Universidad Andrs Bello Facultad de Ciencias de la Salud Departamento de Ciencias Biolgicas

LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR BIO-131/ seccin 3

Trabajo Prctico N 5
Organizacin subcelular

Nombres:
-Patricia Snchez -Dhannicsa Prez

Profesores: -Claudio Villota

-Eduardo Albornoz

Santiago, noviembre 2013

Introduccin
Las clulas son las unidades fundamentales de la vida y mediante la biologa celular debemos encontrar la respuesta a la pregunta de que es la vida y como funciona. (1) Por definicin y a diferencia de las clulas procariontes, las clulas eucariontes poseen un ncleo que contiene la mayora del ADN envuelto en una membrana. Esto deja al material gentico en un compartimiento separado del resto de los contenidos de la clula o citoplasma, donde ocurren las reacciones metablicas. (2) La presencia de ncleo conlleva la existencia de una variedad de organelos, mitocondrias, retculo endoplasmtico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto. Las funciones que desarrollan estos organelos estn estrechamente relacionadas (3). Para un estudio ms profundo de estos organelos, se procede a separarlos por centrifugacin. Esta tcnica fue desarrollada entre otros por Albert Claude y Christian de Duve entre 1940 y 1950, y consiste en la separacin de los componentes de la clula basndose en su tamao y densidad (4).

OBJETIVOS: Comprender el fundamento de la tcnica de fraccionamiento subcelular por medio del rompimiento de la clula y la separacin de los organelos mediante un campo gravitacional. Determinacin del rendimiento y pureza de cada fraccin. Obtencin de preparados enriquecidos en fracciones subcelulares por medio de tcnicas de centrifugacin.

Materiales y mtodos
ACTIVIDAD N1: Fraccionamiento subcelular. A.1) Fraccionamiento subcelular de Hgado de rata: Pasos: 1. preparacin y fraccionamiento de la muestra. La muestra se lava con suero fisiolgico (eliminar el rastro de sangre) luego se filtra a travs de gasa en un embudo de vidrio y toma el nombre de homogenizado crudo (HC) 2. Se guarda 1 ml en un tubo Eppendorf para posterior anlisis. 3. se toman con pipeta 10 ml del homogenizado crudo y se traspasan a un tubo Falcn previamente rotulado. 4. Se procede a la primera centrifugacin de baja intensidad a 2000 RPM (revoluciones por minuto) por 5 minutos. Se obtiene un pellet 1 (P1) y un sobrenadante 1 (SN1). 5. Tomamos un ml de sobrenadante (SN1) y lo vertimos en un tubo Eppendorf de 2 ml. 6. Luego al pellet 1 se le agrega 1 ml de buffer (suero fisiolgico). 7. Procedemos por la segunda centrifugacin a 13.000 RPM durante 10 minutos. Se obtiene pellet 2 (P2) y sobrenadante 2 (SN2). Las muestras se deben mantener en hielo para posterior observacin 8. Tomamos 1 ml de sobrenadante (SN2) y lo vertimos en un tubo Eppendorf. 9. Al pellet 2 se le agrega 1 ml de buffer (suero fisiolgico). A.2) Evaluacin del fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares. -Deteccin de mitocondrias a travs de reaccin de SDH en las fracciones. Esto se realiza segn este esquema, a cada tubo se le deben agregar las siguientes cantidades de microlitros:

N Tubo 1 2 3 4 5 6 Control HC P1 SN1 P2 SN2

Succinato 0,1 M Azul de metileno 400 ul 100 ul 400 ul 100 ul 400 ul 100 ul 400 ul 100 ul 400 ul 100 ul 400ul 100 ul

Agua 400 ul 400 ul 400 ul 400 ul 400 ul 400 ul

Muestra volumen 400 ul 400 ul 400 ul 400 ul 400 ul 400 ul

Posteriormente se agita el contenido de cada tubo y se agregan 100uL de vaselina liquida (para que no ingrese ms oxgeno a la reaccin), y se colocan los tubos en un bao termorregulador a 39.5C durante 5 minutos. Observar si hay cambios de decoloracin. A.2.1) Observacin microscpica de las fracciones. Pasos: 1. En un portaobjetos limpio y seco colocar una gota de la suspensin de ncleos P1 obtenida anteriormente. 2. Colocar sobre ella un cubreobjetos y observar su preparacin al microscopio usando para ello el objetivo de 40X. 3. Agregar azul de tripn y volver observar la preparacin de ncleos. Anotar que se observa. 4. Repetir el proceso con la fraccin enriquecida en mitocondrias P2. Coloque una gota de la muestra en un portaobjetos, coloque sobre ella un cubreobjetos, realizar la tincin con azul de tripn y observe al microscopio usando el objetivo de 40X. Anotar que es lo que se observa.

