BIOCHIMISMUL FERMENTAIEI ALCOOLICE Procesul de fermentaie alcoolic nu se poate desfura fr consum de enrgie, dar pentru a se obine energie este

necesar s se fac mai nti un consum de energie. Moleculele de hexoze (glucoz sau fructoz) sunt metabolizate n celula de levuri, numai dup ce au fost activate. Activarea se refer de fapt la fosforilarea lor, cu participarea compusului macroergic ATP, proces catalizat de enzime specifice. Activarea glucidelor este catalizat de hexokinaz (glucokinaz, fructokinaz). n esen, activarea const n formarea unei serii de esteri ai glucozei i fructozei, care, n anumite condiii, se transform succesiv unii n alii prin izomerizare, fenomen biocatalizat de izomeraze. Reaciile de activare sau fosforilare a glucidelor, constituie stadiul de pregtire a eliberrii energiei din moleculele acestora. n stadiul de activare sau identificat patru esteri ai celor dou hexoze i anume: esterul glucozo-1-fosfat sau esterul Cori; esterul glucozo-6-fosfat sau esterul Robinson; esterul fructozo-6-fosfat sau esterul Neuberg (sub aciunea izomerazei poate fi transformat n ester Robinson); esterul fructozo-1, 6-difosfat sau esterul Harden-Young. Dup activarea hexozelor, care reprezint etapa I-a urmeaz o serie de reacii, grupate n alte patru etape i anume: Scindarea esterului Harden-Young cu formarea a dou trioze (aldehida fosfogliceric i fosfodihidroxiacetona). Oxidarea prin dehidrogenare a unei trioze, cu formarea acidului piruvic. Decarboxilarea acidului piruvic cu formarea aldehidei acetice i eliminarea CO2. Reducerea, prin hidrogenare, a aldehidei acetice cu formarea alcoolului etilic. Etapa I Activarea hexozelor i degradarea lor n dou trioze

Glucoz

Esterul glucozo1fosfat Esterul Cori

Glucoz Esterul glucozo6fosfat Esterul Robinson

Fructoza

Esterul fructozo6fosfat Esterul Neuberg

Esterul Neuberg

Esterul Robinson

Esterul fructozo6fosfat

Esterul fructozo 1,6 difosfat Esterul Harden Young

Esterul Harden Young

Glicerinaldehid 3 fosfat

Etapa a II-a Oxidarea prin dehidrogenare a glicerinaldehidei -3-fosfat

Etapa a III-a Transformarea acidului 3-fosfogliceric n acid piruvic

n mod spontan acidul enolpiruvic se transform n acid piruvic i invers.

Etapa a IV-a Decarboxilarea acidului piruvic i obinerea primului produs principal al fermentaiei alcoolice CO2

Etapa a V-a Reducerea acetaldehidei cu formare de alcool etilic

n desfurarea lungului lan de reacii specifice fermentaiei , cteva precizri se impun: - Dup formarea triozelor, sub aciunea enzimei fosfat-trioz-izomeraza acestea sunt izomerizate, crendu-se un astfel de echilibru nct fosfodihidroxiacetona ocup o proporie de 96,5 %, fa de numai 3,5 % ct reprezint aldehida fosfogliceric. - Caracterul de oxido-reducere biologic al fermentaiei, rezid din faptul c n etapa a doua are loc oxidarea, iar n etapa a patra are loc reducerea, ambele laturi fiind determinate de una i aceeai enzim i anume codehidraza (dehidrogenaza). - Primul mare produs al fermentaiei alcoolice este CO 2 rezultat n etapa a treia. Acesta se elimin din mediul de fermentare producnd tumultul sau "fierberea" mustului. - ntr-o subetap a etapei a doua, se reface compusul macroergic ATP prin adiia la ADP a acidului fosforic, "nmagazinnd" energia pe care o furnizeaz apoi altor molecule de hexoze pentru activare. Formarea unor produi secundari ai fermentaiei alcoolice n timpul fermentaiei, n afar de produii principali (CO 2 i alcoolul etilic) se mai formeaz i ali constitueni cum sunt: glicerolul, aldehida acetic, acidul acetic, acidul lactic, acidul succinic, acetoina, 2,3 butilen-glicolul .a. considerai a fi produi secundari. Formarea glicerolului decurge din necesitatea obinerii energiei de ctre levuri, n primele faze ale procesului de metabolizare a glucidelor, cnd n mediu nu exist aldehid acetic, constituentul care asigur n ultima etap acceptarea de hidrogen i, de fapt, desfurarea ntregului lan de reacii ale catenei respiratorii. La nceputul fermentaiei alcoolice, neexistnd aldehid acetic intr n reacie cealalt trioz fosfodihidroxiacetona, care joac ea rolul acceptorului de hidrogen. Mecanismul biochimic este urmtorul:

Refacerea ATP nseamn asigurarea energiei de care levurile au nevoie. Aceste reacii se petrec pn cnd n mediu se formeaz aldehid acetic.

