Instituto Paracelso: Oxidaciones biolgicas (1er parte)

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Oxidaciones Biolgicas.


1.1. INTRODUCCION AL METABOLISMO

Sabemos que en una determinada clula ocurren miles de reacciones qumicas en
simultneo. Muchas de estas reacciones estn agrupadas de forma tal, que el producto de
una reaccin qumica es sustrato para otra reaccin y as sucesivamente, de forma tal, que
a este conjunto de reacciones acopladas se las denomina como vas metablicas.
Algunas de estas vas tienen como objetivo la sntesis de compuestos qumicos y se las
denomina como vas anablicas. Obviamente, estas reacciones requieren gasto de
energa generalmente en forma de ATP para que puedan producirse. Existen otro tipo
de reacciones, que tienen como objetivo degradar compuestos qumicos; y se denominan
vas catablicas. En lneas generales, se puede decir que estas ltimas suelen ser
espontneas y dan como balance general una ganancia neta de energa, que generalmente
culmina con la formacin de algn compuesto de alta energa (Ej. ATP). Aclaramos que
el balance general resulta en una ganancia energtica, aunquer es posible que en alguno
de las reacciones de la va metablica, sea necesario invertir inicialmente algo de energa
para luego obtener un rdito mayor.

Las vas anablicas:
- Son divergentes A partir de unos pocos elementos pueden formarse millones
de compuestos distintos (Ej. Existen 20 tipos de aminocidos capaces de ser
utilizados para la sntesis proteca, pero a partir de ellos pueden formarse miles y
miles de protenas diferentes).
- Gastan energa Debido a que el balance energtico global suele indicar que
en conjunto se trata de reacciones no espontneas, con un G positivo.
- Son reductivas Es decir, necesitan el aporte de electrones o equivalentes de
reduccin para que puedan llevarse a cabo (ver mas adelante).

Las vas catablicas:
- Son convergentes A partir de la degradacin de diferentes tipos de compuestos
puede obtenerse un nico compuesto comn (Ej. La degradacin de glucdos y
lpidos lleva a la formacin de acetil-coA)
- Generan energa Debido a que el balance energtico global suele tener un
valor de G negativo, esto indica que la reaccin no solo ser espontnea, sino
que tambin liberar una cantidad de energa que podr ser utilizada para la
sntesis de ATP o GTP.
- Son oxidativas Es decir, los compuestos qumicos van perdiendo electrones a
medida que la reaccin progresa. Esto no implica necesariamente la presencia de
oxgeno, pues oxidar quiere decir: agregar oxgeno, quitar electrones o quitar
hidrgenos (ver luego).
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En este punto es
importante remarcar que
el ciclo de Krebs
constituye la base del
metabolismo
intermedio, pudiendo
funcionar en forma
anablica o catablica
segn las necesidades
que tenga la clula en
un determinado
momento. Las vas que
pueden funcionar como
anablicas o catablicas
segn la necesidad se
consideran como vas
anfiblicas.






1.2. INTRODUCCION A LAS OXIDACIONES Y REDUCCIONES

Se comento anteriormente que las reacciones de sntesis son reductivas, mientras que las
reacciones de degradacin son oxidativas.

Al principio de la cursada se comento que oxidar quera decir agregar oxgenos o quitar
hidrogenos y electrones. En ese entonces se cito un ejemplo donde se iba oxidando una
molcula agregando oxgenos, aunque se aclar que esto ocurra en muy pocos lugares
de una clula pues agregar oxgeno directamente aumenta la temperatura y nosotros
somos organismos isotrmicos, es decir necesitamos mantener nuestra temperatura
constante










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De esta manera, al oxidar la molcula mas reducida que existe, un hidrocarburo, se va
transformando hasta llegar finalmente a dixido de carbono (con desprendimiento de
agua), que son los desechos de una combustin oxidativa bien realizada. Durante el
transcurso de estas transformaciones se va liberando energa, que en el caso de realizarse
agregando oxgeno, la misma lo hace principalmente en forma de calor.

En la realidad, para degradar un compuesto, es muy comn que se le vayan quitando
tomos y electrones, lo que necesariamente implica que el compuesto se est oxidando.
En cambio, para sintetizar un compuesto, es necesario agregarle tomos y electrones, lo
que significa que el compuesto se est reduciendo.

