Facultad de Medicina Universidad Particular de Chiclayo

Gentica Mag. Marco Guzmn Tello

MTODOS DE BANDEO CROMOSMICO

ALDAZ RENGIFO, ROXANA COTRINA MORN LADY CHUMPN SNCHEZ, VERNICA DAZ CUMPA, MARIAJESUS SILVA FONSECA, FRANK

Ciclo III Chiclayo, 24 de Marzo del 2014

Universidad Particular de Chiclayo Facultad de Medicina

APELLIDOS Y NOMBRES DE LAS AUTORES:

Aldaz Rengifo, Roxana Cotrina Morn Lady Chumpn Snchez, Vernica Daz Cumpa, Mariajesus Silva Fonseca, Frank SEMESTRE ACADMICO: 2014 II DOCENTE: Mag. Marco Guzmn Tello

CALIFICACION _________

INTRODUCIN
El descubrimiento de las tcnicas de bandeo cromosmico ha significado un considerable progreso tanto en citogentica humana como en citogentica general ya que, al poder obtenerse imgenes reproducibles de la existencia de estructuras cromosmicas transversales (bandas) de diferente tamao a lo largo de los cromosomas, fue posible disponer de una herramienta de identificacin de cada cromosoma humano, como as los de un importante nmero de otros organismos tanto animales como vegetales. Adicionalmente, esta metodologa permiti localizar con certeza los puntos de fractura observados en la mayora de los reordenamientos estructurales y establecer qu cromosomas estaban involucrados en dichas aberraciones. Estas posibilidades citolgicas produjeron un gran impacto especialmente a nivel clnico ya que permitieron diferenciar y caracterizar citogenticamente un elevado nmero de nuevos sndromes de malformacin y retardo mental congnitos. Asimismo, la ms reciente y significativa aplicacin de las bandas cromosmicas ha sido en el programa del genoma humano ya que, tanto genes como sndromes gnicos, son ahora ubicados habitualmente en los mapas de bandas cromosmicas. El gran valor de los diversos patrones de bandeo es que caracterizan a cada cromosoma de diversas especies de entidades biolgicas superiores, excepto los vertebrados inferiores que no las poseen. En los vertebrados y en las plantas superiores las bandas se originaron a travs de prolongadsimos procesos evolucionarios acaecidos a distintos niveles evolutivos constituyendo los componentes cromosmicos observables actualmente. Su estabilidad estructural es tan elevada que, cualquier cambio inducido o espontneo ocurrido en ellos, se expresa como una mutacin indeseable la cual, en el ser humano, o se elimina por muerte del individuo, o impide su reproduccin, u origina una enfermedad hereditaria. Todos estos son mecanismos evolucionarios que aseguran la eliminacin de la poblacin de individuos portadores de alteraciones genticas perjudiciales. Asimismo, estos extraordinarios avances citogenticos han ocurrido en menos de cuatro dcadas de investigaciones y perfeccionamientos metodolgicos revolucionando profundamente la gentica humana al esclarecer racionalmente el origen de un enorme nmero de enfermedades hereditarias.

OBJETIVOS
Investigar acerca de los Mtodos de bandeo cromosmico. Conocer los diferentes tipos de mtodos de bandeo cromosmico. Reconocer la importancia de los mtodos de bandeo cromosmico.

