UNIDAD 6

CRECIMIENTO
Crecimiento
Es el incremento ordenado de todos los
constituyentes y estructura celular. En muchos
microorganismos, este incremento contina hasta
que la clula se divide en dos nuevas clulas por
fisin binaria
El crecimiento microbiano conduce generalmente a
un incremento en el nmero de clulas. Es importante
distinguir entre el crecimiento individual de clulas y
el crecimiento de poblaciones de clulas:
Crecimiento individual
Es el incremento en el tamao y peso de una
clula y es usualmente previo a la divisin
celular
Crecimiento poblacional
Es el incremento en masa o en el nmero de
clulas como una consecuencia del crecimiento
y divisin celular

Conceptos
Tasa de crecimiento
Es el cambio del nmero de clulas o masa
por unidad de tiempo
Generacin
Intervalo para la formacin de dos clulas
provenientes de una.
Tiempo de generacin
Tiempo que tarda una poblacin en duplicarse.
Se puede definir tambin como la cantidad de
tiempo requerida para completar un ciclo de
divisin.

Representacin logartmica de las poblaciones
bacterianas


El crecimiento de una poblacin o cultivo
bacterianos se puede medir en funcin de:

El aumento de la masa del cultivo
El aumento del nmero de clulas

Ambos tipos de expresiones son equivalentes
entre s en cultivos que estn en crecimiento
balanceado o equilibrado (en el que todos los
componentes aumentan una misma proporcin
por unidad de tiempo).
Medicin del crecimiento
Medida del crecimiento por masa
celular (1)
Mtodos directos:
Determinacin del peso hmedo
Determinacin del peso seco
Determinacin del N total
Determinacin de algn componente
caracterstico:
Peptidoglucano
ADN, ARN
Protenas
ATP
Medida del crecimiento por masa
celular (2)
Mtodos indirectos:
Consumo de nutrientes
QO
2
(consumo de oxgeno)


QCO
2
(consumo de dixido de carbono)
Produccin de ciertos metabolitos
Ejm. Produccin de cidos orgnicos
Mtodos turbidimtricos (pticos):
Espectrofotmetro (mide luz transmitida)

Medida del nmero de individuos
Mtodos directos:
Cmara de Petroff-Hausser (para bacterias)
Cmara de Thoma (para levaduras y clulas
mayores que las bacterianas)
Contadores electrnicos de partculas
(contador Coulter)
Mtodos indirectos:
Recuento de viables por siembra de
muestras de diluciones en placas de Petri

Cmara de Petroff-Hauser
Cmara de Petroff - Hausser
Cmara de Petroff Hausser
Cmara de recuento de Petroff-Hausser:
Medidas de la cmara:
excavacin con 0.02 mm de profundidad;
rea de 1 mm2, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes;
cada cuadrado grande est subdividido a su vez en 4x4 = 16
cuadrados pequeos.
O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros
pequeos).
La muestra, es dispensada entre el porta y el cubre y se cuenta el
nmero de clulas en uno de los cuadrados grandes, es decir el total
de clulas de sus 16 celdillas. Se anota el nmero n de clulas
observadas en este cuadrado. Entonces, la concentracin celular es:
n x 25 x 50 x 1000 = concentracin de clulas/mL.
Se obtiene mayor precisin si se cuentan 5 cuadrados grandes , n
sera la suma de estos 5 cuadrados y el clculo final:
n x 5 x 50 x 1000 = concentracin de clulas/mL
Contadores electrnicos de partculas (tipo
Coulter):
Se hace pasar una suspensin microbiana
por un tubo capilar, entre los dos polos de
una corriente elctrica.
Cada vez que por un orificio (30 m
dimetro) pasa una partcula (p. ej., bacteria)
se interrumpe la corriente, lo cual es
recogido por un dispositivo de registro
electrnico, que detecta el nmero y el
tamao de las partculas que van pasando.
(El tamao detectado es funcin de la
intensidad del pulso de voltaje al paso de la
partcula).
CONTADOR COULTER
Principio del Contador Coulter
: www.galenica.cl/.../principio_coulter.html
Alcuotas 0.1 ml
10 x
10
6

Recuento de viables por
siembra en placas Petri
Siembra en superficie
Siembra por incorporacin
Mtodo de aislamiento en cultivos puros
Medios de cultivo
Sistemas de Cultivo
Cultivo cerrado (en Lote o Batch)

Cultivo continuo (sistema abierto)

Cultivo en Lote alimentado
Cultivo en Sistema Cerrado (Batch)
En los sistemas cerrados (que pueden ser
lquidos o slidos), no existe aporte continuo
de nutrientes, ni drenaje de clulas ni de
sustancias de desecho.

