CAPTULO 2.3.4.

LEUCOSIS BOVINA ENZOTICA

RESUMEN
La leucosis bovina enzotica (LBE) es una enfermedad del ganado bovino adulto causada por el retrovirus de la leucemia bovina (BLV). El ganado puede infectarse a cualquier edad, incluida la fase embrionaria. La mayora de las infecciones son subclnicas, pero un porcentaje del ganado mayor de 3 aos ( 30%) desarrolla linfocitosis persistente y una pequea proporcin de linfosarcomas (tumores) en varios rganos internos. Tambin se ha registrado infeccin natural en bfalos, ovejas y capibaras. Los sntomas clnicos, cuando se presentan, dependen de los rganos afectados. El ganado con linfosarcomas casi siempre muere sbitamente o en semanas o meses despus de la aparicin de los sntomas clnicos. Identificacin del agente: Los virus se pueden aislar por cultivo de linfocitos perifricos y la demostracin del virus se puede lograr por microscopa electrnica o por pruebas de deteccin del antgeno de BLV. Por la reaccin en cadena de la polimerasa se puede detectar el ADN del provirus en la sangre perifrica o en los tumores. Pruebas serolgicas: Los mtodos ms utilizados son la inmunodifusin en medio slido (IGDA) de sueros o el enzimoinmunoensayo (ELISA) para sueros o muestras de leche. En muchos pases estas pruebas constituyen la base de polticas acertadas de erradicacin. Tambin pueden utilizarse otras pruebas como el radioinmunoensayo. Se han comercializado. varios kits de pruebas IGDA y ELISA. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: No existen vacunas contra el BLV.

A. INTRODUCCIN
Pueden existir varias causas de los linfosarcomas del ganado bovino, pero la nica causa conocida es el retrovirus de la leucemia bovina (BLV), que origina la leucosis bovina enzotica (LBE). El trmino leucosis bovina espordica (LBES) se reserva normalmente para los linfomas de tipo cutneo y tmico de los terneros, que se definen por la edad del animal afectado y por la distribucin de los tumores. Se desconoce la causa o causas de la LBES. Tambin hay condiciones linfosarcomatosas que no corresponden a las categoras de la LBES o la LBE, como el caso del linfoma multicntrico de adultos, de aparicin espordica y de etiologa desconocida. Solamente deben denominarse leucosis o Leucosis enzotica bovina a los linfomas causados por infeccin con BLV. Aunque los animales pueden infectarse con BLV a cualquier edad, los tumores (linfosarcomas) se observan tpicamente en animales de ms de 3 aos. Normalmente las infecciones son subclnicas; solamente el 30-70% del ganado infectado desarrolla una linfocitosis persistente, y el 0,1-10% desarrolla tumores. Los sntomas dependen del lugar en que aparecen los tumores y pueden incluir desarreglos digestivos, inapetencia, prdida de peso, debilidad general y, a veces, manifestaciones neurolgicas. Los ganglios linfticos superficiales pueden verse inflamados y se pueden palpar bajo la piel o por examen rectal. Los rganos implicados con ms frecuencia son la cuarta cavidad del rumen, la aurcula derecha del corazn, el bazo, el intestino, el hgado, el rin, la tercera cavidad del rumen, los pulmones y el tero. La susceptibilidad del ganado a una linfocitosis persistente est determinada genticamente, y quiz tambin el desarrollo del propio tumor. Existen dudas sobre el papel del virus como causa de la deficiencia inmunolgica o del aumento de prdidas selectivas. En un estudio se demostr que las manadas infectadas con BLV presentaban menor produccin lctea (2,5-3% a nivel de la manada) y un aumento en la tasa de prdidas selectivas, as como una mayor susceptibilidad a otras enfermedades de etiologa infecciosa, del tipo de la mastitis, diarrea y neumona, pero el efecto sobre la fertilidad fue escaso (9).

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B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
El virus puede detectarse por cultivo in vitro de linfocitos de la sangre perifrica. En los linfocitos sanguneos y en clulas tumorales el virus se presenta como un provirus integrado en el ADN de la clula. Tambin se encuentra en la fraccin celular de varios lquidos del cuerpo (fluidos nasales y bronquiales, saliva, leche). La transmisin natural depende de la transferencia de clulas infectadas, por ejemplo durante el parto. Tambin se produce transmisin artificial, especialmente por agujas contaminadas con sangre, equipo quirrgico, guantes usados en exmenes rectales, etc. La trasmisin horizontal en ausencia de estos factores suele ser baja. En regiones con muchos insectos chupadores de sangre, especialmente tbanos, stos pueden transmitir el virus de forma mecnica. Aunque se pueden infectar varias especies animales por inoculacin con el virus, la infeccin natural solo tiene lugar en el ganado bovino (Bos taurus y Bos indicus), en bfalos y en capibaras. Las ovejas son muy susceptibles a la inoculacin experimental y a menudo desarrollan tumores a una edad ms temprana que el ganado bovino. Tambin pueden detectarse anticuerpos persistentes despus de una inoculacin experimental en ciervos, conejos, ratas, cobayas, gatos, ovejas, monos rhesus, chimpancs, antlopes, cerdos, cabras y bfalos. Probablemente el BLV estaba presente en Europa durante el siglo XIX, desde donde se extendi al continente americano en la primera mitad del siglo XX. Puede haber regresado a Europa y a otros pases, con la importacin de ganado norteamericano (11). Varios pases han sido reconocidos oficialmente como libres de infeccin por BLV. Se han realizado diversos estudios para determinar si el BVL causa enfermedades en humanos, sobre todo por el consumo de leche de vacas infectadas. Sin embargo, no existe evidencia concluyente de transmisin, y en la actualidad se considera que el BLV no representa un peligro para el hombre.

