Quelques espces peuvent tre multiplies partir des feuilles : Sansevire ; Bgonia ; Kalancho ; Saintpaulia ; Peperomia :

Crassulace :

Avantages et inconvnients de la multiplication vgtative par rapport la voie sexue (graines) :

* Avantages : obtention de plantes prsentant toutes les mmes caractristiques :clones. * Inconvnients : beaucoup despces sont rfractaires la multiplication vgtative.

Tous les vgtaux ne peuvent donc pas tre multiplis par voie vgtative.
Pourquoi de nombreuses espces sont-elles rfractaires aux techniques traditionnelles de multiplication vgtative ? Si on arrive bouturer des tiges, pourquoi narrive-t-on pas faire la mme chose avec les racines ? Pourquoi narrive-t-on pas bouturer des petits morceaux de plantes ?

Cest pourquoi, devant ces problmes les chercheurs se sont tourns vers une autre technique :

LA CULTURE IN VITRO.

LES GRANDES TAPES DE LAVNEMENT DE LA CULTURE IN VITRO.

1870. Premires tentatives de culture dorganes vivants isols : conservation de queues de ttards de grenouille. LA TOTIPOTENCE CELLULAIRE Ds 1902, Haberland, un biologiste allemand, observe les potentialits naturelles de la multiplication vgtative (bouturage). Suite ces travaux, il nonce le premier grand principe qui ouvrira la voie de la micropropagation des vgtaux. Il sagit du principe de la totipotence cellulaire. "toute cellule vgtale est capable de rgnrer un autre individu identique celui dont elle est issue".
La ddiffrenciation cellulaire : on voit les grandes cellules diffrencies (dans les feuilles, tiges, ptales,...) perdre leurs vacuoles, leur noyau se diviser activement, et de nombreuses et trs petites cellules mristmatiques apparatre. Une cellule ddiffrencie peut alors voluer dans toutes sortes de directions.

ddiffrenciation

diffrenciation

PREMIERS SUCCS !
cellules mristmatiques du cambium.

En 1934, WHITE russit la culture de racines de tomate sur un milieu contenant de l' eau, des sels minraux , un extrait de levure et du sucre et une hormone vgtale, la seule connue lpoque : lauxine*.
Mise en culture de racines de Tomate. Au bout de quelques semaines on observe la croissance des racines.

* En effet, en 1934, on dcouvre lauxine (AIA) : il faut 100 kg de mas immature pour obtenir 500 mg dAIA. Cette substance naturelle est principalement synthtise dans les parties apicales et agit sur llongation des cellules donc sur la croissance des plantes.

En 1939, Gautheret obtient partir de tissu carotte, un amas de cellules ddiffrencies : un cal. On peut cultiver ce cal indfiniment dans le temps. Avec lui dmarre vraiment la culture in vitro ("dans du verre").
Une rondelle de carotte est mise en culture sur un milieu appropri. 15 jours plus tard, on voit apparatre un amas plus ou moins vert : on a la formation dun cal. Le cal rsulte de la prolifration des

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UN MILIEU MIRACLE En 1962, Murashige et Skoog tudient la multiplication vgtative du tabac et mettent au point le premier milieu de base pour la culture in vitro. Ce milieu contient des sels minraux, des sucres, des vitamines B, des auxines et des cytokinines*. Ce milieu rend possible la culture et la prolifration de mristmes* de tiges jusqualors rfractaires la multiplication vgtative in vitro.
* Les cytokinines ont t dcouvertes par le biais de la culture in vitro en 1956. Ce groupe de substances de croissance vgtales est responsable des divisions cellulaires. Les cytokinines sont principalement synthtises dans les parties racinaires jeunes. * Les mristmes sont des organes de la plante contenant des cellules capables de se diviser, et sont responsables de la formation des tiges, des feuilles, des fleurs et des racines. On trouve des mristmes apicaux (en haut des tiges), axillaires et racinaires (au bout des racines).

LIMPORTANCE DES HORMONES VGTALES

EXPRIENCE SUR DES EXPLANTS DE TABAC : comment on oriente une culture laide de deux hormones : lauxine et la cytokinine. On joue sur le rapport Auxine / Cytokinine :

R= concentration en auxine/concentration en cytokinine Si R =1 : formation de cal uniquement ; R <1 : formation de fleurs ou de feuilles sur le cal ; R > 1 : formation de racines sur le cal.

Plantule de Tabac obtenue partir dun cal.

Fleur de Tabac sur le cal.