EL BANDEO CROMOSMICO
Con la tcnica convencional de tincin con Giemsa los cromosomas se tien intensamente y en forma homognea y se los puede contar y agrupar por su aspecto general y eso era lo nico que se poda hacer en los primeros cariotipos. La identificacin de cada cromosoma vino posteriormente con las tcnicas de bandeo. Estas tcnicas que generan bandas transversales permiten definir a cada cromosoma y estudiar su estructura. Cada cromosoma tiene el patrn de bandas caracterstico y existen varias tcnicas de tincin con fines especficos (TABLA I ) . El bandeo G es el ms utilizado en citogentica clnica. El bandeo G se logra con un tratamiento controlado con tripsina antes de la colaboracin con Giemsa y produce bandas claras y oscuras en los cromosomas. Las bandas oscuras contienen ADN rico en bases A-T que replica tardamente son pobres en genes constitutivos y las bandas claras y oscuras en los cromosomas. Las bandas oscuras contienen ADN rico en bases A-T que replica tardamente y son pobres en genes constitutivos y las bandas claras contienen ADN rico G-C que replica tempranamente y tienen muchos genes constitutivos. Tecnicas de bandeo cromosmico: Aunque las tcnicas de bandeo son muy variables, todas ellas pueden agruparse en seis clases principales. La clasificacin inicialmente propuesta por la conferencia de pars (Paris conferense, 1971, suplemento 1975), que presupone que en todos los casos hay una fijacin con fluidos que contienen acido actico, es la siguiente: bandas Q, G, C, R,T y Feulgen. A estos tipos de bandas habra que aadir las bandas de replicacin y las bandas de restriccin. A continuacin se resume algunas de sus caractersticas Bandas G: Se obtienen por digestin de los cromosomas a partir de una enzima proteoltica como la Tripsina. (Urea o proteasas). Descrita como GTG: Banda G por Tripsina y coloreada con Giemsa. A partir de estas se obtiene un patrn caracterstico de bandeo para cada par homlogo, similar al encontrado en bandas Q. Colorean zonas ricas en AT Bandas Q: Se utiliza quinacrina, produciendo patrones de bandeamiento fluorescentes en cromosomas, que al ser observados al microscopio de fluorescencia revelan un patrn caracterstico para cada cromosoma. Regiones Ricas en AT Fluorescentes.

Banda R: Llamadas as por ser inversas a Bandas G.

Se obtienen despus de someter a altas temperaturas las lminas con las preparaciones en un buffer fosfato y luego coloreadas con Giemsa o con Naranja de Acridina. Bandas C: Selectiva sobre heterocromatina constitutiva, centromericas y pericentromricas, se obtienen por desnaturalizacin del DNA por accin del BaOH, que extraen hasta el 50% del DNA preferiblemente el de los brazos de los cromosomas. Bandas NORs: Son las regiones de organizadores Nucleolares en clulas de mamferos, localizados en los tallos de los satlites en cromosomas Acrocntricos. En ellos se localizan los genes de clase I que transcriben para los RNAr 18S y 28S. Estas regiones en las cuales los genes pueden estar transcripcionalmente activos son selectivamente coloreadas con Nitrato de plata (Coloracin NOR), la cual tiene predileccin por protenas cidas. Los organizadores nucleolares son polimrficos y de carcter heredable. Esta tcnica tiene una gran variedad de aplicaciones en investigacin y gentica clnica. Bandeo T: es una variante de bandeo r en el que las bandas se producen principalmente (pero no solamente) en las regiones terminales, suprimiendo casi totalmente las bandas interticiales. Bandeo de Feulen: despus de un tratamiento suave con lcali seguido de una inmersin prolongada en solucin salina fra, se utiliza la reaccin de feulgen mediante tincin con fucsina. Bandeo de replicacin: esta basado en la incorporacin de la 5bromodesoxiuridina (BrdU) en la fase temprana o tardia del periodo s y posterior tinsion con Giemsa. Se ha aplicado a cromosomas de plantas y de vertebrados, aunque posiblemente sea aplicado universlmente. Bandeo de restriccin: la utilizacin de endonucleasa de restriccin (RE) para la digestin del ADN de cromosomas fijados y su posterior tincin produce bandeo. El primer intento fue realizado por Lima de Faria y colaboradores (1080) en preparaciones de Muntiacus muntjak. Mas tarde se utilizaronen cromosomas humanos y posterioridad se ha ido extendiendo su aplicacin a gran variedad de organismos y con un buen numero de enzimas diferentes.

Tabla I: Las tcnicas de bandeo ms usadas: Tincin con Giemsa previo tratamiento controlado con tripsina que degrada las protenas y produce bandas claras y oscuras. A las oscuras se las llama G+

BANDEO G:

BANDEO R :

Tincin con giemsa previo tratamiento con calor. El bandeo R es el reservo del bandeo G

BANDEO Q :

BANDEO C:

Tincin con mostaza de quinacrina o acridina. Se examina con mocroscopio de luz fluorescente y se ven bandas brillantes en distintas intensidades. Las bandas ms brillantes se correponden con las G+. Tincin con giemsa o flurocromos (actinomicina D o cromomicina) y tratamiento previo con calor o lcalis. Muestra las regiones cromosmicas que contienen heterocromatina que son las centromtricas de todos los cromosomas y las secciones en 1q, 9q. 16q y distal Yq Tien las regiones organizadoras del nclolo (acrocntricos en el hombre )

NOR

LOS BANDEOS CROMOSMICOS MORFOLGICOS Y DINMICOS:

PUEDEN

CLASIFICARSE

EN

Los bandeos morfolgicos: Se obtienen basndose en tcnicas inherentes a la heterogeneidad de la cromatina. Existe en ellos una relacin con protenas (histnicas y no histnicas) e interacciones ADN. Estos bandeos pueden ser a su vez clasificados en: tcnicas de tincin diferencial, mtodos de tincin selectiva, coloraciones con fluoroeromos especficos aislados o combinados con colorantes no fluorescentes, y tinciones con anticuerpos fluorescentes. Se subclasifican en:

1. Tcnicas de tincin diferencial 2. Mtodos de tincin selectiva 3. Coloraciones con fluoroeromos especficos aislados o combinados con colorantes no fluorecentes 4. Tinciones con anticuerpos fluorecentes.

Los bandeos dinmicos: Se obtienen basndose en: tcnicas que implican la incorporacin de una base analoga, bromo-desexiuridina (BrdU), en el ADN durante la fase S del ciclo celular. Se denomina tambin bandeo de replicacin debido a la relacin existente entre el tiempo de incorporacin del BrdU y el patrn de replicacin. Cuando se incorpora BrdU durante la fase de replicacin temprana se obtiene un patrn de bandeo R destacndose las regiones ricas en G-C. Luego de realizada esta tcnica, los cromosomas pueden visualizarce utilizando distintos mtodos de tincin que emplean colorante tales como el Giemesa o el naranja de acridina o utilizando anticuerpos especficos. Por otro lado si se incorpora la base anloga durante la fase tarda de replicacin se obtiene un patrn de bandas G, destacndose las zonas de predominio de secuencias A-T. Los cromosomas pueden ser visualizados utilizando diferentes mtodos de tincin.

En relacin con la nomenclatura para descubrir los diferentes bandeos cromosmicos, se emplea un cdigo de tres letras: la primera, indica el tipo de bandeo utilizado, la segunda, la tcnica de deteccin empleada y la tercera, el tipo de tincin.

Nomenclatura de bandeos morfolgicos:

QFQ: Bandas Q por fluorescencia usando quinacrina. GTG: Bandas G por tratamiento enzimtico con tripsina utilizando Giemsa. RFA: Bandas R por fluorescencia usando naranja de acridina.

RHG: Bandas R mediante desnaturalizacin trmica utilizando Giemesa. THG: Bandas T por desnaturalizacin trmica empleando Giemesa. CBG: Bandas C por hidrxido de bario utilizando Giemesa.

Nomenclatura de bandeos dinmicos.

GBG: Bandas G por incorporacin de BrdU utilizando Giemesa. RBA: Bandas R por incorporacin de BrdU empleando naranja de acridina. RBG: Bandas R por incorporacin de BrdU utilizando Giemesa. GB-AAu: Bandas G por incorporacin de BrdU empleando anticuerpos especficos unidos a partculas de oro coloidal. RB-AAu: Bandas R por incorporacin de BrdU usando anticuerpos especficos unidos a partculas de oro coloidal.

Bromo desexiuridina (BrdU) Anlogo mutagnicamente activo de la timina, en que el grupo -CH3 en posicin 5' se reemplaza por Br. Tratamiento e investigacin del cancer debido a que aumenta la susceptibilidad de las clulas a la radioterapia porque inhibe la reparacin de roturas causadas por la radiacin en la doble cadena de ADN

Agente mutagenico: altera los patrones de transcripcin Aumenta la afinidad de las proteinas cromosomales por las zonas de la cadena que contengan BrdU, Altera la unin de protenas reguladoras a la cadena de ADN, Inhibe la expresin de algunas funciones de diferenciacion celular Provoca alteraciones en la membrana plasmatica.

PROCEDIMIENTO BANDAS G Envejecer las preparaciones en estufa a 65C / 14 horas o 3 dias a temperatura de ambiente. Bandeo GTG Tripsina desnaturaliza proteinas de cromosomas Tincion Giemsa o Leishman

