! Aspectos inmunopatolgicos de la infeccin por priones.! ! Consideraciones en dermatologa! ! ! ! RESUMEN! !

Dr. Alberto Paniz-Mondol*!

Las enfermedades transmitidas por priones constituyen un grupo de fatales desrdenes neurodegenerativos tales como el Kuru, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, el sndrome de Gertssman-Strussler-Scheinker y el insomnio familiar fatal. El agente causal denominado prion, por su original designacin partcula infecciosa proteinacea, es una protena celular aberrante convertida a una isoforma no constitutiva (isoforma scrapie), caracterizada por su anormal resistencia a mtodos convencionales de descontaminacin y su desconocido mecanismo de conversin a su forma patognica. Desde el ao 1985 estas enfermedades han captado especial atencin debido a la epidemia de encefalopata bovina espongiforme acontecida en el Reino Unido. El presente trabajo pretende abarcar de una manera general y concisa los aspectos inmunolgicos relacionados a estas enfermedades, as como consideraciones bsicas en el rea de la dermatologa.!

! I. Breviario histrico! !

La historia nos remonta al ao 1953 cuando una extraa enfermedad diezm a la tribu Fore de Nueva Guinea, en ese entonces colonia australiana; los nativos llamaron a este padecimiento "Kuru" que signica "temblor o estremecerse de fro o miedo y que se atribua a hechizos y efectos sobrenaturales" (1). Para ese entonces se encontraba de paso por ese pas el cientco americano Carleton Gajdusek quien permaneci alrededor de tres aos estudiando la devastante enfermedad, pudiendo constatar que slo este grupo tnico desarrollaba la dolencia, incluyendo a aquellos individuos que haban abandonado sus territorios cuando ya la epidemia cobraba ms de 600 muertes. Igualmente not que las mujeres podan transmitirlo a otras comunidades y a travs de sus hijos, por lo cual le atribuy una probable etiologa gentica (1,2).!

En el ao 1959 el veterinario W. J. Hadlow dirige una carta a Gajdusek donde le informa acerca de la similitud existente entre el Kuru y una enfermedad que padecan las ovejas desde haca ms de 200 aos conocida con el nombre de Scrapie, ya que los animales presentaban un cuadro clnico de ataxia y frecuentemente prurito lo que llevaba a estos animales a rascarse contra los alambrados con la consecuente prdida de lana. Esto condujo a Gajdusek a experimentar la inoculacin en otras especies animales, vericndose el carcter de la transmisibilidad en unos chimpancs a nales de 1965. En 1976 Gajdusek comparti el premio nobel por descubrir el origen infeccioso del Kuru, adjudicndole la etiologa a los llamados virus lentos (1-3).!

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El misterio de la tribu Fore es al n resuelto por los antroplogos Robert Glasse y Shirley Lindenbaum quienes descubrieron que esta tribu haba comenzado a practicar ritos canibalsticos hacia 1915, lo cual se haba mantenido como una prctica exclusiva de las mujeres a lo largo del tiempo. De hecho, al prohibirse estos rituales la incidencia de la enfermedad declin prcticamente en su totalidad (1,2).! No es sino hasta 1978 cuando Stanley Prusiner inicia sus estudios en el campo, para nalmente en 1981 sugerir que estas enfermedades eran transmitidas por una protena infecciosa, peculiar en el sentido de poder inducir su replicacin y el desarrollo de la enfermedad sin contener en su estructura cidos nucleicos [Henning J, Paniz A, Hernndez E, Kabchi B, Salazar Y, Snchez L. Actualizacin sobre la respuesta inmunolgica frente a la infeccin por priones. VI Congreso Venezolano de

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Estudiantes de Medicina), Universidad de Los Andes, 1997 (Documento no publicado)]. Despus de fuertes refutaciones, Prusiner consolida sus teoras y se le otorga el premio Nobel en 1997 (3).!

El empleo de nuevas tcnicas diagnsticas y la reciente epidemia de la encefalopata bovina espongiforme han contribuido en forma importante a la mayor caracterizacin y ms profunda comprensin de la patognesis de estas enfermedades, connadas a la larga lista de los diagnsticos por descarte en el pasado.!

! II. Encefalopatas espongiformes subagudas! ! !

En el ser humano las encefalopatas espongiformes subagudas o transmisibles son: 1. El Kuru; 2. La enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; 3. El sndrome de Gertssman-Strussler-Scheinker y 4. El insomnio familiar fatal. Las enfermedades en animales incluyen: 1. El scrapie; 2. La encefalopata espongiforme bovina; 3. La enfermedad de desgaste crnico del Cariac y el alce en cautiverio, as como 4. La encefalopata espongiforme felina y 5. De los ungulados exticos (4).! Etiolgicamente las enfermedades humanas producidas por priones se maniestan por origen infeccioso, tal como el caso del Kuru y los casos de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob iatrognica; por herencia y mutaciones como las formas familiares de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, GertssmanStrussler-Scheinker y el insomnio familiar fatal; o por brotes espordicos (4).!

! III. Prion: denicin. Aspectos bioqumicos y funcionales! ! !

El prion es el trmino que dene el agente causal de las encefalopatas espongiformes transmisibles (EET) y que describe propiedades no convencionales. Su componente esencial lo constituye una protena, mas el trmino no posee implicaciones estructurales (5).! Se describen dos formas de protenas prionicas: por una parte la PrPC o PrP-sen dene a la forma constitutiva producto del gen Prnp, necesaria, mas no suciente, en diversos tipos celulares para la replicacin del prion; en tanto que la forma PrPSC o PrP-res constituye una forma anormal, no constitutiva derivada del gen Prnp que se encuentra en los tejidos de pacientes que padecen EET, la cual es resistente a digestin por proteinasa- K bajo condiciones estandarizadas y diere mayormente de la PrPC por su estado conformacional. Aun cuando no se ha establecido una terminologa convencional, estos trminos y conceptos generales son los ms utilizados en la literatura del tema (6).!

