INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL, ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS PRCTICA 13: AISLAMIENTO DE DNA PLASMDICO.

LUIS PERALTA JESSICA, ROMERO LEOCADIO ANA LAURA, SECCIN 1

Introduccin
Los plsmidos son molculas de DNA de doble cadena de tamao pequeo generalmente de forma circular, que se encuentran presentes de manera libre en el citosol de las bacterias. Poseen un inters singular en la ingeniera gentica por ser uno de los sistemas vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema que permite introducir en una clula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta clula hospedadora el vector se replica y se expresa, en su caso. Existen diversos mtodos para el aislamiento de plsmidos. Las tcnica de Minipreps o mini preparaciones de plsmidos, permiten la recuperacin de plsmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. La mayora de los mtodos explota, de una u otra forma, las diferencias existentes entre el ADN cromosmico y el ADN plasmdico: Los plsmidos tienen un pequeo tamao en relacin con el cromosoma bacteriano. El ADN cromosmico de las bacterias es circular, pero al ser extrado la mayor parte se obtiene fragmentado, en molculas lineales. Los plsmidos son molculas de ADN circular, cerrado en forma covalente. Estos mtodos se diferencian en la pureza del producto final, en el tiempo necesario para llevarlos a cabo y en la posibilidad de aplicarlos en aislamientos a pequea o gran escala; sin embargo todos incluyen tres etapas comunes: crecimiento de las bacterias y amplificacin del plsmido, cosecha y lisis de las bacterias y purificacin del ADN plasmdico. La lisis alcalina es el mtodo mayormente utilizado para el aislamiento de plsmidos circulares proveniente de clulas bacterianas. El tratamiento de las clulas con una base de pH alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas, ocasionando que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separe. Por el contrario la configuracin superenrrollada del plsmido se mantiene estable. OBJETIVOS o o Obtener DNA plasmdico a partir de Puc18. Realizar una electroforesis en gel de agarosa del plsmido obtenido y discutir respecto cada una de las formas obtenidas
Regulador Tris EDTA(TE) Acetato de Potasio 5M SDS 1% -NaOH 0.2 N

TABLA 1. Descripcin del cada una de la soluciones. SOLUCIN MECANISMO DE CCION Tris es un regulador de pH, esto protege el DNA. EDTA es un agente quelante de iones divalentes como en el caso de Mg 2+, el cual es un cofactor de las DNasas, por consiguiente inhibe la actividad de estas enzimas. RNasa elimina el RNA mediante su digestin
La alcalinizacin con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aninico (SDS), provoca la lisis celular, la desnaturalizacin del DNA cromosmico y de las protenas, y la liberacin de los plsmidos. Los plsmidos se ven Menos afectados por su pequeo tamao y estructura superenrrollada. La neutralizacin del medio en presencia de una concentracin alta de sal (acetato potsico), provoca que se cierre covalentemente el DNA plasmdico ya que el K+ se va unir a las cargas negativas del DNA y esto genera la Precipitacin de protena. A la mezcla de ADN desnaturalizado tanto plsmido como cromosomal forman los puentes de hidrgeno. Sin embargo, el ADN cromosomal es muy largo y por tanto no logra establecer bien sus puentes de hidrgeno y forma un agregado junto con el SDS y las protenas bacterianas, el cual precipita. Al centrifugar, en el sobrenadante queda el ADN plasmdico y en el botn el cromosomal El cambio de polaridad del medio que genera el agregado de alcohol, y la disminucin de la temperatura vuelven insoluble al ADN, pudindose recuperar en un precipitado si es centrifugado a altas velocidades. Es posible que la muestra contenga trazas de DNAasas bacterianas Para evitar la degradacin de las molculas de ADN por estas enzimas, se aconseja trabajar con soluciones a baja temperatura Permite resuspender el DNA plasmdico. Mantener las condiciones de pH.

Tris-EDTA-RNasa A

Isopropanol

muy intensa posterior la cual presento un mayor recorrido, esto posiblemente se trate RNA, o productos de la degradacin celular.

CONCLUSIONES:

o o
RESULTADOS Figura 1. Electroforesis de muestra de plsmido

ANALISIS DE RESULTADOS

De acuerdo a la figura 1 podemos observar la presencia de 3 bandas, las cuales posiblemente se traten de la Molcula de DNA plasmdico en sus diferentes formas. En la misma figura observamos que en algunos pozos se presentan machas que posiblemente corresponden a DNA genmico, esto indica que el producto obtenido no se encuentra totalmente purificado. El plsmido obtenido se puede presentar en tres formas, conocidas como superenrrollada, relajada y lineal de longitud completa, estas corresponden a la misma molcula y tienen todas el mismo pb (o longitud de la molcula), pero tienen diferente forma, por lo que ocupan un volumen efectivo diferente y avanzan por el gel a distinta velocidad. La forma de la molcula afecta la velocidad de migracin en el gel de agarosa. Como se muestra en la fig. 1, cada una de las muestras depositadas hay mayor presencia de lo que podra ser molcula en su forma circular relajada, esto posiblemente sea resultado del proceso experimental ya que durante la extraccin, la preparacin y la conservacin del DNA plasmdico, es frecuente que tengan lugar algunos cortes en una sola hebra de las molculas superenrrollada. El plsmido se desenrolla inmediatamente, debido a la tensin acumulada en los superenrollamientos, dando la forma circular relajada. El DNA purificado no se puede superen rollar de nuevo, puesto que no hay topoisomerasas presentes (enzimas capaces de actuar sobre la topologa del ADN, ya sea enredndolo para permitir que se almacene de manera ms compacta) Muy pocos equipos obtuvieron las tres formas de la molcula, y en otros casos tambin se observa una macha

Se obtuvieron las tres formas de la molcula del DNA plasmdico. El DNA plasmdico obtenido en mayor proporcin fue el circular relajado. Las molculas superenrolladas son ms compactas, su volumen es menor, se mueven con ms facilidad a travs del gel, y las encontramos ms lejos del punto de origen, el pocillo. Las molculas circulares relajadas y las molculas lineales de longitud completa avanzan ms lentamente que las superenrrollada. Los resultados de la electroforesis fueron favorables y satisfactorios, permitiendo la diferenciacin de cada una de las formas obtenidas de la molecula de DNA plasmdico.

BIBLIOGRAFIA:

http://bacteriologiaclinica.wikispaces.com/file/view/PR ACTICA_No_4_EXTRACCION_DNA_PLASMIDICO .pdf http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp4.pdf