Resultados
Actividad A.1.: Fraccionamiento subcelular. N
1

2 3 4 5 6

Succinato Azul de Agua Muestra 0,1 M metileno volumen control 400uL 100uL 400uL 400uL HC 400uL 100uL 400uL 400uL P1 400uL 100uL 400uL 400uL SN1 400uL 100uL 400uL 400uL P2 400uL 100uL 400uL 400uL SN2 400uL 100uL 400uL 400uL (la reaccin cada vez fue menor) Actividad A.2.1: Observacin microscpica de las fracciones

Tubo

Reaccin No Si No Si Si No

1) Observacin suspensin de ncleos en P1: Objetivo 40x: Se obtuvo una imagen poco clara, en la cual se presentaba un fondo blanco con ciertas manchas pequeas un poco ms oscuras las cuales se hacan casi imperceptibles. A simple vista no podamos realizar una observacin muy detallada sobre lo observado. -Al incorporar azul de tripn: Se observa una imagen mucho ms clara, se distinguen claramente los ncleos presentes en la muestra. 2) Observacin de la fraccin enriquecida en mitocondrias P2: A partir de la muestra ya tratada con azul de tripn observada con el objetivo 40x, no logramos apreciar mitocondrias.

Discusin
Actividad A.1: Fraccionamiento subcelular. Las mitocondrias pueden ser identificadas por la actividad de la enzima Succinato deshidrogenada (SDH) que cataliza la deshidrogenacin estreo especfica de Succinato a Fumarato durante el ciclo de Krebs, esto ocurre porque los protones y electrones liberados permiten seguir la reaccin a travs de la decoloracin del azul de metileno, que en su estado oxidado es azul y al reducirse se torna incoloro.(5) Nuestro SN1 y Pellet 2 dieron positivo a la presencia de mitocondrias, el SN1 dio positivo porque fue el sedimento de la primera centrifugacin en donde aislamos ncleos, y el pellet 2 que lo conseguimos a partir del SN1 que contiene slo mitocondrias. Actividad A.2.1: Observacin microscopia de las fracciones 1) Observacin suspensin de ncleos en P1: Al observar la muestra en 40x del pellet 1 (P1) no logramos apreciar correctamente ningn organelo, sin embargo cuando agregamos el azul de tripn logramos apreciar claramente los ncleos, ya que este al ser de naturaleza aninica reaccion favorablemente con el azul de tripn que es de naturaleza catinica. 2) Observacin de la fraccin enriquecida en mitocondrias P2: La muestra dio positiva a mitocondrias, sin embargo, no fueron visibles con el microscopio ptico ya que este organelo es demasiado pequeo.

Conclusin
La tcnica de fraccionamiento celular, el que consiste en la ruptura de la clula para su anlisis, as observar los distintos tipos de organelos y macromolculas presentes en ella, con un alto ndice de pureza. Existen varias formas de homogenizacin, vale decir, formas de romper una clula, ya sea por vas mecnicas, por ondas sonoras, presin osmtica entre otras. (6) En la actividad utilizamos como fraccionamiento celular la tcnica de centrifugacin, la cual considera la densidad y tamao de los organelos para posteriormente ser separados, ya que, los organelos con mayor masa y tamao son los que se precipitan primero, en el prctico, gracias a esta tcnica pudimos comprobar que efectivamente el organelo ms grande de la clula es el nucle, ya que fue el primero en precipitarse , y as sucesivamente con los dems organelos, dando a entender que para observar los organelos de menos densidad se debe ir a una velocidad mayor en la centrifugacin. Luego de ser separados y aislados son marcados para asegurar la presencia de estos organelos, en el caso de los ncleos su marcador es el ADN, el cual marcado con azul de tripan, y en el caso de las mitocondrias, estas pueden ser identificadas por la actividad de la enzima succionato deshidrogenada (SDH) Concluimos que se dan por cumplidos los objetivos generales del prctico, ya que, esto complementa tanto la actividad prctica, como, nuestros estudios generales.

Bibliografa
(1) Alberts, Bray, Hopkin, Jhonson, Lewis, Raff, Roberts, walter. Editorial medica Panamericana, 2.ed. captulo 1.pag 1. (2) Gua N5laboratorios biologa celular, pag 2. (3) Alberts, Bray, Hopkin, Jhonson, Lewis, Raff, Roberts, walter. Editorial medica Panamericana, 2.ed. captulo 1. Pag 16. (4) Gua N5laboratorio biologa celular, pag 6. (5) Gua N5laboratorio biologa celular, pag 11. (6) Gua N5laboratorio biologa celular, pag 7