Ahora, tomando como base el primer ejemplo, la oxidacin. Si para degradar un
compuesto necesitamos quitarle tomos y electrones, estos tomos y/o electrones
necesitan ser transferidos a otro compuesto. Lgicamente, no podemos quitar electrones
y tirarlos a la basura. Esta situacin implica que mientras un compuesto se oxida,
necesariamente otro se reduce. El compuesto que cede sus electrones se est oxidando,
mientras que el que lo recibe, se est reduciendo. Aquel compuesto que se reduce al
aceptar lo electrones del otro; y por lo tanto permitir que dicho compuesto se oxide; suele
denominarse agente oxidante.

De hecho, no existe oxidacin de un compuesto si no se acompaa de la reduccin de
otro compuesto; y por ese motivo, mas que hablar de reacciones de oxidacin o
reduccin, se habla de reacciones redox. Obviamente lo mismo se aplica en el sentido
contrario Cuando un compuesto se reduce (acepta electrones) es porque otro se oxida
(cede electrones); y el compuesto que cede los electrones se denomina agente reductor
pues permite que otro se reduzca.

Sin embargo, rara vez la transferencia de electrones se produce directamente, desde el
compuesto que se oxida hacia el compuesto que se reduce. De hecho, dado que la gran
mayora de las reacciones es acelerada por enzimas, es de fundamental importancia la
existencia de coenzimas y grupos prostticos, que colaboran con ellas.

En lneas generales, podemos decir que estos compuestos son cofactores, que se encargan
de transferir electrones entre uno y otro compuesto.


1.3. COFACTORES (COENZIMAS Y GRUPOS PROSTETICOS)

Si partimos de que prcticamente todas las reacciones qumicas biolgicas estn
aceleradas por enzimas, y sabemos que en las reacciones redox hay transferencia de
electrones, podemos definir a los cofactores como molculas capaces de transportar
electrones desde un compuesto hacia otro, interactuando con las enzimas que
aceleran una reaccin qumica. Desde este punto de vista, la nica diferencia de
importancia entre una coenzima y un grupo prosttico es la afinidad de unin con la
enzima en cuestin:





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Las coenzimas se unen dbilmente a las enzimas, de las que pueden desprenderse
con facilidad, mientras que los grupos prostticos se unen fuertemente a las enzimas
(constituyendo una holoenzima) y rara vez se desprenden de la misma. En algunos
casos, la funcin de las coenzimas se extiende mas all, pudiendo transportar no solo
electrones, sino tambin pequeas molculas y/o grupos qumicos. En todos los casos, la
funcin de las coenzimas es de transporte. Sin embargo, suelen estar limitadas a un
compartimiento celular, debido a que no atraviezan las membranas con facilidad.

Las coenzimas mas importantes son:
Nicotinamida Adenina Di-nucleotido (NAD)
Nicotinamida Adenina Di-nucleotido fosfato (NADP)
Coenzima A (CoA-SH)

Los grupo prostticos mas importante son:
Flavina Adenina Di-nucleotido (FAD)
Flavina Mononucleosido (FMN)

En cuanto a la constitucin molcular de las coenzimas y los grupos prostticos, se
sintetizan a partir de 2 orgenes: 1) Una porcin nucleotdica (generalmente presentando
la base nitrogenada adenina), sntetizada en el citoplasma celular a travs de la va de la
sntesis de purinas y; 2) una porcin vitamnica (generalmente derivada de vitaminas del
grupo B), incorporada a travs de la dieta y activadas intracelularmente. La porcin
nucletidica de estos cofactores sera la responsable de que no atraviesen las membranas
con facilidad.

Para ejemplificar mejor como funcionan los cofactores, tomaremos una reaccin de
oxidacin Supongamos que el compuesto A se oxida para transformarse en un
compuesto B (A B). Cuando el compuesto A se transforma en B pierde electrones
acelerado por una enzima. Estos electrones son captados por una coenzima o un grupo
prosttico que colabora con al enzima. En este momento, podemos afirmar que
mientras el compuesto A se oxid (perdio electrones), el cofactor se redujo, pues acept
los electrones que fueron desprendidos del compuesto A. El cofactor en este momento se
encuentra en estado reducido; y est listo para transferir estos electrones a otro
compuesto. Cuando esto ltimo ocurra, diremos que el cofactor se ha re-oxidado.

Los 3 estados del hidrogeno

Realizaremos aqu un esquema
de los 3 estados en los que
podemos hallar al hidrogeno que
ser discutido en clase.







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1.4 NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDO (NAD
+
/NADH)

El NAD es una coenzima constituida por:

una vitamina, la niacina (B3), que se activa intracelularmente a nicotinamida
(una base nitrogenada del estilo de las pirimidinas); y se une a una ribosa y un
fosfato para formar nicotinamida-ribosil-monofosfato (otro nucletido en
definitiva).