En estos sistemas el crecimiento es
irrestricto por unas cuantas generaciones,
debido al agotamiento de nutrientes y/o a la
acumulacin de desechos.
Crecimiento en sistemas
cerrados lquidos
Es el ms habitual en laboratorio
Cultivo en frascos, tubos, etc.
No hay aporte nuevo de nutrientes ni es
posible eliminar los productos de
desecho del cultivo
Se desarrolla a travs de una curva
caracterstica de crecimiento
1

2
3
4
5
6
7
Curva de crecimiento poblacional en sistema cerrado
Fase estacionaria
Fase
muerte
Tiempo
Fase
Lag
Fase
exponencial
(log)
Crecimiento poblacional en un sistema
cerrado
Consta de varias fases:

Fase de latencia o fase Lag
Fase de crecimiento exponencial ( Log )
Fase estacionaria
Fase Muerte

Fase Lag
Es el perodo de tiempo durante el que el inculo se
adapta a las condiciones del medio fresco sobre el
que se ha sembrado. Se trata de un perodo de ajuste
metablico. Su duracin depende de varios factores:

Edad del inculo, si es un cultivo joven (18 horas) la
fase lag es corta
Si las clulas estn daadas por algn agente, la fase
lag es larga, ya que las clulas necesitan un tiempo
para la reparacin de los daos.
Si el medio del inculo es similar al medio fresco, la
fase lag es ms corta;
Si el medio del inculo era un medio rico y el medio
fresco es ms pobre, la fase lag se hace ms larga,
porque las bacterias necesitan un tiempo adicional
para activar la sntesis de las enzimas biosintticas
que estaban reprimidas en el medio rico.
Fase exponencial (Log)
El crecimiento se denomina exponencial porque la
biomasa se incrementa exponencialmente con
respecto al tiempo. De lo anterior se deriva que, si
graficamos el logaritmo de la concentracin de la
biomasa (o celular) en funcin del tiempo, como
ocurre en la curva del crecimiento, obtendremos
una lnea recta como representacin de esta fase.
Fase estacionaria

El crecimiento exponencial se detiene, los nutrientes
indispensables se agotan, no hay incremento o
decremento en el nmero de clulas o masa, hay
limitacin de nutrientes y acumulacin de
sustancias txicas. Los microorganismos son
fisiolgicamente activos y viables.
Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto
de crecimiento se hace nulo, pero an existe
crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento
bruto se equilibra con las muertes celulares.
Fase muerte
Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del
cultivo. Se debe a agotamiento de reservas
de energa. La pendiente de esta parte de la
curva depende de las especies (por ejemplo,
en bacterias entricas es suave, mientras
que en Bacillus es ms acentuada).
Cultivo Continuo
El cultivo continuo es un cultivo balanceado
mantenido por tiempo indefinido en un sistema
abierto de flujo que se compone de:

Una cmara de cultivo de volumen constante, a la
que llega un suministro de nutrientes. (Quimiostato)
De este recipiente se eliminan o separan los
productos txicos de desecho (por un dispositivo de
rebosadero).
Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el
nmero de clulas y la concentracin de nutrientes
en la cmara permanecen constantes, y entonces se
dice que el sistema est en estado estacionario, con
las clulas creciendo exponencialmente
Parmetros del quimiostato
Los parmetros a tener en cuenta son:

Flujo (f), medido en ml/h
Volumen de la cmara de cultivo (v, en ml)
Densidad celular en la cmara (X)
Factor de dilucin D = f/v (en h
-1
).
Tiempo de generacin o tiempo de doblaje (g)
Operacin del quimiostato (1)
La clave de la operacin del quimiostato es
que se trabaja con una poblacin en
equilibrio en la cual la concentracin de un
nutriente esencial (fuente de C, N, O) es
muy baja, normalmente cercana a cero. Por
consiguiente, cada gota de medio fresco
que entra en el quimiostato suministra el
nutriente que es casi inmediatamente
consumido por la poblacin, entonces el
experimentador tiene control directo sobre
la tasa de crecimiento.
La composicin del medio en el reservorio
es importante para una adecuada operacin
del quimiostato en condiciones de
equilibrio. Todos los componentes tienen
que estar en exceso en este medio excepto
uno, el sustrato limitante del crecimiento.

