Medios de cultivos y tcnicas de Esterilizacin.

Universidad Central

Resumen
Para llevar a cabo un crecimiento de microorganismos por medio de un cultivo se ha de tener en cuenta diferentes condiciones de ambiente, ya que dicho medio es el que permite la multiplicacin de microorganismos como bacterias, hongo o parsitos, es por ello que un cultivo es empleado como un mtodo de estudio de las bacterias y otros microorganismos que causan enfermedades tanto en el ser humano como animal, claro est teniendo en cuenta el buen manejo de esterilizacin y desinfeccin de elementos. El objetivo de este laboratorio es conocer las tcnicas de esterilizacin de materiales y medios de cultivo en la toma de muestra ambiente caracterizndose macroscpicamente y microscpicamente. Pues no solo dichos organismos se hacen visibles por ayuda del microscopio, sino que se logran identificar cada tipo de bacteria y se dejan estudiar dichas caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de cultivo especiales. En dicha prctica cabe resaltar la utilizacin especial del Agar Nutritivo (Bacterias) y PDA (Mohos y levaduras) en la Zona de Ping pong de la Universidad Central.Concluyendose de tal modo lo necesario de identificar los medios de cultivo mediante tincin ,Macro-Microscpicamente, ya sean bacterias u hongos.

Palabras clave: microorganismo, Medios de cultivo, Esterilizacin.

Introduccin
Actualmente uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos se lleva a cabo en un estudio del crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en prcticas de laboratorio. El Medio de cultivo es aquel en el cual se da el crecimiento de dichos microorganismos por lo cual es caracterstico su material alimenticio en el que crece dicho cultivo. (1) Para un mejor procedimiento en el crecimiento de bacterias es necesario tener en cuenta una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como se debe tener en cuenta el grado presente de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento y por supuesto debe estar exento de todo microorganismo contaminante. (1)(2) Pues la mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. El agar es un elemento solidificarte muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. Otro agente de solidificacin an ms conocido es la gelatina (3) Es por ello que se debe tener en

cuenta las tcnicas de eterizacin para lograr la descontaminacin microbiana, la desinfeccin y la esterilizacin. Los organismos cultivados fueron los siguientes. Trichoderma Son hongos que estn en casi todos los habitas son los hongos mas frecuentemente cultivables, no tienen fase sexual sino que slo producen esporas asexuales. Sin embargo, hay unas pocas cepas de la fase sexual es conocida, pero no entre las cepas que han sido considerados en general de biocontrol. La fase sexual, cuando lo encuentra, se encuentra dentro de los Ascomycetes en el gnero Hypocrea. Taxonoma tradicional se basa en las diferencias en cuanto a la morfologa, principalmente de la esporulacin asexual. (Kantor,1979) Staphylococcus Es una bacteria Gram positiva, lo que significa que la pared celular de la bacteria consta de una capa muy gruesa peptidoglicano. Ellos son esfricos, formar grupos de 2 planos y no tienen flagelos. Las secreciones son numerosas, pero superficiales asociados adhesinas, endotoxinas, exoenzymes, polisacrido capsular. La cpsula es el responsable de la virulencia de una cepa mucoide son anaerobios facultativos. Se producen principalmente por la respiracin aerbica, o la fermentacin que produce cido lctico. (Pazos y Rojas,1985)

Pseudomonas Es un gnero de bacilos rectos o ligeramente curvados, Gram negativos, oxidasa positivos, aerbicos estrictos aunque en algunos casos pueden utilizar el nitrato como aceptor de electrones. Los miembros de este gnero generalmente son mviles gracias a uno o ms flagelos polares que poseen, son catalasa positivos y no forman esporas. Algunas especies sintetizan una cpsula de exopolisacridos que facilita la adhesin celular, la formacin de biopelculas y protege de la fagocitosis, de los anticuerpos o del complemento aumentando as su patogenicidad. (Kantor,1979) Penicillium Es un gnero grande que puede encontrarse casi por todas partes, siendo el gnero de hongos ms abundante en suelos. La fcil proliferacin de los Penicillium en los alimentos es un problema. Algunas especies producen toxinas, sin embargo muchas especies de Penicillium son beneficiosas para los seres humanos. Los quesos tales como el roquefort, brie, camembert, stilton, etc. se crean a partir de la accin de diferentes especies de Penicillium sobre la leche, y son absolutamente seguros de comer. El antibitico penicilina es producida por el hongo Penicillium chrysogenum, un moho ambiental. (Martinez,Sanchez y Quintana,1985) . Se caracterizan por formar conidios mediante una estructura ramificada que recuerda la forma de un pincel, las ramificaciones terminan en unas clulas que se conocen como fialides. Las filides originan las esporas.