1.

Identificacin del agente

El BLV es un retrovirus exgeno relacionado desde el punto de vista estructural y funcional con los virus humanos 1 y 2 que infectan los linfocitos T (HTLV-1 y HTLV-2). Las principales clulas diana del BLV son los linfocitos B. Las partculas vricas constan en esencia de un ARN de cadena sencilla, la nucleoprotena p12, la protena p24 de la cpsida, la glicoprotena transmembrana gp30, la glicoprotena de la envuelta gp51, y varias enzimas entre las que se incluye la transcriptasa inversa. El ADN del provirus, que se genera por trascripcin inversa de la mayor parte del genoma vrico, se integra al azar en el ADN nuclear de la clula hospedadora, donde permanece sin dar lugar a virus libres in vivo. Cuando las clulas infectadas se cultivan in vitro, generalmente mediante co-cultivo de linfocitos con una lnea celular indicadora, se producen virus infecciosos, lo que sucede ms rpidamente si se estimulan las clulas con mitgenos (16).

a)

Aislamiento del virus

Las clulas mononucleares se aslan en un gradiente de densidad a base de ficoll/metrizoato sdico, partiendo de 1,5 ml de sangre tratada con etiln diamino tetra-actico (EDTA). Despus se cultivan con 2 x 106 clulas de pulmn bovino fetal (FBL) y se cultivan durante 3-4 das en 40 ml de medio mnimo esencial (MEM) con 20% de suero bovino fetal. El virus forma sincitios en la monocapa celular. Se pueden preparar cultivos de corta duracin, cultivando durante 3 das las clulas mononucleares en una bandeja de plstico con 24 pocillos en ausencia de las clulas FBL (13). Los antgenos p24 y gp51 pueden detectarse en el sobrenadante de los cultivos mediante radioinmunoensayo (RIA), enzimoinmunoensayo (ELISA), inmunotransferencia o por inmunodifusin en gel de agar (IGDA), y la presencia de partculas de BLV y de provirus se puede demostrar por microscopa y por PCR, respectivamente.

b)

Reaccin en cadena de la polimerasa

Varios autores han descrito la utilizacin de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar el provirus del BLV (3-5, 19). Con diversa eficacia, se han utilizado cebadores construidos para combinarse con las regiones gag, pol y env del genoma. El mtodo ms sensible y rpido es la PCR doble (anidada) seguida por electroforesis y tincin (4, 12). El mtodo descrito se basa en secuencias cebadoras del gen env, que codifica la gp51. Este gen est muy conservado, y tanto el gen como el antgeno estn generalmente presentes en todos los animales infectados a lo largo de las fases de la infeccin. La tcnica est limitada en su ejecucin a aquellos laboratorios que dispongan de servicios de virologa molecular, y deben tenerse en cuenta las precauciones normales y los procedimientos de control necesarios para asegurar la validez de los resultados de la prueba (ver Captulos I.1.4. y I.1.8.). Se han publicado otros protocolos de PCR para la deteccin de secuencias del provirus del BLV (3, 4, 19).

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La PCR anidada se aplica a la deteccin de la infeccin por BLV en animales individuales en las siguientes circunstancias: Terneros jvenes con anticuerpos del calostro, Casos de tumor, para diferenciar entre linfoma espordico e infeccioso, Tejido tumoral de casos sospechosos recogidos en mataderos, Nuevas infecciones, antes del desarrollo de anticuerpos contra el BLV, Casos de resultados dbilmente positivos o inciertos en pruebas de tipo ELISA, Anlisis sistemtico de ganado en centros de prueba de reproduccin (antes de la introduccin en centros de inseminacin artificial) Ganado empleado en la produccin de vacunas, para comprobar que estn exentos de BLV.