Racines formes sur un cal.

Formation de cal sur un explant de tige de Tabac.

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FONDEMENTS TECHNIQUES de la CULTURE IN VITRO.

La technique in vitro est un mode de multiplication vgtative artificielle des plantes. Il sagit un ensemble de mthodes faisant intervenir d'une part l'asepsie (strilisation du matriel, dsinfection des explants) :

Autoclave : sert la strilisation des milieux de culture et du matriel.

Hotte flux laminaire : travail en conditions aseptiques.

Repiquage de fraisiers dans une hotte flux laminaire.

et d'autre part des conditions de culture parfaitement contrles (milieux de culture dfinis pour chaque type de plante, temprature, lumire, humidit,...).

et de temprature sont contrles.

Elments minraux et organiques rentrant dans la composition dun milieu de culture.

Chambre de culture. Les conditions de lumire

Ces mthodes s'appliquent des organes ou des fragments dorganes : les explants. - graine immature, - embryon, - ovule, - pollen, - bourgeon terminal, - bourgeon axillaire, - morceau de tige, - morceau de feuille, - de ptale de fleur, - etc.... L'explant doit trouver dans le milieu de culture tout ce dont il a besoin pour survivre, se multiplier et ventuellement rgnrer un nouvel individu, en fait, tout ce que la plante mre peut fournir : a) par les racines : les lments minraux, leau ; b) par les feuilles et grce la photosynthse : des sucres, des vitamines et des acides amins ; c) les hormones, pour orienter la formation des organes.

LE MILIEU DE CULTURE
Entreront dans la composition du milieu de culture, des lments minraux ainsi que des lments organiques et ventuellement des rgulateurs de croissance (hormones). A) LES LMENTS MINRAUX : 1- Les macrolments : interviennent en grande quantit. Il s'agit de 6 lments prsents des concentrations leves tels que lazote ( N), le calcium (Ca), le potassium (K), le soufre (S), le magnsium (Mg) et le phospore (P). 2- Les microlments : Appels parfois oligo-lments, et bien qu'ils ne soient ncessaires la plante qu'en faibles concentrations, leur rle est essentiel. Les principaux d'entre eux sont le fer (Fe), le cuivre (Cu), le zinc (Zn), le manganse (Mn), le molybdne (Mo), le bore (B) et le chlore (Cl), le cobalt (Co), le nickel (Ni), etc... B) LES LMENTS ORGANIQUES : 1- Les sucres : Dans le cas de tissus vgtaux placs en culture in vitro, l'assimilation chlorophyllienne est nulle ou insuffisante pour assurer la survie et le dveloppement de l'explant. Ds lors, on ajoute des sucres, le plus souvent du saccharose, aux milieux de culture pour fournir l'explant une source de carbone. Dans la nature, les sucres sont sasphyxient. photosynthtiss partir du gaz carbonique atmosphrique et de l'eau du sol. 2- Les vitamines : L'emploi de diverses vitamines favorise frquemment le dveloppement des cultures in vitro: elles appartiennent essentiellement au groupe B. 3- Les acides amins : Il a parfois t observ que l'apport d'acides amins favorisait la prolifration.

C) LES RGULATEURS DE CROISSANCE.

Appels gnralement hormones vgtales, ils induisent les phnomnes de croissance et de noformation des organes. On trouve ces substances de croissance naturellement dans toutes les plantes; cependant, on a pu synthtiser artificiellement des molcules possdant les mmes proprits. Les hormones utilises sont principalement : - les auxines, - les cytokinines, car ces hormones sont capables dorienter les explants vers la formation de nouveaux organes. Les milieux ainsi constitus sont liquides. Il est ncessaire de les solidifier par lajout dun glifiant pour viter que les explants ne tombent au fond des rcipients et

LES TYPES DE MULTIPLICATION IN VITRO

1- MULTIPLICATION PAR BOURGEONNEMENT AXILLAIRE EXEMPLE : LE SQUOIA (Sequoiadendron giganteum (Lindl.) Buchholz.) Le point de dpart est un bourgeon terminal ou axillaire. Cette technique de micropropagation ne fait qu'acclrer in vitro le fonctionnement normal des bourgeons dj forms sur une plante. A . L'explant initial peut tre soit un mristme, soit un bourgeon, soit un fragment de tige comportant au moins un bourgeon axillaire. B . Sur un milieu appropri comprenant des cytokinines, le mristme se divise ou le bourgeon dbourre et dveloppent tous les deux une tige ou une touffe feuille. B A

C . Cette tige peut tre dcoupe en fragments (noeuds) qui, remis sur le milieu, vont redonner autant de touffes feuilles qui peuvent tre aussi subdivises : cest la phase de multiplication.