Transformarea hexozelor cu formare de glicerol poart numele de fermentaie glicero piruvic Neuberg, avndu-se n vedere c din glucidele fermentescibile rezult glicerol i acid piruvic. C6H12O6 CH2OHCHOHCH2OH + CH3COCOOH Aceast fermentaie Neuberg mai poart numele i de fermentaia a II-a sau secundar, dei prin logic se petrece naintea fermentaiei principale Gay - Lussac. n realitate, cele dou fermentaii (Gay - Lussac i Neuberg) se desfoar simultan. La nceput predomin fermentaia glicero-piruvic, iar apoi domin fermentaia Gay - Lussac, ambele soldndu-se cu eliberare de energie. Cunoaterea acestor aspecte poate atrage efecte de ordin practic i anume: dac n must se adiioneaz aldehida acetic, fermentaia glicero -piruvic este anulat i drept consecin nu se mai formeaz glicerol; dac aldehida acetic este blocat cu SO2, (cele dou substane formnd compusul foarte stabil - acidul aldehido-sulfuros), se formeaz cantiti mai mari de glicerol, ntruct levurile i procur energia pe canalul fermentaiei glicero-piruvice. n acest mod se explic proporiile mai mari de glicerol n vinurile obinute din musturile n care s -au administrat doze sporite de SO2. Formarea altor constitueni secundari ai fermentaiei alcoolice se leag mai ales de prezena n mediul de fermentare a aldehidei acetice nereduse. Pornind de la aceasta rezult: acid acetic, tioaldehide (care la rndul lor pot da tioalcooli mercaptanii), acetali, acetoin, 2,3 butilenglicol, aldehide superioare, acizi grai .a. Acidul acetic rezult mpreun cu alcoolul etilic din aldehida acetic:

Acidul succinic rezult din dou molecule de acid acetic:

Acetil-metil carbinolul sau acetoina rezult din dou molecule de aldehid acetic printr-o reacie de condensare:

 2,3 butilen-glicolul se formeaz din acetoin printr-o reacie de oxidoreducere.

Procesul complex al fermentaiei alcoolice este ilustrat n figura 7.1.

Influenta factorilor de crestere si supravietuire Celula levuriana Influenta factorilor fizici, chimici, biologici

Hexoze Constituenti azotati Vitamine Enzime

Alcooli Acizi ficsi si volatili Esteri Aldehide

Saruri minerale MUST s.a.

Aminoacizi s.a. VIN

- Polifenoli - Ozide - Acizi - Pentoze

Fig. 7.1 Schema general a fermentaiei alcoolice

Transformarea mustului n vin prin fermentaie alcoolic nu se desfoar n mod uniform. Ea parcurge trei faze: faza prefermentativ, faza de fermentaie tumultuoas, faza postfermentativ (lent). Faza prefermentativ se desfoar de la introducerea mustului n recipient pn la nceperea eliminrii CO2. Se caracterizeaz prin tulburarea mustului, creterea lent a temperaturii, pn la 17-180C, nceperea scderii coninutului n glucide i implicit a densitii, eliminare slab de CO2. Dup 1, 2, 3 zile la suprafaa mustului apare spum (format de CO2 care prsete mediul de fermentare). Levurile se nmulesc intens prin nmugurire. La un milion cel./ml mustul este vdit tulbure. Numrul maxim de celule se situeaz ntre 50 i 100 milioane/ml. n aceast faz a fermentaiei levurile desfoar cu precdere metabolismul de tip respirator:

C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O + 673 kcal/mol

Levurile au nevoie de mult energie pentru fortificarea sistemelor enzimatice, pentru nmulire i pentru sintetizarea factorilor de supravieuire. Oxigenul n aceast faz este preluat din must i din golul de fermentaie. Un aport de aer se poate aduce i prin remontri periodice, operaiuni recomandate n vinificaia modern. Faza de fermentaie tumultuoas corespunde etapei de deceleraie a populaiei (scderea ritmului nmulirii levurilor) i a celei staionare. Este delimitat de nceputul i sfritul degajrii evidente a CO2. n aceast faz levurile desfoar o activitate foarte intens, temperatura evolueaz rapid atingnd 25-300C (i chiar mai mult), proporiile n glucide fermentescibile scad n ritm susinut, crete evident coninutul n alcool, se formeaz cantiti mari de CO 2 prin transformarea zaharurilor. Acesta prsind vasul produce un zgomot, uierat de unde i numele

