MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL LABORATORIO CLINICO VETERINARIO EN EL CENTRO DE RECEPCION Y REHABILITACION DE FAUNA SILVESTRE DEL DAMA TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIN 1. HEMATOLOGIA 2. QUMICA SANGUNEA 3. PARASITOLOGA GASTROINTESTINAL 4. ECTOPAR SITOS !. MICROBIOLOGA ". CULTIVOS #. UROAN LISIS BIBLIOGRAFA 2 2 18 19 22 24 2! 28 3$

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL LABORATORIO CLINICO VETERINARIO EN EL CENTRO DE RECEPCION Y REHABILITACION DE FAUNA SILVESTRE DEL DAMA
A%&'()*+ A,)(' E.-.. R/01()2 C.. C%/3('* L.M.. B)(4/5 -.. M'5/4' F.. S64,7)2 A. M/7),7/ Y.

INTRODUCCIN En el manejo de fauna silvestre reas como microbiologa, hematologa, parasitologa y qumica clnica, enmarcadas administrativamente en lo que se llama pruebas de laboratorio se convierten en herramientas bsicas para la difcil tarea de establecer el diagnstico etiolgico en procesos patolgicos. or ello, la !sociacin "acarena ha desarrollado este protocolo de #aboratorio $lnico %eterinario como fuente de ayudas diagnsticas en el centro de recepcin y rehabilitacin de fauna silvestre &$''()*. +na de las finalidades de ,ste protocolo en el $''() es ayudar a el pronto diagnstico, medicacin y tratamiento de los animales all alojados. 1. HEMATOLOGIA #os sntomas, como e-presin de una anomala funcional en un animal enfermo, son de difcil percepcin en fauna silvestre. )in embargo el anlisis de sangre por cuadro hemtico constituye una manifestacin fidedigna sintomtica de un proceso morboso en el organismo. or lo tanto el cuadro hemtico se convierte en una herramienta de enorme valor prctico por su fcil acceso en todos los casos donde se sospeche de una enfermedad. .ebe tenerse en cuenta que el porcentaje de los casos en que el e-amen de la sangre consigue establecer directamente el diagnstico es muy bajo &e-cepto las hemoparasitosis* y que su importancia solo se detecta cuando se diagnostica como sntoma &(o/ler, 0123*. El tejido conectivo sanguneo, como objeto de estudio en el $''() se obtiene, sin e-cepciones, de sangre E'4(5'4$! por puncin con aguja est,ril calibre 678 y 698 en todas las aves, reptiles y mamferos peque:os y;o neonatos de no ms de 9<< gramos= en mamferos y reptiles de mayor tama:o opcionalmente se usan agujas calibre 6> 8 y

60 8 siempre evitando al m-imo la restriccin qumica &+hart y .emm, 6<<<*. #a anatoma de los diferentes animales alojados en el $''() ha llevado a usar vasos sanguneos de primera y segunda eleccin para la toma de la muestra coincidiendo con (o/ler &0123* as? En "!"4(E'@) la primera eleccin es la vena femoral y la segunda la vena braquial con sus variaciones propias &(o/ler, 0123*. En !%E) se ha dividido segAn la longitud del hueso metatarsiano que e-pone la vena metatarsal medial, como proceden Bill y CurdicD &0113*. En aves con metatarso largo como (alconiformes y asseriformes la primera eleccin es la vena metatarsal &(igura 0* y la segunda la vena braquial= en aves con metatarso corto como los sittacidos la primera eleccin es la vena braquial. En aves muy peque:as de menos de 2< gramos la primera eleccin es la vena yugular y como segunda eleccin la vena braquial &Bill y CurdicD, 0113*.

F89%(/ 1. M%)*&(/ */49%14)/ &'0/3/ 3) 5/ :)4/ 0)&/&/(*/5.

En 'E E4#E), bsicamente la e-periencia en el $''() se ha obtenido en Fuelonios. ara los de gran tama:o, se obtiene sangre de la vena yugular y en los de menor tama:o por puncin en el seno venoso occipital tal como reportan Bill y CurdicD &0113*. En todos los casos se tiene en cuenta la cantidad y la frecuencia con la que se e-trae sangre para proteger la volemia del paciente &+hart y .emm, 6<<<*.