Materiales y mtodos

Los materiales llevados a cabo luego de su debida esterilizacin y preparacin fueron en especial los medios de cultivo que en dicha prctica fueron (Agar Nutritivo y PDA). Expuestos al ambiente por 40min aproximadamente, por otro lado el Kit colorante de Gram claro est con ayuda del Mechero y Azul de Lactofenol para lograr la identificacin y clasificacin de bacterias y hongos los cuales fueron parcialmente colocados en el portaobjetos para la identificacin de diferentes morfologas mediante el microscopio.

Resultados Obtenidos Cultivos de hongo de Durazno y Staphylococcus

Ilustracin1.6Colonias de Hongos luego de la inoculacin

Ilustracin 2.Colonias de Tricoderma

Ilustracin 3.Colonias observadas de penicilina

Ilustracin 4.Inoculacin de pseudomona

Anlisis De los Resultados Durante esta practica en la mayora de los casos no se obtuvieron los resultados esperados debido a que no se tuvo una buena tcnica al momento de inocular nuestras bacterias o no se esterilizaron correctamente los instrumentos usados durante la prctica o simplemente no se realizaron en condiciones aspticas. Cuando los cultivos se destapan y manipulan, es muy importante evitar la entrada de aire y el contacto con elementos que puedan estar contaminados. Por esta razn, la transferencia de un medio a otro se realiza siempre en la proximidad de la llama de un mechero, con un asa de cultivo o con una aguja de siembra. Lo cual no se realiz correctamente por lo

cual nuestros medios de cultivos se contaminaron como lo fue en claro ejemplo el cultivo de hongo en el cual encontramos una mezcla de hogos con bacterias. Por otra parte se encontr una pequeas colonias de staphylococcus en los cuales no se obsevaron grandes cantidades debido a que este presenta la caracterstica de ser de forma pequea sin importar el medio en el que se encentre que tan rico o pobre sea. Por ultimo en la penicilium se observaron una gran cantidad de colonias la cuales se observaban filamentosas y vellosas y de textura algodonosa.

Tincin de Gram de Cultivos Ambiente y siembra de microorganismos

Ilustracin 5.Cultivo de pseudomona en AN

Ilustracin 6.Cultivo de E.Coli en AN

Ilustracin7.Despues de tincion Psd Basilos Gram +

Ilustracin Despues de tincion E.Coli Basilos Gram +

ANALISIS Segn los montajes hechos de dichos cultivos Tanto en la ilst.5 de Pseudomona y en la Ilst.6 de E.coli caracterizados por ser cultivos de bacterias con el debido procedimiento de tincin de Gram, Se logro caracterizar estos montajes como Gram+ con la presencia de bacilos segn su morfologa.

Ilustracin 9.AN Muestra Ambiente Ping Pong.

Ilustracin 10.PDA Muestra Ambiente Ping Pong.

Ilustracin11.Despues de Tincion AN Basilos Gram+

Ilustracin12.so de Tincion PDA Espirilosy Basilos Gram+

ANALISIS En los medios de cultivo ambiente llevados a cabo en la zona de ping pong se logro observar en la Ilst 11 de Agar Nutritivo la presencia de bacilos gram+ con una peculiar forma de unin entre estos mismos. Por otro lado en la Ilst 12. En el cultivo de PDA se logro ver la presencia de bacilos y espirilos por su forma alargada Gram+. Es por ello que mediante la tincin de Gram se puedo determinar si las bacterias cultivadas y las expuestas a diferentes ambientes logran ser Gram + o Gram- permitiendo mediante el uso del microscopio una mejor clasificacin de su morfologa permitiendo claro est un mejor estudio de las bacterias all presentes.