C
=HGKAJ

D . Les tiges peuvent alors tre transfres sur un milieu enrichi en auxines, qui permet leur enracinement. On obtient finalement dans chaque tube une plantule complte.

E . Les plantules sont mise en acclimatation en terre o elles reconstituent des plantes normales. Le nombre de plants de Squoia obtenus en 1 an partir dun mristme peut atteindre par cette mthode 4096 (46). Cela reprsente une plantation de 16 hectares darbres adultes !

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2- MULTIPLICATION PAR BOURGEONNEMENT ADVENTIF EXEMPLE : LE SAINTPAULIA (Saintpaulia ionantha Wendl.) Le terme "adventif" s'applique la formation dorganes en un site inhabituel.

A . L'explant est constitu d'un fragment d'organe, d'une portion de tissu, ou mme de cellules isoles.

B . Il est plac sur un milieu contenant des cytokinines. Soit des bourgeons sont noforms directement partir des cellules de l'explant initial (rare).

C . Soit des cellules de l'explant initial se divisent rapidement et forment un cal primaire rattach l'explant de dpart et qui donnera des bourgeons noforms. Cest la phase de multiplication.

D . Toutes les tiges obtenues dans les deux cas sont transfres sur un milieu enrichi en auxine qui va provoquer leur enracinement.

E . Les plantules sont alors acclimates en terre o elles reconstituent des plantes normales.

=HGKAJ

3- MULTIPLICATION PAR EMBRYOGENSE SOMATIQUE. Dans une graine, on trouve la future plante sous forme dembryon (embryon zygotique) qui rsulte de la reproduction sexue. L'embryogense somatique consiste provoquer lapparition dembryons partir de tissus vgtaux mis en culture in vitro. Elle apparat le plus souvent dans les suspensions cellulaires, occasionnellement dans les cals, plus rarement directement sur les organes.

Cals de Ginseng.

Formation dembryons somatiques sur cals de Ginseng. Suspension cellulaire de Ginseng.

A . Sous certaines conditions, les cultures cellulaires s'organisent en nombreux petits massifs structure bipolaire (avec un mristme de tige et un mristme de racine) nomms embryons somatiques.
Colonie dembryons somatiques. Germination.

B. Comme les embryons zygotiques (qui sont prsents dans les graines), les embryons somatiques se dveloppent, directement en plantules enracines.

Plantule de Ginseng.

Plantule de Palmier huile.

C . Des recherches actuelles tentent l'encapsulation des embryons somatiques, sans altrer leur viabilit, pour en faire des semences artificielles.
Encapsulation dembryons somatiques dans de lalginate enrichi de substances nutritives.

AVANTAGES DE LA CULTURE IN VITRO.

La culture in vitro permet : - lobtention de clones slectionns pour leur vigueur, leur caractres intressants (Chrysanthme, Fraisier, Bananier), leur raret (Orchides) ; - l'assainissement des vgtaux (plantes sans virus) : la Pomme de terre ; - la production rapide et en masse, n'importe quel moment de l'anne ;

- le raccourcissement des cycles de dveloppement ; alimentaires et pharmaceutiques.

- la diminution des cots de production (peu de personnel) et des dpenses nergtiques ( rduction des surfaces de culture et clairement rduit) ; - la facilit de stockage et conservation (au froid) de millions de plantes sur de trs petites surfaces, l'tat sain et l'abri des contaminations ; - le rajeunissement dun vgtal ; - la production de substances biochimiques intressantes pour l'industrie, les secteurs

NANMOINS, UN CERTAIN NOMBRE DE PROBLMES SE POSENT : LA VITRIFICATION - certains accidents, non prvisibles au dpart, peuvent intervenir en cours de culture in vitro, comme des malformations dues un dsquilibre hormonal : la vitrification.

Phalaenopsis

Plantes vitrifies Fraisier Oeillet

LA PERTE DE CARACTRES INTRESSANTS - la production rpte de grands nombres de plants uniformes (clones) peut entraner la perte des gnes ncessaires, par exemple, la rsistance aux maladies nouvelles; il faut donc conserver les pieds mres et certains moments, repasser par la reproduction sexue.

Drosera :plante normale

Drosera :plante albinos.