de "fierbere" sau de faz zgomotoas (tumultoas). Faza dureaz 5-6 zile pn la 1415 zile, uneori 1-2 luni cnd coninuturile n zaharuri sunt foarte mari i temperaturile sczute (Cotea D.V., Pomohaci N., Gheorghi M.- 1982). O fermentaie de mai lung durat i la temperaturi sczute se soldeaz cu o zestre mai bogat de constitueni aromatici i de buchet n vin. n aceast faz, energia de care au nevoie levurile este eliberat din glucide, prin fermentaie, adic n anaerobioz.

C6H12O6 2 CH3 CH2OH + 2 CO2 + 33 kcal./mol.

Faza postfermentativ (fermentaie linitit) se manifest prin: degajare de CO2 foarte slab, nceperea depunerii diferitelor particule i a levurilor, scaderea treptat a temperaturii pn la o valoare egal cu temperatura mediului. Dac timpul este friguros au loc i unele depuneri de tartrai. ncepe i limpezirea vinului, ca urmare a acestor fenomene. Sub aspect biochimic are loc transformarea ultimelor urme de glucide, proces ce decurge greu datorit alcoolului format i mbtrnirii levurilor. Exist riscul de stagnare (oprire) nainte de epuizarea glucidelor, ceea ce reprezint un pericol cnd vinurile trebuie s fie seci. De aceea, se practic rensmnri, aerisiri, rscolirea sedimentelor. Aceste dificulti pot fi evitate, n mare msur, dac n faza prefermentativ se practic aerisiri, care favorizeaz formarea sterolilor (factori de supravieuire). n aceast faz ncep i fenomenele de exorbie i autoliz. Evoluia unei culturi de levuri. Se cunoate faptul c levurile se nmulesc prin nmugurire i prin spori, cele dou ci avnd importan sub raport biologic. Din punct de vedere practic, tehnologic prezint interes populaia de levuri care exprim totalitatea celulelor i modul cum evolueaz aceasta pe parcursul fermentaiei alcoolice. Considerndu-se c n must se pleac de la un anumit numr de celule, din microflora spontan sau adiionate ca levuri selecionate, populaia potrivit experimentului efectuat de Monod (1940), ntr-o soluie zaharat model parcurge etapele reprezentate grafic n figura 7.2.

Nr. levuri

IV III I II

VI

timp
Fig. 7.2 Evoluia unei populaii de levuri pe parcursul fermentaiei I, II, III Faza prefermentativ; IV, V Faza fermentaiei tumultuoase VI Faza fermentaiei lente (postfermentaie)

Etapa I este de adaptare a levurilor la mediu. Pe o anumit perioad numrul iniial de levuri rmne constant sau cunoate o uoar diminuare. Etapa a II-a este de accelerare a ritmului de nmulire a celulelor. Etapa a III-a este cea de cretere "exploziv" a populaiei, numit exponenial sau logaritmic. Etapa a IV-a cunoate o deceleraie, de scdere a ritmului de nmulire a celulelor, n comparaie cu etapa

