Sunteți pe pagina 1din 168

MICRONMULIREA

PLANTELOR HORTICOLE
@2013
Lect. univ, prof. dr. Adrian Peticil
ISTORICUL CULTURILOR DE CELULE
I ESUTURI VEGETALE
aurul verde;
surs dehran i energiepentruomi animale;
purificator al atmosferei;
materii primepentruuneleindustrii (alimentar, textil, farmaceutic);
Rolul plantelor n viaa i echilibrul planetei.
Secolul XX: celula vegetal conine n nucleul
su totalitatea informaiei genetice necesar
dezvoltrii unui organismcomplet.
Easesupuneprincipiului clasical totipotenei.
Celul haploid saudiploid

Regenerareaplantelor
Tehnica nmulirii plantelor in vitro
(28 noiembrie 1854 - 30 ianuarie 1945)
1902 - lucrarea Kulturversuche mit
isolierten Pflanzenzelle;
orice celul diploid sau haploid
conine informaia genetic ereditar
imprimat n genom.
1926 - teoria este respin de botanitii
contemporani - E.K s t e r.
Pionierii
Gottlieb Haberlandt
1839 -Vchting i Rechinger
au iniiat experimente pentru determinarea limitelor de divizibilitate ale
materialului vegetal, fr pierderea capacitii regenerative.
1904 - Hanning
a obinut plantule la crucifere pornind de la embrioni extrai din
semine imature la Raphanus sativus, R.landra, R.candatus i Cochlearia danica,
a certificat creterea pe medii artificiale cu adaos de zaharoz a unor
fragmente de plante;
1934 - R. J . Cautheret
a obinut calusuri folosind explante de salcie, plop, ulm, tutun i morcov
pe care le-a stimulat cu auxine i le-a repicat n medii sterile;
1939 - Wihte
a reuit s obin calus din vrfurile rdcinilor
de tomate;
1939 - Schleiden i Schwann
schieaz conceptul totipotenei celulare lansat
ulterior de Haberlandt;
Hermann Vchting
Pionierii
1957- W. D. Stewart
elaboreaz prima metodologie de cultivare in vitro a esuturilor
vegetalepemedii nutritiveconinnd hormoni decretere.
1925, 1929 - Laibach
demonstreaz utilitatea practic a tehnicii de nmulire in vitro
pentru ameliorarea plantelor, izolnd embrionii din semine neviabile
din ncruciarea lui Linum perene cu Linum austriacum i cultivndu-i pe
medii nutritive.
1934 - Kgl, Haagen Smit i Erxleben
primul fitohormon (acidul indolil acetic) deschide o nou
etap n succesul cultivrii in vitro a explantelor,
Pionierii
White (1938), Gautheret i Nobecourt au pus bazele cultivrii in vitro a explantelor
vegetale: organe, esuturi i celule. Totodat, ei i-au adus contribuia i n domeniul
alctuirii mediilor de cultur privind compoziia, concentraia n macro i
microelemente eseniale pentru nutriia explantelor, prezena unei surse de C i N
organic, a unor vitamine i auxine.
-----------------------------------------------------------------------------------------------
1955- Miller i colab.
izoleaz dinspermadeheringi, chinetina
1957- Skoogi Miller
avanseaz ipoteza balanei hormonale a raportului dintre auxin
i citochinin care favorizeaz iniierea de rdcini i mugurai dintr-o
cultur decalus.
1977 i 1978 - Murashige
multiplicarea prin subculturi succesive in vitro dintr-un
singur meristem de orhidee a fcut posibil obinerea a 4 milioane de
exemplare, copii fidele ale plantei donatoare i a demonstrat i
eficiena economic a metodei prin care se face economie de material
biologic.
Pionierii
ETAPELE ISTORICE ALE DEZVOLTARII
TEHNICILOR DE MULTIPLICARE IN VITRO
1. 1939 1902; teoria unitii structurale fundamentale a lumii vii (Schleiden i Schwann,
1939) iar celula a fost acceptat ca unitate structural de baz a organismelor vii, fiind apoi
emis postulatul conceptului de totipotenialitate (omnipotenialitate) celular a lui
Haberlandt, 1902.
2. 1902 1920; o perioad de stagnare a cercetrilor n domeniu
3. 1920 1939; primele succese n domeniul creterii in vitro a embrionilor, a
rdcinilor, a obinerii de calus, esuturi care cultivate apoi pe medii aseptice i
subcultivate periodic prin repicri au condus la obinerea de material vegetal.(
White, Gautheret i Nobecourt).
4. 1939 1966; studii efectuate de numeroi cercettori privind comportamentul
diferitelor explante cultivate pe diferite medii de cultur, pentru cunoaterea i a
factorilor implicai n procesele de nmulire i difereniere a celulelor, gradul lor de
autonomie funcie de substrat, condiiile de cultur, proveniena i natura
explantului.
5. 1966 i pn n zilele noastre; extinderea larg a utilizrii explantelor pentru
multiplicare, dezvoltarea citologiei, citofiziologiei, biologiei moleculare, geneticii i
ameliorrii la nivel ultrastructural i molecular, biochimiei, fiziologiei.
Subramuri de biotehnologii vegetale
Citofitotehnologii
nmulirea i clonareacultivarilor valoroi;
micropropagareai generareadematerial vegetal sntos;
elaborareadetehnologii demodificareagenomului unor specii cormofite;
exploatareacapacitii debiosintez acelulelor izolatencondiii decultur
intensiv;
obinerea deembrioni somatici, producereadesemine artificiale;
clonarearapid aunor soiuri rezultatedinlucrrile deameliorare.
Prezene romneti
1975 - au fost abordate cercetri sistematice privind problemele nmulirii
plantelor in vitro fiindamenajatelaboratoaredeculturi deesuturi laInstitutul de
Cercetri BiologicedinBucureti, Institutul deCercetri SilvicedinBucureti, n
unitile de cercetare agricol i horticol de la Fundulea, Vidra, Mrcineni,
tefneti, n unitile denvmnt superior agricol dinCluj Napoca, Bucureti,
Iai, FacultateadeBiologiedinBucureti, FacultateadeFarmaciedinBucureti i
nuniti deproducie cumar fi ntreprindereadeSereCodlea(1988).
1984 - apare prima monografie de profil intitulat Culturi de celule i esuturi
vegetale aplicaii n agricultur Ed.Ceres, autori Cachi C.D., Raicu P. i
BadeaM.E.
1985 1988 - primele cursuri n domeniul culturilor de celule i esuturi vegetale din
mediul universitar au luat fiin la Institutul Agronomic N.Blcescu din Bucureti
sub form de cursuri postuniversitare.
1987 - acest curs s-a introdus sub form opional la seciile de biologie i la
facultile de horticultur din ar.
1985 se introduce la Bucureti, n cadrul USAMV, Facultatea de Biotehnologie cu
ramuri ale biotehnologiei vegetale, si devine disciplina fundamentala independenta.
1972- ia fiin International Association for Plant Tissue Culture la care Romnia a
aderat n anul 1975.
La noi n ar se nfiineaz Asociaia Romn de Culturi de esuturi i Celule
Vegetale.
1989- Institutul de Cercetri Biologice din Cluj Napoca organizeaz al IV-lea
Simpozion Naional de Culturi de Explante.
noiembrie 2000 - se organizeaz la Universitatea Babe Bolyai Facultatea de
Biologie din Cluj Napoca al X-lea Simpozion de Culturi de esuturi i Celule Vegetale
care marcheaz 25 de ani de la iniierea primelor cercetri n domeniul culturilor de
celule i esuturi n Romnia.
Prezene romneti
SUNPRIDE
Royal Base Corporation
CULTURILE DE TESUTURI DE
PLANTE
Propagarea in vitro
Tehnica rapid (comparativ cu nmulirea vegetativ)
Folosite pentru:
1. Micropropagare
2. Regenerare
form rapid de multiplicare;
proces asexuat de creare de noi plante, identice;
conservarea germoplasmei, prin meninerea
heterozigotismului, care s-ar pierde prin semine.
obinerea de plante libere de virusuri;
proces continuu, nedifereniat de anotimpuri sau
condiii de clim
dintr-o singur plant se produc
multe clone identice genetic
Micropropagarea
Un singur segment nodal va
produce un explant cu 4-6
noduri n decurs de 4-6
sptmni.
Fiecare explant se multiplic,
producnd alte 4-7 explante.
Sute de plante pot fi produse astfel
dintr-un singur segment nodal.
Plantele obinute sunt clone ale
plantei mam.
Specii care permit micropropagarea
arbuti ornamentali, coleus,
difenbachia, ficus, caladium, pomi
fructiferi, semiarbuti, via-de-vie,
trandafiri, orhidee, clematis, liliac,
begonia, frezia, iris, narcisa,
mucata, petunia, lalelele,
rododendron, azalea, mutar,
porumb, soia, gru, orez, bumbac,
tomate, cartofi, citrice, gazon,
ceap, asparagus, varz, castravei,
mazre, fasole.
Avantajele micropropagrii
Tehnologie care economisete spaiul i timpul;
Rezultat favorabil - se pot produce milioane de
specii florale uniforme genetic;
African Biotechnologies produce anual peste 6
milioane de banane i plante de interior la ghivece
La bulboase: dac se produc 5-7 bulbi/an prin metode
convenionale, micropropagarea poate ridica
producia la 1000/an la iris, gladiol, narcis,
Hyacinthus sau Amaryllis
Liber de virusuri;
Conservarea speciilor cu caractere excepionale.
Avantaje globale
Facilitarea circulaiei n siguran a
germoplasmei ntre naiuni - asigur schimbul
de material organic vegetal ntre ri fr
pericolul bolilor sau molimelor.
Ideal pentru:
Culturi cu reproducere vegetativ;
Culturi cu producie mic de semine sau cu
procent mare de semine heterozigote
Limitri
Costul/unitate poate s l depeasc pe cel al
metodelor convenionale de propagare, din cauza
facilitilor, a mentenanei i a costurilor de la borator;
Multe specii sunt recalcitrante la aceast metod
Apariiai variaiei somacloanle urmare a instabilitii
unor plante (schimbri de epigenetic i genetic)
procesul prin care o plant mbtrnit, prin micropropagare, poate fi
transformat ntr-o plant complet noua
Violeta
african
regenernd
rdcini
Regenerarea
Regenerarea este posibil urmare a caracteristicii plantelor
de a fi totipotente, prin folosirea hormonilor
Culturi difereniate: segmente nodale, frunze, rdcini
etc.
Culturile de celule nedifereniate (embriogenez) sunt
totipotente: pot deveni o planta complet noua prin
difereniere.
Aciunea diferiilor hormoni/regulatori aspra plantelor nu este una
identic:
plante diferite raspund diferit la acelai stimul chimic
diferite pri de plant reacioneaz diferit la acelasi
stimul chimic
Hormonii sunt regulatori chimici naturali care se gsesc n plante i
care influeneaz creterea plantelor.
Regulatorii de cretere sunt versiunea sintetic a hormonilor din
plante.
Citochininele induc creterea vegetativ.
Auxinele induc rizogeneza.
Etapele micropropagrii
esutul trebuie s fie
steril, complet liber
de microorganisme.
esutul de iniiere se numete explant si este format din celule
difereniate, care se vor transforma n esuturi difereniate: radcini,
frunze, ovare, cotiledoane etc)
Planta donor
Transfer in vivo
Pepiniera
Aclimatizare
From: Plant Propagation Concepts and Laboratory Exercises. Beyl& Trigiano, CRC Press2008.
Inradacinare
ETAPELE MICROPROPAGARII
Prelevare
Initiere
Proliferare
Gfh
Ptoliferare 2
Explante crescute
Explant inradacinat
Etapele micropropagrii
etapa 1.
Iniierea culturii
etapa 2.
Multiplicarea
etapa 3.
nrdcinarea
etapa 4.
Aclimatizarea
etapa 1.
Iniierea culturii
Factorii care se iau n
consideraie:
A. Selecia plantei:
caracteristicile genetice
(cultivarul, corectitudinea
genetic, plant
sntoas);
controlul agenilor patogeni
n plant;
condiia fiziologic a
plantei.
Factorii care se iau n
consideraie:
B. Dezinfecia:
fungi, bacterii, pduchi,
mucegai, virui, patogeni
interni,
plante i explante sntoase;
perioada din an n care se
face recoltarea explantului
pentru iniierea culturii.
Factorii care se iau n consideraie:
C. Mediul de cultur:
diferite reete, n funcie de
specie.
Factorii care se iau n consideraie:
D. Oxidarea:
fenomen generat de reacia
explantului n funcie de
concentraia de fenoli din
plant;
inhib creterea;
necesit reinoculare pentru
stabilizarea culturii.
etapa 2.
