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CONCLUSES Urge uma extensa reviso das legislaes pertinentes aos animais no-humanos, visando integrao das leis em um corpo jurdico robustamente embasado, coerente e inequvoco, assim como a definio de protocolos claros, viveis (inclusive economicamente) e eticamente aceitveis de procedimentos com animais em geral, incluindo no apenas os ditos de laboratrio, mas tambm aqueles sujeitos a controle, explorao econmica e lazer, dentro de princpios gerais de bem-estar estabelecidos com base em estudos cientficos. igualmente necessria uma profunda mudana na cultura da relao com os animais, racional, coerente e desvinculada de vises antropocntricas. Isto pode ser implementado no mbito da educao ambiental, dentro do objetivo de descartar, entre outros, a noo de que animais podem ser nocivos, feios, intrinsecamente perigosos, ou mesmo objetos para nosso prazer em atividades como a caa e pesca esportivas. A defesa, manejo e conservao dos animais dependem fundamentalmente de decises racionais, bem embasadas e despidas de qualquer vis emocional, e o respeito s diferentes formas de vida que compartilham esse tempo e espaos com o ser humano devem nortear essa relao. Dentro de sua grande diversidade de formas, os animais so, cada qual dentro de seu nvel de organizao, seres maravilhosos, complexos, sensveis e, pelo menos entre os vertebrados, sencientes do bem-estar em todas suas manifestaes.
Eleonora Trajano professora titular do Departamento de Zoologia e coordenadora da Comisso de tica em Uso de Animais Vertebrados em Experimentao, Instituto de Biocincias da USP. Luis Fbio Silveira professor do Departamento de Zoologia do Instituto de Biocincias da USP e curador associado da Coleo de Aves do Museu de Zoologia da USP.

MTODOS ALTERNATIVOS UTILIZAO DE ANIMAIS EM PESQUISA CIENTFICA: MITO OU REALIDADE?

Marcelo M. Morales
INTRODUO A utilizao de animais em pesquisas cientficas, principalmente de mamferos, tem trazido discusses acaloradas por parte de ativistas que so simplesmente contra essa prtica. Parte dos argumentos levantados por esse setor da sociedade baseada no fato de que mtodos alternativos so capazes de substituir a utilizao desses animais em pesquisa, prtica que consideram obsoleta. Ser que esse argumento realmente procede? At que ponto a sociedade est disposta a abrir mo do uso de animais em pesquisa com o risco de bloquear o avano do conhecimento biolgico, testes e desenvolvimento de novos medicamentos, vacinas e mtodos cirrgicos? Diferente do que muitos imaginam, o interesse por mtodos alternativos cresce dentro da prpria comunidade cientfica na tentativa de diminuir o nmero de animais utilizados em experimentao e tambm reduzir o custo dos experimentos, pois animais utilizados em pesquisa precisam ser acondicionados, alimentados e mantidos nas melhores condies de sade e higiene possvel, caso contrrio no podem ser utilizados para propsitos cientficos (1). importante salientar que o termo mtodos alternativos tem causado grande confuso, pois nos leva a acreditar que a cincia pode deixar de utilizar animais e substitu-los, em grande parte dos experimentos, por outros mtodos. Na verdade, existem pouqussimos casos onde simulaes computacionais, experimentos in vitro e outros mtodos so capazes de substituir completamente o uso de animais. O conceito de mtodos alternativos deveria ser compreendido em um contexto mais amplo considerando, inclusive, os esforos que so realizados pela comunidade cientfica mundial para diminuir o uso de animais para um nmero mnimo possvel. Alm disso, o refinamento das tcnicas utilizadas com animais, que proporcionariam a minimizao do possvel sofrimento ou dor, tambm deveriam contribuir para ampliar esse conceito (2, 3). Na mesma linha poderamos considerar como mtodo alternativo a substituio de mamferos por outras espcies (anfbios, rpteis, bactrias, leveduras, vrus, etc). Todavia, o que est na verdade em questo se as tcnicas in vitro e simulaes computacionais realmente podem substituir o uso de animais em pesquisa e prover resultados relevantes e efetivos para melhoria da sade humana e de outros animais. Estudos de molculas e clulas certamente trazem novos conhecimentos, mas, isoladamente, esto longe de trazer a compreenso do funcionamento de organismos complexos como o dos mamferos, onde est includa a espcie humana.