exponenial. Etapa a V-a este cea staionar i se caracterizeaz prin aceea c numrul de celule care se "nasc" este, n general, egal cu numrul celulelor care mor. Bineneles, cele viabile situndu-se, ca numr, la cel mai nalt nivel. Etapa a VI -a este cea n care populaia intr n declin, att ca numr de celule, ct i ca potenial fiziologo-biochimic al lor. n aceast etap populaia devine neproliferant, iar numrul celulelor care mor crete continuu, pe msura scurgerii timpului. n etapele I, II i III levurile desfoar preponderent metabolismul de tip respirator, celulele avnd nevoie de cantiti mari de energie pentru nmulire i fortificarea sistemelor enzimatice. n etapele IV i V levurile i procur energia prin fermentaie, formndu -se masiv alcool etilic i ali constitueni secundari. n etapa a VI-a fermentaia se desfoar greoi, fiind posibil i oprirea metabolizrii glucidelor. Sub raport biotehnologic, etapele I, II i III corespund cu faza "prefermentativ", etapele III i IV corespund fazei "tumultoase", etapa a VI-a exprim faza "postfermentativ" sau "lent". Se menioneaz c cea mai mare parte din coninuturile n glucide sunt metabolizate (cu formare de alcool) n etapa de deceleraie i cea staionar. 7.1.7 TEHNOLOGIA FERMENTAIEI ALCOOLICE Fermentaia este considerat "naterea" vinului. De modul cum se desfoar aceasta depinde, n mod hotrtor, evoluia ulterioar a vinului i calitatea lui. Pentru aceasta n must trebuie s existe factorul biologic (levurile) i s li se asigure condiiile optime de nmulire i activitate fermentativ (temperatur, compui azotai, sruri minerale, factori de cretere). Mustul prelucrat se introduce n recipient, lsndu-se golul de fermentare i se aaz plnia de fermentare. Dup modul cum se declaneaz fermentaia deosebim: fermentaie spontan i fermentaie provocat, iar dup modul cum se influeneaz fermentaia, ea poate fi: fermentaie nedirijat i fermentaie dirijat. Fermentaia spontan se produce de la sine, fiind determinat de levuri din microflora spontan, existent pe struguri. n acest caz fermentaia este declanat de levurile din genul Kloeckera (Kloeckera apiculata) care activeaz pn la 3 -4 %vol alcool. Urmeaz levurile din genul Torulopsis (n special Torulopsis bacillaris) care activeaz pn la 7-8 %vol alcool. n continuare, Saccharomyces ellipsoideus activeaz pn la 12-13 %vol, iar Saccharomyces oviformis produce alcool pn la 17-18 %vol. Aceast succesiune de genuri i specii de levuri indigene formeaz ceea ce s-a numit conveerul levurian spontan (Bernaz D. i col.- 1962). n podgorii cu o mare vechime, n care microflora levurian s -a consolidat de-a lungul timpului i la vinificarea unor recolte bine maturate i n perfect stare fito-sanitar, succesiunea menionat poate contribui la obinerea unei bune caliti a vinurilor. n alte situaii nu prezint siguran. Fermentaia provocat se desfoar sub aciunea levurilor selecionate, cu nsuiri fiziologo-biochimice corespunztoare tipurilor i categoriilor de vinuri ce urmeaz a se obine. Exemplu: pentru obinerea vinurilor seci albe, roii i roze i a vinurilor materie prim pentru spumante se vor folosi rase aparinnd speciei Saccharomyces oviformis (bayanus); pentru obinerea vinurilor cu zahr rezidual (demiseci, demidulci, dulci) se vor implica rase din specia Saccharomyces ellipsoideus. Tot levuri selecionate, cu nsuiri cunoscute, se vor folosi n cazuri de recolte infectate (avariate) i cnd musturile provin din plantaii noi i rzlee. Levurile selecionate pun rapid stpnire pe mediu, devenind de la nceputul i pn la sfritul procesului de fermentaie principalul factor de metabolizare a glucidelor, realiznd aa-zise fermentaii pure. Levurile selecionate sunt pstrate pe diferite medii de cultur sau, mai nou, pregtite sub form liofilizat i sub form uscat (L.S.A.) sau granulat. Indiferent cum se pstreaz, levurile selecionate se

adiioneaz sub form de maia 5-7 mil./ml. La ora actual se folosesc pe scar larg levurile sub form uscat. Ele se reactiveaz (cu puin timp nain te de inoculare n must sau mustuial), conform instruciunilor de pe ambalaje. Fermentaia nedirijat se desfoar la voia ntmplrii i prezint numeroase riscuri. Fermentaia dirijat presupune un control riguros a temperaturii de fermentaie, a densitii, a evoluiei populaiei de levuri, a structurii microbiene. n funcie de situaii se iau msuri de reglare a temperaturii, aerri, rensmnri .a.