Cuestionario

1.Cules son los mtodos de esterilizacin ms utilizados en Microbiologa?

En qu tipo de materiales se aplica cada uno? Esterilizacin por calor hmedo. Esterilizacin por calor seco. Esterilizacin por radiacin. Esterilizacin por tratamiento qumico. Esterilizacin por filtracin. (microbiologia general , 2008) Agentes fsicos El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el calor hmedo el cual destruye a los microorganismos por desnaturalizacin de las protenas y el calor seco que destruye a los microorganismos por oxidacin de sus componentes celulares. El calor es considerado como el mtodo de esterilizacin por excelencia siempre y cuando el material a esterilizar soporte altas temperaturas sin sufrir ningn tipo de dao. La radiacin, o emisin y propagacin de la energa a travs de un medio, puede ser utilizada como agente para la eliminacin de microorganismos. As tenemos que las radiaciones ionizantes se pueden utilizar para la esterilizacin de materiales termolbiles, como por ejemplo materiales plsticos, y las radiaciones no ionizantes, como la luz ultravioleta, puede ser empleada en el control de reas cerradas, produce una disminucin en el nmero de clulas vegetativas o de esporas vivas con el tiempo de irradiacin. (Gamba, 2001)

Agentes mecnicos La filtracin permite la remocin de todos microorganismos presentes en un lquido o un gas retenindolos sobre la superficie de un material. (Gamba, 2001) Agentes qumicos Algunas sustancias qumicas pueden ser utilizadas como agentes esterilizantes porque tienen la capacidad de promover una o ms reacciones qumicas capaces de daar los componentes celulares de los microorganismos (protenas, membranas, etc.) (Gamba, 2001) 2Por qu el calor es el agente esterilizante ms eficaz?

Calor: Mtodo ms generalizado para el control de crecimiento microbiano. Se pude aplicar la desnaturalizacin que es la aplicacin de altas temperaturas y el tiempo que se lleva para reducir 10 veces la densidad de la poblacin a una cierta temperatura es llamado tiempo de reduccin decimal. Tambin se usa el trmino de tiempo de muerte trmica, que es tiempo mnimo que se necesita para destruir todos los microorganismos. Se usan mtodos como la pasteurizacin o la autoclave. (Ariana Gonzles Ros, 2012)

Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El calor provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las membranas y/o procesos oxidativos irreversibles en los microorganismos. (Esterilizacion generalidades ) (microbiologia! outside) La efectividad del calor como mtodo de esterilizacin depende de: Temperatura Tiempo de exposicin

3. Qu pasos son necesarios para esterilizar un material que puede estar contaminado con endosporas bacterianas? El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de Microbiologa. Es un sistema cerrado donde se forma vapor de agua que se somete a una presin elevada, una atmsfera, lo que hace que el agua alcance una temperatura de 121C causando la desnaturalizacin de enzimas lo que conlleva a la muerte de los microorganismos y la destruccin de las esporas. Habitualmente, se esteriliza a 121C durante 20 minutos. El proceso completo de esterilizacin en una autoclave se compone de diferentes fases: 1. Fase de descarga: Terminado el proceso de esterilizacin, deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la presin y temperatura del caldern empieza a bajar poco a poco. 2. Fase de esterilizacin: Una vez cerrada la vlvula de purgado y alcanzada la temperatura de esterilizacin previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilizacin. 3. Fase de purgado: A medida que la resistencia calienta el agua del fondo del caldern, se va produciendo vapor que desplaza el aire, hacindolo salir por la vlvula de purgado que est abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilizacin.(Martn C,s.f)

4.Explique cules son las diferencias entre los procesos de esterilizacin, desinfeccin y asepsia. ASEPCIA: Es el conjunto de medidas y procedimientos que impiden la llegada de microorganismos a un medio. (Advertlsement, 2011) ESTERILIZACION: Consiste en la destruccin completa de todos los microorganismos, incluidas las formas resistentes como esporas bacterianas, virus sin envoltura y hongos. Proceso de destruir los agentes infecciosos o microorganismos incluyen sus formas de resistencia, por medio de agentes fsicos o qumicos. (Advertlsement, 2011)