La prueba de PCR no es adecuada para utilizacin a nivel de manada, pero puede emplearse como una ayuda a la serologa en pruebas confirmativas. i) Sensibilidad y fiabilidad del mtodo Sensibilidad analtica Aunque la prueba de PCR anidada tiene una sensibilidad terica de una molcula problema, en la prctica la sensibilidad analtica es algo ms baja, alrededor de 5-10 molculas de ADN provrico por muestra. ii) Muestras positivas falsas La elevada sensibilidad del mtodo de la PCR anidada puede causar problemas de muestras falsas positivas debido a la contaminacin entre las muestras. Para reducir esto, se adoptan durante el anlisis varios procedimientos especiales, como la utilizacin de cabinas de flujo laminar, empleo de locales separados para las distintas fases del proceso, guantes nuevos en cada caso, uso de tubos de apertura especial para cada ensayo individual, controles negativos (blancos con agua), etc. Estas precauciones contra la contaminacin se han descrito extensamente (5). iii) Muestras negativas falsas Debe advertirse que solo una pequea proporcin de los linfocitos perifricos resulta infectada, lo que limita la sensibilidad del ensayo. La presencia en algunas muestras de sustancias inhibidoras puede originar resultados falsos negativos. Para detectar esto se utiliza en cada ensayo, por lo menos, un control positivo. Adems, a cada muestra se aaden controles internos (rplicas). La rplica es una molcula problema modificada que se amplifica con los mismos cebadores que la molcula problema real, pero que genera un producto ms largo en PCR, y que puede visualizarse mediante electroforesis en gel de agarosa. La rplica se aade a una concentracin baja y esto, junto con el mayor tamao del producto de la PCR, favorece una amplificacin del problema real (2). No obstante, es posible que la rplica compita con la verdadera molcula. Por tanto, puede ser necesario analizar cada muestra con y sin rplica. Preparacin de la muestra

Los linfocitos de la sangre perifrica (PBL) se separan de la sangre con EDTA utilizando el mtodo FicollPaque de separacin (Pharmacia & Upjohn, Uppsala, Sweden). Alternativamente, se puede utilizar la capa leucocitaria o incluso sangre completa, por ejemplo cuando las muestras se han congelado. Los tumores y otros tejidos deben homogenizarse para formar una suspensin al 10%. Extraccin del ADN

La purificacin del ADN total es un prerequisito para alcanzar una sensibilidad ptima. Se han comercializado varios mtodos de purificacin, por ejemplo el NucleoSpin (Macherey-Nagel) o el tratamiento con resina quelante (BioRad).

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El siguiente mtodo se basa en estudios de Singer-Sam et al. (17) y Walsh et al. (20). Se deben adoptar precauciones especiales en todos los pasos para evitar el riesgo de contaminacin (5). i) En un tubo eppendorf de 1,5 ml para cada muestra, se aaden 100 l de resina quelante (Sigma C7901 o Chelex de BioRad). A los tubos con la resina quelante se aaden 100 l de las muestras y 10 l de la rplica. Las muestras se agitan en un vrtex. Se cierran los tubos eppendorf y se incuban a 56C-60C durante 20 minutos. Los tubos se agitan en un vrtex durante 10 segundos. Se incuban los tubos a 96C durante 8-10 minutos. Los tubos se agitan en un vrtex durante 10 segundos y se colocan inmediatamente en hielo. Opcional: Todas las muestras se equilibran a una cantidad estndar de ADN (500 ng/reaccin) aplicando, por ejemplo, el mtodo Beta Globin (19).

ii)

iii) iv) v) vi) vii)

viii) Se centrifugan los tubos a 15.000 g durante 2 minutos. ix) i) Se utilizan 5 l en el ensayo de PCR. Procedimiento de PCR anidada Diseo de cebadores y secuencias Se han publicados varios protocolos de PCR para la deteccin de secuencias del provirus del BLV (3, 4, 19). Como ejemplo, se describe con detalle un ensayo de PCR basado en el desarrollado por Ballagi-Pordany et al. (3). La regin del BLV usada como diana es el gen de la gp51 (env). La secuencia empleada para el diseo de los cebadores est disponible en el banco de datos GenBank, con nmero de acceso K02120. Las secuencias de los cebadores son:

Oligo OBLV1A OBLV6A OBLV3 OBLV5

Secuencia (5-CTT-TGT-GTG-CCA-AGT-CTC-CCA-GAT-ACA-3) (5-CCA-ACA-TAT-AGC-ACA-GTC-TGG-GAA-GGC-3) (5-CTG-TAA-ATG-GCT-ATC-CTA-AGA-TCT-ACT-GGC-3) (5-GAC-AGA-GGG-AAC-CCA-GTC-ACT-GTT-CAA-CTG-3)

Posicin en K02120 5029 5442 5065 5376

Tamao del producto de PCRI: 440 bp; tamao del producto de PCRII: 341 bp; tamao del producto de la rplica: 761 bp.

ii)