7.2 MACERAIA N TEHNOLOGIA OBINERII VINURILOR

Maceraia este un proces biofizic i biochimic complex i n acelai timp o verig tehnologic indispensabil n practica obinerii vinurilor roii, roze i aromate. Dup cum se tie, la aproape toate soiurile negre (Cabernet Sauvignon, Merlot, Pinot noir, Burgund mare), pigmenii roii antocianii sunt stocai n pielie, mustul fiind incolor. Din strugurii acestor soiuri vinificai n mod obinuit nu se pot obine dect vinuri albe sau ptate. La fel, la soiurile aromate, cum sunt: Muscat Ottonel, Tmioas romneasc .a. substanele odorante se gsesc n cea mai mare proporie localizate tot n pielie. n aceste situaii, pentru a obine vinuri roii, roze i aromate, n afara operaiunilor cunoscute se impune, cu necesitate, nc una menit s determine extragerea din prile solide ale strugurilor a substanelor roii i aromate i ncorporarea lor n masa mustului. Aceast operaiune tehnologic, bazat pe un ntreg complex de fenomene, poart numele de maceraie. De fapt, vinurile roii, roze i aromate se numesc, pe drept cuvnt, vinuri de maceraie. Practic, maceraia, ca verig tehnologic, urmeaz dup obinerea mustuielii i const n meninerea la un loc, pe o anumit durat timp, a prilor solide ale strugurilor (faza solid) cu mustul (faza lichid). Extragerea antocianilor i, n general, a polifenolilor decurge mai greu, necesitnd, n funcie de mai muli factori 3-5-7 zile n condiiile tehnologiei clasice i 48 60 de ore n condiiile aplicrii la vinificaia n rou a unor procedee moderne, cum este spre exemplu procedeul cu cisterne rotative metalice (Gheorghi M.- 1997). Substanele aromate se extrag ns mai rapid, mbogirea mustului n aceti constitueni asigurndu -se n 24-36 ore. n general, la vinificaia n rou, macerarea prilor solide ale strugurilor se desfoar concomitent cu o parte din transformarea mustului n vin prin fermentaie alcoolic. De aceea acest proces complex care asigur extragerea polifenolilor, a aromelor i a altor constitueni din prile solide ale mustuielii poart numele de macerare-fermentare. Se menioneaz c la vinurile roii i aromate, calitatea acestora depinde, n mod esenial, de modul cum se desfoar procesul de macerare-fermentare i de momentul separrii celor dou faze ale mustuielii. Fermentarea fazei lichide mpreun cu prile solide ale strugurilor comport o simultaneitate de fenomene, pe de-o parte fenomene de transformare biochimic a glucidelor n alcool, CO2 i ali compui secundari, iar pe de alt parte, de macerare a pielielor, pulpei i seminelor, cele dou componente ale fermentrii-macerrii influenndu-se reciproc. De fapt, reciprocitatea se manifest astfel: prin fermentaie rezult alcool i o cantitate important de cldur, factori care determin, n msur hotrtoare, macerarea i extragerea constituenilor din prile solide, iar macerarea mbogete mustul-vin n unele substane necesare nutriiei levurilor, stimulnd, la rndul ei, fermentaia alcoolic. Pe parcursul fermentrii-macerrii, din prile solide ale strugurilor, alturi de polifenoli sunt extrai i ali constitueni care mbogesc vinurile n extract i substane minerale, conferindu-le astfel corpolen, plintate i valoare igieno-alimentar sporit. Macerarea prilor solide ale strugurilor, ca proces deosebit de complex implic, n etapa de extragere a diferiilor constitueni i ncorporarea lor n faza lichid, fenomene de osmoz, dializ i difuziune. Dizolvarea polifenolilor i a

celorlalte substane i difuzia pot fi accelerate prin ncorporarea periodic a prilor solide n faza lichid sau prin recircularea unei pri din mustul -vin peste aglomerarea de pri solide de la partea superioar a recipientului (Peynaud E.- 1984). Extragerea antocianilor i intensitatea colorant cresc treptat pn la atingerea unui maxim, dup care se produce o descretere a lor, datorit adsorbiei i refixrii unei pri din acetia pe fraciunile solide ale mustuielii, dar i prin unele transformri ireversibile suferite de materia colorant (Nicolini G., Mattivi F.- 1995). Avnd n vedere aceste aspecte, se recomand ca separarea fazei lichide de cea solid s se fac nainte de a ncepe procesele de refixare a antocianilor i cele de transformri ireversibile a lor n forme incolore. Procesul de macerare-fermentare este influenat de o serie de factori cum sunt: temperatura, SO2, coninuturile n acizi liberi ai mustului, coninutul n acizi liberi, coninutul n alcool, durata de contact ntre cele dou faze, aciunea mecanic de ncorporare a fazei solide n cea lichid .a. n ultimele dou decenii se folosesc tot mai mult preparatele enzimatice n diferite scopuri oenologice. Pentru o ct mai bun extragere a antocianilor din pieliele strugurilor n timpul macerrii fermentrii la vinificaia n rou rezultate mulumitoare se pot obine prin folosirea enzimelor pectolitice din preparate autorizate de legislaiile n vigoare (Celotti E. i col.- 1997, Bduc-Cmpeanu C.- 1999). Enzimele pectolitice exogene degradeaz pectinele din pereii celulari facilitnd extractibilitatea antocianilor i a altor constitueni, din fraciunea solid a mustuielii, ntr-un timp mai scurt. Dintre preparatele comerciale cu enzime pectolitice s-au remarcat, n mod deosebit, cele care poart numele de Lallzyme i Vinozim G, folosite n doze de 3 g/hl. Alte aspecte privind procesul de macerare i macerare-fermentare se prezint n cadrul Tehnologiei de obinere a vinurilor roii, cap.9.