Operacin del Quimiostato (2)
f (en ml/h)
f ( en ml/h)
V
Nutriente
limitante
X
X
S
R

D = f/v
v
Reservorio de medio
fresco, con un sustrato
limitante (S
R
)
Vlvula de control del flujo
Suministro de aire
Filtro de aire
Cmara de cultivo
Receptor del efluente rebosado
Quimiostato

Aportan una fuente continua de clulas en
fase exponencial, lo que se aplica a
procesos industriales de fermentacin
(produccin de bebidas alcohlicas, de
antibiticos, de aminocidos, etc).
En el quimiostato, el crecimiento a bajas
concentraciones de sustrato permite estudiar:
aspectos fisiolgicos (por ejemplo,
catabolismo del sustrato limitante);
seleccin de mutantes y estudios
ecolgicos.

Aplicaciones del Sistema de Cultivo Continuo
Cintica del crecimiento
microbiano
Crecimiento balanceado (1)
Una poblacin de bacterias que se encuentre en un medio
adecuado en el que se mantienen constantes todos sus
parmetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal
que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, N
de clulas, ADN, ARN, protenas, etc., es un valor constante y
similar en cada caso:

AM/M = AN/N = A[ADN]/[ADN] = A[protenas]/[protenas] = ... = K

As pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o
logartmico, el cultivo se comporta como una reaccin
autocataltica de primer orden:
velocidad de aumento del componente = K{cantidad del
componente}
Crecimiento balanceado (2)
Tambin se puede decir que el N de clulas, la masa celular u
otros componentes se duplican en un mismo tiempo
determinado.
Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o
equilibrado. Se caracteriza por ser el crecimiento en el que
todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo
tiempo, o dicho de otra manera:
Aquel en el que estos constituyentes aumentan
proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de
tiempo. Este factor es la tasa exponencial de crecimiento (),
que es caracterstica para cada cepa bacteriana en cada
medio determinado.

Expresiones Matemticas para el Crecimiento
Exponencial
1) X

X es el nmero de clulas o la masa del
microorganismo
es la tasa especfica de crecimiento
(para un tipo de microorganismo dado depende principalmente de
la composicin y concentracin del medio de cultivo, presencia
de inhibidores, temperatura y pH)
t es el tiempo en que se mide el crecimiento

Cuando esta ecuacin se integra .
=
dt
dX




2) lnX = ln X
0
+ (t)

Donde ln es el logaritmo natural (en base e), X
0
es
el nmero de clulas en el tiempo cero, X es el
nmero de clulas en un tiempo t , y t es el tiempo
transcurrido mientras se mide el crecimiento.

Tomando el antilogaritmo a cada lado:

3) X = X
0
e
t

Esta ecuacin es til para predecir la densidad de la
poblacin en un tiempo futuro a partir de la poblacin actual
y de la tasa de crecimiento

Un parmetro constante muy importante en una poblacin
que est creciendo exponencialmente es el tiempo de
duplicacin (o de generacin). La duplicacin de la
poblacin ocurre cuando X/X
0
= 2.
Reordenando y sustituyendo este valor en la ecuacin 3
nos da:
4) 2 = e
(tgen)

Tomando el logaritmo natural de cada lado tenemos:

5)
gen
693 . 0
gen
2 ln
t t
= =
Expresiones matemticas para el quimiostato
En el quimiostato la tasa de crecimiento y la densidad
poblacin pueden mantenerse constantes a eleccin
del experimentador.
Sin embargo, la tasa de crecimiento es una funcin de
la concentracin de nutrientes. Esta funcin representa
un proceso de saturacin que puede ser descrito por la
ecuacin:
6)

donde
max
es la tasa de crecimiento a saturacin de nutrientes, S es la
concentracin de un nutriente limitante y Ks es la constante de saturacin
numricamente igual a la concentracin del nutriente en la que
=
max