Mezclas de reaccin Las mezclas de reaccin se combinan (excepto la muestra y la rplica) antes de aadirlas a los tubos de reaccin. Cada cinco muestras debe aadirse un control negativo (con agua bidestilada) y un control positivo. Los volmenes totales de mezcla se calculan multiplicando los volmenes indicados por el nmero total de muestras, incluyendo los controles, ms uno. Se utiliza polimerasa Taq a una pre-dilucin de 1/10. Las muestras de ADN y las rplicas (2) deben aadirse en recintos separados del laboratorio: el recinto nmero 1 para preparaciones de ADN y para rplicas, y el recinto nmero 2 para productos de la PCRII a fin de minimizar la contaminacin.
1

Disponible del Dr. Belk, Department of Virology, National Veterinary Institut, Box 585, Biomedical Centre, S-751 23, Uppsala, Suecia.

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a)

Reactivos aadidos en una habitacin limpia del laboratorio

Esta mezcla se puede preparar por adelantado y mantener a 4C hasta 1 mes.

Reactivos por reaccin (conc.) H2O bidestilada (estandarizada) 10 tampn para PCR (Perkin Elmer) dNTP (10 mM) Seroalbmina bovina (1 mg/ml) Cebadores (10 pmol/l): OBLV1A OBLV6A OBLV3 OBLV5 En total:

Reaccin PCRI 21 l 5 l 4 1 l 5 l

Reaccin PCRII 21 l 5 l 4 1 l 5 l

1.5 l 1.5 l 38 l

1.5 l 1.5 l 38 l

Lo siguiente debe aadirse inmediatamente antes de comenzar la PCR Reactivos por reaccin (conc.) MgCl2 (25 mM) Polimerase Taq (1 unidad/reaccin) Aceite mineral En total: b) Reaccin PCRI 5 l 2 l 2 gotas 45 l Reaccin PCRII 5 l 2 l 2 gotas 45 l

Reactivos aadidos en el recinto nmero 1 (ADN) 2 (PCRII) Reaccin PCRI 5 l 50 l Reaccin PCRII 5 l 50 l

Reactivos por reaccin (conc.) Muestra de ADN (o de agua) Producto de PCRI En total: iii) Perfiles trmicos de la PCR Para la PCRI 5 30 1 Para la PCRII 5 30 1 iv)

94C/45 segundos, 60C/60 segundos, 72C/90 segundos 94C/45 segundos, 55C/60 segundos, 72C/90 segundos 72C/420 segundos 20C

94C/45 segundos, 58C/60 segundos, 72C/90 segundos 94C/45 segundos, 53C/60 segundos, 72C/90 segundos 72C/420 segundos 20C

Procedimiento de laboratorio
I Mezclar los reactivos para la PCR como se describe en el paso ii. Cuando se aadan las muestras de ADN, utilizar guantes o abridores de tubos distintos para cada tubo individual. Colocar las muestras en

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hielo. Ajustar el termociclador a 80C. Poner las muestras en el termociclador e iniciar el programa de I la PCR (paso iii). Mezclar los reactivos para la PCRII como se describe en el paso ii. Usar guantes o abridores de tubos distintos para cada tubo individual cuando se aada el producto de la PCRI. Colocar las muestras en hielo. Ajustar el termociclador a 80C. Poner las muestras en el termociclador e iniciar el programa de la PCRII (paso iii). Electroforesis en gel de agarosa Llevar los productos de la PCRII al laboratorio de electroforesis. Depositar aproximadamente 10-15 l de las muestras y 23 l de tampn de carga en un gel de agarosa al 2% que contenga bromuro de etidio al 0,01%. La electroforesis se realiza a 90 mA durante 2 horas utilizando 0,5 x tampn Tris/borato/EDTA (TBE). Para controlar el tamao de los productos de amplificacin se recomienda un patrn de 100 bp. El anlisis de los productos de la PCR se realiza por iluminacin con luz UV. i) Interpretacin de los resultados Muestras positivas Las muestras positivas deben dar productos de PCR del tamao esperado (341 bp), similar al producto del control positivo. ii) Muestras negativas Las muestras negativas no deben dar productos de PCR del tamao esperado (341 bp), pero debe estar presente el producto de la rplica (144 bp). iii) Resultados dudosos El ensayo debe repetirse cuando los controles positivos (rplica o control positivo externo) son negativos o si los controles negativos con agua son positivos. Prueba confirmativa

Para una identificacin confirmativa, los productos de la PCR se pueden secuenciar, hibridar a una sonda o analizarse mediante anlisis del polimorfismo de fragmentos de restriccin (RFLP) (10).

2.