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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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natural que semelhanas entre o funcionamento do organismo descoberta de uma substncia que se ligava fortemente aos receptodos mamferos os faam candidatos para as pesquisas aplicadas res de acetilcolina, outros pesquisadores puderam obter grandes sade humana. Roedores (ratos, camundongos, cobaias, e hamsters) quantidades desse receptor a partir do peixe eltrico, o que permitiu tm sido priorizados devido ao seu pequeno tamanho e tambm que fosse estudada a sua seqncia de aminocidos, a sua estrutura pelo fato de se reproduzirem rapidamente, mas sua utilizao o molecular, bem como a forma que esse receptor responde a ao da alvo principal de ativistas, apesar de terem sido, e continuarem acetilcolina (5). Em seguida, na tentativa de fazer anticorpos contra sendo, fundamentais para o avano da cincia (4). Analisemos os o receptor de acetilcolina, pesquisadores injetaram essa protena em 135 ganhadores do Prmio Nobel em fisiologia ou medicina entre coelhos. Inesperadamente, esses coelhos desenvolveram um quadro 1901-1984, onde a maior parte dos organismos utilizados em suas parecido com a miastenia grave, o que levou ao entendimento de que pesquisas eram mamferos. Dentre os trabalhos dos laureados desse essa uma doena auto-imune (onde o organismo forma anticorpos perodo, 45 envolviam vertebrados de sangue quente, 17 trabalhos contra protena do seu prprio corpo). citavam a utilizao de seres humanos, 25 combinavam vrios orgaAssim, para o entendimento da miastenia grave humana houve o nismos, incluindo mamferos, invertebrados e cultura de clulas. envolvimento de msculos de sapos, sinapses de roedores, toxina de At mesmo plantas foram utilizadas como modelo mostrando, de serpente, receptor de peixe eltrico e anticorpos de coelhos. Certaforma clara, a contribuio de uma srie de organismos para o desenmente, para que possamos chegar cura dessa doena, muitos outros volvimento da pesquisa cientfica na rea biolgica. Em 2007, o Probstculos devero ser ultrapassados e, necessariamente, necessitamio Nobel de medicina e fisiologia foi entregue a trs cientistas remos do auxlio de mamferos em experimentaes. (Mario R. Capecchi, Martin J. Evans e Oliver Smithies) que revoluCertamente mtodos alternativos devem ser utilizados sempre que cionaram as pesquisas com doenas genticas ao contriburem para possvel e a busca dessas metodologias precisa ser um dos alvos da o desenvolvimento de animais com modificaes cincia moderna. Abaixo, relacionaremos algumas em genes especficos que so capazes de apresentar das principais alternativas utilizao de mamfeas mesmas doenas genticas encontradas em seres ros em pesquisas cientficas e como elas puderam e humanos (animais nocaute). Essa metodologia podem contribuir para o avano cientfico. MTODOS possibilitou o desenvolvimento de animais que so ALTERNATIVOS EXEMPLOS DE MTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE utilizados para o estudo de diversas patologias, DEVEM SER MAMFEROS EM PESQUISA CIENTFICA incluindo arteriosclerose, fibrose cstica, doenas UTILIZADOS cardiovasculares e cncer. VERTEBRADOS Diferentes tcnicas e a utilizao de vrias espcies SEMPRE QUE Peixes, anfbios, rpteis e pssaros so bastante prde animais so importantes para a construo do POSSVEL ximos aos mamferos. A maioria das propriedades conhecimento biolgico que leva melhoria da das transmisses qumicas em clulas nervosas foi sade humana e de outros animais. Um exemplo obtida atravs do estudo das junes neuro-muscudisso est na histria de como os pesquisadores lares (a sinapse entre o nervo e o msculo esqueltico) de sapos. O entenderam as bases da doena miastenia grave (uma doena neurodesenvolvimento embrionrio tambm mantm muitas similaridamuscular que causa fraqueza, fadiga e paralisia dos msculos volundes entre a classe vertebrada. Assim sendo, esses animais podem sertrios, podendo ameaar a vida quando atinge, principalmente, os vir de modelos para entender o que ocorre em mamferos. msculos da deglutio e da respirao) (5). Talvez o primeiro estudo relacionado com essa doena tenha vindo dos estudos de INVERTEBRADOS Claude Bernard que estudou, em sapos, a ao do curare (que causa Entre os invertebrados, os insetos so os representantes majoritrios. a paralisia dos msculos) (6). Em estudos posteriores, pesquisadores O grande nmero de pesquisas realizadas a partir do uso dessas espmostraram que pacientes com