tanto en trminos de extensin y direccin (activantes o desactivantes), estn fuertemente influenciados por las condiciones de estimulacin (seal, concentracin en el momento del tratamiento), la especie, el tejido, y el estado de diferenciacin. Aunque algunos atribuyen la desactivacin a IL-10 y TGF-, otros consideran que estas citocinas no son slo inhibidoras, pues anlisis de expresin gnica han evidenciado que inducen genes compatibles con el perfil alternativo. Sin embargo, es importante notar que IFN- e IL-4 son los agentes ms conocidos como ejecutores de un rango de efectos antagonistas sobre los macrfagos: la expresin

de CD16, CD32 y CD64 es inducida por IFN- , pero inhibida por IL-4; la expresin del MMR y la 15-lipooxigenasa es inducida por IL-4, pero inhibida por IFN-. Adems, la expresin y sntesis de citosinas proinflamatorias como IL-1, IL-6, y TNF-, son inhibidos por IL-4 pero inducidos por IFN-. Tratando de generar una nomenclatura que defina grupos denominados como activados alternativamente, sensu stricto, M2, M2, tipo II, se propuso el uso de M2 como nombre genrico para las formas alternativas de activacin que, adems, comparten propiedades funcionales generalmente involucradas en respuestas tipo II, como inmunoregulacin y remodelacin del tejido. Para referirse a cada forma en particular, se propone denominar como M2a a la activacin inducida por IL-4 e IL-13, M2b a la promovida por la exposicin a complejos inmunes y agonistas de los TLRs y M2c a la estimulada por IL-10 y glucocorticoides. Aunque esta clasificacin no incluye el TGF-como activador alternativo, otros autores consideran que esta citocina induce el fenotipo M2c. Actualmente no est claro si un macrfago al ser estimulado adquiere un fenotipo que conserva durante su vida funcional, caso en el cual existiran in vivo subpoblaciones de macrfagos con estados de activacin definidos, o si el patrn de activacin de los macrfagos cambia de manera constante de acuerdo a los estmulos que encuentren, lo que generara un amplio rango de fenotipos no estables representantes de un continuum de activacin. Es importante considerar que cualquier nomenclatura o clasificacin subestima la complejidad de la situacin in vivo, en la cual la diversidad de los estados de AM est influenciada por la complejidad de los estmulos, la secuencia de exposicin a los mismos y el estado de diferenciacin del macrfago al momento de la estimulacin.