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El prion es un agente ampliamente resistente a tratamientos fsicos y qumicos (formaldehdo y glutaraldehido, -propiolactona, cido acetiletilindeamina, nucleasas, compuestos cisdiamino platino, temperaturas de 80C, radiaciones ionizantes y otros) [Henning J y col. VI Congreso Venezolano de Estudiantes de Medicina, ULA, 1997. Documento no publicado)].! Es una sialoglicoprotena de 33-35 kd, proviene de un gen compuesto de dos o tres exones, un marco de lectura simple, y un promotor rico de cimetidina/guanidina. La estructura del gen y la secuencia de la protena han sido altamente conservados en los mamferos (5-7).! La traslacin de PrP, ARNm y el procesamiento del producto inicial del gen resultan en una protena de 210 aa anclados en la membrana plasmtica a travs de una glicoprotena de fosfatidilinositol ligada a su extremo carboxilo-terminal. Tanto la isoforma constitutiva como la no constitutiva son transcritas en el mismo gen, lo cual sugiere que cualquier modicacin ligada a la enfermedad debe ocurrir a nivel pos-transcripcional (4-6). PrPSC es el mayor y probablemente el nico componente de la partcula prionica infecciosa, su formacin es postranslacional involucrando un proceso de cambio conformacional de la PrPC. Estudios de modelos moleculares han demostrado que estructuralmente

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la conformacin de la PrPC se compone de cuatro hlices que conteniendo a su vez cuatro regiones de estructura secundaria. Describe un dicroismo circular que contiene en un 40 % a hlices y en un 3 % bandas . En el caso de la PrPSC se describe un 34 % a hlices y 43 % bandas . Existen a su vez cambios estructurales que determinan distintas cepas de priones (7-9).!

La localizacin en la supercie de la membrana celular y otras evidencias bioqumicas indican que la protena se comporta como: receptor de membrana, factor de crecimiento de clulas gliales, receptor inductor de acetilcolina, molcula de adhesin linfocitaria, activador de clulas linfoides, funciones de sealizacin y transporte (Cuadro 1). Y tambin se ha descrito su funcin en las sinapsis, en los procesos de memoria, mantenimiento de ritmos circadianos y regulacin de patrones de sueo (5,10). Hasta ahora la funcin de esta protena a pesar de encontrarse ampliamente expresada en tejidos embriolgicos y adultos parece no ser esencial o compartir su funcin con otras molculas, ya que se ha descrito en modelos experimentales, que mediante la delecin del gen PrPC murido por recombinacin homloga de clulas madres embriolgicas, los ratones mutantes que se generan poseen un desarrollo normal (4,9,11).!

Cuadro 1!

Comparacin entre las isoformas constitutiva y no constitutiva de la protena prinica!

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IV. Hiptesis acerca de su naturaleza infecciosa!

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Los trabajos de Prusiner para determinar la naturaleza de los priones, comprendieron una serie de fases: primeramente la extraccin y puricacin, la determinacin de la naturaleza qumica de este agente, las pruebas que condujeron a su identicacin y nalmente los ensayos biolgicos de infectividad. Todos estos distintos pasos son explicados a continuacin.! 1. En un principio durante la fase de puricacin (utilizando extraccin con detergentes y centrifugacin) se decidi agregar tres nuevos pasos que consistan en: exposicin a nucleasas, exposicin a proteasas y anlisis electrofortico. En este punto Prusiner y su equipo observaron que la infectividad del agente (scrapie) permaneca inalterada tras la digestin con nucleasas (enzimas capaces de intervenir en el proceso de clivaje de cidos nucleicos), en cambio tras la exposicin a proteasas (las cuales cortan secuencias de aminocidos en una protena) ocurra una disminucin en la infectividad, lo que llev al planteamiento que la actividad biolgica del agente dependa de una protena (12-14).!

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2. En el curso de su trabajo examinaron numerosos reactivos qumicos para determinar si eran capaces o no de alterar la infectividad del prion. La base de sus hallazgos se bas en que aquellas sustancias capaces de alterar la naturaleza proteica disminuan la infectividad del prion, en tanto que aquellas sustancias que no jugaban ningn papel en la esfera proteica no alteraban la infectividad (12-14).! Las ms claras evidencias provinieron del uso de proteasas. Por lo general las proteasas son altamente especcas y no se describe casi efecto sobre otras molculas biolgicas que no sean protenas. De los trabajos iniciales se desprenden dos puntos esenciales:!

! 1. Las proteasas reducen la infectividad prionica.! ! ! !

2. Las molculas PrP posean resistencia al tratamiento con proteasas si se comparaban con otras protenas.! De esta forma se utilizaron otros reactivos que no escindan las cadenas de aminocidos sino que actuaban desplegando a las protenas (desnaturalizacin), por ejemplo, el detergente duodedecilsulfato de sodio (SDS), urea y ciertas sales lograban disminuir la infectividad biolgica de los priones (todas las reacciones mediadas por estas sustancias se describen como irreversibles) (12-14).! Por lo descrito anteriormente se decidi realizar el ensayo con dietilpirocarbonato (DEP) la cual modica qumicamente a las protenas de una manera que el proceso pueda ser revertido posteriormente mediante el uso de hydroxilamina. Los resultados obtenidos mediante este procedimiento fueron una abolicin de la accin prionica y su posterior restablecimiento tras el uso de la hydroxilamina (12-14).!

! Tras estos experimentos se presumi entonces que el blanco de accin lo constitua la PrP.! ! !

A pesar de los resultados obtenidos hasta este momento an permaneca abierta la posibilidad de que la PrP no fuera un componente estructural del prion sino un producto patolgico resultante del proceso infeccioso del scrapie. Sin embargo, se logr determinar que la concentracin de PrP era directamente proporcional a los ttulos de priones encontrados; el rango obtenido por medio de digestin en proteasas fue el mismo tanto para PrP como para priones (12-14).!

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Finalmente por los hallazgos experimentales obtenidos sobre material puricado tratado con proteasas, se determin que PrP era la nica protena que poda ser detectada, sugiriendo as que los priones se constituan de una nica protena mayor.!

