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MICROBIOLOGIA
ATIVIDADE PRTICA ASSUNTO Estudo da atividade Metablica das Bactrias para identificao taxonomica. I-INTRODUO. Os microrganismos atravs de en imas e atividades metablicas produ em em determinados meios de cultura altera!es "ue podem ser evidenciadas atravs dos produtos finais e intermedi#rios do metabolismo. $endo assim podemos utili ar essas altera!es para evidenciar a presena e a ao de en imas "ue certos microrganismos elaboram. %odo microrganismo apresenta o seu prprio sistema en im#tico espec&fico' o "ual respons#vel pela metaboli ao de substratos "ue conten(am fontes de )arbono diversas tais como' )arboidratos'*licos&deos' +lcoois poli,(&dricos' e tambm fontes de -itrog.nio' /rote&nas outras subst0ncias nitrogenadas. )ada microrganismo ento capa de metaboli ar' segundo o seu sistema en im#tico espec&fico' diferentes nutrientes para obteno de )arbono e -itrog.nio. 1s principais fontes de )arbono dispon&veis para os microrganismos so2 CARBOIDRATOS: Monossacar&deos2 glicose. 3issacar&deos2 maltose' sacarose' lactose etc. /olissacar&deos2 amido' glicog.nio etc. PROTENAS: GLICOSDEOS2 esculina. 1s principais fontes de -itrog.nio dispon&veis para os microrganismos so2 PROTENAS: pept&deos. amino#cidos. OUTRAS SUBSTNCIAS NITROGENADAS 1s rea!es bio"u&micas 4provas bio"u&micas5 reali adas' 6in vitro7' consistem na verificao das altera!es e transforma!es "ue ocorrem num substrato pela ao de en imas presentes em determinado microrganismo. $endo assim algumas destas rea!es bio"u&micas so utili adas com recurso auxiliar importante para a identificao e diferenciao de g.neros e espcies microbianas. II - OBJETIVOS 8 1, Evidenciar a ao de en imas bacterianas envolvidas no metabolismo dos )arboidratos e das /rote&nas. 9, :nterpretar as rea!es e altera!es produ idas nos meios de cultura decorrentes do seu metabolismo de diferentes espcies bacterianas. ;, 3escrever os princ&pios de cada <eao Bio"u&mica reali ada. =, 3escrever o perfil bio"u&mico das culturas bacterianas testadas para a sua identificao taxonomica . >, <econ(ecer a )oprocultura como um exemplo de mtodo microbiolgico para identificao de bactrias patog.ncias e de interesse cl&nico. manitol' glicerol' sorbitol.

ESQUEMA SIMPLIFICADO DE ROTINA MICROBIOLGICA PARA ENTEROBACTRIAS

1.)oleta 1MO$%<1$ ?E@E$

9 $uspenso $alina *licerinada %amponada

ESTUFA !"C#$%& ESTUFA !"C#$%&

; :solamento prim#rio 1gar Mac )onFeG 1gar $angue

ESTUFA !"C#$%&

= 1nalise Macroscpica e Microscpica das )olHnias )OBI-:1$ %J/:)1$ )olorao de *ram Bacilos *ram /ositivos negativos Bacilos *ram negativos )ocos *ram /ositivos ou *ram negativos

:dentificao %1KO-IM:)1 %estes de $ensibilidade 1-%:B:O*<1M1 :3E-%:?:)1CDO B:OLAJM:)1