+un nucletido de adenosina monofosfato (AMP)

Esta molcula puede encontrarse en dos estados:
Oxidada (NAD
+
) Su centro reactivo, representado por la nicotinamida est
cargado positivamente.
Reducida (NADH) Su centro reactivo se encuentra neutro, gracias a la
incorporacin de un ion hidruro (H
-
). Cabe remarcar que el ion hidruro est
constituido por un hidrgeno con un electrn de ms, estando formado por un
protn y dos electrones.












Cuando una molcula (A) se oxida en presencia de la coenzima NAD
+
, le cede a la
misma dos electrones en forma de hidruro. Por lo tanto, mientras la molcula (A) se
oxida para transformarse en (B), la coenzima NAD
+
, se reduce para transformarse
en NADH

A + NAD
+
B + NADH + H
+


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En este contexto podemos considerar que (A) es un compuesto inicialmente reducido, que
se transformar en (B), un compuesto finalmente oxidado. Por el contrario, NAD
+
es un
compuesto originalmente oxidado, que se transformar en NADH, un compuesto
finalmente reducido. Dado que la presencia de NAD
+
es necesaria para que (A) pueda
oxidarse, decimos que el NAD
+
es un agente oxidante. De hecho, todas las coenzimas
oxidadas son agentes oxidantes, mientras que todas las coenzimas reducidas son
agentes reductores.



En la clase detallaremos el mecanismo molecular por el cual acta la nicotinamida
adenina di-nucleotido. Remarcamos que es muy comn su utilizacin, para la oxidacin
de alcoholes, que finalmente se transforman en carbonilos, luego en carboxilos y por
ltimo en CO2.

Existe una variante del NAD+, denominada NADP+ (nicotinamida adenina dinucleotido
fosfato), cuya nica diferencia estructural con el NAD es la existencia de un grupo fosfato
anexado a la posicin 2 de la ribosa; y a diferencia del NAD no suele estar vinculado a
una forma tangible de energa.


1.5. FLAVINA ADENINA DINUCLEOSIDO (FAD / FADH
2
)

La flavina adenina dinucleosido se encuentra constituida por:
una vitamina, la flavina (B2) que ya viene con una ribosa, y se le agrega un fosfato
para activarla a flavina-ribosil-monofosfato. Dentro de la flavina, se destaca el
centro reactivo, denominado como anillo de isoaloxacina.
un nucleotido de adenina monofosfato (AMP)






















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Esta molcula puede encontrarse en 2 estados:
Oxidada (FAD) el centro reactivo representado por la isoaloxacina de la flavina
se encuentra con 2 dobles enlaces N=C y est preparado para captar dos tomos
de Hidrogeno.
Reducida (FADH2) el centro reactivo captur 2 hidrogenos y redistribuy sus
electrones, quedando solo 1 doble ligadura C=C.













En este contexto, cuando una molcula (A) se oxida en presencia de FAD, cede 2
electrones en forma de hidrgenos. El FAD, que capta esos dos hidrgenos (cada uno
con 1 electrn y 1 protn) se transforma en FADH2. El FAD, por ser un grupo
prosttico oxidado, se comporta como un agente oxidante que acta sobre la
molcula (A).

En la clase explicamos el mecanismo molecular por el cual acta el FAD.

Este tipo de mecanismo de oxidacin es muy comn que se utilice sobre compuestos que
presentan cadenas hidrocarbonadas (-CH2-CH2-). Como consecuencia, el compuesto que
resulta oxidado forma un enoil con una conformacin con dobles ligaduras (-CH=CH-
), lo que en definitiva representa otra variante de oxidacin: la quita de hidrgenos.

Existe una variante del FAD, denominada flavina mononucleotido (FMN), que carece
del nucleotido de AMP, estando constituida exclusivamente por flavina-ribosil-fosfato; y
generalmente se une a protenas.

Similitudes y diferencias entre NAD y FAD

Ambos son cofactores, capaces de aceptar y ceder 2
electrones (reacciones reversibles). Sin embargo, el FAD
puede captar y ceder electrones individuales, provenientes
de 2 tomos diferentes, mientras que el NAD no puede.
Ambos interaccionan con la enzima, pero el FAD se une
tan fuertemente a las enzimas, que de hecho, forma parte
de la estructura de la misma. En cambio, el NAD entra y
sale de las enzimas con facilidad, encontrndose libre en
solucin. Esto le permite transportar electrones a lugares
mas alejados, e inclusive actuar como regulador de la
funcin celular.