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3. Habindose ya establecido el rol de una protena en el proceso infeccioso, el paso siguiente consisti en tratar de descartar la presencia de cidos nucleicos.! Las radiaciones ionizantes por dao directo a los cidos nucleicos destruyen clulas y virus. Alper ensay en esta materia obteniendo como resultado que eran necesarias altas dosis de radiacin para eliminar el agente del scrapie; as se concluy que ste agente careca de cidos nucleicos descartando la hiptesis viral (12-14).! Por otra parte Prusiner y su equipo expusieron varias soluciones de priones a un pool de diversas nucleasas, incluyendo enzimas que destruan tanto el cido desoxirribonucleico (ADN) como el ribonucleico (ARN), sin detectar ninguna disminucin en la infectividad.! Una posible objecin a este experimento radicaba en la posibilidad de que la enzima no pudiera ganar acceso al cido nucleico. Tal era el caso de muchos virus resistentes a las nucleasas por el hecho de que el material gentico se encontraba protegido por una cubierta proteica.! A n de solventar esto, se utilizaron unas molculas denominadas psoralenos, las cuales tienen la capacidad de traspasar las cubiertas proteicas de la mayora de los virus y en conjunto a la exposicin con rayos ultravioletas es capaz de ligarse a los cidos nucleicos inactivndolos; de la misma manera tras este procedimiento no se observ prdida de la infectividad. De igual manera se utilizaron iones de zinc los cuales actan de una manera similar a los psoralenos, obtenindose los mismos resultados (12-14).!

! De todo lo descrito con anterioridad se desprende la siguiente conclusin:! ! ! V. El problema de la replicacin! !

Los mtodos usados para modicar la naturaleza proteica inactivaban los priones pero no ejercan efecto alguno sobre los viroides, en tanto que los tratamientos utilizados para atacar cidos nucleicos destruan los viroides pero no modicaban la naturaleza de los priones.!

Para el momento en que Prusiner dilucidaba el por qu de la naturaleza infecciosa de los priones comenzaban a surgir las interrogantes acerca de los mecanismos de replicacin utilizados por estos; en principio surgieron tres hiptesis: la primera, planteaba que el prion (a pesar de las evidencias obtenidas para ese entonces) consista en un virus convencional con un genoma ADN o ARN que codicaba para la estructura completa de la protena (2,3,13); la hiptesis ms radical planteaba que los aminocidos de la PrPc de alguna manera determinaban su propia secuencia durante la replicacin, proponindose indirectamente el proceso de la trascripcin reversa (siguiendo la va protena ARN / ADN) interpretndose as por los mecanismos celulares como un incremento en la sntesis proteica (13).!

En este sentido se especulaba que la secuencia de aminocidos de la PrPc serva como marco y andamio para el ensamblaje directo de una nueva molcula proteica, aun cuando no se conocan enzimas capaces de aproximarse a la construccin de tan complejas estructuras proteicas (12,13). Sin embargo, hoy por hoy se ha demostrado que la conformacin de la PrPsc hace las veces de templado para dirigir la formacin de PrPsc nacientes, sugiriendo por dems que las distintas cepas de priones se originan en la diversidad nativa encriptada en la PrPsc madre (15).!

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La tercera hiptesis, an compartida por muchas investigadores plantea la existencia de una secuencia gnica (ADN) que codica para una secuencia de aminocidos determinantes del prion. El gen, a pesar de no ser contenido por el prion, constituye un componente normal del genoma y la infeccin por priones de alguna manera activara el gen o simplemente lo alterara (3,12-14). Incluso, podra ocurrir que el prion incluya una pequea secuencia de cido nucleico que podra estimular la activacin del gen. La secuencia insertada podra fungir como un promotor o activador de la expresin gnica. Alternativamente si el prion consiste nicamente de estructura proteica, la misma PrP podra ligarse al ADN celular en alguna regin que controle la trascripcin del gen PrP, lo cual constituira una situacin excepcional (12-14,16).!

Existen en la actualidad mltiples hiptesis acerca de la replicacin y la conversin, algunos plantean la existencia de cepas, otros el rearreglo de genes, sin embargo, no existe un consenso ni unicacin consistente de datos experimentales.!

! VI. Papel de los linfocitos T y B, y, del sistema de complemento! ! VI. I. El papel de los linfocitos T! !

Como es bien sabido la expresin de la PrPc no se restringe nicamente a los tejidos del sistema nervioso central (SNC); y su presencia en tejidos linfoides de ratones y ovejas ha sido demostrada (3,5,17). Los trabajos iniciales enfocados al estudio de la patognesis del scrapie fueron los primeros en demostrar que los linfocitos T no jugaban un rol determinante en la biognesis de estas patologas; esto demostrado a travs de la timectomizacin en varios modelos animales donde no se evidenci alteracin alguna en lo que respecta al perodo de incubacin posterior a una inoculacin perifrica del agente (18).!

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Igualmente, se han realizado estudios en ratas transgnicas e inmunodecientes, corroborndose que las deciencias puntuales de clulas T (CD4 -/-, CD8 -/-, 2 -/-, TCR a -/- y perforina -/- en roedores), no alteran en forma alguna la susceptibilidad o acumulacin del material infeccioso (priones) en bazo u otros tejidos (19,20).! Sin embargo, es importante destacar que la protena prionica PrPc, es decir, la forma constitutiva, juega un papel importante como molcula de supercie en el proceso de activacin de clulas T (17). Lo cual se ha demostrado, entre otras cosas, por su sobreexpresin posterior a la estimulacin in vitro con el mitgeno no especco de clulas T. con canavalina A; y su reduccin importante tras esta estimulacin posterior a la inactivacin del gen (PrP -/- en ratas).! Se ha demostrado que la protena prionica en su forma constitutiva PrPc juega un papel importante como molcula de supercie en el proceso de activacin de clulas T.!

! VI. II. Papel de los linfocitos B! ! ! !

El rol de los linfocitos B en la patognesis de la infeccin por priones es an ms complejo, ya que se ha demostrado su participacin directa e indirectamente en varios de los mecanismos vinculados al sistema inmunitario.! Se ha demostrado que en ratones, con abolicin selectiva de la funcin de clulas B, e incluso, en modelos de inmunodeciencia severa combinada (SCID) (Rag-1 -/- , Rag-2 -/- y Agr -/- ) el grado de infectividad y la subsecuente invasin neural se encuentran notablemente afectadas (19-22).! Durante muchos aos se plante la posibilidad de que los mismos linfocitos B eran los responsables de transportar fsicamente a estos agentes hasta el sistema nervioso central (SNC) junto a los

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macrfagos (19,21); sin embargo, los ensayos experimentales fracasaron en demostrar la infectividad en clulas B circulantes a pesar de la intensa presencia de priones en clulas del lecho esplnico (24).!