miastenia grave, quando tinham seus cies culminou, e ainda contribui, no entendimento de mecanismos nervos estimulados, no respondiam. Nesse momento foi cogitada biolgicos existentes em quase todos os seres vivos. Por exemplo, a possibilidade de terem sido envenenados pelo curare, a mesma estudos sobre a pigmentao dos olhos da Drosophila (mosca da substncia estudada por Claude Bernard. Quinze anos mais tarde, banana) levaram hiptese de que cada gene controla uma nica todavia, pesquisadores demonstraram, em vrios modelos animais, enzima, um conceito fundamental da biologia molecular (8). Outro que a transmisso de sinais entre o nervo e o msculo era realizada exemplo o caso dos estudos realizados em axnios de lulas que propor uma substncia denominada acetilcolina. Tambm foi descoporcionaram as bases do conceito da participao de ons durante o berto que a acetilcolina agia em molculas receptoras (receptores) potencial de ao na transmisso dos impulsos eltricos nervosos (9). localizadas no msculo, mais precisamente no local onde o nervo terminava (7). Estudos mostraram, logo em seguida, que o curare MICROORGANISMOS bloqueava a ao da acetilcolina e diminua a sua efetividade. Mais Geralmente os microorganismos, tais como bactrias e leveduras, tarde, em Taiwan, dois qumicos isolaram uma poderosa toxina proso aceitos como modelos para estudo de metabolismo, gentica e vinda de veneno de serpentes que tem o poder de paralisar um anibioqumica. Como exemplo mais comum da utilizao desse mal, ligando-se fortemente aos receptores de acetilcolina. Com a
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recurso podemos citar os fundamentos dos mecanismos de expresso gnica desses organismos que so aplicveis para compreenso do desenvolvimento normal e patolgico de embries humanos. Alguns estudos mostram que algumas semelhanas so preservadas entre esses microorganismos e mamferos. Leveduras, por exemplo, possuem receptores de estrognio que apresentam afinidade idntica aos encontrados em tero de ratas. Esses dados mostram que esses seres podem ser utilizados como modelos, mas no substituem totalmente os mamferos (10). Por outro lado, o entendimento do mecanismo de funcionamento de outro microorganismo, o vrus, pode ser utilizado em benefcio da sade humana. A terapia gentica utiliza o vrus como veculo para transportar genes normais para clulas de tecidos acometidos por doenas genticas. Quando o vrus (modificado para que no cause doena) infecta a clula hospedeira transfere o gene que os pesquisadores inseriram no seu genoma, fazendo com que a clula do hospedeiro expresse o gene de interesse. CULTURA DE CLULAS E TECIDOS Cultura de clulas e tambm de tecidos so utilizados, principalmente, em pesquisa bsica aplicada. Como exemplo podemos citar estudos sobre a ao de quimioterpicos sobre a viabilidade de clulas cancergenas. Esses experimentos so a base para saber se uma droga tem o potencial de eliminar clulas cancergenas. Testes de toxicidade de algumas substncias tambm podem ser realizados em cultivo de clulas. Esses ensaios do suporte, por exemplo, para o conhecimento se uma droga ou substncia recm descoberta txica para clulas de nosso organismo (11). Clulas em cultura so fceis de serem manipuladas e observadas do ponto de vista microscpio, bioqumico e molecular, aps a adio de substncias no meio onde esto sendo cultivadas. Todavia, essa mesma substncia testada nas clulas deve ter seu comportamento estudado quando aplicada em um organismo vivo (em animais de experimentao principalmente mamferos), pois, in vivo, vrios fatores do prprio organismo podem interferir nos resultados. De qualquer forma, os estudos prvios in vitro auxiliam na reduo do nmero de animais utilizados nas pesquisas. Um exemplo concreto da utilizao de tecidos humanos na pesquisa a glndula hipfise (pituitria). Essas glndulas, provenientes de doadores cadveres, eram utilizadas para extrao do hormnio do crescimento para ser oferecido no tratamento de crianas com deficincia na produo desse hormnio. Essa prtica caiu em desuso aps a constatao de contaminao de algumas crianas com doenas infecciosas provenientes do doador (12). A bioengenharia utilizando a bactria Escherichia coli tornou a produo desse hormnio mais eficiente sem o risco de contaminaes provindas dos doadores. Tecidos coletados de bipsias de mama, por outro lado, podem ser utilizados, por exemplo para estudar o desenvolvimento de cncer desse rgo. Clulas derivadas de tecidos de outros rgos podem ser utilizadas para os mais diferentes propsitos cientficos. SISTEMAS IN VITRO E MODELOS MATEMTICOS Experimentos in vitro so apropriados para algumas reas da cincia biolgica. Por exemplo, vrios estudos sobre o metabolismo inter35