Pruebas serolgicas

La infeccin del ganado con el virus dura toda la vida y origina una respuesta persistente de anticuerpos, los cuales se detectan por primera vez a las 3-16 semanas post-infeccin. Los anticuerpos derivados de la madre pueden tardar de 6-7 meses en desaparecer. No hay modo de distinguir entre los anticuerpos adquiridos por transferencia pasiva y los que resultan como consecuencia de una infeccin activa. Sin embargo, la infeccin activa se puede confirmar por la deteccin del provirus del BLV mediante PCR. Los anticuerpos pasivos tienden a proteger a los terneros contra la infeccin. Durante el perodo prximo al parto, las vacas pueden tener anticuerpos sricos que son indetectables por IGDA debido al paso de los anticuerpos desde el sistema circulatorio de la vaca al calostro. Por tanto, cuando se utiliza la prueba IGDA, un resultado negativo de la prueba con suero tomado a ese tiempo (2-6 semanas antes del parto y 1-2 semanas despus del parto) no es concluyente y la prueba debe repetirse. No obstante, la prueba IGDA se puede realizar en esta fase con el calostro. Los anticuerpos que primero se detectan son los dirigidos contra gp51 y p24 del virus. La mayor parte de las pruebas rutinarias IGDA y ELISA detectan anticuerpos contra la glicoprotena gp51, que son de aparicin temprana. Se han descrito mtodos para realizar estas pruebas (6, 8). Existen sueros liofilizados para utilizar en ELISA como sueros estndar de la OIE, que son dbilmente positivos y negativos, y estn disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE en Inglaterra (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual). Estos sueros pueden emplearse para establecer la sensibilidad de las pruebas ELISA. Debe advertirse que aunque el suero dbilmente positivo se ha equilibrado para ser equivalente al E4 diluido 1/10, no es adecuado para utilizacin en la prueba IGDA. Como las disponibilidades son limitadas, se sugiere que los estndares de trabajo para ELISA sean locales y calibrados frente a sueros estndar.

a)

Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el mercado internacional)

Se puede utilizar un ELISA indirecto o un ELISA de bloqueo. Las pruebas basadas en estos principios estn comercializadas; se pueden necesitar kits diferentes para muestras de suero o de leche. Algunos ELISAs son lo suficientemente sensibles como para utilizarse con muestras mezcladas, acumuladas en comn. Las pruebas ELISA se realizan en la fase slida de microplacas. El antgeno del BLV se emplea para recubrir las placas, bien directamente o por medio de un anticuerpo policlonal o monoclonal (MAb) de captura. El antgeno se prepara de modo similar a como se hace para la prueba IGDA y se utiliza a una dilucin predeterminada (por ejemplo, 1/10) en solucin salina tamponada con fosfato (PBS). En forma de kit, las

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placas se adquieren a veces antigenizadas. Se pueden aadir algunos conservantes a las muestras de leche para evitar su agriamiento por fermentacin. Normalmente, las muestras con conservante no se deterioran de modo significativo si se conservan hasta 6 semanas a 4C.

Enzimoinmunoensayo indirecto ELISA para leche

El siguiente mtodo es adecuado para la deteccin de anticuerpos en muestras de leche de mezcla. Controles

En cada ensayo deben incluirse controles de leche fuertemente positiva, dbilmente positiva y negativa, y controles de diluyente. Un control fuertemente positivo se prepara diluyendo a 1/25 el suero estndar positivo de la OIE (E4 1/10) en leche negativa. Un control dbilmente positivo se prepara diluyendo el suero estndar positivo de la OIE (E4 1/10) 25 veces el nmero de muestras de leche individuales que componen el conjunto de leche problema. La leche utilizada para diluir los controles de suero estndar no debe ser pasteurizada, debe estar descremada y con conservante. i) Ejemplo de procedimiento de la prueba Las muestras de leche deben mantenerse en reposo en un refrigerador hasta que se forme una capa cremosa definida (24-48 horas), o alternativamente se centrifugan a 2.000 rpm durante 10 minutos. La capa cremosa se elimina antes de la prueba. En columnas alternadas, se unen a la placa de titulacin un antgeno de BLV y un control negativo de antgeno. Se mezclan 100 l de la muestran problema con 100 l de tampn de lavado para hacer una dilucin 1/2 en la placa, aadindolo a dos pocillos de control de antgeno y a dos pocillos con antgeno BLV. La placa se cierra y se mezcla el contenido de los pocillos en un agitador. Se incuba la placa durante 14-18 horas a 2-8C. Se aaden 300 l de diluyente de lavado por pocillo y se eliminan; a continuacin se aaden otros 200 l de diluyente de lavado, se agita durante 10 segundos, y se vuelve a eliminar. Finalmente se aaden otros 300 l y se deja en reposo durante 3 minutos antes de eliminar. Se aaden 200 l por pocillo de IgG anti-bovina purificada por afinidad y conjugada con peroxidasa de rbano, y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente. La placa se lava aadiendo 300 l de diluyente de lavado por pocillo; luego se elimina y se vuelven a aadir otros 300 l de diluyente de lavado, que se deja en reposo durante 3 minutos y se elimina. Los pasos vi y vii se repiten.