En la actualidad cobran importancia aquellas hiptesis que demuestran la accin indirecta de las clulas B sobre estos procesos patognicos. Por ejemplo, se ha demostrado que, en ratones decientes en linfocitos B maduros, ocurre indirectamente una deciencia a nivel de las clulas dendrticas foliculares, las cuales requieren de la estimulacin por parte de las clulas B para mantenerse en su estado diferenciado (22); ms adelante se analiza el importante papel de las clulas dendrticas foliculares en el proceso perifrico de la infeccin por priones.!

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Hasta el momento no existen evidencias que sugieran que las clulas B secreten por si solas factores o sustancias que intervengan en el proceso de neuroinvasin o neurodegeneracin (25), sin embargo, s es bien sabido qu! e las clulas B proveen seales importantes que participan en la maduracin y en el mantenimiento de distintos tipos celulares en los centros germinales (22,26).!

! VI. III. Papel del sistema de complemento! ! ! !

El complemento es un importante sistema de defensa que puede activarse por tres vas diferentes, la va clsica, dependiente de la unin antgeno-anticuerpo, la va independiente de anticuerpo, o de las lecitinas, que reconoce monosacridos expresados sobre las membranas de microorganismos; y por ltimo, la va alterna; aunque algunos autores sugieren la existencia de una cuarta va que se iniciara a partir de C5, facilitando procesos de degranulacin plaquetaria (27).! La activacin del complemento y la unin a receptores celulares de membrana para el complemento son esenciales para la localizacin de antgenos en clulas dendrticas foliculares (22,28). Como es sabido, las clulas dendrticas no fagocitan al antgeno sino que lo capturan en sus prolongaciones y lo retienen hasta tanto lo puedan presentar a los linfocitos T (27,28) pudiendo permanecer retenidos por largos perodos de tiempo (22).! Recientemente se ha descrito el importante papel que juega el complemento en los procesos de localizacin y retencin del agente scrapie en las clulas dendrticas foliculares, principalmente en los primeros das posterior a la infeccin (29-31). Se han realizado experimentos, provocando genticamente deciencias del factor C3 (30), as como depletando transitoriamente dicho factor (32) disminuyendo signicativamente la acumulacin de PrPsc en bazo y prolongando de una manera importante el perodo de incubacin despus de la inoculacin perifrica del agente scrapie (29,32).!

Se ha propuesto incluso que la PrPsc puede interactuar directamente con componentes especcos del sistema de complemento, aunque an no se conoce mecanismo alguno (29). Utilizando modelos con deciencias del factor C1q (C1q -/- ), "va clsica" (33); y modelo de doble knock out del factor B y C2 (H2-BF/C2-/- ), "va clsica y alterna" (34); se ha demostrado que la activacin de la va clsica de complemento fue la ms propensa involucrando la activacin de C3 durante la infeccin prinica; sin embargo, el perodo de incubacin fue marcadamente ms prolongado en ambos modelos (29,32) sugiriendo la vinculacin de ambas vas.!

! VII. Papel de los macrfagos y las clulas dendrticas foliculares! !

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Tanto los macrfagos como las clulas dendrticas foliculares juegan un papel esencial en la fase perifrica del proceso patognico de las EET, razn por la cual es necesario en primera instancia

hacer mencin general de las teoras y evidencias que hasta el momento nos aproximan al entendimiento del proceso que conduce a los priones hasta el SNC (Figura 1).!

Figura 1. Posibles rutas seguidas por el prion en el proceso patognico desde el compartimiento perifrico al compartimiento central.!

! Los priones demuestran una mayor efectividad cuando son depositados directamente en el cerebro del hospedero, pero sta no es la ruta usual de infeccin (3,4,13,14). Por ejemplo en el caso de transmisin de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, en la mayora de los casos ha sido por la administracin de productos hormonales contaminados (35), trasplantes de cornea (36) y ms recientemente se ha propuesto la posible va transfusional (37) e incluso la transmisin por va de secrecin nasal (38,39).!

Especial mencin merece la transmisin por va oral, como en el caso del Kuru, adquirindose la infeccin posterior a rituales canbalisticos (2,3,35). Es evidente que los priones consiguen un camino a travs del cuerpo para nalmente llegar al SNC, pero hasta el momento no se han hallado cambios histopatolgicos en otros rganos; lo que s se ha demostrado es que los priones efectan una multiplicacin silente en zonas de reserva durante la fase de incubacin (40). Uno de esos reservorios podra constituirlo el sistema inmune y muchos estudios recalcan la importancia de la replicacin prionica en rganos linfoides.!

El tipo PrPSC se acumula en el tejido linfoide amigdalino en grandes cantidades, pudiendo ser fcilmente detectadas por medio de anticuerpos en preparados histolgicos. Igualmente se han

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detectado grandes cargas a nivel intestinal, especcamente en placas de Peyer, posterior a la administracin oral de priones (41).!

La naturaleza de las clulas que soportan la replicacin prionica en el sistema linfo-reticular an permanece incierta. Se ha descrito la acumulacin de PrPSC en clulas dendrticas foliculares en ciertas cepas de roedores. A pesar de esta implicacin, las clulas del sistema inmune no pueden ser del todo responsables del transporte de los priones hasta el SNC, lo cual plantea la posibilidad que la transmisin se efecte por va nerviosa perifrica retrgrada como en el caso de la rabia y los herpesvirus.!

As permanece an la hiptesis de que las clulas pertenecientes al sistema linfo-reticular transportan los priones a los terminales nerviosos perifricos y de ah ocurra un proceso trans-sinptico a lo largo de los tractos nerviosos (42,43).!

! VII. I. Propagacin del prion en clulas del sistema linfo-reticular! ! ! VII. II. Papel de los macrfagos! ! !

Aun cuando la infeccin por priones no parece inducir una respuesta inmunolgica crnica, se conoce que los priones colonizan el sistema linfo-reticular (SLR) antes que ocurra la colonizacin a nivel del SNC (44). Tras la infeccin ocurre una ruta de acceso al SLR pero aun permanece sin conocerse que sistema de transporte es utilizado a este nivel perifrico.!