DESINFECCION: Es el procedimiento y uso de sustancias por las cuales se eliminaran o inhiben microorganismos en superficies inanimadas, pero es su forma vegetativa teniendo poca eficacia en esporas. Proceso de destruir los agentes infecciosos o microorganismos pero no sus formas de resistencias, por medio de agentes fsicos o qumicos. (Advertlsement, 2011) 5.Cmo se relacionan estos procedimientos con la pasteurizacin? La pasteurizacin es un proceso trmico con el objetivo de reducir los agentes los objetivos del tratamiento trmico es una "esterilizacin parcial" de los alimentos lquidos, alterando lo menos posible su estructura fsica, sus componentes qumicos y sus propiedades organolpticas. Tras la operacin de pasteurizacin, los productos tratados se enfran rpidamente y se sellan hermticamente con fines de seguridad alimentaria; por esta razn, es bsico en la pasteurizacin el conocimiento del mecanismo de la transferencia de calor en los alimentos. A diferencia de la esterilizacin, la pasteurizacin no destruye totalmente las esporas de los microorganismos, ni elimina todas las clulas de microorganismos termfilos.) (Advertlsement, 2011) (Definicion. DE) 6.Describa el procedimiento a seguir para los siguientes mtodos de muestreo de aire: Conteo de partculas: la monitorizacin de la concentracin ambiental de partculas permite detectar desviaciones significativas en la limpieza del aire. Esta se lleva a cabo con contadores fijos controlados a distancia. (Botet, 2006) Muestreadores activos del aire: muestreo volumtrico del aire por impacto de partculas viables en medios slidos. Es en si la recoleccin de partculas viables mediante un instrumento de muestreo apropiado y de acuerdo con un plan de muestreo. Estimacin de la cantidad de microorganismos suspendidos en el aire y por lo tanto nos proporciona una medida indirecta del riesgo de contaminacin del producto. (Acosta, 2007)

Muestreador centrfugo: la colecta de microrganismos por centrifugacin permite la creacin de un torbellino que produce que las partculas suspendidas en el aire se impacten sobre la superficie de colecta. El muestreador ms comn de este tipo es el Biotest RCS (Reuter Centrifugal Air Sampler, Alemania). El aire es succionado por el rotor del Muestreador, que al girar crea fuerza centrfuga y ocasiona la impactacin de las partculas. Sobre las paredes de la cmara se coloca una tira plstica con agar en la que se desarrollaran colonias de microrganismos, despus de ser retirada e incubada a la temperatura adecuada. (Sarukhn, 2004) STA: Slit-to-agar air sampler el aire es enviado a travs de una rendija sobre una placa de Petri, que gira lentamente. (Botet, 2006)

7.Cules son los principales gneros de hongos representados en cualquier clave taxonmica? Describa 5 gneros de importancia ambiental, que se encuentren frecuentemente en el ambiente.

Gnero Trichoderma: est compuesto por hongos que se encuentran presentes en forma natural en casi todos los suelos y otros habitas del planeta. Su desarrollo se ve favorecido por la presencia de altas densidades de races de plantas, las cuales son colonizadas rpidamente por estos microrganismos y as aprovechar una fuente nutricional adicional. Donde acta como bio-controlador y colonizador de races, entre otros, micoparasitismo, antibiosis, competencia por nutrientes y espacio, tolerante al estrs por parte de la planta. (Gomez, 2005) Genero Cordyces: es un gnero que se caracteriza por encontrarse en el suelo, desarrollando trampas para capturar y destruir nematodos, adems puede crecer como saprobio. (Miguel Ulloa, 1994) Gnero Rhizopus: sus esporangiforos normalmente se desarrollan en racimos a partir de los extremos de estolones en el punto de origen de los rizoides. Tienen importancia principalmente como causantes, en frutas y hortalizas, de podredumbres durante el almacenamiento y distribucin en los canales de comercializacin. (I.M. Smith, 1998) Gnero Aspergillus: son mayoritariamente ubicuas, aislndose de diferentes sustratos, aunque con mayor frecuencia de climas clidos. Algunas especies tienen inters por su importancia industrial, otras por ser agente de biodeterioro o producir micotoxinas, o por ser patgenas para los animales y los vegetales. Las colonias de las especies de este gnero se desarrollan en general de forma rpida y presentan diversas tonalidades. Estn formadas por densas agrupaciones de conidiforos sobre los que se encuentran las clulas conidigenas que son las que originaran las esporas asexuales o conidios. (Castillo, 2007) Gnero Penicillium: las especies de este gnero son conocidos como contaminantes habituales de diferentes substratos y pueden presentar la capacidad de producir diversas micotoxinas. La mayora de las especies se les considera saprofitas, existiendo pocas que se aslen rutinariamente como patgenas oportunistas. Estas especies forman colonias que crecen generalmente de manera rpida, estn formadas por densas agrupaciones de coniforos y la mayora presentan coloraciones verdosas. (Castillo, 2007)

