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TEMPO
- Indispensvel ao mdico;
- Prever a evoluo da infeco;
Exame microscpico de espcimes obtidos do paciente; Cultura e identificao de mios a partir de espcimes obtidos do paciente; Determinao de uma resposta imune patgeno-especfica no paciente; Deteco de macromolculas patgeno-especficas em amostras do paciente; -Magnetude laboratrio. e confiabilidade da informao de cada
+
TESTE -
Positivo verdadeiro
Falso negativo
- Na prtica: no existem testes diagnsticos 100% de sensibilidade e especifidade; - Combinao de testes: quando disponveis;
MTODOS CONVENCIONAIS
MICROSCOPIA TICA Utiliza luz visvel para visualizao de microrganismos; baixa resoluo; visualizao de microrganismos requer o uso de tcnicas de colorao
Tcnicas de colorao: Simples: positiva ou negativa Diferencial Gram Ziehl-Neelsen azul de metileno - Giemsa impregnao pela prata imunoperoxidase endosporo
- Diplococos Gram no interior de leuccitos no pus uretral = gonococo; o mesmo em LCR= meningococo.
- Menos til: locais no estreis microbiota normal; - Escarro contaminado (orofaringe) - Ziehl-Neelsen
MICROSCOPIA
FLUORESCNCIA CAMPO ESCURO
CONTRASTE DE FASE CONFOCAL
ELETRNICA
MTODOS TRADICIONAIS DE IDENTIFICAO DE MICRORGANISMOS ORAIS - CULTURA MICROBIANA Disperso Diluio Identificao fenotpica morfologia das clulas e colnias estruturas celulares tolerncia atmosfrica motilidade metabolismo bioqumico perfil proteico (SDS PAGE) Incubao
Sangue
Staphylococcus aureus
Api test
CULTURA Vantagens Identificao das espcies predominantes da microbiota (amplo espectro) Identificao de novas espcies (possveis patgenos) Determinao da proporo de diferentes espcies na microbiota Avaliao da susceptibilidade a antimicrobianos
CULTURA Desvantagens Alto custo Grande consumo de tempo Requerimento de pessoal treinado Inabilidade de identificar espcies no cultivveis ou de crescimento difcil Avaliao de nmero limitado de amostras Viabilidade da amostra (tempo da coleta at incubao proximidade com laboratrio)
corrente eltrica
Coomassie Staining
kDa
195 111 59
29 24 12 6.4
Western-Blotting
300 400
100
200
Western blotting
Protenas de interesse.
Testes enzimticos
BANA
anticorpo primrio
bactria
Ac2
Extrao do DNA
Eletroforese
Eletroforese
PCR
Amplamente utilizada; Excelente especificidade; Sensibilidade e limite de deteco; Microrganismos no viveis; rapidez; Nmero limitado de espcies identificadas; qualitativo Desvantagem: contaminao cruzada (microcontaminao); Preparo de sondas para hibirdizar o DNA-alvo.
ELETROFORESE
Gel de agarose Aplicao Fonte
Visualizao
DESNATURAO
SUSPENSO BACTERIANA
DNA EM SUSPENSO
Petit et al. 1993 - 14 cepas de Aa isoladas de 3 membros de uma famlia (digesto com BamHi e PstI)
Enzimas de restrio
RFLP tcnica
Southern-blotting
Ribotipagem Revelao
Ribotipagem
Interao com a sonda
RIBOTIPAGEM Tcnica de REA e southern blotting dos genes que codificam o RNA r (16S e 23S) e ptns ribossomais; Genes do RNAr so conservativos e universalmente presentes em todas as espcies - uma nica sonda de RNAr pode ser aplicada na tipagem de vrios microrganismos; nmero menor de bandas - melhor interpretao; escolha da endonuclease;
Pulsed Field Gel Eletrophoresis (Schwartz e Cantor 1984) Separao fragmentos de DNA de grandes dimenses: endonucleases com baixa frequncia de sitios de restrio e direo alternada do campo eltrico permite a separao desses fragmentos;
Nmero pequeno de fragmentos - fcil interpretao; Mtodo altamente discriminatrio e reproduzvel; DNA ntegro - cls. bacterianas so colocadas em plugs de agarose; lise enzimtica e desnaturao protica; digesto do DNA no gel; Grande tempo de execuo; Alto custo; Mtodo de escolha para tipagem de MRSA, enterococos, C. difficile M. avium e entricos (Tenover et al. 1994)
Ribotipagem comparativa:
Sequenciamento de DNA: mtodo padro para deteco de similaridades entre espcies baseado na sequncia de nucleotdeos do DNA cromossomal ou genes especficos amplificados - banco de dados GenBank (EUA) e EMBL (Cambridge, Inglaterra)
utilizado em combinao com o PCR - rapidez; dados estocados em bancos de dados genticos; a sequncia de DNA deve estar presente em todas as espcies e ter certo grau de variabilidade para comparao Ex.: micobactrias associadas doena disseminada em pacientes HIV/aidticos (Bttger et al. 1992)
Maxmam-Gilbert Sanger
- Fragmentos de DNA genmico, cDNAs ou oligonucleotdeos fixados a uma superfcie slida (carga positiva);
- Aplicao nos spots feita por robs: 10.000 pontos/cm2 - Pesquisa: genmica funcional
MICROARRAY
103
Adicionar 800l Acetato de Amnia 5M Depositar amostras nas canaletas do MiniSlot fixar DNA na membrana a 120 por 20 min
HIBRIDIZAO
MiniBlotter
Sondas de DNA genmicas marcadas com digoxigenina Prehibridizao a 42C 1 hr. Girar membrana 90 Hibridizao em buffer de formamida a 42C 16 hrs. Lavado de alta adstringncia em buffer SSC 0.4M a 68C 40min. Anticorpo contra digoxigenina conjugado fosfatase alcalina (1:15.000) Deteco por quimioluminescncia com CDPStar em filme RX
Canaletas de hibridizao
Membrana de nylon
Amostras de Placa
Sondas de DNA
CHECKERBOARD + CULTURA
CHECKERBOARD + PCR
AMOSTRA DE PLACA SUBGENGIVAL
HIBRIDIZAO COM SONDAS DE OLIGONUCLEOTDEOS ESPECFICAS PARA AS DIFERENTES SEQUNCIAS AMPLIFICADAS UTILIZANDO-SE O CHECKERBOARD
Streptococcus spp.
Granulicatella adacens
CULTURA
Detecta o maior espectro de diferentes espcies Determina susceptibilidade antimicrobiana Identifica espcies Limite de deteco 103 - 105 cls.
Determinam um nmero Relativo baixo custo e rpidos limitado de espcies Identifica espcies No determinam susceptibilidade No requerem a presena de antimicrobiana microrganismos viveis Reao cruzada entre espcies do 2 4 Limite de deteco de 10 - 10 cls. mesmo gnero Alta sensibilidade e especificidade Identifica espcies No requere a presena de microrganismos viveis Limite de deteco de 10 cls. Relativo alto custo Requer pessoal treinado e equipamentos adequados No determina susceptibilidade antimicrobiana Determinam um nmero limitado de espcies
PCR
CONCLUSES
- Vrias tcnicas diferentes; - Todos os mtodos so sujeitos a falta de preciso;