Se sospecha que los macrfagos (M) pueden estar vinculados en este primer paso, debido a su actividad fagoctica y su movilidad, lo cual le permite circular entre rganos linfoides, torrente sanguneo y parnquimas de distintos rganos (19,44).! Respecto a su papel se han estudiado igualmente el compromiso de los M esplnicos en los estados tempranos de la infeccin por scrapie. Al ocurrir la deplecin de los M esplnicos mediante el uso de la tcnica de suicidio (donde se utiliza el difosfonato de diclorometileno incluido en liposomas), se ha observado un incremento en la cantidad de inculo a nivel esplnico, as como una acelerada replicacin del agente en los estados tempranos de infeccin. Los resultados experimentales han sugerido que posiblemente los M juegan un papel como primera lnea de defensa y limitan en parte la infeccin a nivel de tejidos perifricos mediante el secuestro fagoctico del agente y por ende disminuyen la replicacin del mismo, al menos a nivel esplnico. Otro fenmeno notable es que el uso de difosfonato de diclorometilo acta igualmente depletando de manera transitoria a las clulas dendrticas foliculares y clulas B, observndose aun replicacin, lo cual sugiere inequvocamente la existencia de otros mecanismos compensatorios que contribuyen a la persistencia de la infeccin en estados tempranos (45).!

Es importante hacer mencin de las clulas con actividad fagoctica dentro del SNC, especialmente el papel de la microglia, destacando que el rol de las clulas gliales en la patognesis de las enfermedades prionicas es evidente debido a que la gliosis precede el proceso neurodegenerativo o de neurodegeneracin (46,47). Existen evidencias experimentales en modelos de roedores infectados que demuestran a nivel cerebral un incremento de los niveles de ciertas citotoxinas derivadas de la glia, incluyendo al TNFa, IL-1a e IL-1. Se ha hallado que las reas de activacin microglial coinciden con las reas de formacin de placas PrP en pacientes con sndrome de Gerstmann-StrausslerScheinker , as como se ha demostrado en la actualidad que para el desarrollo del efecto neurotxico de la PrP106-126 in vitro es necesaria la presencia de la microglia (48-50).!

Se ha descrito recientemente mediante sustraccin de tejido cerebral de roedores infectados y anlisis de ADNc, la sobre-regulacin de ciertos genes que codican para una serie de enzimas, entre

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ellas hidrolasas lisosomales (lisozima M y ambas isoformas de la -N acetilhexosaminidasa), peroxiredoxina y en especial una protena similar a la perforina (gen 1 especco para la proliferacin de M [MPS-1]), lo cual se correlaciona directamente con el desarrollo y progresin de la degeneracin espongiforme, tomando en cuenta la accin especca de cada una de estas enzimas (48).!

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La funcin siolgica de la lisozima M an no est clara; se conoce que acta degradando ciertos peptidoglicanos que componen la pared celular bacteriana y funge como un excelente marcador de M activados. MPS-1 fue aislado como gen especco para M; su estructura al ser deducida por secuenciacin de nuclotidos expresa un dominio de signicativa homologa con la perforina, la cual originalmente fue identicada como una protena granular en Ly T citotxicos y clulas NK.! El hecho de que los sistemas lisosomales se encuentren sobreactivados y la posibilidad de que MPS-1 exhiba un potencial citotxico importante como para provocar directamente muerte neuronal, agrega a la intervencin de los M dentro de la patognesis de la infeccin por priones un papel crucial (48).! Las evidencias experimentales han sugerido que para que la infeccin pueda acceder a nivel de SNC desde el SLR, es necesaria una larga interaccin en la cadena celular. Las hiptesis planteadas inicialmente acerca de la inltracin de monocitos a travs de la barrera hematoenceflica y por tanto un rol en el desarrollo de la infeccin han perdido terreno en la actualidad (41).!

! VII. III. Papel de las clulas foliculares! !

Estudios experimentales utilizando dosis subletales de irradiacin gamma (en dosis simples o fraccionadas) antes de inoculacin del agente prionico, as como estudios en animales timectomizados, no han demostrado alteracin alguna en el perodo de incubacin de estas infecciones, sugiriendo que la replicacin del prion (scrapie) en el SLR depende de un grupo celular radio-resistente y mitticamente inactivo, apartando de esta manera la posibilidad de intervencin de las clulas T o sus precursores. De esta manera y cumpliendo con los criterios anteriormente descritos, las clulas foliculares juegan un claro papel como fuertes candidatas para la funcin de replicacin, sumando a esto las evidencias que aun en animales no infectados, exhiben una gran capacidad de ligar anticuerpos para la PrP (41,45,51,52). Las evidencias experimentales que soportan este hecho se describen a continuacin:!

En cepas de ratones con inmunodeciencia severa combinada (SCID) la carencia de linfocitos T y B previene la maduracin de clulas dendrticas foliculares; estos ratones tienden a fracasar en la replicacin del agente (disminuyendo la infectividad) y se observa una disminucin de la acumulacin de PrPSC en bazo, lo que conlleva por ltimo al no desarrollo de la enfermedad posterior a una resistencia perifrica. En cambio si estos ratones (SCID) son infectados de manera directa, intracerebralmente, son tan susceptibles al desarrollo de la enfermedad como su contraparte inmunocompetente; incluso luego de la reconstitucin de las cepas SCID la resistencia perifrica a la infeccin sucumbe y se denota acumulacin de PrPSC a nivel esplnico (41).!

Por otra parte se ha sugerido que los Ly esplnicos pueden adquirir los priones posiblemente de las clulas dendrticas foliculares, nicamente si expresan la PrP, el mecanismo de cmo sucede esto permanece sin determinar. Se deduce que debido a que los Ly permanecen en estrecho contacto con las clulas dendrticas foliculares en la intrincada red de los centros germinales, dicha captacin se efecta por interacciones celulares directas. Se especula que los priones pueden encontrarse expresados en la supercie de las clulas dendrticas como anticuerpos - PrPSC o complejos complemento - PrPSC de manera similar a como son retenidos los complejos inmunes por las clulas dendrticas foliculares para el largo mantenimiento de la respuesta inmune (44).!