Bandeo G con colorante Wright Protocolo mas usado. Se introduce la preparacion en solucion salina de 2SSC (Citrato trisodico disuelto en NaCl 0,3M) durante 1 minuto a 65C. Esto permite que se abra la hebra de ADN. Lavar la preparacion con agua destilada y secar al aire. Teir con colorante Wright al 0.25% y tampon Sorensen en proporcion 1 a 3 duraten 3 minutos PROCEDIMIENTO BANDA C CBG bandas C obtenidas con hidroxido Barico usando Giemsa 1. Introducir la preparacion en una cubeta con HCL 0.02N a temperatura ambiente por 10 minutos, lavar con agua y dejar secar aire 2. Introducir la preparacion en una cubeta a 60C con Ba(OH)2 saturado durante 1 minuto. Esto despuriniza y desnaturaliza el ADN. 3. Lavar con agua destilada y metanol para eliminar restos de bario dos veces 4. Dejar secar e incubar en 2xSSC a 65C / 15 min 5. Lavar la preparacion y dejar secar 6. Teir con colorante Leishman al 20% o Giemsa durate 5 a 10 minutos. Esta tecnica degrada un 50% del material cromosomico lo que dificulta la aplicacin posterior de otras tecnicas. El unico material que queda teido es la heterocromatina constitutiva porque resiste a la degradacin. PROCEDIMIENTO BANDAS NOR 1. 2. 3. 4. Aadir 0.2uL de solucion de nitrato de plata al 50% filtrada a la preparacion Adicionar 6 a 8 gotas de formaldehido al 0.3% (acelera la tincion) Incubar a 37C durante 24h protegido de la luz

TIPOS DE BANDEO CROMOSMICO

La tincin se utiliza para distinguir los 24 diferentes tipos de cromosomas humanos. Cuando se tien, cada cromosoma se presenta con un patrn caracterstico de bandas. Las bandas teidas aparecen como bandas oscuras sobre fondos no teidos. Los cromosomas se identifican en base a los patrones de bandas y la ubicacin de los centrmeros. Bandeo C El bandeo C es una forma de bandeo cromosmico que tie los centrmeros, que son las regiones de ADN que se encuentran cerca de la mitad de un cromosoma donde dos cromtidas hermanas vienen en contacto ms cercano, y la heterocromatina constitutiva. La heterocromatina es una variedad de la cromatina, la combinacin de ADN y otras protenas que forman el ncleo. Queda condensada y tie oscuro, incluso en las clulas de interfaz no dividida, que son clulas que se preparan para dividirse.

La tcnica de Banda C fue descubierta por casualidad y originado en un experimento en donde ADN satlite marcado en ratn fue hibridizado in situ con cromosomas de raton. En este experimento, el ADN del cromosoma fue desnaturalizado con NaOH y renaturalizado en buffer SSC. Los sitios hibridizados fueron detectados por autoradiografa usando coloracin de Giemsa para cromosomas. La prueba de hibridizacin preferencialmente fue en las regiones centromericas de los cromosomas. Sin embargo tambin se noto que el Giemsa coloreo otras regiones en otros cromosomas (Fukui y Nakayama, 1996) Los sitios de los cromosomas que presentan heterocromatina constitutiva y que tien Banda C positiva son: En la regin del centrmero Alrededor de la regin organizadora nuclear Cerca del sitio del RNA para 5S En la parte final de los cromosomas es decir la heterocromatina telomerica, en general estas localizaciones se conocen como centromerica e intercalar y la ltima categora incluye todas las otras posiciones.

Bandeo G : La tincin de giemsa, o bandeo G, es un tratamiento de cromosomas que usa tripsina, que se incluye para eliminar las protenas cromosmicas. El giemsa se utiliza para teir cromosomas y para identificar aberraciones cromosmicas, como reordenamientos y translocaciones. Cada par de cromosomas se tie con un distintivo patrn de bandas claras y oscuras. Las bandas oscuras son llamadas bandas G. stas se correlacionan aproximadamente a la composicin de pares de bases, que es la composicin de dos nucletidos en los lados opuestos de las hebras de ADN y conectados por un enlace de hidrgeno, as como secuencias repetitivas de ADN. El bandeo G se utiliza a menudo en la deteccin de la malaria y otros parsitos.

Bandeo Q El nombre de bandeo Q proviene del hecho de que utiliza mostaza de quinacrina para teir cromosomas. Despus de esto, el cromosoma se examina usando microscopa fluorescente. Algunas de las bandas mostrarn fluorescencia brillante y otras aparecern oscuras; las bandas oscuras son llamadas bandas Q y corresponden muy de cerca de las bandas G. La tcnica es til para detectar heteromorfismos, que son variaciones normales en la apariencia de los cromosomas.

