DETERMINAREA CANCICLOVIRULUI IN PLASMA UMANA PRIN CROMATOGRAFIE LICHIDE DE PERFORMANTA INALTA CU DETECTIE IN UV

Indroducere

Citomegalovirusul (CMV) este cel mai comun agent patogen oportunist care afecteaza transplantul de organe solide(SOT). Gancivlovir (GCV) un analog deoxiguanozin a fost alegerea initiala pentru prevenirea si tratarea bolii CMV la pacientii de transplant. Adminsitrarea intravenoasa (IV) de GCV (5 mg/kg/12 h dat pe parcursul a 2-3 saptamani sau administratiile prelungite in functie de informatiile despre produs) a fost standardul de aur pentru trantamentul infectiei stabilit , in timp ce GCV oral a fost administrat pentru profilaxia CMV din cauza biodisponibilitatii sarace (F). Valganciclovir (VGCV), ester valyl de GCV, se caracterizeaza printr-o aproape de zece ori mai mare biodisponibilitate decat GCV, si ofera perspectiva de a inlocui suboptimat oral profilactic (oral GCV) si regimuri terapeutice intravenoase. Indicatiile aprobate a VGCV sunt tratamentul retinitei cu CMV la pacientii cu HIV si profilaxia infectiei cu CMV la pacientii SOT. Farmacocinetice de GCV dupa GCV IV si/sau VGCV oral a fost studiata in diferite categorii de pacienti. Analizele de farmacocinetica noi, ca famacocinetica populatiei, ofera modele predictive, care permit ajustarea dozei. Concentratiile plasmatice terapeutice GCV la beneficiarii de transplant de organe care primesc tratament oral VGCV de obicei intre 2.0 la 20 micrograme/mL. Suprimarea viremei CMV si boala este legata de expunerea la GCV de aceea este important sa se realizeze expunerea necesara, evitand evenimente adverse si dezvoltarea unei rezistente virale.
1

Doar un singur studiu farmacocinetic (PK) a comparat expunerea la GCV intre pacientii tratati cu GCV IV si oral VGCV, la stare de echilibru, la pacientii de transplant SOT care sufera de infectie CMV. Un studiu anterior a demonstrat suprimarea viremei in timpul profilaxiei cu expunere GCV(ASC), de 40-50 g h/ml, ceea ce sugereaza ca ajustarea dozei la o valoare de expunere tinta ar justifica dezvoltarea unui model farmacocinetic aplicabil clinic. Unele metode de inalta performanta pentru cromatografie lichida au fost descrise pentru a analiza GCV in plasma , ser si alte fluide biologice. Cu toate acestea, aceste metode HPLC/ ultraviolete(UV),au una sau mai multe dintre urmatoarele deficiente: proceduri de extragere (12,13,14) o cerinta de volume mari de plasma (250-1000 microlitri)(12,13,15), termen lung de procesare (16,17), limita mare de cuantificare (LLOQ) (18) sau sensibilitate relativ scazuta. De fapt, concentratiile ganciclovir sunt in prezent evaluate in spitalul nostru de referinta de catre un HPLC validata cu metoda de detectie UV. Aceasta metoda necesita fie volumul esantionului mare sau timp mare de rulare. Pentru a depasi aceste probleme, o noua metoda de analiza a GCV a fost dezvoltata. Scopul acestei lucrari este de validare a metodei de analiza GCV cu UHPLC folosind detectia UV. Probele de plasma de la beneficiarii de transplant au fost determinate de metoda curenta aplicata HPLC si UHPLC, ambele rezultate au fost corelate.