medirio utilizam a bioqumica para o estudar a dinmica de reaes enzimticas que ocorrem em nosso sistema biolgico. J os modelos matemticos podem contribuir para o trabalho experimental atravs da definio de variveis e testando teorias, reduzindo o custo desses experimentos e os tornando mais eficazes. Um exemplo disso a predio, atravs de modelos matemticos, da estrutura de protenas, que poderiam prever suas propriedades fsicas e qumicas (13). Testes de irritabilidade poderiam ser beneficiados por esses estudos, todavia, apesar de contribuir para a diminuio do nmero de animais utilizados, essa metodologia no dispensaria o teste final em animais ou substituto biolgico (ovos fertilizados de galinha ou cultura de clulas). sempre preciso lembrar que computadores processam e armazenam conhecimentos j existentes e muitos deles foram adquiridos com a utilizao de animais na pesquisa. EXEMPLOS DE MTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE ANIMAIS EM TESTE OU EM USO 1) TESTE DE IRRITABILIDADE No passado, os testes de irritabilidade de substncias eram comumente realizados diretamente aplicando a substncia sobre a crnea de coelho (ensaio de Draize) (14). Vrios testes foram desenvolvidos para substituir essa prtica e alguns so indicados abaixo (15). Teste da membrana corio alantide: utiliza ovos de galinha fertilizados para avaliar a irritabilidade da membrana corion alantide, que possui uma grande quantidade de vasos sanguneos (16). Teste de hemlise: nesse teste so avaliados os fenmenos de hemlise e desnaturao protica, decorrentes da ao da substnciateste (17). Teste de opacidade de crnea bovina: onde so testadas a opacidade e permeablidade de crnea provinda de olhos de bovinos (que seriam descartados), aps a exposio substncia a ser testada. Teste em olhos isolados de coelhos ou galinha: em olhos isolados de animais mortos (que seriam descartados) so testadas, aps a exposio substncia teste, o edema e opacidade da crnea bem como a reteno de fluorescncia. Teste de viabilidade celular: substncias so adicionadas aos meios de cultura de clulas especficas (MDCK, 3T3-L1, SIRC) e so testados alguns parmetros de sua viabilidade (danos em suas membranas ou em suas junes, por exemplo). 2) TESTE DE TOXICIDADE Culturas de clulas de diversos tecidos podem ser utilizadas e nelas podem ser realizados testes de toxicidade de vrias substncias. A viabilidade celular bem como danos em sua estrutura so utilizados como parmetros de anlise dessa toxicidade. O teste de toxicidade durante o desenvolvimento e reproduo podem ser realizados em embries de galinha, peixe e anfbios e essa metodologia mostrou ser bastante importante (11). Todavia, como podemos concluir, nenhum teste in vitro pode ainda substituir, nesse caso o teste em animais.

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CONCLUSES Como pudemos observar nesta discusso, apesar dos esforos despendidos para encontrar mtodos alternativos ao uso de animais, poucos avanos foram obtidos para que fosse possvel excluir essa prtica na pesquisa cientfica. Apesar de continuarmos perseguindo esse objetivo, em um futuro mais prximo, a meta mais realista seria reduzir o nmero de animais utilizados em propsitos cientficos associando diferentes tcnicas s alternativas j existentes e, sempre que possvel, refinar as tcnicas para que o desconforto seja reduzido ao mnimo. O mais sensato, portanto, admitir que existem mtodos complementares, mas que no podem ser considerados substitutivos.
Marcelo M. Morales professor associado do Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) e presidente da Sociedade Brasileira de Biofsica. 14. Draize, J. H.; Woodard, G.; Calvery, O. H. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J. Pharm. Expt. Ther., v. 83, pp. 377-390. 1944. 15. Bradlaw, J. A.; Wilcox, N. L. Workshop on eye irritation testing: practical applications of non-whole animal alternatives. Food Chemical Toxicology, v. 35: 1-11. 1997. 16. Luepke, N.P. Hens egg chorioallantoic membrane test for irritation potential. Food Chemical Toxicology, vol. 23: 287-291. 1985. 17. Wolfgang, J. W. P.; Pfannenbecker, U.; Hoppe, U. Validation of red blood cell test system as in vitro assay for the rapid screening of irritation potencial of surfactants. Molecular Toxicology, v. 1, pp. 525536, 1987.

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