ii)

iii) iv) v)

vi)

vii)

viii) Se aaden 200 l de substrato ABTS (cido 2,2-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-sulfnico]) (precalentado a 25C) y se incuba la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La reaccin se detiene aadiendo 50 l de solucin de parada. Lectura e interpretacin de los resultados

Se ajusta el lector de placas y se lee la absorbancia a 405 nm. Todos los pocillos de la microplaca deben leerse en las 2 horas siguientes a la adicin de la solucin de parada. La lectura de absorbancia de los pocillos que contienen antgeno negativo se resta de las lecturas de los pocillos que contienen el antgeno positivo. Para cada muestra problema, los dos valores de absorbancia neta se promedian. Lo mismo se lleva a cabo con los controles duplicados dbilmente positivos. Las lecturas de los duplicados no deben diferenciarse en ms de 0,1 unidades de absorbancia. Para que la prueba se considere vlida, el promedio de la absorbancia neta de los controles dbilmente positivos (WP) debera estar entre 0,2-0,6 unidades de absorbancia. La absorbancia neta de los controles fuertemente positivos debera ser >1,0 unidades de absorbancia. La absorbancia neta del control negativo y del control de los diluyentes debera estar por debajo del lmite del valor dudoso. Teniendo en cuenta los criterios anteriores: i) Las muestras problemas son positivas si los valores de absorbancia neta son mayores o iguales que los del control WP.

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ii)

Las muestras problema son dudosas si su absorbancia neta es el 75% o menos que el valor de la absorbancia neta del control WP. Por ejemplo, si la absorbancia neta del control WP = 0,40 entonces el lmite inferior del valor dudoso = 0,40 x 0,750 = 0, 30 Por tanto, en este ejemplo, el rango dudoso sera 0,30-0,39 y las muestras con valor > 0,40 se consideraran positivas.

iii)

Las muestras problema son negativas si el valor de su absorbancia neta est por debajo del lmite inferior del rango dudoso (< 0,30 en el ejemplo).

Enzimoinmunoensayo de bloqueo ELISA para suero

El siguiente mtodo es adecuado para la deteccin de anticuerpos en muestras suero. i) Procedimiento de la prueba Recubrimiento de la placa Todos los pocillos se recubren con anticuerpo contra el BLV prediluido en tampn de recubrimiento (100 l/pocillo); la placa se cierra y se incuba durante 18 horas a 4C. Se realiza un ciclo de lavado (lavado estndar), que consiste en tres lavados llenando los pocillos hasta arriba y dejando cada vez el tampn durante 3 minutos; despus se seca la placa. Se aade el antgeno del BLV prediluido en tampn de lavado (100 l/pocillo); se cierra la placa y se incuba durante 2 horas a 37C. Se realiza otro ciclo estndar de lavado. ii) Preparacin y adicin de muestras y controles Los controles de suero positivo y negativo se prediluyen en tampn de lavado (1/2) y se aade la solucin a cuatro pocillos por cada control (100 l/pocillo). Para probar muestras de mezclas conjuntas se pueden agrupar 80 sueros diluidos (1/2) con el tampn de lavado y la solucin se aade a dos pocillos (100 l/pocillo) por cada muestra. Las muestras aisladas deben diluirse 1/100 con tampn de lavado y aadir la solucin a dos pocillos (100 l/pocillo) por cada muestra. Despus de colocar las muestras, se cierra la placa y se incuba durante 18 horas a 4C. Se realiza un breve lavado llenando los pocillos y vacindolos inmediatamente. iii) Preparacin y adicin de conjugados y substrato A todos los pocillos se aade (100 l/pocillo) anticuerpo biotinilado prediluido (utilizando tampn de lavado + 10% de suero fetal bovino). Se cierra la placa y se incuba en un agitador durante 1 hora a 37C. Se realiza un lavado estndar como se describi anteriormente. Se prediluye avidina conjugada con peroxidasa en el tampn de lavado y se aade a todos los pocillos (100 l/pocillo). Se cierra la placa y se incuba en un agitador durante 30 minutos a 37C. Se realiza un lavado estndar. Se aade a todos los pocillos 100 l del substrato ortofeniln diamina y se cierra la placa dejndola en la oscuridad durante 9 minutos. La reaccin se detiene aadiendo 0.5 M de cido sulfrico (100 l/pocillo). Lectura e interpretacin de los resultados aisladas o conjuntas de