$O<O%:/:?:)1CDO Esc(eric(ia coli $almonella $(igella Eersinia

<E$AB%13O ?:-1B

COPROCULTURA R'()*+' ,-+- *.'/-0)1(' ) *2)1(*3*4-56' 2) E1()+'7-4(8+*-.. 9.C'/)(-. 1s amostras de fe es devem ser coletadas em frascos de boca larga' limpos' secos e esterili ados.
Obs. 1ps a obteno do material fecal a an#lise dever# ser reali ada o mais r#pido poss&vel ' na impossibilidade' deve,se conservar sob refrigerao. $. T+-1.,'+() ) ,+),-+' 2- -0'.(+- ,-+- *1:4*' 2- +'(*1- -1-/:(*4-2 9.1. %ransporte e preparo da $uspenso de fe es. 9.9. Enri"uecimento das fe es para pes"uisa de $almonella e $(igella. . P/-;<)-0)1(' 2-. -0'.(+-. =.<.,)1.6'> )0 0)*' 2) A?-+ S-1?<) ) S)/)(*@'.#D*3)+)14*-2'+).. .9. P/-;<)-0)1(' - ,-+(*+ 2- .<.,)1.6' 2) 3)A).. , )om o aux&lio da ala de platina' atravs do mtodo semeadura por esgotamento ou varredura' foi inoculado no seguinte meio de cultura2 M1gar Mac. )onFeG , :ncubado em estufa ;NO) durante 9= (oras. 9B ETAPA DA AULA :niciar os testes identificando os meios de cultura com a letra da cultura teste' utili ando tcnicas de semeadura ade"uadas a cada um dos testes a ser reali ado' seguir as orienta!es do professor. %. A1C/*.) M-4+'.4',*4- ) M*4+'.4D,*4- 2-. C'/E1*-. %.9. A1C/*.) M-4+'.4',*4- 2' A?-+ M-4 C'1F)G D*3)+)14*-56' M-4+'.4D,*4- 2-=.> 4'/E1*-=.>: ,)olHnias cor <osa. ?ermentadoras de Bactose ,)olHnias :ncolores. -o fermentadoras de Bactose %.$., C-+-4()+*A-56' M*4+'.4D,*4- 2-=.> C'/E1*-=.>: <eali ar a colorao de *ram da4s5 colHnia4s5 selecionada4s5.
1. 2. 3. 4. !. #. $. %. '. TCNICA DE COLORAO DE GRAM. Colocar a lmina sobre um suporte de colorao e cobrir o esfregao com Violeta de Genciana, aguardar 1 minuto. Escorrer o corante e lavar com gua corrente. Cobrir o esfregao com Lugol, aguardar 1 minuto. avar com lcool ! Acetona. "mediatamente, lavar com gua corrente. Cobrir o esfregao com "uc#ina de G$am, aguardar %& #egundo#. Escorrer o corante e lavar com gua corrente. &ecar a lmina entre papel de filtro. E(aminar o esfregao corado ao microsc)pio com ob*etiva de 1++, - imerso..

%. I1()+,+)(-56' P+).<1(*@- ,-+- 7-4*/'. G+-0 1)?-(*@'. )0 0)*' 2) A?-+ M-4. C'1F)G:
Ca$acte$'#tica# da# Col(nia# )$o*+*el Mic$o$gani#mo //////////////////////////////////////////////////////////////////////// "ncolor, transparente Proteus sp, Salmonella sp, Shigella sp 0rande, 1osa c23alo turvo Escherichia coli. 0rande, 1osa 4uc)ide Klebsiella sp, Enterobacter sp

R).</(-2' ,-+4*-/ 4'0 7-.) 1- M-4+'.4',*- ) M*4+'.4',*- 2-. 4'/E1*-. 2' A?-+ M-4 C'1F)G: HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

I. I2)1(*3*4-56' B*';<:0*4- = A?-+ TSI ) P+'@-. B*';<*0*4- >. $elecionar as colHnias do 1gar Mac )onFeG e inocular nos seguintes meios de %$: e /rovas Bio"u&micas2
ObPetivos2
a5 <E)O-QE):ME-%O 3O$ M1%E<:1:$' ME:O$ 3E )AB%A<1 E <E1%:RO$.

b5 :-O)AB1CDO 3E 1MO$%<1$ 3E )AB%A<1$ B1)%E<:1-1$ EM 3:?E<E-%E$ ME:O$ 3E )AB%A<1'