Materiale si metode
Aparatura si conditiile cromotografiei: Cromatografia a fost efectuata cu ajutorului unui sistem Water Acquity cu detector cu ultraviolete setat la 245 nm. Separerea a fost efectuata pe o coloana UHPLC Acquity HSS T3 obtinut din Waters. O precoloana Vanguard HSS T3 a fost folosita pentru e preveni particule de la infundarea coloanei si pentru a prelungi durata de viata a coloanei.
2

Aceasta a fost echipat cu autosampler de racire si de control al temperaturii al cuptorului coloanei. Temperatura camerei de autosampler a fost de 40 grade Celsius. Modul de injectare a fost de bucla partiala cu supraincarcare de ac si infectat de 7.5 microlitri. Elution a fost efectuat la 0.7 ml/ min cu o solutie de faza mobila, care a fost solutie apoasa de potasiu monofosfata (Ph 4.0: 0.02M) continand 1% din acentonitril. Solventul de spalare puternic si moale a fost metanolul si apa, Sistmeul Acquity UHPLC a fost echipat cu HP Pavilion, cu software-ul EMPOWERTM pentru a prelucare datele (zona de integrare, de calcul si de trasare a cromatogramei) pe parcursul metodei de validare. Zona GCV a fost direct extrapolata din curba de etalonare de zi cu zi si doar in cateva probe zona a fost ajustata manual.

Colectia de esantioane
Potrivit unui protocol de studiu aprobat anterior de catre Comisia de etica a spitalului Universitar, probe de sange au fost luate de la pacientii de transplant de orange solide sub profilaxie sau tratament cu GCV si VGCV in timpului sejurului lor la spital si de rutina lor anterioara urmate de programarea lor la medic. Probe de sange (5 ml), au fost restrase in tuburi vidate inainte si la 30, 60, 90 min si la 2, 3, 4, 6, 8 si 12 ore dupa adiminstrarea GCV. Esantioanele au fost centrifugate la 13000 rpm timp de 10 min la 4 grade Celsius si plasma a fost separata si transferata in doua portiuni de 1 ml tuburi de testare, polipropilena si depozitate la -20 grade Celsius pana in momentul analizei.

Standardele solutie de baza si calibrarii plasmei

Solutie stoc de GCV 1000 g/mL in HCl 0.1 N a fost diluata in continuarecu plasma, gol pentru prepararea solutiei de lucru de GCV 80 /ml. Pentru a pregati solutii pentru construirea de curbe standard, o cantitate masurata de fiecare solutie de stoc a fost transferata intru-un tub de testare si amestecat bine.Ulterior dilutii seriale au fost efectuate pentru a crea solutii mixte standard la intervale de concentratie tinta de 0.5,1,
3

5,10,16, 20, 25 si 30 micrograme/ml. Plasma martor a fost obtinuta de la un bazin de plasma de voluntari sanatosi si au fost stocate maxim 48 de ore la 4-12 grade. Standardele de calibrare au fost depozitate pana la 3 luni la 20 grade , 200 de portiuni de microLitri in 1.5 ml de polipropilena tuburi Eppendorf, decongelate in ziua de analiza. Probleme de Control al calitatii (QC) au fost de asemenea pregatite prin spiking a solutiei stoc in plasma martor, si dupa cum este descris pentru pregatirea standardelor de calibrare. Nivelurile de concentratie ale probelor QC de GCV(1,5, 8,5 si 15 g/ml) au fost selectate pentru a cuprinde gama relevanta clinic a concentratiilor asteptate in probele de plasma. Probele QC au fost depozitate pana la 3 luni la -20 grade si analizate de fiecare data, impreuna cu probele de la pacient.

Liniaritatea si limita de cuantificare

Liniaritatea a fost evaluata prin analiza unui set de cinci curbe de calibrare a plasmei. Curbele de calibrare au fost pregatite asa cum este descris in standardele solutiei stoc si a calibrarii plasmei sesctiunea de mai sus. Liniaritatea metodei de transare a fost determinata de zona de varf (y) din GCV. Masuratori de calibrare au fost supuse analizei regresiei celui mai mic patrat de un calculator, pentru a oferi informatiicu privire la panta Y-intercepteaza, coeficientului de corelatie (r) si concentratiile calculate. Coeficientul de corelatie trebuie sa fie mai mare sau 0.9800. Limita inferioara de cuantificare (LLOQ) este definita ca cea mai mica concentratie GCV care ar putea fi cuantificate cu valori de precizie si acuratete mai mica de 20%.