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Se han demostrado altos niveles, por medio de tcnicas de atrapamiento de complejos de PrP, en un extenso nmero de clulas no relacionadas con tipos neuronales, en rganos linfo-reticulares y pncreas, tanto de ratones infectados como no infectados. La asociacin entre ambas formas de protena prionica (la forma constitutiva y no constitutiva) con las clulas dendrticas foliculares en bazo, ndulos linfticos y placas de Peyer sugiere fuertemente que en estos tejidos, las clulas dendrticas foliculares constituyen sino el nico, el principal sitio de replicacin (41,44,52,53).!

! VIII. Aproximacin a un esquema inmunoteraputico para el control de las EET! ! !

Hasta los momentos slo existen como propuestas para combatir las EET aproximaciones teraputicas tericas, las estrategias en la actualidad se han basado en modelos de prevencin. De todos modos es importante considerar que para el momento que se reconocen los primeros sntomas de una de estas enfermedades ya ha ocurrido un dao considerable en el SNC, lo cual conere a la prolaxis posexposicin un mayor chance de xito en el tratamiento de la entidad prionica.! Aun cuando los mecanismos siopatolgicos no estn del todo esclarecidos, las evidencias experimentales han trazado una ruta que parte desde su compartimiento perifrico (donde intervienen M, clulas dendrticas foliculares, clulas B, etc.) a un compartimiento central (SNC) dejando al descubierto una serie de blancos capaces de ser atacados, manipulados o modulados con el n ltimo de detener el desarrollo de estas enfermedades, teniendo al sistema inmune un rol protagnico.!

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Es imprescindible recordar que no existen evidencias claras de una respuesta inmune crnica en estas infecciones; la ausencia de reactividad inmunolgica no se encuentra asociada a ninguna disfuncin del sistema inmune detectable o a alguna actividad supresora a nivel celular, incluso en los estados terminales de la enfermedad (3).! 1. El primer paso debe contemplar el ataque en estados tempranos de la infeccin, actuando a nivel perifrico; una alternativa sera prevenir la maduracin de clulas dendrticas a travs de una supresin linfoctica para de esta manera eliminar lo que hasta ahora se considera la zona principal de reservorio. Igualmente se plantea la esplenectoma como forma de eliminacin del reservorio de infectividad, claro est que hipotticamente seran medidas efectivas pero nicamente de ser aplicadas en una fase inicial (41).!

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Se ha comprobado que la ausencia de clulas B y anticuerpos se correlaciona con el no desarrollo de la infeccin y se ha vinculado fuertemente con el proceso de neuroinvasin; aun cuando la supresin total de clulas B est fuera de lugar, es preciso investigar a profundidad su rol y sus interacciones con otros elementos que podran ser blancos de ataque ms factibles (3,19,21,45).! 2. Otra estrategia de inmunoterapia sera el uso de molculas que regulen la respuesta inmunitaria (inmunomoduladores). Al respecto se sabe que en contraste a los efectos que ejercen sobre las patologas infecciosas convencionales, los inmunopotenciadores como la tohemaglutinina (PHA) ms bien potencian la infectividad prionica (casos similares se han descrito con BCG y virus vaccinios) (41).! Otras sustancias que adems de su efecto antiviral son capaces de producir otros efectos en la respuesta inmunitaria son los interferones; es bien sabido que en las infecciones virales estos pueden producir una disminucin notoria de la inmunidad celular, disminucin de receptores y agammaglobulinemias transitorias que de alguna forma inuiran en lo descrito en el punto anterior; sin embargo, en una revisin de 20 trabajos no se describe cambio alguno en estas enfermedades e igual sucede para el caso de la ciclofosfamida (3,41).!

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Sin embargo se ha descrito experimentalmente la efectividad de ciertas sustancias como el acetato de prednisona, el aceite de arachis y los polianiones; estos ltimos proveen un largo perodo de ventana a la infeccin, reduciendo los ttulos de infeccin hasta en un 90 % siempre y cuando se administre continua y constantemente durante un rango estricto (semanas) antes o despus de la infeccin. En todo caso es necesario comprender que ninguno de estos tratamientos son efectivos cuando se ha instalado la infeccin en el SNC.!

3. El uso de ciertas sustancias como el glicerol, dimetilsulfoxido (DMSO) y el trimetilamonio (TMAO) han demostrado tener funciones de gran importancia como son la propiedad de estabilizar las protenas en su conformacin nativa (lo cual impedira modicaciones postranscripcionales), proteger a las protenas de la desnaturalizacin trmica y como hecho curioso estas sustancias adems de evitar la agregacin in vitro, estabilizan a la PrP disminuyendo su conversin a la forma no constitutiva (3).!

Este grupo de sustancias reciben, en general, el nombre de molculas chaperonas y no son ms que protenas que facilitan el plegamiento de los polipptidos que se sintetizan en el retculo endoplasmtico para asegurar su estabilidad. Otras como las protenas de stress o shock trmico, se sintetizan cuando aumenta la temperatura, ocurre trauma u otro stress fsico. Estas molculas protegen otras protenas propias de las clulas de los procesos de degradacin, pero su papel en estas patologas no ha sido determinada (3,5).!

Es importante citar a este nivel el papel de la protena X. Utilizando clulas de neuroblastoma de ratn infectadas con scrapie y transfectadas con el gen quimrico HU/MO PrP se extendieron los estudios acerca de esta protena. La sustitucin de un residuo HU en la posicin 214 218 prevena la formacin de PrPSC. Las cadenas laterales de estos residuos protruan de la misma supercie del extremo COOH-terminal de la hlice a formando un epitope discontinuo con los residuos 167 y 171 en asas adyacentes. Sustitucin de residuos bsicos en las posiciones 167,171 218 prevenan la formacin de PrPSC, stas PrPs mutantes parecen actuar como "dominantes negativas" ligando a la protena X e inactivndola para el proceso de propagacin del prion. Estos resultados experimentales parecen explicar el efecto protector de los residuos bsicos polimrcos en las PrP tanto de humanos como de animales.!

Pudiendo constituir stas un rea de importante potencial teraputico, debe ahondarse ms. Como es sabido la PrP transcurre en una profunda transicin estructural, durante la propagacin del prion, muchas protenas como las chaperonas participan en este proceso, cabe preguntarse entonces si la protena X funge como una chapern molecular clnico, otorgando ventajas protectoras o facilita el rol patgeno de la PrP. Lo cierto es que los estudios son sugestivos y que hasta el momento no se ha descrito chapern molecular alguno que intervenga en la formacin del prion (35,42,54).!