1.1 HEMATOCRITO O EMPACADOS ;PCV<+

VOLUMEN

DE

GLBULOS

RO-OS

En el $''() se utiliGa para su determinacin el m,todo de la microescala &@ ), 0126*, el cual se realiGa con tubos capilares para ma-imiGar la muestra y a su veG mantener la volemia del paciente &+hart y .emm, 6<<<*. El resultado se e-presa como porcentaje. R%&84/ H)0/&',(8&' ='( M8,(')*,/5/ )e puede utiliGar cualquier tubo capilar pero se prefieren tubos hepariniGados ya que en la centrifugacin se obtiene un valor cualitativo con la lnea blanca o leucocitaria en el borde sobrenadante de color rojo &@ ), 0126*. )e procede colocando un tubo capilar sobre la sangre por el e-tremo hepariniGado &(igura 6*, crculo rojo o en los sin anticoagulante por cualquier e-tremo y se procede como sigue? 0* or capilaridad se deja ascender hasta las H partes del capilar, 6* El e-tremo contrario se tapona con plastilina, arcilla o se sella con calor, I* )e ubica el capilar en el cabeGote con tubos de ensayo adaptados y se centrfuga a 06<<< rev.minJ0 - 3 min, >* )e lee en el dispositivo de lectura para "icrohematocrito con proyeccin de lnea, $omo resultado se obtienen los siguientes tres valores que tienen gran importancia clnica? .el plasma? 4ndice 4ct,rico o #ip,mico. .e los 8lbulos Clancos? $antidad cualitativa. .e los 8lbulos 'ojos? orcentaje, el cual se obtiene como la proporcin de c,lulas con relacin al plasma= si est aumentado indica policitemia, no distinguible a simple vista si es 'elativa o %erdadera y si est disminuida se relaciona con anemia &"ussman y 'ave,0172= .avidson y Benry,0172= @ ),0126= )chlam,0129= Bill y CurdicD, 0113*.

F89%(/ 2. T'0/ 3) 0%)*&(/ =/(/ (%&84/ 3) 7)0/&',(8&'. A 5/ 3)(),7/ *) '>*)(:/ )5 &%>' 3) 7)0/&',(8&' ,'4&(/*&/3' ,'4 5/ 08,(')*,/5/

1.2 HEMOGLOBINA+ #a prueba se hace por la t,cnica convencional, bien descrita en la literatura, la cual consistente en diluir 0< microlitros de sangre en 9 ml de )olucin de .rabDin, para posterior lectura en espectrofotmetro a 9>< nm de longitud de onda &@ ), 0126*. El resultado se e-presa en gr;dl y Anicamente su disminucin tiene importancia clnica al ser indicador de anemia cuando aparece junto con otras variables. $abe anotar que el valor puede estar aumentado, pero esto es debido a una hemoconcentracin por deshidratacin o policitemia y no por un real incremento de la hemoglobina en la sangre &.avidson y Benry, 0172*. 1.3 RECUENTO CELULAR DE ERITROCITOS EN HEMOCITMETRO DE NEUBAUER CON PIPETAS AFORADAS CUENTAGLBULOS+ El RBC o 'ecuento Eotal de Eritrocitos nos indica cuntos eritrocitos hay en un milmetro cAbico de sangre. )u valor, al igual que el del hematocrito, puede estar aumentado, indicndonos concretamente policitemia verdadera, o disminuido lo cual se relaciona con anemia &"ussman y 'ave, 0172*. En M/01?)('* requiere solucin de formaldehidoJcitrato preparada as? a 11 ml de agua destilada se la adiciona 0 ml de (ormaldehdo al I7 K &formalina comercial*. ! esta solucin se le adicionan I.< gr. de $itrato )dico &se puede reemplaGar por @-alato de !monio* &@ ), 0126*. En