Recuperare
Recuperarea absoluta a procedurii de extractie a fost evaluata prin compararea zonei de vart a celor probe QC cu cele ale standardelor de referinta pregatite in HCl si injectat direct in coloana analitica. A fost

exprimat in raport procentual din zona QC extras in raport cu standardul de referinta injectat direct.

Stabilitatea
Cicluri inghet dezghet, autosampler si studii de stabilitate pe termen lung au fost efectuate la cinci dubluri si au fost studiate pe trei probe QC la trei concentratii. Pentru a evalua stabilitatea inghet dezghetm probele au fost supuse la inghetarea pentru 24 de ore la -20 grade si decongelate neasistata la temperatura camerei timp de 3 cicluri. Stabilitatea pe termen lung dupa trei luni in depozit la -20 grade, a fost efectuat de asemenea. Indicatori medii din zona de probe extrase dupa fiecare conditie experimentala ca o functie a ratelor medii ale probelor din zona de proaspat extrase, analizate la momentul zero au fost comparate iar rezultatele au fost exprimate in procente ale concentratiilor de esantionare proaspat, care au fost considerate ca fiind de 100%. Corelarea cu metoda HPLC Probele alea tuturor pacientilor au fost anlizate in duplicat prin doua tehnici cromatografice (UHPLC si HPLC) pentru a determina concentratiile GCV in conditiile de performanta si prezentate in tabelul A.1. Pentru a asigura o relatie liniara intre date, liniaritatea a fost testata cum este descris de Passing si Bablok folosind Analyse-It Standard Edition. Daca liniaritatea este data, testarea ipotezei nule a=0 si b=1 se efectueaza. Analiza a GCV in ser prin metoda de cromatografiere lichida de inalta performanta cu detectie UV-VIS a fost efectuat dupa cum urmeaza. Pentru precipitarea de proteine plasmatice, 20 microlitri de solutie de TCA a fost adaugata la 200 microlitri proba de ser si amestecata si centrifugata la 10000 rpm timp de 4 minute. Supernatant a fost injectat direct in sistemul HPLC. Faza mobila a fost un tampon fosfat 0.02 M si a emis un debit de 1ml/min. Volumul esantionului injectat a fost de 40 microlitri si timpul de functionare total a fost de 5 minute.

Rezultate Testul de performanta a fost determinat in conformitate cu FDA, orientari pentru validarea metodei bioanalitice. Metoda a fost validata prin determinarea de liniaritate, de pricizie, acuratete, sensibilitate, limita inferioara de cuantificare (LLOQ) si de stabilitate. In tabelul A.1 o comparatie a conditiilor si a performantelor pentru cele doua tehnici HPLC/UHPLC este indicat. Timpul de retentie UHPLC a fost de 0.7 min in timp ce HPLC a fost de 5 min. Desi GCV de varf a fost de 0.7 min, timpul de functionare totala a fost de 2.5 min pentru ca dupa fiecare analiza coloana UHPLC a fost spalata cu metanol si acetonitril la un debit de 0.7 ml/min pentru 1.5 minute. Timpul total a fost de mai putin de jumatate cu privire la HPLC masurand mai multe probe ale pacientilor pe zi. Cromatograma tipica UHPLC este prezentata in Fig B.1.

Liniaritatea si limita cuantificarii

Coeficientii de corelatie pentru toate standardele au fost mai mari decat 0.999 si pantele curbelor de cinci preparate pe cinci zile diferite au avut un coeficient mediu de variatie (CV) de 3.63%. O ecuatie tipica pentru curbele de calibrare a fost Y=2.81e004X+2.56e003 unde y si x zona de varf si concentratia GCV. Validarea de LLOQ a fost efectuata in 10 loturi diferite de plasma martor. Limita inferioara de cuantificare a GCV de UHPLC a fost de 0.05g/ml cu 7.5 microlitri injectat un coloana UHPLC. Cu toate acestea , calibrarea a fost efectuata in intervalul 0.5 30 micrograme/ml deoarece concentratia probei de plasma a fost mai mare de 1 mg/ml.