Multiplicarea
Factorii care se iau n consideraie:
A. Pstrarea culturii:
culturile stabilizate continu
dezvoltarea rapid a noilor
organe ;
proliferarea creterilor axilare i
laterale;
creterile variaz cu specia i
cultivarul.
Factorii care se iau n consideraie:
B. Noi explante:
explantul iniial se secioneaz
dnd natere la noi plante;
Factorii care se iau n
consideraie:
C. specia, mediul de
cultur, reacia la
inoculare i condiiile de
laborator modific rata de
multiplicare;
etapa 3.
nrdcinarea
Factorii care se iau n
consideraie:
A. Scopul :
pregtirea noile plante pentru
transferul din cultura steril;
nrdcinarea i aclimatizarea
sunt considerate stadii limit n
micronmulire;
nrdcinarea se poate face in
vitro sau in vivo;
necesit mediu de nrdcinare
special.
etapa 4.
Aclimatizarea
Factorii care se iau n
consideraie:
A. Transferul plantelor din
mediul in vitro in mediul in vivo,
n condiii nesterile de via;
pericolul major este
deshidratarea;
procentele de pierderi variaz cu
specia;
MICRONMULIREA
PLANTELOR HORTICOLE
@2013
Lect. univ, prof. dr. Adrian Peticil
LABORATORUL DE
CULTURI IN VITRO
Dou spaii
Zona nesteril/generaliti
Def.= spaiul destinat activitilor care se desfoar n condiii nesterile.
Conine:
spltor;
laboratorul de preparare a mediilor de cultur;
camere de cretere;
depozit de sticlrie;
depozit de substane chimice
ncperea cu autoclave.
Def. = ncpere aseptic, steril, n care se execut sterilizarea, prelevarea i
inocularea explantelor
Contine:
mai multe hote de lucru cu flux laminar orizontal sau vertical de aer steril.
Procese:
dezinfectarea materialului vegetal;
prelevare;
inoculare explante in vitro;
repicare sau subcultivare.
Zona steril/generaliti
ncperi amenajate facil pentru ntreinere i evacuare;
pardoseal din gresie sau mozaicsau alte materiale moderne;
pereii acoperii cu faian sau vopsea de ulei, pentru a se putea ntreine uor i
a fi facil pentru procesele de aseptizare;
asigurarea unei curenii perfecte n toate compartimentele laboratorului
(praf + murdrie = surse de germeni infecii)
Caracteristicile spaiilor laboratorului de micronmulire
Orice defeciune de lung durat poate provoca perturbaii grave n
desfurarea lucrrilor, stagnnd fluxul operaiunilor bani pierdui.
Dimensionarea
se va face innd cont de specificul activitii;
volumul de activitate pe care laboratorul urmeaz s l aib;
amploarea personalului care va deservi laboratorul;
mobilierul i aparatura folosite.
Ex: culturi de meristeme
Scop: obinerea in vitro de material devirozat;
Specific: prelevarea explantelor se face la stereomicroscop. n
consecin, fiecare operator va lucra la un astfel de aparat, instalat n
nia sau boxa steril. Dimensionarea recipientelor de cultur.
Inocularea i creterea culturilor.
ncpere pentru termoterapie.
Laborator profilat pe testarea i certificarea calitii i a strii de
sntate a plantelor generate in vitro.
Camera de cretere.
Ser (construcie special n cazul n care se urmrete pstrarea
culturii n condiii de protejare de ageni fitopatogeni sau construcie
obinuit).
Alcatuirea zonei nesterile
Spltorul
ncpere cu ciment pe jos i cu canalizare n pardoseal, ciment mozaicat
sau gresie, cu panta usoara in conditii de scurgere in pardoseala.
Cuprinde
bazine pentru nmuierea sticlriei i pentru splarea propriu-zis a
acesteia i, eventual, un al treilea bazin pentru limpezirea sticlriei
splate.
distilator (de 510 litri)
ap cald i rece
sistem de iluminare
rastele pentru uscarea sticlriei.
dulapuri n scopul depozitrii sticlriei, a unor materiale i a reactivilor
care nu necesit condiii speciale de pstrare.
cutii pentru gunoi (preferabil cu capac) i un suport pentru perii
necesare pentru splarea sticlriei.
Caracteristici:
camer spaioas (s permit accesul concomitent a 34 persoane)
corespunztor iluminat.
Dotat cu instalaii de: canalizare, ap curent (rece i cald), gaze, electricitate,
pomp pentru vid etc.
Pardoseala: materiale uor lavabile.
Mesele de lucru vor fi faianate sau vor fi acoperite cu material plastic ori cu folie
melaminat, pentru a putea fi ntreinute uor i pentru a rezista la reactivi.
Aparatura:
1 3 agitatoare;
1 2 bain marie;
pH-metru;
frigider de mare capacitate, cu congelator.
balane electronice - subuniti de gram (100 10 mg);
microscop optic i un stereomicroscop.
Sticlarie
Laboratorul pentru pregtirea mediilor de cultur
Sterilizarea
Ce este sterilizarea?
Ce se sterilizeaz: mediul de cultur, apa distilat, instrumentar, sticlarie i alte vase de
cultura, hartia de filtru.
1. Recipientele cu medii de cultur se sterilizeaz prin autoclavare la temperatura de 121
C, pe o durat de timp care variaz n funcie de ncrctur. Odat sterilizate, pot fi
pstrate o perioad de timp, n camer frigorific, la ntuneric, pentru a evita degradarea
sau fotooxidarea vitaminelor i a hormonilor i pentru a prentmpina deshidratarea
mediilor, prin evaporarea apei.
2. Apa distilat este indispensabil n laborator, att pentru prepararea apei sterile ct i
pentru splarea materialului biologic sau la cltirea final a sticlriei. Se folosete n
procese de cltire a materialului vegetal, n dezinfectie, in lucrul la hota.
3. Instrumentar - necesar n lucrul la hota, n mediul aseptic, cu material liber de
virusuri i boli.
4. Sticlaria folosit n cadrul procedurilor de lucru la hota va fi sterilizat.
5. Hrtia de filtru care se folosete tampon ntre materialul vegetal sterilizat i suprafaa
hotei se sterilizeaz.
este destinat pstrrii n condiii optime a inoculilor, n vederea asigurrii
bunei dezvoltri a acestora.
CONDITII: condiii maxime de aseptizare, s nu fie igrasie, s nu fie demisol
sau subsol, dei literatura veche recomand, din contra, acest tip de
amplasament pentru evitarea fluctuaiilor mari de temperatur. Recent, nu se
mai recomand amplasarea camerelor de cretere sub nivelul solului, deoarece
pot aparea probleme legate de umiditate, microorganismele specifice zonelor
calde si umede, fr aerisire. Asigurarea climatizarii camerelor de cretere ntr-
un anumit regim de temperatur, de preferin 2123 C ( 2 C fa de
temperatura dorit) i cu o U de 50%, dar nu sub 50%(!).
ARHITECTURA: etajere metalice cu polie de sticl amenajate spaial i cu
acces facil; sistem de iluminare automatizat, perei zugravii n alb lavabil
(faian nu mai este recomandat pentru c dezvolt microrganisme ntre
rosturi), pardoseala din ciment, pentru a fi uor de ntreinut.
Camera de cretere
tuburi fluorescente amplasate deasupra
culturilor, la o distan de 3040 cm.
trebuie s asigure necesarul specific
speciei luate n cultur; aezarea
flacoanelor s fie fcut pe un strat izolator,
de exemplu din polistiren expandat pentru
prevenirea supranclzirii mediului i a
deshidratrii acestuia.
Atentie!!Fluctuaiile de temperatur produc
modificari ale volumului de aer din
recipientele de cultur formarea unor
cureni din exterior spre interior care
transport germeniinfectarea secundar
a mediilor de cultur.
Atentie!! Tuburile fluorescente trebuie s
asigure iluminarea uniforma i s nu fie
surs de incendiu.
Fotoperioada optim: 16 ore lumin/8 ore ntuneric, la 2-2,6 klucsi.
SISTEMUL DE ILUMINARE
ROL
Asigur condiii controlate necesare etapelor micropropagrii in vitro;
Asigur condiiile necesare primei etape din aclimatizare i trecerea in vivo.
(Pelargonium sp)
in vitro in vivo
Alctuirea zonei sterile
Camera steril
Def. =camera care foloete la sterilizarea, prelevarea, inocularea i multiplicarea
explantelor.
Caracteristici
Pereii vopsii n ulei sau placai cu faian.
Pardoseala din ciment pentru a fi uor lavabil, dar nu va avea canalizare n
podea.
Dotari
nie sau boxe (hote) cu flux laminar,
orizontal, continuu, de aer steril; asepsia
aerului este asigurat prin filtre speciale
care rein particulele mai mari de 0,2 mm;
periodic, filtrele trebuie schimbate, ntruct
ele se uzeaz ; hotele vor fi orientate pe
peretele opus uii i ferestrelor, pentru a
evita formarea curenilor de aer. n spaiul
propriu-zis de lucru vor fi aezate suporturi
pentru instrumente sterile i vor fi montate
instalaii obinuite de iluminat i tuburi
pentru emanaie de raze ultraviolete
necesare sterilizrii.
Nu este permis s se
interpun mna,
instrumentarul sau alte
obiecte chiar sterile ntre
curentul de aer steril i
recipientul deschis.
De regul, nia sau hota
trebuie ncrcat naintea
nceperii lucrului numai cu
obiecte sterilizate, iar
operatorul se va spla cu
alcool pe maini de fiecare dat
cnd prsete i revine n
perimetrul baleiat de fluxul
laminar, orizontal, de aer
steril.
Hota va fi pus n funciune
cu cca 20 de minute nainte de
nceperea operaiunilor.
Operatorul la hota
Sticlria
- se utilizeaz toate tipurile de
recipiente din sticl dintr-un
laborator de agro sau biochimie.
- sunt necesare pipete, cilindrii
gradai, plnii, baloane cotate (de
diferite capaciti), sticle i borcane
pentru reactivi (de variate tipuri i
mrimi), vase Erlenmeyer i
Berzelius de dimensiuni diverse,
capsule Petri, casolete, baghete,
tuburi din sticl, sticlele de ceas, nuci
filtrante, filtre Millipor, seringi,
exicatoare etc.
- recipiente de cultur: pot fi folosite
baloanele cu fund plat ori variate
vase din sticl incolor, de forme i
mrimi diferite.
Flacoanele cu medii de cultur, n
vederea sterilizrii vor fi obturate cu
dopuri sau capace.
Dotarile laboratorului
boxa sau incinta steril, autoclav, aparatul de distilat i bidistilat ap,
frigiderele de mare capacitate, agitatoarele magnetice (cu plit pentru
nclzirea mediilor), balanele (analitic i tehnic), pH-metrul, etuvele,
microscopul i stereomicroscopul, 12 lupe, centrifuga pentru
sedimentarea biomasei n suspensiile celulare, compresorul, o pomp de
vid, dispozitivul de repartizare a mediului, recipientele de cultur, aparatul
de fotografiat.
Aparatura i dispozitivele
n tehnicile de culturi de esuturi se lucreaz
cu instrumentar de tip chirurgical: pense (de
diferite forme i mrimi, mai lungi dect
eprubetele n care urmeaz s inoculm), ct
mai elastice, foarfeci i bisturie, anse, cuite,
scalpele, lame de ras, perforatoare (de diferite
dimensiuni), care s permit explantarea unor
cilindrii de esut, etc.;
Categoria a doua: ace, seringi, ace spatulate,
lamp de spirt etc.
Instrumentarul
n laborator snt necesare i alte materiale de mic valoare, i anume: site
cu azbest, clame, trepiede, tuburi din sticl sau din cauciuc, becuri de
gaz etc.
Vata este necesar n cantiti mari atat pentru dezinfectarea minilor
operatorului, a dezinfectrii i splarii hotelor i a suprafeelor de lucru
ct i pentru confecionarea dopurilor.
Alte obiecte: trus mecanic termometre de camer, mnui din cauciuc
(de uz menajer), folie incolor din polietilen (pentru acoperirea vaselor
de cultur), elastice (pentru fixarea foliei de polietilen la gtul
recipientelor), folie din aluminiu (pentru nchiderea sau acoperirea
flacoanelor cu mediu), site de metal (pentru strecurarea materialului
vegetal n operaiunea de sterilizare), tvi metalice, couri din srm,
casolete metalice, suporturi pentru eprubete, vase i cutii din plastic,
perlit, vermiculit, sfoar, a, tifon, hrtie de filtru i de mpachetat etc.