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Algunos autores consideran por estos motivos que NAD
+
/NADH pueden ser
considerados como sustratos y productos de una reaccin enzimtica, a pesar de que
tradicionalmente los cofactores son considerados de manera diferente (para mas
detalles ver cintica enzimtica).

1.6. COENZIMA A

La coenzima A tiene una estructura un poco diferente a las anteriores. Est
constituida por:
Adenosina difosfato (ADP)
cido pantotnico derivado vitamnico del grupo B.
Beta-mercaptoetil-amina que presenta el centro reactivo SH (tiol o
sulfhidrilo).


La coenzima A no es transportador de electrones, sino mas bien de grupos qumicos.
Bsicamente, se la puede considerar como un transportador de grupos acetilos o acilos,
cuya estructura original deriva del cido actico (CH3-COOH).

En clase se esquematiza el mecanismo molecular por el cual, la coenzima A puede captar
o ceder grupos acetilos o acilos:


ANTES DE CONTINUAR CON LOS TEMAS SIGUIENTES, ASEGURATE
DE HABER ENTENDIDO BIEN LOS CONCEPTOS FUNDAMENTALES
QUE EXPLICAMOS HASTA ESTE PUNTO DEL APUNTE



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2.1. DESCARBOXILACION OXIDATIVA


El piruvato es un -ceto-acido de 3C (con un carboxilo, una cetona y un metilo)
que se obtiene: 1) Principalmente de la glucosa a travs de la glucolisis en
condiciones aerbicas; 2) de la transaminacin o reacomodacin de ciertos
aminocidos (principalmente alanina) o; 3) a partir del cido lctico (lactato) que
en condiciones normales proviene del glbulo rojo o del msculo en ejercicio
intenso. Los 3 procesos mencionados son citosolicos y forman el piruvato en el
citoplasma. Para ingresar a la matriz mitocondrial, utilizar un mecanismo
de cotransporte con protones (H
+
) ubicado en la membrana mitocondrial
interna (MMI).

La descarboxilacin oxidativa implica, como su nombre lo indica, la oxidacin y prdida
del grupo carboxilo del cido pirvico (piruvato) en la matriz mitocondrial. Esta
reaccin es catalizada por un complejo multienzimtico, donde existen 3 sitios catalticos
y diversos sitios reguladores que forman parte de la misma protena, llamada comnmente
como complejo de la piruvato deshidrogenasa. Diversos cofactores y derivados
vitamnicos interactan con la enzima, para permitir su normal funcionamiento. Pero ms
importante an, son los diferentes compuestos que pueden regular la actividad del
complejo enzimtico. Esto se debe a que quizs, el producto mas importante de la
descarboxilacin oxidativa, es la formacin de molculas de acetil-coA a partir de
piruvato. La acetil-coA es capaz de ingresar al ciclo de Krebs para oxidar los 2 carbonos
del grupo acetilo; y por ese motivo, la regulacin del complejo piruvato
deshidrogenasa (CPDH) y la formacin de acetil-coA constituyen la llave de entrada
al ciclo de Krebs.

A continuacin se esquematiza el balance global de la reaccin:


(irreversible)
PIRUVATO + CoA + NAD ACETIL-CoA +NADH+CO2
(3C) (2C)
(se redujo) CPDH (se oxid)

Experimentos donde se marcan radioactivamente o de otra manera los carbonos del
grupo acetilo del acetil-CoA demuestran que estos jams se convierten en piruvato,
lo que demuestra la irreversibilidad de la reaccin.

El detalle de la transformacin molecular sera el siguiente.
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La unin
entre la
coenzima A y
el grupo
acetilo
consiste en un
enlace
tioester.
Mencionemos
que existen otras vas en la mitocondria a partir de las cuales se puede obtener acetil-
coA: 1) La beta-oxidacin (o degradacin) de cidos grasos y; 2) La degradacin de
cuerpos cetnicos.

Sin embargo, dado que la descarboxilacin oxidativa posee el carcter de
irreversible (G muy negativo en condiciones biolgicas), el acetil CoA que no
puede convertirse en piruvato - no es glucognico (el piruvato es el principal
precursor de la glucosa en estado de ayuno, principalmente a nivel del hgado,
justamente cuando la glucolisis est inhibida en este rgano).


2.2. COMPLEJ O DE LA PIRUVATO DESHIDROGENASA

Se encuentra formado por 3 enzimas: (E1) Piruvato deshidrogenasa
propiamente dicha; (E2) Dihidrolipoil-transacetilasa y; (E3) Dihidrolipoil-
deshidrogenasa.