Hasta el momento interferir en la conversin de PrPC a PrPSC parece ser la alternativa teraputica ms atractiva. De esta manera las estrategias ms razonables seran: estabilizar la estructura de la PrPC va formacin de un complejo droga-PrPC o mediante la modicacin de la accin de la protena X, la cual podra fungir como un chapern molecular. Aun est por determinarse si resulta ms efectivo disear una droga que se ligue a la PrPC al sitio de unin de la protena X o una droga capaz de mimetizar la estructura de la PrPC con residuos polimrcos bsicos capaces de prevenir la infeccin (35,42,54).!

4. Dentro del esquema de inmunoterapia debe considerarse tambin el rol de las interleuquinas y citoquinas. Aun cuando no existe mayor informacin experimental al respecto, si hay ciertos detalles que son esenciales a considerar y que plantean la manipulacin con TNFa como alternativa

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teraputica, especialmente en la fase inicial perifrica de la infeccin como se describe en el experimento a continuacin.!

Utilizando ratones inmunodecientes, se investigaron los tipos celulares a nivel esplnico que intervenan en el proceso infeccioso y su propagacin. En los ratones carentes de TNF (TNFa-1-) se evidenci la carencia de centros germinales y clulas dendrticas foliculares. En contraste en los tejidos de ratones carentes de Il-6 (Il-6-1-) las cuales expresaban centros de conexin y clulas dendrticas foliculares con centros germinales inconstantes. Cuando ambas cepas de ratones TNFa-1- e Il-6-1- fueron inoculados directamente al SNC (con la cepa Sc ME7) 100 % de ellos fueron susceptibles desarrollando la enfermedad en un corto perodo de incubacin; no obstante al ser inoculados perifricamente la mayora de los TNFa-1- no desarrollaron enfermedad en tanto que los Il-6-1- sucumbieron en su totalidad. Todo esto indica el importante papel de las clulas dendrticas foliculares en la replicacin perifrica y como la neutralizacin del TNFa constituye una alternativa teraputica (49).!

La sobre-expresin de TNFa ha sido interpretada como una llave inicial en el desarrollo de patologas inamatorias, infecciosas y autoinmunes del SNC (incluyendo la meningitis, esclerosis mltiple y malaria cerebral). La neutralizacin de este en roedores previene lesiones inamatorias y desmielinizantes, en encefalomielitis autoinmunes experimentales. La induccin de Il-1a, Il-1, Il-6 y TNFa ha sido reportada en modelos de scrapie en roedores, sugiriendo que las citoquinas juegan un papel importante en la patognesis neurodegenerativa y por ende un importante blanco teraputico (49).!

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5. La creacin de animales knock-out aporta otra alternativa; se ha demostrado que tras eliminar el gen que codica para la PrP no ocurren consecuencias siolgicas, resultando el papel de la PrP constitutiva no esencial para ningn proceso. El problema de estos planteamientos en la rama teraputica radica en la forma de depositar polinuclotidos teraputicos en el SNC (3).! 6. ltimamente se ha experimentado con el uso de ciertas sustancias que han demostrado algunos efectos; el mecanismo de accin de la anfotericina no se conoce, pero se sabe que tanto el Rojo Congo como ciertos antibiticos derivados de la antraciclina se unen, intercalan y clivan la altamente ensamblada estructura de la PrPSC (42,55).! Desafortunadamente la investigacin en el desarrollo de nuevos frmacos para esta rea no resulta atractiva a la industria farmacutica por su baja incidencia, tal vez con el surgimiento de la epidemia de encefalopata bovina se haga necesario el desarrollo de nuevos agentes. Si la industria no se toma este esfuerzo las consecuencias sern inmensurables.!

! IX. Consideraciones en dermatologa! ! IX. I La piel y la protena prionica! ! !

En la ltima dcada la piel ha sido blanco de invalorables investigaciones mdico- biolgicas, que nos han mostrado a sta como un rgano complejo, en donde se desarrollan innumerables interacciones celulares y moleculares, que intervienen en complicados sistemas de regulacin y en mecanismos de control de suma importancia frente a nuestro medio ambiente (56).! Ambas capas de la piel, tanto el componente externo o epitelial (epidermis) as como el componente interno (dermis o corin) albergan nutridos grupos celulares. La epidermis presenta tres tipos de clulas que facilitan sus caractersticas funcionales, stas son: 1. Los melanocitos, 2. Las clulas Langerhans y 3. Las clulas de Merkel. Por su parte, las clulas que incluyen la dermis: son bsicamente broblastos, macrfagos y mastocitos (56-58).!

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Todas estas clulas juegan un papel en la homeostasis y respuesta inmune de la piel, especial mencin merecen dos de las constituyentes de la epidermis. Por un lado, las clulas de Langerhans que son clulas histiocticas, dendrticas, que captan y procesan las seales antignicas y comunican esta informacin a las clulas linfoides (27,59-61), cuyo rol junto a los macrfagos ha sido ampliamente desarrollado en lo que respecta a la fase perifrica de la infeccin por priones. Y, por otra parte, las clulas epiteliales escamosas o queratinocitos consideradas elementos de extrema importancia en la biosntesis de citoquinas fundamentales para la regulacin funcional de las clulas epidrmicas adyacentes y de las muchas otras que constituyen el microambiente drmico (62,63).!

La isoforma constitutiva de la protena prionica se expresa en numerosos tejidos y grupos celulares, fungiendo un amplio nmero de funciones ya descritas y encontrndose las ms altas concentraciones en el SNC (3,5,40). En piel, se ha detectado la protena prionica en su forma constitutiva por medio de tcnicas inmunohistoqumicas en queratinocitos. Curiosamente, adems de su caracterizacin in vitro, la expresin de la PrPc en estas clulas ha presentado una fuerte sobrerregulacin en pacientes con enfermedades inamatorias de la piel (eczema, psoriasis y ulceraciones) (64).!

! IX. II Dermatopatogenia! !