8. Mediante que decretos se puede basar usted para determinar los valores lmite de muestreo en aire en los siguientes escenarios, (enunciando cuales son): a). Criadero de pollos, Venta de comidas rpidas: Decreto 2323 de 2006: por el cual se reglamenta parcialmente la ley 9 de 1979 en relacin con la Red Nacional de Laboratorios y se dictan otras disposiciones. Tiene por objeto organizar la red nacional de laboratorios y reglamentar su gestin, con el fin de garantizar su adecuado funcionamiento y operacin en las lneas estratgicas del laboratorio para la vigilancia en salud pblica, la gestin de la calidad, la prestacin de servicios y la investigacin. Decreto 983 Desde el punto de vista microbiolgico los ingredientes alimentarios y los alimentos no podrn contener: Microorganismos patgenos. Toxinas u otros metabolitos microbianos actual o potencialmente riesgosos.

 Agentes microbianos capaces de causar alteracin y que la tecnologa exigible para su elaboracin debi eliminar. Cualquier tipo de microorganismo que por su cantidad o por sus cualidades indique una manipulacin defectuosa, malas condiciones higinicas o haga presumir la presencia de microorganismos patgenos. Producto Micotoxinas Lmite (mcg/kg. o l) Leche, derivados y productos lcteos Aflatoxinas M1 0.5 Alimentos industrializados para nios de corta edad Aflatoxinas (B1+B2+G1+G2) Otros alimentos y condimentos Aflatoxinas (B1+B2+G1+G2) (20 mientras que B1 no supere 5) Arroz, cebada, porotos, caf, maz Ocratoxina A 50 Maz, cebada Zearalenona 200 Jugos de frutos Patulina 50. (Alcaldia de Bogota, 1998) c). Planta de tratamiento de aguas: DECRETO 475 DE 1998 CARACTERISTICAS EXPRESADAS EN VALOR ADMISIBLE Color Verdadero Unidades de Platino Coblato (UPC) 15 OLOR Y SABOR Aceptable Turbiedad Unidades nefelomtricas de tubidez (UNT) 5 Slidos Totales mg/L 500 Conductividad micromhos/cm 50 1000 Sustancias Flotantes Ausentes Artculo 25. El agua para consumo humano debe cumplir con los siguientes valores admisibles desde el punto de vista microbiolgico: Tcnica utilizada MICROORGANISMOS INDICADORES: Filtracin por membrana Sustrato definido Tubos mltiples de fermentacin "aceptable hasta el ao 2000 Coliformes totales 0 UFC/100 cm3 0 microorganismos/100 cm3 <2microorganismos/100 cm3 Escherichia coli 0 UFC/100 cm3 0 microorganismos/100 cm3 negativo Pargrafo primero. Los resultados de los anlisis microbiolgicos se deben reportar en las unidades de NMP/100 cm3 (nmero ms probable), si se utiliza la tcnica del nmero ms probable o la tcnica enzimtica de sustrato definido y en UFC/100 cm3 (unidades formadoras de colonia), si se utiliza la tcnica de filtracin por membrana. Pargrafo segundo. Se recomienda un valor mximo admisible de 100 Unidades Formadoras de Colonias (U.F.C.) por 100 centmetros cbicos (cm3), para microorganismos mesfilos, como prueba complementaria de la calidad del agua desde el punto de vista microbiolgico.Artculo 26. Ninguna muestra de agua potable debe contener E-coli en 100 cm3 de agua, independientemente del mtodo de anlisis utilizado. (Alcaldia de Bogota, 1998)

Bibliografa
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