Recuperare
Aceasta metoda de extractie a oferit o recupeare acceptabila absoluta medie GCV>85%. Tabelul A.3 enumera rezultatele studiilor de recuperare.

Stabilitatea
6

Stabilitatea pe termen scurt, pe termen lung si de de inghet-dezghet a analizelor a fost determinata in plasma umana dupa fiecare perioada de depozitare iar rezultatele au fost procesate imediat dupa ce a fost preparat proaspat. Probele au fost considerate ca fiind stabile, daca abaterea de la starea initiala a fost de +-15%. Specificacitatea Nici o interferenta cromatografica a fost observata de la urmatorele potentiale medicamente co-administratesau a metabolitilor acestora: ciclosporina, tacrolimus, acidul micofenolic, everolimus, sirolimus, prednison, sulfametoxazol si trimetoprim.

Corelatia cu metoda HPLC

A fost o mare corelatie intre amandoua tehnici cum se vede in figura B 3.2. CI95% la b (panta) a fost 0.854-1.091 si CI95% la a (intersectia axei y) a fost -0.867-0.685.

Discutii Metoda UHPLC a fost dezvoltata pentru a determina GCV in plasma umana pentru investigatiile farmacocinetice si se aplica in prezent intr-un protocol de cercetare. Precizia si acuratetea metodei de fata in conformitatea cu criteriile de analiza a probelor biologice in conformitate cu instructiunile US FDA, in cazul in care precizia (CV) si acuratetea (RE), determinat la fiecare nivel de concentratie nu trebuie sa depaseasca 15% din coenficientul de variatie (CV). Valorile RE intra-zi si inter-zi au aratat o mare repetabilitate si reproducabilitate. Aceste rezultate indica faptul ca metoda propusa UHPLC ofera o precizie acceptabila. Comparativ cu metoda curenta folosita de HPLC, UHPLC este o tehnologie recent dezvoltata si ofera o capacitate mai mare de varf, rezolutiemai mare, sensibilitate sporita si viteza mai mare de analiza. Reducerea timpului de retentie si volumul mic esantion de
7

UHPLC cu program isocratic este foarte important, in scopul de a imbunatati monitorizarea acestui medicament la pacienti. Scurtare a timpului de functionare totala folosind UHPLC este foarte important, daca, avem in vedere numarul total de probe pacient in studiul cinetic. Corelatie intre cele doua tehnici este buna insemnand casi UHPLC si HPLC sunt bune pentru determinarea concentratiei GCV. Am dezvoltat o medota simpla si sensibila UHPLC pentru determinarea GCV pentru 200 microlitri din proba cu plasma cu ajutorul detectorului de radiatii UV. Rezultatele obtinute demonstreaza utilitatea pentru monitorizarea terapeutica sau alte studii de farmacocinetica.

Concluzii Monitorizarea de droguri terapeutice de administrare a gancioclovir nu este angajat in tratamentul pacientilor de transplant de organe solide pacientii infectati cu CMV, dar aceasta metoda este aplicata in prezent intrun protocol de cercetare. Suprimarea viremei in timpul profilaxia cu expunere la gabcioclovir , sugereaza ca ajustarea dozei la o valoare de expunere tinta ar justifica dezvoltarea unui model farmacocinetic aplicabil clinic. O abordare care sa permita modificarea dozei, dupa GCV determinarea plasmei pentru a obtine o expunere plasmatica tinta este de natura sa imbunatateasca rezultatul la pacientii SOT infectate cu CMV. Acest lucru necesita nu numai metoda rapida si sensibila dar de asemenea metoda de bioanalitice selective cu privire la medicamente administrate concomitent care este prevazut prin tehnica UHPLC.