Materiale diverse
Substanele necesare n
laborator
detergenii sau spunurile (solide ori lichide),
soda i prafurile de curat de uz menajer;
alcoolul utilizat pentru dezinfectare (se poate folosi i spirtul sanitar);
acidul clorhidric tehnic;
amestecul cromic (folosit n scopul curirii veselei);
cloramin;
hipoclorit etc.
ntre substanele chimice de uz comun intr i reactivii obinuii din laboratoarele
de chimie, i anume: acizi minerali (clorhidric, sulfuric, azotic) i baze (hidroxidul
de potasiu, natriu, amoniu, de puritate tehnic i cu grad ridicat de calitate), utilizai
n curirea sticlriei i necesari n prepararea unor soluii; acizi organici (acetic,
citric, oxalic), alcool etilic (absolut, de 96 sau 70 ), aceton, eter, cloroform (utilizai
n cantiti mici), dimetilsulfoxid (DMSO), polietilenglicol (PEG), Tween, ap de
brom, clorur mercuric, hipoclorit de natriu sau de calciu, perhidrol etc.
1. Materiale chimice
srurile anorganice i compuii organici utilizai n prepararea soluiilor nutritive,
reactivi de uz comun (baze i acizi), substane indispensabile pentru sterilizarea
materialului vegetal, si preparate destinate curirii ncperilor i obiectelor.
Se analizeaza tipul de explant, proveniena lui i sezonul n care se recolteaz. Se
aleage mediul cel mai echilibrat pentru a se asigura o evoluie bun a inoculilor.
Dac nu ne putem decide, vom face experiene de tatonare, cu diferite medii.
Tipuri de concentraii ale compuilor frecvent ntilnii n mediile de cultnr (n
mM/L) (dup De Possatd i colab., 1974)
2. Substanele necesare pentru
prepararea mediilor de cultur
Constituenii Concentraie (n mM/1)
Sczut Medie Ridicat
SRURI MINERALE
NH
4
NO
3
5 10 20
KNO
3
10 20
KH
S
PO
4
0,1
NaH
2
PO
4
__ 1 2
KC1 1.9 __
CaCl, 1 2 3
MgSO
4
0,5 1,5 3
H
3
BO
3
0,01 0,05 0,15
MnSO
4
0,01 0,05 0,1
ZnSO
4
0,001 0,02 0,04
CuSO
4
0,00001 0,0001 0,0015
Na
2
Mo0
4
0,00001 0,0001 0,001
CoCl
2
0,0001 0,0005 0,001
KI 0,0005 0,0025 0,005
FeSO
4
0,01 0,05 0,1
Na,EDTA 0,01 0,05 0,1
A UXINE 0,0001 0,001 0,01
CITOCHININE 0,0001 0,001 0,01
SUBSTANE ORGANICE
Inozitol 0,1 0,3 0,6
Acid nicotinic 0,004 0,02 0,04
Piridoxin HC1 0,0006 0,003 0,006
Tiamin HC1 0,0001 0,002 0,04
Biotin 0,00004 0,0002 0,001
Acid folie 0,0005 0,001 0,002
Pantotenat decalciu 0,0002 0,001 0,005
Riboflavin 0,0001 0,001 0,01
Acid ascorbic 0,0001 0,001 0,01
L-Cistein HC1 0,01 0,06 0,12
Glicin 0,0005 0,005 0,05
Zaharoz 6 60 120
Sera de aclimatizare
Spaiu destinat trecerii explantelor de la condiii in vitro la conditii in vivo cu
parametri controlai.
MICRONMULIREA
PLANTELOR HORTICOLE
@2013
Lect. univ, prof. dr. Adrian Peticil
Asepsia n culturile vegetale in
vitro
ASEPSIZARE = STERILIZARE
Def. = procesul, operaiunea de distrugere (cale fizic sau chimic), filtrare, nlturare
(fizic), splare sau ultrasonare a micro-organismelor i a sporilor acestora;
Ci de sterilizare: A) distrugerea germenilor i B) eliminarea germenilor.
DISTRUGEREA GERMENILOR
Arderea prin flambare;
nclzirea cu cldur uscat sau vapori supranclzii;
Iradierea cu raze gamma, microunde sau UV;
Agenti chimici: alcool etilic, soluii clorurate, oxid sau pentaoxid de etilen
(INFLAMABIL!!), ap oxigenat, ap bromat.
ELIMINAREA GERMENILOR
Filtrarea;
Splarea n curent de ap sau ap staionar cu ageni spumani.
INFECIILE PRIMARE
PREVENIREA INFECIILOR PRIMARE ESTE CONDIIE
SINE QUA NON N CULTURILE IN VITRO
INFECIILE SECUNDARE
Se declaneaz dup cteva sptmni de la inoculare.
PREVENIRE:
Respectarea regulilor de asepsie la nivelul materialului vegetal;
Respectarea asepsiei la nivelul recipientelor i mediilor de cultur;
Respectarea asepsiei la inoculare, cu instrumentar sterilizat ;
Respectarea manipularii flacoanelor, fr contaminare.
Personalul trebuie s aib cunotine minime de microbiologie,
despre natura germenilor (virusuri, bacterii, alge, drojdii,
mucegaiuri) i cile de transmitere i reproducere a acestora.
CONDITIE
STERILIZAREA NCPERILOR, A
SUPRAFEELOR I
INSTRUMENTARULUI
Sterilizarea atmosferei ncperilor, mobilierului i altor obiecte,
cile de acces, niele, incintele.
Sterilizarea hotelor
!!! UV !!! Se ntrerup cu 20-30 minute nainte de accesul personalului care
deservete lucrul la hote pericol de contaminare.
Sterilizarea casoletelor, recipientelor cu mediu steril, a instrumentarului,
flacoanele cu inoculi n caz de repasare: la etuv, autoclav, alcool 70,
fierbere n baie de ap sau electric, flambare.
nainte de nceperea operaiunilor de lucru la hota: sterilizarea
instrumentarului prin introducere n alcool, flambare sau alte substane
bactericide.
Sterilizarea periodic a minilor operatorului prin pulverizare de alcool
etilic i sterilizarea permanenta a instrumentarului n timpul lucrului.
!!!ATENTIE!!! Instrumentarul sterilizat poate fi fierbinte.
Aciunea lui asupra plantelor poate sa le provoace daune totale.
STERILIZAREA RECIPIENTELOR DE
CULTUR I
DEZINFECTAREA ALTOR OBIECTE
Recipientele de cultur - trebuie s fie presterilizate.
!!!ATENTIE!!! Presterilizarea poate produce degradarea calittii sticlei i
poate elibera compui toxici care influeneaz negativ culturile.
Dopurile de cauciuc sau din plut sau material plastic
termorezistente, splate, fierte i sterilizate n prealabil.
Dopurile de vat (se prefer) se asepsizeaz odat cu mediul de cultur.
Aparatura care se introduce n hota steril se dezinfecteaz cu alcool etilic
70
STERILIZAREA LICHIDELOR, A APEI
I A MEDIILOR DE CULTUR
Mediul de cultura: porionat, obturat i
sterilizat.
Dopul sau capacul nu se va nchide etan,
pentru
a permite circulaia vaporilor de ap agent
sterilizant.
Autoclavare la 120, timp de 20-30 minute,
1 atm.
Vasele nu se umplu mai mult de din
capacitate - risc explozie din cauza variaei de
presiune de la sfaritul autoclavrii.
Inocularile se opereaz numai dup rcirea
mediului de cultur, la 24-48 h.
SUPRAAUTOCLAVAREA = se produce o alterare a calitii mediului
de cultur prin deteriorarea echilibrul ionic din mediu, afectarea
capacitii de solidificare a agarului, caramelizarea zaharozei.
SUBAUTOCLAVAREA = se dezvolt coloniile de microorganisme, ceea
ce duce la inutilizarea lotului de mediu.
Sterilizarea se poate face i n kukta - oala sub presiune- cu capacitate
de 8-10 l.
Durata sterilizare: 15-25 minute de la momentul declanarii emisiei de
vapori
Sterilizarea la rece: se poate aplica mediilor lichide, prin filtrare cu nuci
filtrante de sticl sau porelan sau filtre Millipor.
Substanele dezinfectante n mediul de cultur
practic mai putin uzitat
inhib dezvoltarea bacteriilor sau ciupercilor (oxidul de propilen)
inhib viruii (penicilina, streptomicina, cloramfenicol)
RISC: provoac mutaii, inhib organogeneza, stopeaz organogeneza,
debilitate crescut la trecerea plantelor din in vitro n in vivo i scade
capacitatea adaptativ)
Sulfamidele n mediul de cultur
au aciune bacteriostatic puternic dar nuse folosesc n mediul de cultur
ASEPSIZAREA
MATERIALULUI VEGETAL
Se realizeaz numai cu ageni chimici.
Condiie esenial i prim etap n culturile in vitro.
Factori care influeneaz tipul
de asepsizare:
1. specia;
2. condiiile ecologice;
3. organul;
4. esutul;
5. poziia n plant;
6. vrsta;
7. fenofaza plantei.
Succesul asepsizrii depinde de:
selectarea corect a metodei de asepsizare;
substanele alese pentru sterilizare;
concentraia acestora;
durata de timp alocat asepsizrii.
!!!! Organele subterane au cel mai
mare grad de infectare cu ageni
patogeni (parazii, simbioni sau
saprofii i sporii lor)
ATENTIE!!!
Mugurii, tulpinile, ramurile i organele cu pilozitate:
------- ader sporii germenilor cu uurin;
------- mpiedic accesul dezinfectantului direct pe suprafa;
------- tensiune superficial ( spumant)
------- proceduri speciale: antibiotic n mediul de cultur ( ex.: Pelargonium sp)
1. aciune suficient de puternic;
2. toxicitatea nu trebuie s distrug
esuturi/necroze;
3. trebuie s poat fi ndeprat cu
uurin;
4. sterilizarea este doar de suprafa
pot s apar infecii la a 2-3 repasare
(bacterii, virusuri, micoplasme sau fungi
aflate n esuturile din organe)
Privire general asupra dezinfectanilor
Tipuri de dezinfectani
ALCOOL ETILIC
Concentraii variate: 70, 96 sau absolut.
Puternic liposolubilizant
Coagulant proteic excelent
Se recoamand doar la organele cu pilozitate mare,
epiderma cutinizata puternic, muguri bine nchii.
Scufundare 5-60 sec.
Necesit cltire RAPID cu ap distilat pentru
rehidratare
APA BROMAT mai puin eficient
CLORURA MERCURIC toxicitate mare
HIPOCLORIT DE CALCIU sau SODIU (Apa de Javel)
Concentraii variate;
Se recomand submersarea unor poriuni vegetale mai mari,
din care se va seleciona ulterior materilaul de inoculat/NECROZARE;
Conin 15-20% Cl se recomand folosirea imediat a dezinfectantului pentru
eficien;
Concentraii recomandate: 1-8%;
Probarea eficacitii soluiilor pe baz de clor activ: colorarea n alb a zonelor lezate
prin tiere sau nepare;
Se recomand splarea ulterioar n aprox. 5 bi succesive (a 10-15 min fiecare) n
ap distilat, steril.
PROCEDURI
RECOMANDATE
Fructe
PRESTERILIZARE: alcool etilic absolut
STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na 2%, 10 minute.
POSTSTERILIZARE: cltiri n ap steril cu extragerea esuturilor care
intereseaz.
PROCEDUR: cultura de ovule.
Flori
PRESTERILIZARE: alcool etilic 70-90%, 1 minut
STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na 2-5%, 15-20 de minute.
POSTSTERILIZARE: cca. 5 cltiri n ap steril
PROCEDURA: cultur de antere, multiplicare, propagare, iniiere cultur
calus.
PROCEDURI RECOMANDATE
Frunze
PRESTERILIZARE: tergere suprafa limb cu alcool etilic absolut.
STERILIZARE: clorur mercur 0,1%, cca 1 minut..
POSTSTERILIZARE: cca 5 clatiri n ap steril s i tamponare exces ap cu
hrtie filtru steril.
PROCEDUR: cultur calus, probeleme de difereniere - cere prezena
nervurii principale.
OBSERVAII: greu de sterilizat, necrozeaz usor.
Fragmente de tulpin
PRESTERILIZARE: cltire ap curgtoare i alcool etilic absolut.
STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na (2-5%, pn la 10%), 15-30 de
minute; ap distilat, 1 or.
POSTSTERILIZARE: cca. 3 cltiri n ap steril.
PROCEDUR: cultur de calus, multiplicare, propagare. Pentru cultura
de neoplantule.
OBSERVAII: respectarea polaritii naturale.
PROCEDURI
RECOMANDATE
Semine
PRESTERILIZARE: alcool etilic absolut, 10 sec., splare ap distilat steril.
STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na (10%), timp de 20-30 min./apa bromat
(1%), 5 min./clorur de mercur (15-30%)%, 15-20 min./fenol (5%).
POSTSTERILIZARE: cca 5 cltiri n ap steril
PROCEDUR: cultur de rdcini, cultur de calus, nugurai i organe pentru
regenerare neoplantule..
OBSERVAII: germinare pe hrtie de filtru, umectare constant.
Organe de rezerv
PRESTERILIZARE: ap curgtoare cu agitare.
STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na (2%), 20-30 de minute.
POSTSTERILIZARE: cca. 3 cltiri n ap steril.
PROCEDUR: cultur de calus, cultur de neoplantule.
MICRONMULIREA
PLANTELOR HORTICOLE
@2013
Lect. univ, prof. dr. Adrian Peticil
MEDIILE DE CULTUR
Def.: Medii aseptice, compozitie chimica de natura complexa, care
pot inlocui partial organismul matern al explantei, asigurand hrana
acestuia in conditii modificate.
Suportul fizico chimic necesar cresterii si dezvoltarii explantelor.
CATEGORII
Lichide, semisolide si solide.
CRITERII DE SELECTARE A MEDIULUI DE CULTUR:
Tipul de explant, modul de cultivare, proveniena, stadiul de dezvoltare
a explantului, specia, soiul, marimea, sezonul (important mai ales
pentru muguri), scopul culturii.
GENERALITI
Dac nu exist cercetri referitoare la multiplicare in vitro pe o specie,
se fac tatonari pe mediile standard cunoscute modificari de
concentratie auxine, citochinine reactia plantei.
Mediile de cultur ajung la proprietile finale numai dup
sterilizare i autoclavare
Cei care au studiat necesarul de elemente chimice pentru hrana
explantelor i evolutia lor: fiziologi specializai in nutriia plantelor.
Recomandri:
Cultur de calus - Gamborg (B5), Gautheret, Heller, Murashige-Shoog
(MS).
Cultur de rddcini White.
Cultur diverse organe Gamborg, Murashige-Shoog.
Cultur antere - Nitsch.
COMPUI ANORGANICI: ap, sruri minerale (macro i micro elemente)
COMPUI ORGANICI: glucide, vitamine, regulatori de cretere, agar etc.
COMPOZIIE
COMPUII ANORGANICI
1. APA
Existena far ap?
Procesele vitale n plante; metabolismul plantelor i apa.
Procesul de prelevare
Inoculare
Cultura in sine
Aclimatizare

Depind de cantitatea
de ap.
Reechilibrare osmotic prin imersie n concentraie salina moderat.
COMPOZIIE
COMPUII ANORGANICI
1. APA
Apa n recipietele de cultur: circuit nchis.
Reglarea temperaturii n camera de cretere;
Condensul din recipiente i pierderea acestuia prin neetaneizarea
recipientelor

dezechilibrarea hidric a explantelor.


apa bidistilat sau distilat vs. apa pur sau ultrapur
considerat ap
moart sau
nebiologic.
optim pentru
realizarea
mediului de
cultur.

COMPOZIIE
COMPUII ANORGANICI
2. SRURILE MINERALE
. Cele mai frecvente saruri folosite sunt fosfatii, azotatii, clorurile si
sulfatii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn, Cu, Na.
MICROELEMENTE
Fe, Mn, Zn, Al, B, Cu, Mo, Na, Co, I.
Rolul fiziologic al fiecarui element din mediul de cultura
variaza in functie de concentratie, natura explantelor,
specificul culturii etc.
MACROELEMENTE
C, O, H, N, P, S, K, Ca, Mg
Proportiile lor in mediile de cultura se aleg conform cu scopul urmarit, fie
folosind retele deja consacrate, fie prin tatonari personale.
COMPOZIIE
COMPUII ANORGANICI
MACROELEMENTE
. Rolul macroelementelor in compozitia mediului
Exemple:
omiterea N, S sau P in cazul culturilor de liber secundar la morcov
provoaca moartea inoculilor in cca 2 luni de la inoculare.
Lipsa cationului de K duce la incetinirea cresterii culturilor.
Marirea concentratiei cationului de K duce la marirea ratei cresterii
culturilor de tutun si vita de vie salbatica.
Carentele de Ca si Mg genereaza tulburari vegetative culturilor, pana
la moartea celulelor.
Absenta NH4NO3 pt culturile de Lactuca sativa genereaza doar calus,
fara sa se produca diferentierea mugurasilor.
Tesuturile senescente sau ameliorate cer medii cu continut de Ca
suplimentar.
COMPOZIIE
COMPUII ANORGANICI
MICROELEMENTE
. Rolul microelementelor in compozitia mediului
Exemple:
Fe intervine in metabolizarea intranucleara, sinteza ARN si sinteza
proteica; necesita a fi administrat sub forme chelatizate, deoarece este
greu de asimilat.
Lipsa Zn modifica sinteza auxinei.
Mn participa la proteosinteza si formarea ARN-ului in celulele
radacinilor de mazare
B are rol in procesele de diviziune si crestere celulara
Al este catalizator al multor reactii chimice.
OMITEREA totala a microelementelor din mediile de cutura conduce la
reducerea cresterii celulare cu 40% in final, dupa a 3-a repasare la
decesul culturii.
MEDIILE RECOMANDATE
WHITE (1943) recomandat pentru culturile de tesuturi tumorale.
HELER (1953) recomandat pentru multe culturi, mai putin tutun.
KNUDSON (1925) recomandat pentru orhidee si ferigi.
MURASHIGE-SKOOG (1962) recomandat pt culturi de calus la
tutun si culturi de celule la majoritatea speciilor. Numit mediu
universal.
GAMBORG (1968) recomandat in germinarea in conditii aseptice a
semintelor.
AGARUL
Produs natural extras din alegele marine aduce un procent
suplimentar de elemente chimice (Ca si Mn).
Influenteaza potentialul osmotic si difuzia nutrientilor.
pH-ul mediului de cultura MS
Ph-ul si precipitarea mediilor de cultura
Mediul MS standard autoclavare turbiditate in urma precipitarii si
scaderii pH-ului cu 0,2-0,5 unitati.
Cauza: ionii bivalenti de Fe, in precipitare oxideaza in Fe trivalent ce
precipita sub forma de ion fosfat feric.
Corectiile se fac cu citrat de Na ( variatia este limitata la 0.15 unitati
pH).
Cercetarile continua.
COMPUII ORGANICI
COMPUII ORGANICI
ROL
1934 WHITE - zaharoza si extractul neautolizat de drojdie
(contine glicina/aminoacizi si tiamina/vitamine) aduc
superioritate nutritionala mediilor de cultura.
1934 s-a descoperit pricipiul de actiune al AUXINELOR.
1938 ROBBINS SI SCHMIDT piridoxina si acidul nicotinic sunt
adaugate in mediu.
COMPUII ORGANICI
CARBONUL ORGANIC
ZAHAROZA
Culturile vegetale evolueaza optimla o concentratie a zaharozei de
2-3% (3% glucoza doar pentru culturi de meristeme la unele specii
lemnoase).Variatiile intre 1,2% - 8% (cartof): in functie de natura
explantului, tipul de cultura, specie si scopul culturii.
Mediul de cultura contine adaos de carbon glucidic, ceea ce
asigura substrat respirator pentru culturi ( prin degradarea
glucidelor se obtine energia necasara proceselor vitale,
multiplicarii, cresterii si diferentierii celulare).
Polimerizarea glucozei duce la celuloza, compus de baza al
peretelui celular.
Zaharoza prezinta eficienta maxima in procesele metabolice la
nivelul culturilor in vitro (alte surse: glucoza, fructoza, maltoza,
rafinoza, amidonul).
Excesul de zaharoza: celulele plasmolizeaza din cauza presiunii
osmotice
COMPUII ORGANICI
CARBONUL ORGANIC
ALCOOLI
GLICEROLUL poate fi folosit ca sursa energetica, potentand efectul
glucidelor.
MONOALCOOLII (metanol, etanol, propanol, butanol) nu pot fi
utilizati, fiind toxici (chiar si la dilutii mari).
AZOTUL ORGANIC
Tesuturile vegetale sunt autotrofe fata de azot, preluandu-l din
substantele anorganice.
1939, WHITE --- GLICINA imbunatateste cresterea radacinilor la
tomate.
UREEA si UNELE BAZE AZOTATE ----surse eficiente de azot organic.
1981, BIONDI si THORPE --- utilizarea aminoacizilor in mediile de
cultura are efecte bune in conditiile in care urmarim formarea
calusului; atentioneaza asupra faptului ca sursele de azot organic in
culturi pot fi toxice.
COMPUII ORGANICI
VITAMINELE
Avantajele vitaminelor in cultura explantelor s-au descoperit
intamplator (1922-1940) dupa WHITE.
Orice mediu de cultura contine vitamine la aceasta data, fiind
considerate indispensabile.
VITAMINA B1
(TIAMINA)
Valoare biologica
importanta.
Stimuleaza cresterea
celuleor si tesuturilor.
VITAMINA B6
(PIRIDOXINA)
Precursor al
enzimelor.
ACIDUL FOLIC
Efect stimulant asupra
tesuturilor tumorale
dar si efect toxic
urmare a
descompunerii in acid
p-aminobenzoic (factor
de crestere insa).
ACIDUL
NICOTINIC
Utilizat inca din
1938; indispensabil.
VITAMINA H
(BIOTINA)
Utilizata inca din
1946 (Morel).
Exercita efect
stimulator asupra
culturilor de celule.
VITAMINA C
(ACIDUL ASCORBIC)
Actiune antioxidanta.
INOZITOL
(glucid/vitamina)
Obligatoriu in mediul
de cultura dar nu se
cunoaste clar rolul
fiziologic.
COMPUII ORGANICI
FITOHORMONII/FITOREGULATORII
Stimuelaza, inhiba sau modifica calitativ si cantitativ cresterea si
dezvoltarea explantelor.
Concentratii foarte mici, de ordinul 1mM sau M.
FITOHORMONII produc modificari la nivelul proceselor de
morfogeneza, organogeneza, embriogeneza, cu urmari in dezvoltarea
celulara, tisulara, organica, diferentierea celulara sau la nivelul intregii
plante.
FITOREGULATORII regulatori chimici, organici, compusi de sinteza
care imita efectele hormonilor naturali, devenind indispensabili in
biotehnologiile vegetale.
INFLUENTA FITOHORMONILOR (raspunsul imediat sau intarziat
al plantei) depinde de starea fiziologica a centrilor receptori (celule,
tesuturi, organe), stadiul de dezvoltare al organelor plantei, natura si
nivelul semnalului, interactiile acestuia cu alti fithormoni, conditiile de
mediu s.a.m.d.
COMPUII ORGANICI
FITOHORMONII/FITOREGULATORII
Multiplicarea si cresterea celulara - fenomene complexe- pot produce
reactii particulare urmare a interactiunii dintre fitohormonii explantei si
fitoregulatorii administrati in mediul de cultura.
CINCI MARI CATEGORII DE FITOHORMONI
AUXINE, CITOCHININE, GIBERELINE, ACIDUL ABSCISIC, ETILENA.
DARWIN 1880
Intuieste existenta fitohormonilor.
Peste un secol, inca nu se cunosc mecanismele de interactiune si toate
procesele implicate.
WENT 1928
Descoperirea care a lansat fitotehnologia: identifica auxina A in
urina umana.
ANII 30
Se descopera actiunea giberelinelor, acidului abscisic si etilenei.
SKOOG 1955-1956
Izoleaza din sperma de heringi chinetina (6 furfurilaminopurina).
STEWARD 1956
Citochininele native din laptele de cocos.
COMPUII ORGANICI
AUXINELE
In plante, auxinele se gasesc libere (AIA) fie legate -sub multiple forme,
sau combinatii ale AIA cu acid aspartic, glutamic sau acid ascorbic
TIPURI DE AUXINE
AIA (auxina nativa), AIB (acidul 3-indolilbutiric-nu se gaseste in toate speciile
vegetale), ANA (acidul 1-naftilacetic), 2,4-D (acidul 2,4-diclorfenoxiacetic),
4ACFA SAU ACPA (acidul 4- clorfenoxiacetic), ANOA (acidul 2-naftoxiacetic),
2,4,5-T (acidul 2,4,5-triclorfenoxiacetic), DICAMBA (acidul 3,6-dicloro-2-
metoxibenzoic), PICLORAM (acidul 4 amino-3,5,6-tricloro-2-piridincarboxilic) ,
AMCA (acidul 2-metic-4-clorfenoxiacetic).