I.9 AGAR T.S.I A?-+ T+:,/*4) A5J4-+ F)++' -. = TRIAGEM > )om auxilio da agul(a de inoculao semear' a colHnia selecionada' na profundidade e tambm na superf&cie inclinada do meio de 1gar %.$. :. :ncubar S ;NO)T9=(oras. 1ps o per&odo de incubao proceder a Beitura I.$ PROVAS BIOQUMICAS PROVA DA FENILALANINA )om auxilio da agul(a de inoculao semear' a colHnia selecionada' na profundidade e tambm na superf&cie inclinada do meio de 1gar ?enilalania. :ncubar S ;NO)T9=(oras. 1ps o per&odo de incubao proceder a Beitura PROVA DO CITRATO, )om auxilio da agul(a de inoculao semear' a colHnia selecionada' na profundidade e tambm na superf&cie inclinada do meio de 1gar ?enilalania. :ncubar S ;NO)T9=(oras. 1ps o per&odo de incubao proceder a Beitura PROVA DE MOTILIDADE )om auxilio da agul(a de inoculao semear' a colHnia selecionada' na profundidade e tambm na superf&cie inclinada do meio de 1gar )%1. :ncubar S ;NO)T9=(oras. 1ps o per&odo de incubao proceder a Beitura PROVA DE INDOL )om auxilio da ala de inoculao semear' a colHnia selecionada' no meio de 1gua de /eptona. :ncubar S ;NO)T9=(oras. 1ps o per&odo de incubao proceder a Beitura PROVA DE VM =VERMELKO DE METILA )om auxilio da 1la de inoculao semear' a colHnia selecionada' no meio de )aldo M<,R/. :ncubar S ;NO)T9=(oras. 1ps o per&odo de incubao proceder a Beitura PROVA DE VP4VOGES-PROSLAUER5, )om auxilio da 1la de inoculao semear' a colHnia selecionada' no meio de )aldo M<,R/. :ncubar S ;NO)T9=(oras. 1ps o per&odo de incubao proceder a Beitura

$B ETAPA M L)*(<+-

>

%. A1C/*.) M-4+'.4',*4- ) M*4+'.4D,*4- 2-. C'/E1*-. )0 A?-+ M-4 C'1F)G %.9. A1C/*.) M-4+'.4',*4- 2' A?-+ M-4 C'1F)G D*3)+)14*-56' M-4+'.4D,*4- 2-=.> 4'/E1*-=.>: ,)olHnias cor <osa. ?ermentadoras de Bactose ,)olHnias :ncolores. -o fermentadoras de Bactose %.$., C-+-4()+*A-56' M*4+'.4D,*4- 2-=.> C'/E1*-=.>: <eali ar a colorao de *ram da4s5 colHnia4s5 selecionada4s5.
1+. 11. 12. 13. 14. 1!. 1#. 1$. 1%. TCNICA DE COLORAO DE GRAM. Colocar a lmina sobre um suporte de colorao e cobrir o esfregao com Violeta de Genciana, aguardar 1 minuto. Escorrer o corante e lavar com gua corrente. Cobrir o esfregao com Lugol, aguardar 1 minuto. avar com lcool ! Acetona. "mediatamente, lavar com gua corrente. Cobrir o esfregao com "uc#ina de G$am, aguardar %& #egundo#. Escorrer o corante e lavar com gua corrente. &ecar a lmina entre papel de filtro. E(aminar o esfregao corado ao microsc)pio com ob*etiva de 1++, - imerso..

%. I1()+,+)(-56' P+).<1(*@- ,-+- 7-4*/'. G+-0 1)?-(*@'. )0 0)*' 2) A?-+ M-4. C'1F)G:
Ca$acte$'#tica# da# Col(nia# )$o*+*el Mic$o$gani#mo //////////////////////////////////////////////////////////////////////// "ncolor, transparente Proteus sp, Salmonella sp, Shigella sp 0rande, 1osa c23alo turvo Escherichia coli. 0rande, 1osa 4uc)ide Klebsiella sp, Enterobacter sp

R).</(-2' ,-+4*-/ 4'0 7-.) 1- M-4+'.4',*- ) M*4+'.4',*- 2-. 4'/E1*-. 2' A?-+ M-4 C'1F)G: HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH I. PROVAS BIOQUMICAS
a5 ER:3E-):1CDO e :-%E</<E%1CDO 31$ /<OR1$ B:OLAJM:)1$. b5 ER:3E-):1< 1 /<E$E-C1 3E E-@:M1$ B1)%E<:1-1$ <EB1):O-131$ U$ /<OR1$ B:OLAJM:)1$ <E1B:@131$.