S Ks
S
max
+
=
Ec. de Monod
Ecuacin de Monod
max
max/2
Concentracin del sustrato limitante S mg/L
La tasa de crecimiento es una funcin de la concentracin de
nutrientes en valores bajos
S Ks
S
max
+
=
F (en ml/h)
F ( en ml/h)
V (mL)
S (g/L)
X (ncel/L)
S
R

Operacin del quimiostato (1)
La clave de la operacin del quimiostato es que en
una poblacin en equilibrio, la concentracin del
nutriente es muy baja, normalmente cercana a cero.
Por consiguiente, cada gota de medio fresco que
entra en el quimiostato suministra el nutriente que
es casi inmediatamente consumido por la
poblacin, entonces el experimentador tiene control
directo sobre la tasa de crecimiento. Si se aade
nutriente ms rpidamente, incrementa; si se aade
ms lentamente, desciende.
Tasa de Dilucin
En un quimiostato la velocidad a la que el medio entra es igual
a la velocidad a la que sale el medio usado con las clulas por
rebosamiento. A este parmetro se le denomina Tasa de
Dilucin D, y se define como:

7)

donde F es la velocidad de flujo (en unidades de volumen
por tiempo, mL/hr) y V es el volumen del quimiostato (mL).
Por tanto, D tiene unidades de tiempo
-1
(hr
-1
), como y en
condiciones de equilibrio =D

V
F
D =
Densidad de Poblacin en el Quimiostato
La relacin entre el crecimiento celular y el consumo del
nutriente puede definirse como:
8)

donde Y es la constante de rendimiento para el organismo y medio dado y
dX/dS es el incremento celular por unidad de sustrato consumido.
La constante de rendimiento se expresa en unidades de peso
microbiano formado


es una medida de la eficiencia con que las clulas convierten el
nutriente en ms material celular
consumido sustrato de peso
formado microbiano peso
= Y
S
X
d
d
Y =
La composicin del medio en el reservorio es
importante para una adecuada operacin del
quimiostato en condiciones de equilibrio.
Todos los componentes tienen que estar en
exceso en este medio excepto uno, el sustrato
limitante del crecimiento. El smbolo para la
concentracin de tal sustrato en el reservorio
es S
R
, mientras que la del mismo sustrato en el
recipiente de cultivo es S. Teniendo en cuenta
las ecuaciones 1, 6 y 8, se pueden hacer las
siguientes consideraciones:
Operacin del Quimiostato (2)
Cuando se inocula un quimiostato con un pequeo nmero de
bacterias y la velocidad de dilucin no sobrepasa un cierto valor
crtico (Dc), el nmero de organismos empieza a incrementar
por:
9)


Como inicialmente >D, dX/dt es positivo. Sin embargo , a medida que la
densidad de poblacin aumenta, disminuye la concentracin del nutriente
limitante del crecimiento causando un descenso de . Si D se mantiene
constante, se alcanzar un estado de equilibrio en que = D y dX/dt = 0
Los estados de equilibrio slo son posibles cuando las
velocidades de dilucin no exceden de un valor crtico Dc. Este
valor depende de la concentracin del sustrato limitante en el
reservorio (S
R
):
10)



|
.
|

\
|
+
=
R
R
S Ks
S
max Dc
DX X
dt
dX
dt
dX
= = o salida - o crecimient
As cuando S
R
>>K
s
(que es lo normal) se pueden obtener
estados de equilibrio a velocidades de crecimiento prximas a

max

El cambio en S viene dado por:

11)

Como el consumo es el crecimiento dividido por la
constante de rendimiento (ecuacin 8), tendremos:
12)


Cuando se llega a un estado de equilibrio dS/dt = 0,
entonces:

consumo - salida - entrada =
dt
dS
Y
X
SD S
dt
dS
R

=
Se pueden calcular los valores en equilibrio de la
concentracin del organismo (X) y del sustrato limitante
del crecimiento (S)
13)

14)

Se pueden determinar los valores de X y S para
cualquier tasa de dilucin. La concentracin del sustrato
(S ) depende de la tasa de dilucin (D) aplicada y es
independiente de la concentracin de sustrato en el
reservorio (S
R
)

( )
|
|
.
|

\
|

=
=
D
D
K S
S S Y X
S
R
max
Ejercicios
Control del crecimiento