Hasta el momento se ha descrito la transmisin horizontal de la infeccin prionica en pacientes que han recibido trasplantes de crnea (36), pacientes que han sido expuestos a equipos neuroquirrgicos contaminados, por contacto con secreciones contaminadas, como por ejemplo de mucosa nasal (38) e, incluso se ha propuesto la va transfusional (37). Sin embargo, antes del advenimiento de la tecnologa recombinante y hasta el momento, el uso de la hormona de crecimiento extrada de cadveres humanos constituye la fuente iatrognica de infeccin ms importante.!

Se ha comprobado que las supercies epiteliales constituyen una puerta de entrada importante para la protena crinica, si existe una lesin previa que haga vulnerable la propiedad de barrera, o incluso, si se inocula directamente el material contaminado. Esto ha sido demostrado experimentalmente practicando escaricados de piel con material quirrgico contaminado en ratones inmunocompetentes que luego han desarrollado la enfermedad (65). Es importante resaltar este hecho, ya que constituye un factor de transmisin ocupacional para personal de laboratorio, mdicos y personal que labore en salas de autopsias y que pueda exponerse incidentalmente o infectarse tras entrar en contacto con material contaminado (65,66).!

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Las evidencias experimentales indican que la ruta de infeccin transdrmica constituye el mismo riesgo al que implica la inoculacin intravenosa o intraperitoneal (65,66).! Para la ocurrencia de la infeccin, tras la exposicin a la PrPsc se plantea que ocurra una primera y esencial interaccin con el tejido linfoide asociado a piel y mucosas, de donde posteriormente pudiera ocurrir propagacin a otros rganos linfoides a nivel sistmico (67,68). Aun cuando no se han encontrado evidencias empricas que respalden que clulas de la periferia sean las encargadas de transportar a los priones, los macrfagos parecen fuertemente implicados en este proceso, tanto por su propiedad fagocticas, as como por su movilidad (44). Sin embargo, no debe perderse de vista otro grupo celular de vital importancia como lo son las clulas de Langerhans, las cuales proporcionan la principal va de presentacin a las clulas T nativas de los antgenos que penetran por va cutnea (27,61).!

Las clulas de Langerhans por tratarse de un tipo de clulas dendrticas podran servir como reservorio del agente prionico, durante una primera fase de latencia (perifrica) (51-53). stas, tras unir al agente, lo interiorizan y lo procesan, para migrar desde la epidermis a los vasos linfticos, y de

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aqu a los ganglios. Seguida y nalmente, residen en las regiones parafoliculares de la corteza (donde reciben el nombre de clulas dendrticas interdigitantes) y donde su funcin es la de presentar al antgeno a las clulas T CD4+ nativas (61).!

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No obstante, distintos pptidos de la protena prionica son presentados en asociacin con antgenos del complejo mayor de histocompatibilidad tipo II. Este complejo, por tanto, resulta en la activacin de las clulas T CD4+ especcas, que contrariamente a lo que se crey por tanto tiempo s conlleva a una respuesta especca hacia la PrP no constitutiva, como ha sido demostrado por la produccin de anticuerpos (69).! Es importante destacar igualmente, el rol que juegan los linfocitos B en el proceso de neuroinvasin a nivel perifrico. Tal vez la ruta de propagacin ms prominente ocurre cuando las clulas B contactan con las terminaciones nerviosas, sobre todo a nivel esplnico (21). Sin embargo, esto no descarta el papel que puedan jugar otras clulas de transferencia.! El contacto directo de la PrPsc con los terminales nerviosos (estableciendo un corto circuito al sistema linforeticular) parece ser la va menos eciente de todas (21), resaltando el importante papel del sistema inmune en esta patologa. Asimismo, debe destacarse que la transferencia fsica del agente infeccioso de una clula linfoide a una neurona debiera ser mediada por una molcula "ligando", funcin para la cual se ha propuesto a la protena "X", ya mencionada con anterioridad (21).!

! IX. III Riesgo de transmisin en dermatologa! !

Como ya se ha mencionado, los priones pueden adherirse a supercies metlicas como en el caso de electrodos (39), as como piezas de instrumental quirrgico, constituyendo estas supercies metlicas vehculos excelentes para la contaminacin experimental (68,70). Esta caracterstica, sumada al hecho de que la PrPsc es ampliamente resistente a los mecanismos tradicionales de desterilizacin, se aade para conferir una situacin de alto riesgo. La esterilizacin instrumental de acero inoxidable utilizando formaldehdo (3,70) y exposicin a altas temperaturas han fallado en la eliminacin del agente; distinguindose incluso una alta estabilidad al calor de la isoforma no constitutiva que puede llegar a superar los 150 grados en comparacin con la forma constitutiva del prion (70).!

Adems del uso del material quirrgico contaminado los dermatlogos deben mantenerse alertas en el uso de productos biolgicos empleados en el rea de la cosmetologa (66,68), sobre todo de aquellos que deriven del uso de tejidos bovino (64,68), y humanos (66). Es importante en primera instancia, mencionar el uso de soluciones inyectables de colgeno bovino hoy disponibles en varias presentaciones en el mercado, ya que ha sido durante largo tiempo reconocido como un material altamente biocompatible para el uso de implantes drmicos (68). Sin embargo, hoy en da, posterior a la epidemia de encefalopata bovina espongiforme, se han extremado las medidas de bioseguridad por parte de la Food and Drug Administration (FDA) y la USDA (Animal and plant health inspection service) (66). Los derivados del cido hialurnico utilizados para relleno y aumento tisular (71) as como los injertos utilizados para la cicatrizacin de heridas, tericamente trasmiten la enfermedad (68).!

Aun cuando no se han encontrado evidencias certeras del contagio por va transfusional o por el uso de derivados sanguneos (37) el uso de la toxina botulnica empleados para nes estticos ha sido cuestionado, ya que los derivados comerciales existentes hoy en da consisten de la neurotoxina asociada a albmina srica humana a n de estabilizar el complejo y prevenir su agregacin en supercies (66). Para prevenir los riegos de infeccin la FDA ha ampliado los criterios de exclusin de los "pool" de donantes.!

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En conclusin, aun cuando no se ha documentado casos de contagio por va transfusional, uso de hemoderivados, plasma, neurotoxinas o compuestos tisulares animales, no deben descuidarse las medidas de vigilancia clnico-epidemiolgicas as como el riguroso monitoreo en los procesos de manufactura de productos biolgicos.!

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