A:)* @ R)=&85)* el m,todo seleccionado por rapideG consiste en utiliGar una dilucin con solucin salina fisiolgica. R%&84/ C'4&)' 3) E(8&(',8&'* ' RBC+ En "amferos, !ves y 'eptiles con la pipeta de conteo para eritrocitos se toma solucin de formaldehidoJcitrato o solucin salina fisiolgica hasta el aforado 0<0, se libera en un vidrio de reloj hasta el aforado 9 y lo dems se desecha. )e toma sangre hasta el aforado 9 con la misma pipeta y se meGcla con el liquido que se liber en el vidrio de reloj. )e enjuaga la pipeta succionando y e-pulsando I veces. )e monta el hemocitmetro con la laminilla. )e esperan 9 min. y se cuentan las c,lulas presentes en cada cuadro &.avidson y Benry, 0172*. 'C$L M de c,lulas - 0<<<< En caso de no e-istir una pipeta cuentaglbulos, con pipeta corriente se realiGan conteos de la siguiente forma? $on pipeta se toman > ml de )olucin de (ormaldehidoJ$itrato o )ol. (isiolgica y se liberan en un vidrio de reloj= se adicionan <.<6 ml de sangre y se meGclan con el liquido que esta en el vidrio de reloj. )e enjuaga la pipeta succionando y e-pulsando I veces. )e monta el hemocitmetro con la laminilla. )e esperan 9 min., se lee y calcula como se e-puso anteriormente. 1.3 INDICES ERITROCITICOS+ V'5%0)4 C'(=%*,%5/( M)38' ' VCM+ 4ndica el tama:o promedio de los glbulos rojos, es muy importante porque nos dice en t,rminos de tama:o celular si las c,lulas eritrocticas son microcticas, normocticas o normales o macrocticas, los cuales son conceptos que clasifican las anemias como regenerativas o no regenerativas &.!%4.)@N y BEN'O, 0172= "+))"!N y '!%E, 0172*. El clculo se hace de la siguiente forma? VCM A H)0/&',(8&'B1$CT'&/5 95D>%5'* ('E'* C'4,)4&(/,8D4 M)38/ 3) H)0'95'>84/ C'(=%*,%5/( ' CMHC? 4ndica la cantidad promedio de hemoglobina que tienen 0<< ml sangre= es importante porque indica la intensidad de la coloracin de los eritrocitos &Bipocrmica o poco coloreado y Normocrmica o normalmente coloreado*, los cuales son conceptos que junto a %$"

clasifican anemias &.!%4.)@N 0172*

y BEN'O, 0172= "+))"!N y '!%E,

CMHC A H)0'95'>84/B1$$CH)0/&',(8&' 1.4 FROTIS SANGUNEO+ El cuadro hemtico en el $''() se determina con frotis sanguneos convencionales, con las t,cnicas de rutina que para laboratorio de patologa clnica describen "ussman y 'ave &0172*, .avidson y Benry &0172*, @ ) &0126*, )chlam &0129* y Bill y CurdicD &0113*. +na veG hecho el frotis sanguneo, usualmente se colorea con cualquiera de las dos tinciones, segAn lo sugerido por (o/ler &0123*, Pallace &0126*, !lman y $ols &0117*, Bill y CurdicD &0113* y +hart y .emm &6<<<* usadas para distinguir la celularidad y mantener los placas en montaje permanente, estas t,cnicas son? T84,8D4 3) GIEMSA R)/,&8:'* N),)*/(8'* @ P()=/(/,8D4+ +na solucin stocD se prepara meGclando <,79 gr de $olorante 8iemsa en polvo con 39 ml. de "etanol al 17 K, completando luego a 0<< ml. con 8licerol & apro-. I3 ml.*. )e agita I veces al da por espacio de una hora a lo largo de cuatro das consecutivos, posteriormente se filtra y est la solucin &@ ), 012I*. #a Eincin de trabajo se prepara adicionando dos a tres gotas de la solucin madre de 8iemsa por cada ml. de !gua amortiguadaQ= para preparar mayores cantidades calculando para 0<< ml de solucin de trabajo se adicionan. I,9J 9 o 0< ml. de solucin madre. Esta meGcla no se debe agitar con e-cesivo bro por que se corre el riesgo de que el colorante se precipite &@ ), 012I*. Q)olucin Cuffer de (osfatos &!gua !mortiguada*? )e meGclan I,73 gr. de (osfato !cido de )odio Na6B @> y 6,0 g. de (osfato diacido de otasio RB6 @> en 0<<< ml de !gua destilada. !justar pB entre 7.< y 7.6. 8uardar en frasco mbar &@ ), 012I*. R%&84/ 3) C'5'(/,8D4 G8)0*/ 0* Bacer frotis,

6* I* >* 9* 3* 7*

)ecar el frotis al ambiente, (ijar en "etanol al 17 K por IJ9 min. )ecar al ambiente nuevamente, !dicionar colorante de 8iemsa al frotis por I< min. Escurrir la lamina, #avar la lamina con agua amortiguada de (osfatos a chorro &.!%4.)@N O BEN'O 0172= @ ) 0126= )$B#!" 0129= +B!'E y .E"", 6<<<*. 2* @pcionalmente en el $''() montamos un cubreobjetos con resina Entellan o Clsamo de $anad.