LEITURA DOS RESULTADOS L)*(<+- 2' A?-+ T.S.I. = A?-+ T+:,/*4) A5J4-+ F)++'> 15 /ara a leitura do %$: ' deve,se observar a alcalini ao ou acidificao do meio nas regi!es do +pice e da Base' isso verificado atravs da mudana de cor do meio de cultura' ou sePa2 1M1<EBO RE<MEBQO4)E<EV15 RE<MEBQO %:VOBO. M1-)Q1$ -E*<1$ BOBQ1$ 1):3:?:)1CDO 1B)1B:-:@1CDO ME:O :-1B%E<13O 4 1us.ncia de )rescimento5 /<E$E-C1 3E Q9$. /<E$E-C1 3E *+$.

I2)1(*3*4-56' P+).<1(*@- 2) GN1)+'.#E.,84*). ,+'@C@)*. 7-.)-2'. 1'. +).</(-2'. 2' T.S.I. A?-+. APCE BASE GS K$S GN1)+'.#E.,84*). +):3O +):31 O Escherichia coli, Enterobacter sp ,Klebsiella sp 1):3O 1):31 Salmonella typhi, Escherichia coli, Serratia sp 1):3O 1):31 O O Salmonella sp, Citrobacter sp, Proteus sp 1lcalino 1):31 O Salmonella sp, Citrobacter sp, Hafnia alvei Escherichia coli, Morganella sp, Providncia sp 1lcalino 1):31 Salmonella typhi, Shigella sp, E.coli Morganella sp,Providncia sp,Serratia sp 1lcalino 1):31 O Salmonella typhi 1lcalino 1):31 O O Salmonella Sp, Citrobacter Sp, Ed ardsiella Sp, Proteus Sp 1 cultura -OXXXXXXX constitu&da por bactrias do *.neroTEspcie2 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX L)*(<+- 2-. ,+'@-. B*';<:0*4-.. I12'/ , 1dicionar ao meio de cultura' )aldo +gua de /eptona' ; a > gotas de reativo para indol2 /resena de anel vermel(o , reao /ositiva. I12'/ positivo /resena de anel acastan(ado , reao -egativa. I12'/ negativo VM-V)+0)/&' 2) M)(*/- , 1dicionar ao meio de cultura')aldo M<,R/' = gotas de vermel(o de metila. /resena de colorao vermel(a , VM positivo /resena de colorao acastan(ada , VM negativo VP-V'?).-P+'.F-<)+ , 1dicionar ao meio de cultura' )aldo M<,R/' Y'Wml de alfa,naftol e Y'9 ml de ZOQ =Y[ para cada 1 ml de cultura. /resena de colorao vermel(a , VP positivo. /resena de colorao acastan(ada , VP negativo C*(+-(' , mudana de colorao no meio de cultura 1gar )itrato de $immons . )olorao 1 ul , C*(+-(' /ositivo. )olorao Rerde , C*(+-(' -egativo. M'(*/*2-2) , observar a difuso do inculo no meio de cultura 1gar )%1. )rescimento locali ado e difuso provocando turbide - M'(*/*2-2) /ositiva. )rescimento locali ado do inculo sem turbide - M'(*/*2-2) -egativa. F)1*/-/-1*1- , adicionar ao meio de cultura' 1gar ?enilalanina' > a N gotas de cloreto frrico. /resena de colorao verde , F)1*/-/-1*1- /ositiva. /resena de colorao amarela , F)1*/-/-1*1- -egativa. 1 cultura -OXXXXXXX constitu&da por bactrias do *.neroTEspcie2 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
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