Se ajusta el lector de placas y se lee la absorbancia a 490 nm. Para lectores de doble longitud de onda se utiliza un filtro de referencia entre 620 nm y 650 nm. Los resultados se leen dentro de los 60 minutos siguientes a la adicin de la solucin de parada. La absorbancia del control negativo debe estar prxima a 1,1 + 0,4. Si la absorbancia es menor de 0,7 el tiempo para el desarrollo del color en el paso iii antes descrito debe aumentarse (ver, preparacin y adicin de conjugados y substrato). A la inversa, si la absorbancia supera 1,5 el tiempo debe acortarse. La absorbancia del control positivo debe ser menor que la absorbancia del control negativo x 0,25. Una muestra es positiva cuando la absorbancia de cada uno de los dos pocillos problema es igual o menor que la absorbancia media de los cuatro pocillos negativos x 0,5. Una muestra es negativa cuando la absorbancia de cada uno de los dos pocillos problema es igual o mayor que la absorbancia media de los cuatro pocillos negativos x 0,65. Para muestras que dan valores comprendidos entre la absorbancia del control negativo x 0,50 y la absorbancia del control negativo x 0,65 se recomienda volver a probar el animal tomando una muestra un mes ms tarde.

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Sensibilidad del enzimoinmunoensayo

Se puede determinar la sensibilidad de las pruebas ELISA para leches de mezcla utilizando los sueros estndar de la OIE que son dbilmente positivos y negativos. Las pruebas deben dar resultado positivo con E4 cuando se diluye en leche negativa a una dilucin de 250 veces el nmero de leches individuales de la mezcla (Directiva 88/406 de la Unin Europea). Por ejemplo, para mezclas de 60 leches, E4 se debe diluir 1/250 x 60 =1/15000. Utilizando el suero estndar de la OIE dbilmente positivo disponible en la actualidad (E4 1/10), en la muestra anterior la dilucin debera ser 1/25 x 60 =1/1500. Para muestras de leche individual, el suero estndar de la OIE dbilmente positivo diluido 1/25 (E4 1/250) en leche negativa, debe ser positivo. Cuando se prueban muestras de mezclas de sueros, el suero estndar de la OIE debe dar un resultado positivo a una dilucin igual al nmero de animales individuales de la mezcla. Por ejemplo, para un conjunto de 50 muestras individuales, el suero estndar de la OIE dbilmente positivo diluido 1/50 en suero negativo debera dar un resultado positivo. En las pruebas en que las muestras de suero se ensayan individualmente, el suero estndar de la OIE dbilmente positivo sin diluir debe ser positivo.

b)

Inmunodifusin en gel de agar (prueba prescrita para el comercio internacional)

La prueba IGDA es especfica, pero no muy sensible, para detectar anticuerpos en muestras de suero individuales. Sin embargo, no es adecuada para muestras de leche (excepto el primer calostro) debido a su escasa especificidad y sensibilidad. La prueba IGDA es sencilla y fcil de realizar y ha sido muy til y eficaz como base en esquemas de erradicacin. En los kits comerciales para pruebas IGDA se incluyen sueros de referencia, pero no hay sueros estndar de la OIE actualmente disponibles para esta prueba. Se puede obtener consejo de los laboratorios de referencia de la OIE que se indican en la Parte 3 de este Manual. i) Gel de agar: Se prepara una solucin de agar o agarosa al 0,8-1,2% en tampn Tris 0,2 M, pH 7,2, que contenga 8,5% de NaCl. Una manera de preparar el agar es disolver 24,23 g de Tris metilamina en 1 litro de agua destilada y ajustar el pH a 7,2 con HCl 2,5 M. Se disuelve cloruro sdico (85 g) en 250 ml de Tris/HCl y se lleva a 1 litro. Se aade la agarosa (8 g) y la mezcla se calienta en una olla a presin o en un autoclave a 4,55 kg/cm2 durante 10 minutos. La mezcla se reparte en alcuotas de 15 ml que pueden mantenerse a 4C durante aproximadamente 6 semanas. Antgeno: El antgeno debe contener la glicoprotena gp51 especfica de BLV. El antgeno se prepara en un sistema adecuado de cultivo celular, como en monocapas de clulas de rin de cordero fetal (FLK) persistentemente infectadas. Las clulas utilizadas para producir el antgeno del BLV deben estar libres del virus no citoptico de la diarrea vrica bovina y de retrovirus bovinos, as como de virus similares al de la inmunodeficiencia bovina (lentivirus) y de virus bovinos sincitiales (espumavirus). Despus de 3-4 das de cultivo a 37C, el medio de crecimiento se reemplaza con medio de mantenimiento. Se recogen las clulas 7 das despus, empleando una solucin estndar de tripsina/verseno y la suspensin celular obtenida se centrifuga a 500 g durante 10 minutos. A continuacin, las clulas se resuspenden en medio de crecimiento; 30% de las clulas se devuelven al recipiente de cultivo y el resto se desecha. Se recoge todo el sobrenadante y se concentra 50100 veces por mtodos disponibles, bien sea por concentracin del material en tubos Visking inmersos en polietiln glicol o por precipitacin con sulfato amnico seguida de ultrafiltracin, o mediante precipitacin con polietiln glicol y posterior desalinizacin y separacin por tamao en una columna de poliacrilamida. El antgeno contiene fundamentalmente gp51, pero tambin puede contener p24. El antgeno se puede estandarizar para la glicoprotena gp51 por titulacin con E4 del siguiente modo. Se preparan diluciones dobles de la preparacin de antgeno. La dilucin mayor que, probada contra el suero estndar E4 sin diluir, origina una lnea de precipitacin equidistante entre el antgeno y el suero, contiene una unidad. En la prueba se utilizan dos unidades de antgeno. iii) Suero control positivo: El control de suero positivo deriva de un animal infectado natural o experimentalmente (vacas u ovejas). La lnea de precipitacin formada entre los pocillos del antgeno y del suero control debe ser ntida y equidistante. Se debe incluir en la prueba una dilucin del control de suero positivo que origine un resultado positivo dbil como indicador de la sensibilidad de la prueba. Suero control negativo: Se utiliza suero de animales no infectados (vacas u ovejas). Sueros problema: Sueros de cualquier especie animal. Procedimiento de la prueba: El agar se licua calentndolo en un bao de agua hirviendo y se vierte en placas de Petri (15 ml por placa de Petri de 8,5 cm de dimetro). Las placas se dejan enfriar a 4C alrededor de 1 hora antes de