ACTIUNEA FIZIOLOGICA A AUXINELOR
1. Cresterea in lungime a celuleor (marirea plasticitatii peretilor celulari);
2. Permeabilizarea membranelor plasmatice;
3. Influente pozitive asupra sintezei ARN ribozomal;
4. Stimuleaza diviziunea celulara (alaturi de citochinine);
5. Influenteaza sinteza de etilena;
6. Influenteaza cresterea celulelor in tropisme;
7. Implicate in fenomenul de dominanta apicala, caulinara;
8. Actiune inhibitoare asupra caderii frunzelor si fructelor;
9. Actiune rizogenastimularea butasilor in inmultirea vegetativa;
10. Inhiba formarea embrionilor somatici.
COMPUII ORGANICI
AUXINELE
La concentratii mici: actiune benefica asupra cresterii;
La concentratii mai mari: actiune inhibitoare sau chiar toxica (dicamba
sau 2,4-D) auxinele de sinteza devin erbicide.
Auxinele de sinteza
ANA SI 2,4-D sunt cele mai stabile;
Viteza de degradare si capacitatea de actiune depinde de multi
factori: tipul tesutului, natura si concentratia auxinei, fenofaza
plantei, organul supus tratamentului.
Radacinile sunt mai receptive la concentrati scazute de auxine;
Tulpinile, frunzele si fructele (in formare) cer concentratii mai
ridicate de auxine.
COMPUII ORGANICI
CITOCHININELE
In absenta citochininelor, CELULELE NU SE DIVID.
1955: la 3 luni de la izolarea citochininei, de sintetizaza benzil-adenina/
benzilanimopurina/BA/BAP)
Citochininele native se regasesc in multe extracte vegetale (drojdie de
bere, germeni de porumb, lapte din nuca de cocos)
TIPURI DE CITOCHININE
K sau KIN(CHINETINA sau KINETINA), Z (ZEATINA), BA sau BAP
(BENZILADENINA sau BENZILAMINOPURINA), 2iP
(IZOPENTENILADENINA), TDZ (TIDIAZURON)
PARTICULARITATI
Biosinteza citochininelor se realizeaza in radacini si embrioni, in meristeme.
Se folosesc, de regula, in dilutii mari si suporta bine autoclavarea.
AUXINE + CITOCHININE = BALANTA HORMONALA
Concentratii sporite de auxine potenteaza rizogeneza.
Concentratiile sporite de citochinine potenteaza formarea de muguri si
generarea de tulpinite.
Concentratii sporite din ambele potenteaza morfogeneza si procesele de
calusare.
COMPUII ORGANICI
CITOCHININELE
ACTIUNEA FIZIOLOGICA A CITOCHININELOR
1. Impulsioneaza diviziunea celulara;
2. Stimuleaza formarea de mugurasi si tulpinite, in functie de
concentratie si balanta;
3. Stimuleaza proteosinteza (au fost gasite citochinine legate de ARN
transfer);
4. Rol in preventia senescentei;
5. Efect antagonic auxinelor, anihiland dominanta apicala a mugurelui
terminal;
6. Sustine capacitatea de supravietuire a inoculilor;
7. Favorizeaza si sustine multiplicarea celulara;
COMPUII ORGANICI
GIBERELINE
Descoperite in 1926 de KUROSAWA si izolata abia in 1935, cea mai
activa giberelina fiind acidul giberelic (AG3);
Importanta mai mica decat auxine si citochinine.
ACTIUNEA FIZIOLOGICA A GIBERELINELOR
Produc alungirea internodiilor tulpinilor si a rahisului
inflorescentelor;
Ajuta la inlaturarea fenomenului de nanism;
Rol in reglarea nivelului endogen de auxina;
Suprimarea latentei la nivelul semintelor, mugurilor sau
organelor de rezerva;
Actiune complexa in anteza;
Rol in formarea fructelor partenocarpice;
Rol in germinarea semintelor;
AG3 nu exercita vreo actiune asupra rizogenezei.
COMPUII ORGANICI
GIBERELINE
Biogeneza este localizata in extremitatile radacinilor ,
embrionilor, frunzelor foarte tinere si mugurilor activi;
Semintele contin cea mai mare cantitate de gibereline,
cele imature fiind cele mai bogate in fitohormoni;
Folosirea giberelinelor in culturi in vitro se face cand se
urmareste favorizarea alungirii meristemelor
caulinare, apicale;
Absenta giberelinelor in mediul de cultura poate
genera un fenomen de crestere globuloasa.
Particularitati
COMPUII ORGANICI
ETILENA
Fitohormon recent recunoscut, identificat insa din 1901 de
NELJUBOV;
Hidrocarbura nesaturata gazoasa, a fost greu de identificat in
celule deoarece fructele verzi au un continut mic de etilena (mai
mare in fructele in coacere);
Auxinele naturale stimuleaza biogeneza de etilena.
Mai putin utilizata in culturi in vitro, fiind gazoasa; se foloseste
sub forma de acid 2-cloroetilfosfonic (ACEP);
Etilena este insa prezenta in recipientele de cultura;
! Explantele care sufera de fenomenul de vitrificare (hiperhidrie)
au o productie de etilena care duce la lignificarea vaselor
lemnoase si rigidizarea peretilor celulari parenchimatici.
---------------
COMPUII ORGANICI
ETILENA
ACTIUNEA FIZIOLOGICA A ETILENEI
-cercetarile continua-
Control asupra cresterii permeabilitatii membranelor plasmatice;
Stimuleaza caderea frunzelor, coacerea si caderea fructelor;
Influenteaza deschiderea florilor, ofilirea si decolorarea;
Induce senescenta tesuturilor;
Intervine in transportul auxinei;
Celulele supuse traumelor produc si emana etilena;
Stimuleaza rizogeneza adventiva;
Inhiba cresterea in lungime a radacinilor;
Influenteaza geotropismul radacinilor;
Stimuleaza cresterea izodiametrica a celulelor.
COMPUII ORGANICI
ACIDUL ABSCISIC (AAB)
ROL important in viata cormofitelor;
ACTIUNEA FIZIOLOGICA A ACIDULUI ABSCISIC
Produce inhibitie asupra cresterii si dezvoltarii embrionilor,
mugurilor si meristemelor;
Implicat in procese de latenta a organelor de rezerva, mugurilor
si semintelor;
In concentratii scazute AAB inhiba efectele AIA si ale
giberelinei;
BIOSINTEZA AAB se afla in frunze (in toate etapele dezvoltarii
plantei);
Utilizat in mica masura in culturile de tesuturi.
COMPUII FENOLICI
Compusi toxici, eliberati in special de speciile lemnoase, in conditii
de stres, care prin actiunea lor antagonica substantelor de crestere,
inhiba reactiile metabolice, oprind cresterea si potentand fenomenul
de dormanta indus de AAB, senescenta si necroza.
Eliminarea lor in mediul de cultura se face atata de celulele agresate
cat si explantul in general, de celulele din profunzime.
Fenolii se elimina oxideazarea brunifcarea mediului
necrozarea celulelor moartea inoculilor.
PREVENTIA se realizeaza:
1. Operarea a 2-3 culturi succesive, repasari, mediu nou;
2. Precultivarea meristemelor pe medii de cultura lichide, 3 zile,
15C, lumina continua la 500 lucsi, mediu solid;
3. Adaugarea in mediul de cultura a unor substante antioxidante:
cisteina HCl, acid ascorbic, acid citric, DDT(ditiotreitol);
4. Adaugarea in mediul de cultura de carbune vegetal;
5. Pastrarea in intuneric a explantelor inoculate pentru o perioada
scurta de timp.
EXTRACTELE VEGETALE
Extract drojdie de bere, hidrolizat de cazeina, suc de portocale, suc
de tomate, lapte din nuca de cocos, extract de malt, extract de
endosperm imatur de porumb etc.
Se utilizeaza in concentratii scazute (de 0,1-1 g.l).
Exista reactii necunoscute ale acestora urmare a necunoasterii
complete a compozitiei chimice.
COMPUSI ANTIVIRALI
Scop: obtinere de culturi libere de viroze;
Procedura este putin folosita in practica curenta;
Exemple: ribavirina, DHT (2,4-dioxohexahydro - 1,2,5-triazina);
Studii facute pe Cymbidium, Prunus sp., Malus sp.;
Prezinta fitotoxicitate iar eficacitatea este conditionata de tipul de
virus, specia virusata si chiar cultivar (BOXUX 1995).
PREPARAREA MEDIULUI DE
CULTURA
Tehnologia de preparare a fost evidentiata in cadrul lucrarilor practice.
Atentionare: folosirea substantelor termolabile a caror sterilizare nu se
pate face prin autoclavare, acestea se adauga in mediu ulterior
autoclavarii, cand temperatura mediului are 35-37C.
Se tine cont de toate informatiile referitoare la manipularea
substantelor chimice intr-un laborator, se lucreaza in curatenie si cu
atentie.
PROBLEME:
Precipitatele insolubile
Infectiile: solutii stoc invechite, vase de cultura nespalate si
nedezinfectate, autoclavare necorespunzatoare, lipsa curateniei in
camera de preparare a mediului
Nesolidificarea mediului dupa racire: prea putin agar (sub 5-
6g/l),pH prea mic (sub 5,5),temperatura de autoclavare prea mare
MEDIULUI DE CULTURA
CATEGORII DE INFECTII DIN MEDIILE DE CULTURA:
1. origine micotica: fructificatii de diferite culori (negru Aspergillus
sp., verde-albastru Penicillium)
2. origine bacteriana: in mediu si la suprafata lui, in zona de contact cu
planta, halou translucid, de culopare alb galbuie
3. brunificarea mediului: provocat de oxidarea fenolilor emisi de
planta
4. vitrificarea/sticlozitatea
5. deshidratarea mediului: umiditate defectuoasa.
MICRONMULIREA
PLANTELOR HORTICOLE
@2013
Lect. univ, prof. dr. Adrian Peticil
ETAPE:
1. PREGTIREA MATERIALULUI VEGETAL
2. INIIEREA I STABILIZAREA CULTURII
3. MULTIPLICAREA
4. NRDCINAREA
5. ACLIMATIZAREA
FAZELE PROPAGRII
IN VITRO
FAZELE PROPAGRII
IN VITRO
1. PREGTIREA MATERIALULUI VEGETAL
N VEDEREA PRELEVRII EXPLANTULUI
Etapa documentar crucial pentru desfurarea cu succes a
procesului
Ce informaii stocam?
Tipul de cultur dorit;
Natura, mrimea i numrul de inoculi;
Natura i proveniena explantului, gradul de dezvoltare a plantei
mam, fenofaza, condiiile de cretere;
Mediul de cultur ales i compoziia acestuia; variaiile.
Tipul de instrumentar necesar procedurii ce urmeaz a se desfura n
etape repetitive;
Regimul culturii: factorii reglabili ca temperatur, umiditate, lumin
fotoperioad;
Particulariti tehnice.
FAZELE PROPAGRII
IN VITRO
continuare
MORFOLOGIA EXPLANTULUI
Explantul trebuie s fie VIU, ideal s conin meristeme, s nu fie
necrozat, modificat sau cu esuturile mecanice distruse.
Se noteaz:
Originea explantelor, specia, varietatea, clona, linia;
Determinarea ecologic a provenienei plantei donor: cmp deschis,
sere, solarii, camere de cretere, depozite sau culturi primare;
Expoziia pe planta donor;
Se tie c:
Se recomand ca explantele s fie recoltate din poriunile tinere ale
plantei donor.
Plantele din spaiile nchise au anse de infestare mai mic.
Exist o corelare ntre localizarea explantului pe planta mam i
contaminarea cu germeni dauntori (distana fa de sistemul radicular).
FAZELE PROPAGRII
IN VITRO
continuare
Se tie c:
Variabilitate mare de reacie: n funcie de biotipurile unei specii, de
soiurile alese sau varieti precum i de originea sa biologic
(morfologic, funcional sau de fenofaz i sezon)
Variabilitate mare de reacie la explante din considerente morfo
funcionale:
Vrful, mijlocul sau baza ramurii;
Ramur umbrit sau nu, solarizat sau nu;
La plante lemnoase: zonele mai apropiate de polul radicular sunt
cele mai bine aprovizionate cu ap, hran i hormoni;
Prezena meristemelor: vrfuri rdcini, noduri, bractee,
inflorescene, apexuri.
Variabilitate n funcie de condiiile ecologice.
GENERALITI
NATURA ESUTURILOR
Natura esuturilor componente:

Variabilitate structural i funcional mare

Totipotena celular

Regenerare la nivelul inoculilor

Difereniere celular
GENERALITI
VRSTA PLANTEI DONOR/PLANTEI MAM SAU A
ORGANULUI DIN CARE SE PRELEVEAZ
Cea mai ridicat capacitate regenerativ o au: cotiledoanele,
hipocotilele i muguraii.