Bandeo R Al tratar a los cromosomas antes de teirlos, con calor o productos qumicos particulares, las bandas claras y oscuras que aparecen estn invertidas. Si las bandas G y Q se tien mal, entonces el bandeo R se emplea para brindar un contraste superior, permitiendo as que las bandas se lean ms fcilmente. Es la inversa del bandeo C y tie las regiones no centromricas, preferiblemente a los centrmeros.

Bandas Ag-NOR Se conoce como bandas Ag-NOR aquella que colorea las Regiones Organizadoras Nucleares (de ah la nomenclatura NOR) en ocasiones son tambin llamadas Banda N, su coloracin es debido a la afinidad con el Nitrato de Plata. La Regin Organizadora Nucleolar es el sitio en donde estn localizados los genes de ADNr; el nucleolo est compuesto por cinco componentes estructurales, el centro fibrilar, el componente fibrilar, el componente granular, el intersticio nucleolar, y la cromatina condensada asociada. (Goessens, 1984) En eucariotas el organizador nucleolar consiste de mltiples repeticiones arregladas en tandem, de las secuencias para ARN-r 18S y 28S intercalado con secuencias espaciadoras. Los espacios pueden ser transcritos, pero su transcripcin nunca incluye un ribosoma maduro. Usualmente se refiere a ADN ribosomal (ADN-r) como una repeticin de genes con secciones en tamdem arregladas y agrupadas dentro de uno o varias regiones del set de cromosomas (Champman y may, 1993)

Bandas GTG Las bandas G deben su nombre al hecho de que en todas sus modalidades se emplea Giemsa para colorear los cromosomas. Esta tcnica que, en trminos generales, es la ms usada en mamferos, por permitir excelentes preparaciones permanentes sin requerir el uso de microscopio de fluorescencia, se basa en un tratamiento que altera la estructura de las protenas cromosmicas seguido de una coloracin. El mtodo de denaturacin trmica descrito por Sumner et al. (1971), es conocido como ASG (Acid-Saline-Giemsa) y se constituye en la primera tcnica de bandas G conocida. En esta modalidad se logra la denaturacin proteica mediante un tratamiento con 2XSSC (Solucin Salina Citratada) caliente. Sin embargo, el mtodo ms usado en la actualidad es el conocido con el nombre de bandas GTC (bandas G por Tripsina usando Giemsa como colorante); fue introducido por Seabright en 1971, y como su nombre lo indica, se basa en una digestin enzimtica con Tripsina. La banda G ha sido reportada en muchos grupos animales pero por ejemplo en varias especies de peces esta banda no resulta positiva pues al parecer muchos de ellos no poseen compartamentalizadin del ADN en isocoros quienes seran los responsables del bandeamiento.

Bandas RHG Este patrn de bandas es, en trminos generales, el inverso (reverse) de las bandas G, o sea, las bandas G-positivas son R-negativas, y las Gnegativas son R-positivas; se les denomina bandas RHG para significar que son bandas reversas obtenidas por calor usando Giemsa como colorante. La tcnica original se basa en una denaturacin trmica.

CONCLUSIONES
El mtodo de bandeo cromosmico es una tcnica convencional de tincin con Giemsa los cromosomas se tien intensamente y en forma homognea y se los puede contar y agrupar por su aspecto general y eso era lo nico que se poda hacer en los primeros cariotipos. Entre los mtodos de bandeo cromosmico tenemos a los bandeos morfolgicos y dinmicos, detro de cada uno de ellos existen ms mtodos descritos a lo largo del trabajo. La importancia de los mtodos de bandeo cromosmico radica en que permiten definir a cada cromosoma y estudiar su estructura, siendo esto de gran utilidad para la gentica mdica.

LINKOGRAFA Y BIBLIOGRAFA.
http://www.fmed.uba.ar/depto/histo1a/genetica/adm/sg2.pdf http://datateca.unad.edu.co/contenidos/203023/MATERIAL_EN_LINEA/CU RSO%20203023/CIOTGENETICA%20APLICADA%20AL%20MEJORAMIE NTO/leccin_17_bandeo_cro http://www.scielo.edu.uy/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S030332952002000200003 http://www.oocities.org/researchtriangle/lab/2513/bandeos.htm http://www.ehowenespanol.com/tipos-bandeo-cromosomico-info_214482/ http://www.slideshare.net/gatitamony/citogenetica http://www.monografias.com/trabajos-pdf4/tres-etapas-historia-citogeneticahumana/tres-etapas-historia-citogenetica-humana.pdf http://eprints.ucm.es/8778/1/T30948.pdf