ii)

iv) v) i)

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cortar en el agar los bloques de los pocillos. Se emplea un molde que origina una disposicin hexagonal de seis pocillos alrededor de un pocillo central. Se pueden utilizar pocillos de varias dimensiones; un sistema adecuado emplea pocillos de 6,5 mm de dimetro con 3 mm de separacin entre los pocillos. Para obtener mejores resultados, las placas deben usarse el mismo da que se preparan y cortan. ii) El antgeno se coloca en el pocillo central de la disposicin hexagonal y los sueros problema en los pocillos exteriores, alternados con suero control positivo. Debera preparase tambin un sistema control por placa con suero control positivo, suero control dbilmente positivo y suero control negativo en lugar de los sueros problema. Las placas se mantienen a temperatura ambiente (20-27C) en una cmara hmeda cerrada y se observan a las 24, 48 y 72 horas. Interpretacin de los resultados: Un suero problema es positivo si forma una lnea de precipitacin especfica con el antgeno y es una lnea de identidad con la del suero control. Un suero problema es negativo si no forma una lnea especfica con el antgeno y no refleja la lnea del suero control. Pueden aparecer lneas inespecficas que no convergen con las lneas formadas por el control positivo. Un suero problema es dbilmente positivo si curva la lnea del suero control hacia el pocillo del antgeno, sin formar una lnea visible de precipitacin con el antgeno. La reaccin es dudosa si no puede interpretarse como positiva o negativa. La prueba no tiene validez si los controles no dan los resultados esperados. Los sueros que originan resultados dudosos o dbilmente positivos pueden concentrarse y volverse a probar.

iii) iv)

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

En terneros jvenes nacidos de madres infectadas con BLV, los anticuerpos maternos contra la gp51 del BLV son importantes como proteccin contra la infeccin por BLV (12). Sin embargo, varios experimentos en los que se ha utilizado BLV inactivado, clulas FLK fijadas e infectadas, o gp51 purificada indican que stos antgenos solo inducen proteccin a corto plazo. Tambin se ha comprobado que la vacunacin del ganado con clulas vivas de una lnea celular BL3, establecida a partir de un animal con leucosis bovina espordica, solo provoca proteccin de corta duracin. La naturaleza del antgeno que proporciona proteccin en estos casos se corresponde probablemente con un antgeno de transplante asociado al tumor (18). Las clulas ovinas que solo sintetizan los productos gp51 y gp30 del gen env y la principal protena estructural p24, indujeron una respuesta serolgica en el ganado bovino (1); el ganado result protegido despus de vacunacin repetida con estas clulas. La vacunacin de ovejas con un virus vacunal recombinante que expresa la gp51 del BLV indujo proteccin (14). No obstante, la proteccin se desarroll sin produccin de niveles detectables de anticuerpos neutralizantes. Adems, Portetelle et al. encontraron que los virus vacunales recombinantes protegan a las ovejas incluso en ausencia de anticuerpos anti-gp51 (15). Por consiguiente, se interpreta que la inmunidad mediada por clulas puede jugar un papel importante en la inmunidad protectora contra la infeccin por BLV. Se ha logrado la expresin de gp51 por virus recombinantes y por levaduras que contienen la secuencia del gen env del BLV. Estos sistemas provocan proteccin en ovejas (7). Pese a estos avances en el conocimiento, no existen todava vacunas comercializadas para el control de la LBE.

REFERENCIAS
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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Leucosis bovina enzotica (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la pgina web de la OIE para una lista ms actualizada: www.oie.int).

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