GENERALITI
VRSTA PLANTEI DONOR/PLANTEI MAM SAU A
ORGANULUI DIN CARE SE PRELEVEAZ
Metode care pot ajuta prelevarea din
plante donor mature/btrne:
Tratamente termice
Stimularea drajonarii (juvenilizarea)
Regulatori de cretere
Regim special de iluminare
Culturi de plant mam n regim de
termoterapie
Riscul prelevrii din plante
btrne: infecii i viroze mult mai
agresive
Arachis Hypogea
GENERALITI
MOMENTUL DE RECOLTARE
Crucial i LIMITAT, chiar i la o unic fenofaz.
Recoltarea se poate face:
n cursul germinaiei seminelor
Un anumit moment din formarea celulelor generative la nivelul
inflorescenei
Punctual, la un moment dat n timpul creterii frunzelor, fructelor sau
seminelor
n perioada de laten a mugurilor
Plantele lemnoase din climat temperat pun probleme mari ref. la perioada
de recoltare a materialului vegetal pentru inoculare, reuita depinznd de
sezon, momentul recoltrii i condiiile pedoclimatice.
RECOMANDARE
Recolatarea explantelor se face conform recomandrilor manualelor de
specialitate cu respectarea condiiilor menionate pentru specia, genul,
familia sau cultivarul respectiv, n funcie de sezon.
GENERALITI
MRIMEA EXPLANTELOR
Cunotinte de anatomie vegetal i
cunoaterea amplasrii esuturilor care se vor
preleva.
INDUSTRIAL:
se prefer apexuri, meristeme apicale.
Dimensiunea explantului se cere a fi minim, la limit, dar s se
asigure totipotena celular; standardizat pentru fiecare specie, soi, n
funcie de natura explantului, fenofaza plantei donor sau a organului
din care se preleveaz.
Explant marepericolul de infecie crete; deshidratarea accentuat.

Regenerare mai rapid n mediu de cultur.


Suprafaa de contact a explantului cu mediul de cultur trebuie s fie
suficient de mare pentru a se asigura schimburile gazoase i absorbia
hranei i a apei.
DAR
GENERALITI
STERILIZAREA MATERIALULUI VEGETAL
Succesul asepsizrii depinde de:
selectarea corect a metodei de asepsizare;
substanele alese pentru sterilizare;
concentraia acestora;
durata de timp alocat asepsizrii.
FACTORII care influeneaz
tipul de asepsizare:
1. specia;
2. condiiile ecologice;
3. organul;
4. esutul;
5. poziia n plant;
6. vrsta;
7. fenofaza plantei.
DE RETINUT
1. aciune suficient de puternic;
2. toxicitatea nu trebuie s distrug
esuturi/necroze;
3. trebuie s poat fi ndeprat cu
uurin;
4. sterilizarea este doar de
suprafa pot s apar infecii la
a 2-3 repasare (bacterii, virusuri,
micoplasme sau fungi aflate n
esuturile din organe)
GENERALITI
STERILIZAREA MATERIALULUI VEGETAL
Se face cu scopul de a elibera plantele de agentiipatogeni .
Se folosesc agenti chimici, in diferite concentratii in functie de natura
explantului, de tipul lui.
Caracteristici importante pentru un dezintectant:
sa distruga agentii patogeni;
sa nu afecteze tesuturile;
sa se curete usor de pe materialul vegetal.
Tipuri de agenti de sterilizare: alcool, hipoclorit sodiu, hipoclorit
de calciu, apa oxigenata, apa bromata, azotat de argint, clorura
mercurica, antibiotice.
FAZELE PROPAGRII
IN VITRO
2. INIIEREA I STABILIZAREA CULTURII
INOCULAREA
Def. = introducerea explantului sterilizat, aseptic, n medii de cultur sterile.
De reinut:
Pornirea hotei se face cu 20 de minute nainte de demararea activitii, cu
sterilizarea prealabil a suprafeei de lucru;
Echipament steril (halat, manui, mti);
Dezinfecia permanent a minilor i
braelor;
Activitatea n camera steril ncepe la
15-30 minute de la oprirea UV;
Pe perioada activitii, se evit
micrile inutile, formarea curenilor
de aer iar conversaia se limiteaz la
maxim;
INIIEREA I
STABILIZAREA CULTURII
Se face la hot, conform
procedurilor stabilite;
ndeprtarea agentului
sterilizant se face tot la hot, cu
ap steril, conform
procedurilor agreate iniial;
Se recomand evitarea
pstrrii explantului n stare
submers, prevenind astfel
necroza (anaerobioza)
Explantul sterilizat se
pstreaz n capsule Petri
sterile sau pe hrtie de filtru
steril umectat cu ap
steril;
STERILIZAREA MATERIALULUI BIOLOGIC
INIIEREA I
STABILIZAREA CULTURII
! ! n momentul inoculrii, minile vor trebui s tin simultan recipientul
cu mediu, dopul (capacul sau buoanele speciale), penseta (bisturiul sau ansa)!!
Etaneizarea recipientului se face cu folie polietilen sau aluminiu;
Periodic, masa de lucru se elibereaz, pentru a nu ncrca spaiul steril;
Fluxul operaiunilor trebuie s se desfoare constant, ritmic, ordonat;
INOCULAREA
REINEM
!!Instrumentarul, recipientul sau
dopul cazute pe suprafaa de lucru
se ndeprteaz imediat, fr a mai
fi refolosite.
INIIEREA I
STABILIZAREA CULTURII
Manipularea explantului se face cu grij, cu instrumentar sterilizat i RCIT
n prealabil;
Se va respecta polaritatea: polul caulinar se plaseaz n afara mediului;
Se plaseaz orizontal sau uor oblic (la inoculi meristematici apicali sau
axilari , se va cuta a se pune n contact mediul cu suprafaa secionat);
Explantul se introduce uor n mediul de cultur, ct s prezinte stabilitate i
s nu se rstoarne;
Recipientele se etaneizeaz, se eticheteaz i se trimit n camera de cretere.
INOCULAREA
REINEM
!! Explantul scapat din penset pe
suprafaa de lucru sau care, n
timpul manipulrii, atinge alte
suprafee n afara hrtiei de filtru
steril pe care se lucreaz, se
ndeprteaz imediat, fr a mai fi
refolosit.
INIIEREA I
STABILIZAREA CULTURII
perioada de incubare i cretere a culturilor variaz n funcie de tipul
culturii, specia i natura explantului folosit, condiiile din camera de cretere i
protocolul folosit;
!! INFECIILE!! CATEGORII DE INFECII DIN MEDIILE DE CULTUR:
1. origine micotic: fructificaii de diferite culori (negru Aspergillus sp., verde-
albastru Penicillium)
2. origine bacterian: n mediu i la suprafaa lui, n zona de contact cu planta,
halou translucid, de culoare alb galbuie;
3. brunificarea mediului: provocat de oxidarea fenolilor emii de plant;
4. vitrificarea/sticlozitatea;
5. deshidratarea mediului: umiditate defectuoas.
STABILIZAREA CULTURII
Culturile se stabilizeaz, de regul, n primele 14
zile de la inoculare;
infeciile latente virusurile.
INIIEREA I
STABILIZAREA CULTURII
Eliminarea recipientelor infectate din camera de cretere se face imediat
cum acestea apar;
Se urmresc condiiile de mediu din camera de cretere conform cu
protocolul de lucru stabilit iniial;
Se fac notri zilnice asupra evenimentelor care suvin asupra culturii, pentru
evidenierea succesului sau eecului iniierii i validitii protocolului de lucru;
STABILIZAREA CULTURII
PARTICULARITI
o Explantele generate
de plante ierboase au
primele manifestri
vegetative la 14 zile
maxim de la inoculare;
o Explantele provenind
de la plantele lemnoase
manifest vegetativ la
40-60 de zile.
Allium cepa - esalota
3. MULTIPLICAREA.
SUBCULTIVAREA SAU REPICAREA
FAZELE PROPAGRII
IN VITRO
Meristemele apicale i apexurile caulinare tulpinie cu
rdcinue vitroplantule (similar nmulire vegetativ butai);
Nod, internod i alte segmente de organe mugurai tulpinie;
Multiplicarea: transferul sau pasarea inoculilor pe medii proaspete
sau alte medii, cu compozitie diferita (hormoni), prin realizarea de
subculturi; operaiune indispensabil n toate ramurile biotehnologiei.
MULTIPLICAREA.
SUBCULTIVAREA SAU REPICAREA
Subculturile se realizeaz prin:
Desprirea culturii generale
Transformarea tulpinielor n noi inoculi prin microsecionare
Separarea glomerulelor (orhidee)
Multiplicare clonal: se detaeaz material biologic din cultura iniial i
se multiplic de cte ori este nevoie, pe medii cu aport de citochinine.
Culturile de calus: se repic periodic, fragmentate, pe medii proaspete cu adaus
de auxine.
Culturile de rdcini: multiplicarea se opereaz periodic, obligatoriu, prin tieri n
masa radicular i transferarea apexurilor pe medii lichide; n caz contrar, cultura
moare.
MULTIPLICAREA.
SUBCULTIVAREA SAU REPICAREA
Senescenta culturii. Cauze posibile:
Carene provenite din hrnirea neadecvat a celulelor din mediul de
cultur
Epuizarea proprietilor mediilor de cultur
Toxicizarea mediului de cultur.
MOMENTUL multiplicrii: se alege n funcie de scopul culturii, de natura i
tipul culturii i de particularitile de reacie ale explantelor.
Semne ale unei culturi care necesit multiplicare:
calusul devine brun, cenuiu sau se usuc,
frunzuliele bazale se nglbenesc,
crete gradul de vscozitate al suspensiilor celulare.
MULTIPLICAREA
SUBCULTIVAREA SAU REPICAREA
Tehnologie:
se realizeaz n condiii aseptice
!! Atenie deosebit acordat sterilizrii instrumentarului, recipientelor
i condiiilor igienice din camera de inoculare;
etichetare cu pstrarea datelor importante pentru identificarea
culturilor.
FAZELE PROPAGRII
IN VITRO
4. NRDCINAREA
Reprezint etapa de pregtire a materialului vegetal pentru trecerea
in vivo, n spaii protejate nti i apoi n cmp prin stimularea
aparitiei sistemului radicular.
Mediul de nrdcinare folosit: auxine n concentraii mari i
gibereline cu adaos de crbune vegetal.
Se produc: limitarea lstririi axilare, stimularea alungirii lstarilor,
inducerea rizogenezei i formarea rdcinilor.
PROBELEME: mediul cu auxine poate produce inhibiia plantelor; se
tempereaz printr-un tratament inductiv cu auxine cencentrate i apoi
introducerea n mediul de nrdcinare.
ATENIONARE: plantele nrdcinate in vitro au
rdcini glabre, fr periori absorbani i foarte
sensibile.
FAZELE PROPAGRII
IN VITRO
.
5. ACLIMATIZAREA
Cea mai dificil etap n producerea materialului prin micropropagare.
PROCEDUR:
1. Lstarii nrdcinai se plaseaz n substraturi.
2. Se depoziteaz n spaii cu umiditate ridicat i temperatur controlat.
3. Fortificare i cretere n cmp, pentru cteva luni.
4. Livrare materialului sditor.
Dureaz aproximativ 2 sptmni;
La plasarea n substrat, plantele se
spal de agar- surs de infecii;
Ghivecele i substratul se
sterilizeaz;
Plantele pot intra n repaus
tratament cu gibereline 200ppm.
DISCUII
MICRONMULIREA
PLANTELOR HORTICOLE
@2013
Lect. univ, prof. dr. Adrian Peticil
ORGANOGENEZA
Def.:
Capacitatea esuturilor vegetale de a forma organe de novo, bazat pe nuirea
celulelor somatice specializate de a dediferenia i a se rentoarce la stadiul de celule
meristematice, capabile de diviziune activ cu generare de primordii de organe,
lstari, frunze, flori sau pri floarale.
ORGANOGENEZA
MERISTEMOIZII
Def.:
Celule cu caracteristici meristematice, rezultate n urma diviziunii celulare
repetate, cu plasticitate morfogenetic mare (diferite medii de cultur i diferii
factori climatici genereaz diferite primordii de organe)
MICROPROPAGAREA se bazeaz pe regenerarea de
LSTARI ( CALUGOGENEZ) i
RDCINI (RIZOGENEZ)
ORGANOGENEZA DIRECT/ADVENTIV
Primordiile se dezvolt direct din meristemoizii derivai direct din explantul iniial.
ORGANOGENEZA INDIRECT
Celulele explantului iniial se divid i genereaz esut calusal, n care apar
meristemoizii, din care, ulterior dau rdcini adventive.