PROBLMES INHRENTS LA TECHNIQUE - lasepsie des explants : la prsence de micro-organismes, bactries, champignons, virus, qui, sils ne sont pas totalement limins, contaminent la culture et tuent les jeunes plantules.

bactries

moisissure

- Lacclimatation : le passage des conditions de culture normale est parfois dlicat. En effet, durant son sjour in vitro, la plante est labri des stress. - Lapparition danomalies gntiques (certains cas dhyperfloraison, perte de sexualit chez certaines espces, apparition dorganes anormaux) : cest la variation somaclonale.

CULTURE IN VITRO SAUVEGARDE DES ESPCES EN DANGER. EXEMPLE : LES PLANTES CARNIVORES.
Les plantes carnivores sont un exemple de plantes en voie de disparition. La culture in vitro permet ainsi de conserver en un endroit rduit plusieurs dizaines despces dorigines et de milieux diffrents.

Darlingtonia californica Torr., origine : Californie.

Heliamphora nutans Benth., origine : Guyana.

Dionaea muscipula Ellis., origine : Caroline.

Sarracenia flava L., origine : Floride, Louisiane

: Nepenthes kashiana Hook., origine : Assam. Pinguicula moranensis HBK., origine : Mexique. Pinguicula gypsicola Brandg., origine : Mexique. Drosera capensis L., origine : Afrique du Sud.

Drosera adelae F. Muell., origine : Nord Australie.

Drosera gigantea Lindl., origine : Ouest Australie.

Drosera filiformis Ral., origine : USA.

Drosera natalensis Diels., origine : Afrique du Sud.

Drosera rotondifolia L., origine : Belgique.

Drosera pygmaea DC., origine Nouvelle Zlande.

Drosera peltata Sm., origine : de lInde au Japon.

CULTURE IN VITRO MULTIPLICATION DESPCES DIFFICILES OBTENIR PAR DES MTHODES TRADITIONNELLES.

Psychopsis papilio (Lindl.) H.Jones, origine : Guyane. Phalaenopsis hybride.

Vanda sp., origine : Asie du Sud Est.

Les travaux de Knudson dans les annes 1940, ont ouvert une re nouvelle dans la culture des Orchides. Les Orchides botaniques, ou non (hybrides) ont des taux de germination naturel trs faible (1 2 plantes pour un million de graines). La mthode des semis in vitro dans un but de multiplication est dapplication la plus facile. Elle permet davoir un pourcentage de germination trs lev (90%). La sauvegarde et le repeuplement de certaines espces en voie de disparition ou rares est prsent possible. Les graines sont semes sur un milieu de culture solide. Elles germent en donnant des protocormes. Les protocormes sont des structures peu diffrencies directement issues du dveloppement naturel de lembryon des graines dorchides. La production procde par la division de protocormes, chaque partie rgnrant un nouveau protocorme en quelques semaines.
Formation de protocormes partir dun semis in vitro de Catasetum barbatum (Lindl.) Lindl., origine : Guyane.
Semis de graines dorchides.

. K?D

Protocorme dAnsellia africana Lindl., origine :Afrique tropicale.

2 4 = EI=JE

Organisation microscopique dun protocorme.

Par ailleurs, cultivs sur un milieu appropri et en prsence de cytokinines, des protocormes peuvent tre forms partir de nombreux explants tels que : - des jeunes feuilles (Cattleya, Epidendrum, Phalaenopsis ,...) des jeunes inflorescences (V ascostylis, Neosty]is,...) - des boutons floraux de linflorescence (V anda , Dendrobium, Phalaenopsis , Oncidium, Epidendrum,...) - des mristmes : dans ce cas, les clones seront assainis (plantes exemptes de virus et/ou de bactries). Chaque protocorme noform volue ensuite en une nouvelle plantule. La prsence dune autre hormone vgtale (lacide gibbrellique) favorise la germination des protocormes et llongation des tiges. Lorsque les jeunes plantules prsentent 3 4 feuilles et une taille de 5 7 cm (aprs 3 6 mois de culture selon lespce), elles sont transfres dans un pot contenant un substrat horticole pour Orchides. Par la technique in vitro, on peut obtenir un grand nombre de plants identiques (mriclones) qui sont dune qualit sanitaire irrprochable. Ainsi, les Orchides sont passes au premier rang des plantes horticoles micropropages.
Fouch

Angraecum sesquipedale Thouars, origine : Madagascar. Rodriguezia lanceolata Lodd., origine : Guyane.

O.M.P. Ralisation

Sobralia violacea Lind., origine : Vnzuela.

: J-G.