Con este complejo interactan 5 cofactores diferentes:
- pirofosfato de tiamina (PPT)
- cido lipoico (lipoamida)
- Flavina adenina dinucleotido (FAD)
- coenzima-A (CoA-SH)
- Nicotinamida adenina dinucleotido (NAD)

Dentro de estos cofactores, es fundamental remarcar la importancia de la lipoamida, pues
tiene la capacidad de oxidarse formando puentes di-sulfuro; y reducirse captando
electrones y protones:

S SH

+2e- +2 H+ =
S SH
(oxidada) (reducida)

La estructura que tiene el puente disulfuro esta unida a un ainoacido lisina de la parte
proteica de la enzima.

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Las enzimas del complejo piruvato deshidrogenasa y los cofactores se relacionan de la
siguiente manera, teniendo cada una de las enzimas un grupo prosttico propio, mas 2
coenzimas que actan de manera externa.

E1- Piruvato deshidrogenasa (PDH) Pirofosfato de tiamina (PPT)
E2- Dihidrolipoil transacetilasa Acido lipoico o lipoamida
E3- Dihidrolipoil deshidrogenasa FAD (flavina)
CoA
NAD+ Trabajan solas

El veneno arsenito (ASO2) bloquea la descarboxilacin oxidativa al unirse a la forma
reducida de la lipoamida. Solo 4 de los 5 elementos tienen vitamina Cules son?

2.3. REGULACIN DEL COMPLEJ O

Existen distintas formas de regular al complejo piruvato deshidrogenasa:

1) Alosterica: actuando en un lugar diferente del sitio activo.

Los altos niveles de ATP, Acetil-coA y NADH los que inhiben alostericamente a la PDH,
especialmente cuando los niveles de cidos grasos de cadena larga estn aumentados. El
AMP, la coA y el NAD+son estimuladores alostricos del complejo.

La formacin de Acetil CoA est coordinada con la velocidad de utilizacin de ATP.
Cuando la relacin ATP/ADP es baja; o lo que es lo mismo, la relacin ADP/ATP es
alta. Se estimula al complejo piruvato deshidrogenasa.
Cuando la relacin NADH/NAD es baja; o lo que es lo mismo, la relacin
NAD/NADH es alta Se estimula al complejo piruvato deshidrogenasa.


2) Covalente: por fosforilacin y defosforilacin.

Existe un segundo sistema de regulacin covalente El complejo de la Piruvato DHG existe
en dos formas: activa (desfosforilada) o inactiva (fosforilada). La inactivacin est
catalizada por una proteina quinasa llamada PDH quinasa ATP-Mg++ dependiente,
que se encuentra fuertemente unida al complejo. El ATP es un fuerte activador de la
kinasa, que inactiva al complejo PDH para que fosforile a la E1. La reactivacin del
complejo est catalizada por una fosfoprotena fosfatasa (PDH fosfatasa) que
desfosforila al complejo y es dependiente de Mg++ y Ca++. Ni la PDH quinasa ni la
PDH fosfatasa requieren AMPc, por lo que pueden considerarse AMPc independientes.

PDH quinasa (fosforila con gasto de ATP)

PDH

PDH fosfatasa (defosforila)



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(-) CPDH
(+) CPDH
ATP (+) PDH Kinasa


ADP AMP (-) PDH quinasa
Ca++ (+) PDH fosfatasa


La regulacin es totalmente lgica. Cuando una clula tiene bajas cantidades de ATP
y de NADH, necesita degradar combustibles para obtener energa; y esto puede lograrse
con la formacin de acetil-CoA para que ingrese a la fase final de la degradacin: el ciclo
de Krebs.

Bueno, comentamos con anterioridad que el complejo de la piruvato deshidrogenasa
estaba constituido por 3 enzimas y diversos cofactores que interactuaban con ella.
Desarrollaremos en extensin la constitucin y el mecanismo molecular por el cual acta
este complejo:

2.4. CICLO DE LA LIPOAMIDA o del ACIDO LIPOICO
(Mecanismo molecular del complejo deshidrogenasa)


El detalle que esta simplificado es este esquema ser analizado en clase. Concluiremos
que por cada piruvato se obtiene un acetil-coA y un NADH que contiene unido electrones
de alta energa. El acetil-coA tiene como principal destino el ciclo de Krebs. Dado que la
fuente principal del piruvato (3C) es la glucosa (6C), por cada glucosa se obtienen 2
piruvatos. Pero como este se descarboxila, generalmente terminamos obteniendo: 2
Acetil-Coa (de 2C +la CoA) cada uno; y 2 NADH (siempre que estemos considerando a
la glucosa como el combustible original, la cual a su vez ya genero 2 NADH y 2 ATP
adicionales en el citoplasma).

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