ORGANOGENEZA
Explant iniial meristemoid primordii de organe
(organogenez direct)
Explant iniial calus meristemoid primordii de organe (organogenez
indirect)
Cea mai rspndit cultur in vitro, aplicabil la toate speciile, soiurile i cultivarurile,
cu excepia plantelor reticente la acest procedeu.
APEX: vrf de cretere al unui lstar; ntlnit la plantele ierboase ct i la lemnoase.
CULTURILE DE
APEXURI
Asociat cu termoterapia, se utilizeaz pentru devirozarea portaltoilor i
soiurilor:
t: 37-39 grade;
Apexurile au rata de cretere mai rapid dect viteza de propagare a
celuleor virusurilor.
Reacia speciilor la acest tip de cultur este diferita.
Ex: Standardi i Catalano (1985): Actinidia chinensis culturile de apexuri sunt
greu de dezinfectat i recomand culturi de meristeme.
Exemplu: 1952, Morel si Martin: cultivarea varfurilor de crestere la Orhidee
pe medii de cultura artificiale au o rata de multiplicare de 1: 1.000.000 pe an,
uniforme genetic si libere de virusuri.
CULTURILE DE
APEXURI
Apexurile au crestere nedeterminat in vitro cu modificarea balanei
hormonale neogeneza de lstari (capacitatea de proliferare este nelimitat)
Sunt specifice i se recomand speciilor/soiurilor/cultivarurilor care au
dominana apical pronunat (au internodii lungi)
CULTURILE DE
MINIBUTASI
MICROBUTAIREA: procedeu sau tehnic prin care cultivarea
minibutailor se face orizontal n mediul de cultur
Procedura: defolierea pentru stimularea pornirii in
vegetatie a mugurilor axilari
MERISTEMELE
Def.: esuturi tinere, cu activitate celular intens n plant, formate din celule
nespecializate funcional, cu diviziune continu i care asigur creterea n lungime i
grosime, fiind dispuse de obicei terminal, att n partea hipogee ct i n partea epigee.
CULTURILE DE
MERISTEME
Tipuri de meristeme
(dup tipul structurilor pe care le genereaz)
1. PRIMARE (caracter embrionar):
Terminale - vrful rdcinilor i tulpinilor, n muguri de mare
importan la pomii fructiferi;
Laterale cambiu
Intercalare - la baza internodiilor de la monocotiledonate;
Foliare n frunzele aflate n curs de dezvoltare (rol major n
organogenez)
Adventive n rdcini i parte aerian.
2. SECUNDARE (influeneaz creterea n grosime)
Cambiu i felogen;
3. SPECIALE (localizate la nivelul explantelor cultivate in vitro):
Promeristemul faza timpurie de formare a meristemului cu
importan n embriogeneza somatic;
Meristemoidul aglomerare meristematic nestructurat care poate da
natere la diferite organe;
Embrioidul grup de celule meristematice care genereaz embrioni
somatici.
CULTURILE DE
MERISTEME
Tipuri de meristeme
(dup zona n care se gsesc meristemele)
1. RADICULARE
Structura mai simpl
Funcii limitate
Categorii: apicale, laterale, adventive.
2. CAULINARE
Mult mai complexe funcional i morfologic;
CULTURILE DE
MERISTEME
Epoca optim de prelevare a meristemelor: a se evita perioadele de dorman
sau laten a speciilor vizate.
Tehnologia de prelevare i cultivare:
se preleveaz din material vegetal sterilizat;
sub lupa binocular;
pH-ul mediului se recomand a fi la 5.5 5.8;
concentraia n macroelemente s fie redus la jumtate;
la unele specii se recomand inerea meristemelor timp de 3-7 zile la ntuneric,
pentru limitarea oxidarii;
temperatura variaz n funcie de specie: 22, 25 sau i mai mult (via de vie);
Intensitatea luminoas: variaz de la 2.400- 10.000 lucsi (conifere).
Avantajele culturii de meristeme:
1.nmulirea clonal a materialului biologic valoros
2. Eliminarea bolilor i dauntorilor
3. Material nou, juvenilizat, cu capacitate mare de multiplicare
4. Bncile de gene.
Tip de cultur in vitro larg utilizat care genereaz material sditor liber de
viroze i micoplasmoze.
CULTURILE DE
MERISTEME
Dimensiune meristem: 0.1 0.3 mm
anse mari de devirozare;
slaba rat de supravieuire n faza de stabilizare.
Teorii privind aciunea antiviral: competiie ntre celulele gazd i parazit sau
faptul c celulele agresate sunt capabile s elimine virusurile.
Condiii preliminare pentru o cultur
de meristeme reuit:
1. muguri prelevai de pe ramuri
(pomi) sau alte organe care i-au
satisfcut nevoia de frig.
2. adugarea de gibereline n mediul
de cultur pentru stimularea creterii i
elongatiei meristemelor.
CALUS
Def.: mas neorganizat de celule, mai mult sau mai puin difereniate, cu
capacitate variabil de proliferare, aprut n urma unei rniri mecanice
suferit de plant, ca form de aprare i regenerare celular.
CULTURILE DE CALUS
Generaliti pentru iniierea culturii:
Faz intermediar a organogenezei indirecte;
pH optim: 5.6 6.0 (7 la culturile de Actinidia sp. ) nainte de
autoclavare
Balana corect ntre concentraiile de auxine i citochinine
Se recomand utilizarea auxinelor i citochininelor numai n mediu
(2.4 D sau ANA).
Sursele de carbon (zaharoz, glucoz, maltoz, galactoz) pot induce
modificri la nivelul diferenierii, precumi n creterea i morfologia
calusurilor
A fost prima sursa a culturilor in vitro pentru muli ani
CULTURILE DE CALUS
Trei etape n cultura de calus:
1. Inducerea formrii calusului/inducie
2. Proliferarea calusului/diviziune
3. Regenerarea organic/difereniere
1. Inducerea formrii calusului
Reacia explantului la cultura de calus este
variabil n funcie de tipul morfologic al
explantului, putnd varia capacitatea
proliferativ, textura, culoarea sau morfologia
celulelor componente.
Stimularea formrii calusului se face prin
hormonii specifici, auxine, citochinine sau
auxine si citochinine (variaz n funcie de
specie)
Tipul de material vegetal folosit: orice tip de organe rdcini, tulpini, frunze,
flori, esuturi.
Pentru juvenilizare se folosesc cotiledoane, puiet sau embrioni imaturi.
CULTURILE DE CALUS
1. Inducerea formarii calusului,
continuare
esuturile meristematice nu au nevoie de procese de difereniere, fiind
capabile de diviziune rapid i formarea de calus.
n faza de inducere de calus, esuturile parenchimatice - care sunt masa
calusului - intr intr-un proces de dedifereniere celular.
!! Centrii alcatuii din celule cu
activitate mitotica pot fi numiti
MERISTEMOIZI;
Celulele lor evolueaza in diferite
organe: lstari, rdcini sau
embrioni somatici.
CULTURILE DE CALUS
2. nmulirea calusului
Procesul de nmulire al calusului este direct gestionat de balana hormonilor;
Precesul n urma cruia calusul se divide nu este pe deplin cunoscut,
presupunndu-se c se formeaz n urma interaciunii hormonilor eliberai de
celulele rnite.;
Celulele din alctuirea calusului devin meristematice, se divid activ, rapid i
scad n volum.
CULTURILE DE CALUS
3. Diferenierea/regenerarea de organe
adventive din calus
!! De reinut:
1. Generarea de organe are la baza principiul totipotenei celulare (cteva
grame de calus pot genera mii de neoplantule);
2. Culturile de calus au instabilitate genetic i fiziologica mare, ceea ce
limiteaz cultivarea n scopul conservrii germoplasmei sau pentru
multiplicare clonal (variabilitatea somaclonal, intens studiat n acest
moment n ameliorare)
Aceasta faz este controversat; rata creterii calusului scade; se ajunge
la un echilibru ntre creterea n volum i diviziune.
MICROALTOIREA
1. Aprut recent, urmare a descoperirii incompatibilitii dintre portaltoi
i altoi la multe specii.
2. Genereaz plante mam libere de virusuri i alte boli care ulterior pot
fi utilizate ca surs de ramuri altoi pentru altoirea tradiional.
Primul pom liber de virusuri obtinut prin microaltoire a fost obinut n 1970,
prin microaltoirea la Citrus (Murashige i colab.)
Folosit pentru:
1. multiplicarea unor specii care rspund dificil la cultura de
meristeme (cire, cais);
2. aproape exclusiv pentru producerea de pomi liberi de virusuri la
speciile: piersic, mr, cais, cire, prun.
MICROALTOIREA
MICROALTOIREA
TEHNOLOGIE
Presupune altoire in vitro, n condiii ASEPTICE a unui apex meristematic pe
un portaltoi obinut din semine sau din minibutai cultivai tot in vitro.
1. OBINEREA PORTALTOIULUI
se poate obine din semine, din minibutai sau meristeme apicale i
laterale, toate in vitro.
ieirea din dormans (stratificare, tratamente cu citochinine,
gibereline, frig)
nlturarea endocarpului cu meninerea tegumentelor seminale
verificarea viabilitii seminelor
sterilizarea seminelor n etanol 70% 1 min, hipoclorit de sodiu 0.7%
clor activ i Tween 20 cu 0.3%, 20 minute
cltiri ap distilat steril
inoculare pe mediu MS ( - ) pentru germinare; 20C i intuneric
MICROALTOIREA
2. PREGTIREA ALTOIULUI
Se poate extrage dintr-un apex meristematic de la lstari crescui n
vitro, sau de la ramuri sau lstari obinui in vivo
Sterilizare - dac provine de la plante cultivate in vivo
3. ALTOIREA PROPRIU ZIS
Se nltur cotiledoanele de la
portaltoii obinui in vitro
Se secioneaz transversal portaltoiul
Apexul meristematic al altoiului se
detaeaz i se plaseaz pe zona inciziei
Se trece ntr-o eprubeta steril, pe
mediu de cultur steril LICHID
Atmosfera este saturat n umiditate
(asigur limitarea atacului bolilor i favorizeaz
calusarea)
4. ACLIMATIZAREA
Cnd mini altoiul atinge 1.5 -2 cm lungime
Se trece gradual in vivo, printr-o umiditate relativ a aerului ridicat.
MICROALTOIREA
AVANTAJE:
1. plante altoite n timp relativ scurt;
2. condiii de cretere (mediul de cultur i
camerele de cretere) controlate eficient;
3. util n devirozarea materialului genetic virozat
pentru cazurile n care specia nu suport
termoterapia din cauza riscului de apariie a
mutaiilor genetice sau la speciile care se
nmulesc greu in vitro;
4. aplicabil speciilor care se nmulesc uor in
vitro, dar care nu nrdcineaz
5. avantaj pentru cercetarea tiinific privind
compatibilitaile ntre altoi i portaltoi.
DEZAVANTAJ
Tehnic pretenioas i preioas, necesit
personal nalt calificat.
CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM
UTILITATE
Latenta semintelor la unele specii
Imposibilitatea germinarii semintelor unelor specii, chiar in conditii
favorizante de lumina, temperatura si umiditate.
EMBRIOGENEZA SOMATICA
procesul de formare a embrionului fie dintr-un zigot, fie dintr-o celula somatica -
vegetativa sau generativa
care se bazeaza pe capacitatea regenerativa a fiecarei celule vegetale,
urmare a principiului totipotentei celulare
si a faptului ca nu numai embrionul zigotic genereaza embrion, ci fiecare celula
vegetala, chiar haploida fiind.
este proprietatea generala a celulelor cormofite
Lansata incepand cu 1958, de Steward si Reinert prin studii pe Daucus carota si
suspensii de celule, completat in 1979 de Thomas si colab., pe studii la Umbelifere.
Au fost puse in evidenta peste 135 de specii cu capacitate embriogenara, din 81 de
genuri si 32 de familii.
CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM
Embriogeneza somatica se
intalneste la nivelul:
Calusului
In culturile de celule derivate
din calus sau din culturile de
protoplasti
La nivelul epidermei,
La explante din fragmente de
tulpini, segmente uninodale
Fragmente de pistil,
hipocotile sau cotiledoane.
Fig. 1. Mature zygotic embryo of Norway
spruce (Picea abies) (explant) Fig. 2 a,b.
Initiation of embryogenic callus on mature
zygotic embryo of Norway spruce (Picea
abies). Fig. 3 a,b. Proembryo of Norway
spruce (Picea abies). Fig. 4. Embryogenic
callus multiplication: (a) silver fir (Abies
alba), (b) Norway spruce (Picea abies) on
solid medium, c) Norway spruce (Picea
abies) on filter paper placed on solid
medium Fig. 5. Cotyledonary somatic
embryos of (a) European larch (Larix
decidua), and (b) Norway spruce (Picea
abies).
CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM
EMBRIOGENEZA SOMATICA DIRECTA
Embrionii iau nastere din celulele aprtinand tesuturilor plantelor care au servit la
initierea culturii
Embrioni somatici se gasesc in celule nucelare (Citrus sp.), celule
epidermice, hipocotil (Daucus carota) sau in celulele somatice.
MOMENT OPTIM
pentru recoltarea izolarea si inocularea embrionilor:
14 zile dupa polnizare.
MEDIUL DE CULTURA: regulatorii de crestere au o importanta vitala in
culturile de embrioni somatici.
CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM
DE RETINUT:
Lipsa AUXINELOR impiedica formarea embrionilor somatici;
In faza de maturare, prezenta auxinelor in mediul de cultura perturba maturarea
acestora, recomandandu-se rducerea sau eliminarea completa a auxinelor din
mediu.
Pentru unele specii, este importanta prezenta in mediu a unui raport
auxine/citochinine (2,4-D).
Natura si concentratia glucidelor: marirea concentratiei de zaharoza poate
preveni GERMINATIA PRECOCE a embrionilor somatici.
Temperatura, lumina si compozitia aerului din vasele de cultura influenteaza
embriogeneza somatica.
PROCEDURA
1. Sterilizarea materialului donor;
2. Excizarea embrionului imatur;
3. Inoculare pe mediu;
4. Diferentierea embrionilor somatici in diferite stadii de dezvoltare (globulara,
cordiforma, torpila, cotiledonara) si suprapunerea diferitelor stadii de
evolutie imposibilitatea automatizarii culturilor (costuri mari de
manopera)
CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM
EMBRIOGENEZA SOMATICA INDIRECTA
Inseamna regenerarea embrionilor somatici din calus.
DE RETINUT
Capacitatea de regenarare depinde de specie (unele specii regenereaza
numai organe, altele numai embrioni somatici si altele din ambele
categorii) si felul explantului;
Conteaza varsta explantului si a plantei donor;
Calitatea depinde de numarul de multiplicari;
PROCEDURA
1. Initierea culturii de calus;
2. Multiplicarea calusului si identificarea calusului EMBRIOGEN
(ridica probleme la nivel global, deoarece nu sunt inca date certe
despre criteriile de identificare si proceduri);
3. Inductia pe un mediu nou de cultura;
4. Formarea embrionilor somatici.
CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM
CONDITIONARI ALE EMBRIOGENEZEI SOMATICE
1. Auxine in concentratie mare inseamna inductia embrionilor somatici;
2. Acidul abscisic stimuleaza formarea embrionilor in culturile de calus
si celule in suspensie;
3. Giberelinele si etilena inhiba procesele de inductie;
4. Tesuturile juvenile favorizeaza sansele formarii embrionilor somatici;
5. Temperatura ridicata stimuleaza formarea embrionilor somatici;
6. Laptele de cocos, foarte bogat in citochinine, are un rol important in
inductia procesului de embriogeneza somatica.
LIMITARI ALE EMBRIOGENEZEI
Materialul genetic este relativ instabil in procesele embriogenezei
Risc aparitie mutatii;
Nerecomandat pentru multiplicarea clonala;
Nu se poate aplica tuturor speciilor urmare a faptului ca nu toate speciile
formeaza embrioni somatici;
Culturile repetate duc la deprecierea calusului;
Aparitia fenomenului de dormans.
CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM
IMPORTANTA EMBRIOGENEZEI SOMATICE
Embrionul, ca material inmultitor, este structurat morfofunctional
(radacinita, tulpinita, muguras);
Viteza uluitoare de propagare, ceea ce permite la o singura
inoculare producerea unui numar foarte mare de plante;
Plantele derivate din embriogeneza somatica sunt identice genetic
cu donorul;
Cresterea plantelor este uniforma;
Plantele sunt robuste;
Embrionii pot fi stocati pentru o lunga perioada de timp in banci de
gene;
Prezinta material important de studiu pentru mutageneza
CULTURA EMBRIONILOR
ZIGOTICI
Presupune separarea embrionilor zigorici de tesutul ovular, cultivarea
acestora in condiii aseptice, pe medii decultura speciale care
potenteaza dezvoltarea ovulului, in conditii speciale care asigura
cresterea si diferentierea embrionara normala.
PROBLEMA: avortarea embrionilor intalnita in
ameliorarea plantelor.
CAUZA: dereglari fiziologice in procesul de
crestere al semintei si fructului.
REZOLVAREA: embriocultura/cultura de
embrioni zigorici.
Rapid and high efficiency regeneration system (organogenesis and somatic
embryogenesis) from isolated shoot apices in vitro. (A) One day old isolated shoot
apices with primordial leaves LP =leaf primordia; SM =shoot meristem. (B) One- week
old explant showing bulged meristem portion and expanded primordial leaves. (C)
Three- week old meristematic mass showing multiple buds and leaf initials. (D)
Individual buds (shown in Fig.1C) producing 2-8 translucent tissue strata. (E) Each of
the tissue stratum giving rise to many somatic embryos. (F) Meristematic clumps
showing differentiating buds. (G) Germinating somatic embryos showing shoot apex
(SA) surrounded by a pair of primary leaves (PL). (H) Differentiation of somatic embryos
into platelets. (I) Plantlets with well formed roots in magenta box. (J ) Acclimatization of
plantlets in the growth chamber. (K) Regenerated plants in greenhouse
CULTURA EMBRIONILOR
ZIGOTICI
POMICULTURA: cultivarea unor embrioni imaturi proveniti de la
incrucisarile soiurilor extratimpurii si timpurii de samburoase.
VITICULTURA: imposibilitatea obtinerii unor descendenti hibrizi cand
genitorul matern este un soi apirenembrionul avorteaza.
Ce OFERA EMBRIOCULTURA?:
extragerea embrioniului abia format cu o
portiune de tesut nuclear sau cultivarea
ovulului fecundat, depasindu-se astfel
barierele incompatibilitatii.
Figs. 1522. Anthurium embryos at 1624 wk postpollination. Sections stained with
PAS (carbohydrates stain pink) and aniline blue-black (proteins stain blue). 15. Overview
of an intact embryo 16 wk postpollination 2 mm in length. 16. Shoot apex and leaf
primordium in embryo 20 wk postpollination surrounded by the single cotyledon. 17.
Procambium from cotyledon connecting to shoot apex region of embryo 20 wk
postpollination. 18. Root apex of embryo 20 wk postpollination. 19. Base of embryo with
suspensor 20 wk postpollination. 20. Starch and protein storage products of the cotyledon
and endosperm 20 wk postpollination. 21. Calcium oxalate crystal deposits (raphides) in
the cotyledon of an embryo 20 wk postpollination. 22. Tracheary protoxylem in cotyledon
24 wk postpollination. In Figs. 16, 17, 18, and 20, bar =125 m; in Fig. 18, bar =100 m;
and in Figs. 19, 21, and 22, bar =25 m. Figure Abbreviations: c, cotyledon; em, embryo;
en, endosperm; ep, protoderm, lp, leaf primordium; pc, procambium; r, raphides; ra, root
apex, s, suspensor; sa, shoot apex; x, xylem
CULTURA EMBRIONILOR
ZIGOTICI
Initierea culturii:
a) variaza de la specie la specie:
cires 28/35 de zile de la inflorire, sau dupa intarirea samburelui
visin 29/41 de zile
piersic 81/97 de zile.
b) depinde si este determinat de marimea cotiledoanelor
MEDIUL DE CULTURA: are formula cu atat mai complexa cu cat
stadiul de dezvoltare al embrionului in momentul prelevarii este mai
incipient si se recomanda chiar si extracte naturale de endosperm
concentratii mai mari de zaharoza pentru presiunea osmotica este
ridicata.
STERILIZAREA: se poate realiza la
concentratii mari, deoarece endocarpul si
tegumentul permit aceasta.
CONDITIILE culturii: mult mai stricte, cu
pH, lumina si temperatura mult mai
riguros controlate
SAMANTA SINTETICA
Creata in folosul embriogenezei somatice, prin generarea unui endosperm
artificial care sa protejeze si sa hraneasca embrionul.
Embrionii somatici isi pierd repede valabilitatea se folosesc:
1. Gelurile de incapsulare cu substante chimice nutritive, regulatori osmotici si
pesticide;
2. Semanarea embrionilor in flux lichid cu ajutorul tehnologiilor puse la punct
pentru culturile in vivo.
AVANTAJE:
1. Permite folosirea si producerea de seminte la speciile care nu produc de obicei
seminte;
2. Inlocuiesc semintele hibride;
3. Folosirea unor genotipuri speciale;
4. Importanta maxima in ameliorare;
DEZAVANTAJE:
1. Se deshidrateaza repede si necesita sisteme de invelisuri care sa le pastreze
umiditatea relativa;
2. Embrionul este mentinut in stare de repaus cu ajutorul unor substante chimice;
3. Semanatul presupune scoaterea embrionului din repaus;
4. Procent variabil spre mic de plante viabile obtinute;
5. Pesticizarea semintei trebuie limitata, deoarece la dezvoltarea embrionului,
acestea impiedica micorizarea.
SAMANTA SINTETICA
PROCEDURA DE REALIZARE:
Incapsularea embrionilor in alginat de sodiu 2-4%.
Scufundarea embrionilor in alginat de sodiu 2-4%
Imbaierea individuala in clorura de calciu 50 M, cu pH 7.
La max 30 de minute distanta, capsulele se intaresc si pot fi manipulate
Se pastreaza in conditii de refrigerare, la 3-6 C, in conditii aseptice.
Dezavantajele tehnicii:
Alginatul de calciu are permeabilitate mare pentru elemente solubile;
Radacinile lastarilor cresc mai lent;
Capsulele sunt lipicioase si de manipuleaza greu la semanare.
Incapsularea organelor, extensie a semintei sintetice
Se pot incapsula bulbi proveniti din culturi in vitro, minibutasi si rozete
de frunze de la diverse specii: kiwi, zmeur, mar, crin etc.
AVANTAJELE metodei:
Materialul vegetal se poate pastra cu cheltuieli mult reduse;
Economie de spatiu;
Economie de forta de munca.
CULTURA DE ANTERE, POLEN, OVARE,
OVULE SI ESUT NUCELAR
CULTURA DE ANTERE I POLEN
Aprut odat cu stabilizarea tehnologiei de micropropagare.
Tehnologie:
recoltarea i desprinderea anterelor cnd florile se afl n faza de boboc;
sterilizare
inoculare pe mediu lichid sau solid.
Cultura de polen: se recomand transferarea periodic a anterelor pe mediu proaspt
pentru a coloniza ct mai multe vase de cultur.
CULTURA DE OVARE, OVULE I ESUT NUCELAR
Folosit n cazul incompatibilitilor dintre soiuri sau specii, n condiiile n care mare parte
din incompatibiliti provin din disfuncii ale polenului sau organelor sexuale.
Inocularea OVARELOR se face nainte sau dup polenizare n funcie de compatibilitatea
existent.
Se poate efectua i fecundare in vitro.
Cultura de esut nucelar induce poliembrionia sau tetraploidizarea.
Cultura de ovar i ovuli nu este aplicabil direct n micronmulire.
CULTURA DE PROTOPLATI
CULTURA DE PROTOPLATI
Tehnic de micropropagare relativ recent, cu aplicabilitate n pomicultur, care permite,
teoretic, producerea de hibrizi ntre specii i soiuri de orice fel.
Procedura: unirea n condiii specifice a dou celule crora li se dezagreg enzimatic (sau
mecanic) structura peretelui celular, obinndu-se astfel hibrizi somatici.
Se bazeaz pe ingineria genetic, iar interveniile la nivelul celulei fac posibile transferul
de gene, selecia de plante rezistente la agenii patogeni i boli.
Tehnica:
Explantele se
trateaz enzimatic
pentru a li se
distruge peretele
celular, proces care
se petrece pe baza
presiunii osmotice;
CULTURA DE PROTOPLATI
DINTRE AVANTAJE:
obinerea de hibrizi ntre speciile incompatibile natural;
hibrizi ntre speciile care nu nfloresc sau care nu au timp s i matureze organele.
DEZAVANTAJE:
Lipsa tehnologiilor de selecie a plantelor;
Descendeni instabili genetic, sterili sau chiar cu mutaii fizice;
Calusul himeric;
Nu se asigur transmiterea caracterelor utile;
Numr de specii care rspund la aceast metod limitat.
Regenerarea membranei celulare/cultura de protoplati