T84,8D4 FRIGTH + #a Eincin de trabajo se elabora adicionando a I<< ml de !lcohol "EES#4$@ al 13K <.9 g de $olorante P'48EB y posteriormente se adicionan I< ml de 8licerina ura &@ ), 012I*. R%&84/ 3) C'5'(/,8D4 FRIGTHB 0* Bacer (rotis 6* )ecar el frotis al ambiente I* !dicionar el colorante por IJ9 min. >* !dicionar agua destilada tamponada en %olumen igual 9* Esperar hasta aparicin de espejo metlico 9 min. 3* #avar la lamina con agua amortiguada de (osfatos chorro&.!%4.)@N O BEN'O 0172= @ ) 0126= )$B#!", 0129*Q.

Q @pcional "ontar en Entellan o Clsamo de $anad. En el $''() preferimos de manera regular esta coloracin por agilidad en el proceso.

1." MORFOLOGA ERITROCITARIA? !l ver la lmina coloreada al microscopio de manera normal, los eritrocitos en M/01?)('* son c,lulas abundantes que se deben distinguir de las dems por su uniformidad en formas redondas y peque:as &en promedio 7 micras* y anucleadas con color Eosinfilo &C!NR), 0120*G en A:)* @ R)=&85)* los eritrocitos son de gran tama:o, biconve-os uniformes y con nAcleo central alargado como la c,lula misma.= son ms aguGados en aves &8'4(@#),, 0113* que en reptiles &"artneG, 0113*. #os citoplasmas de aves y reptiles son levemente Eosinfilos con nAcleo basfilo &(@P#E', 0123*.

+na veG coloreada la lmina e-isten detalles relevantes dentro de las caractersticas histolgicas de los glbulos rojos tienen significado clnico &"+))"!N O '!%E, 0172*, estos detalles son? (ragmentos Nucleares &$,lulas inmaduras o 'ubricitos* Eipos de $romasia &Bipocrmicos, $,lulas 4nmaduras o 'eticulocitos* oiquilocitosis & (orma* como Equidnocito, #eptocito, !cantocito o $odocito unteados Casfilos? rocesos E-icos &)$B4##4N8, 0177= .!%4.)@N y BEN'O, 0172= "+))"!N, y '!%E, 0172= )$B!#", 0129* &!#"!N et al, 0117* 1.# CONTEO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS+

$on la t,cnica de $oloracin no solo se ti:en las c,lulas eritrocticas, tambi,n lo hacen las c,lulas #eucocticas por lo cual se puede contar y establecer diferencialmente cuales son las abundancias relativas o porcentuales de cada una de ellas= este conteo diferencial se realiGa de manera convencional, como lo indican lo procedimientos de laboratorio de patologa clnica bien rese:ados en "ussman y 'ave &0172*, .avidson y Benry &0172*, &@ ) &0126*, )chlam &0129* y Bill y CurdicD, &0113). En los diferente grupos de fauna silvestre que se pueden hallar variaciones de tama:o que pueden llegar a ser propias de un 8enero ta-onmico. )in embargo e-iste un patrn para reconocer la forma de las c,lulas sanguneas &B!PREO O CENNEE, 0113*. )e debe tener en cuenta que en sangre se hallan dos lneas celulares y que solo los leucocitos componen los elementos figurados que sirven para hacer el conteo diferencial= los eritrocitos que se hallan no se cuentan aunque adicionalmente generan informacin valiosa &ver 0.3*.

1.#.1. RECONOCIMIENTO DE LOS LEUCOCITOS PARA EL CONTEO DIFERENCIAL? #os leucocitos tienen caractersticas histolgicas en nAcleo y citoplasma que son Anicas y solo son reveladas con la t,cnica de tincin e-puesta= son importantes para establecer un conteo diferencial y para derivar de el un buen diagnstico paraclnico.

En mamferos los patrones en general son? J Neutrfilos? $,lulas de 1 a 00 micras, con nAcleo segmentado en I a 9 partes y con citoplasma transparente y abundante Casfilos? $omo Neutrfilos pero el citoplasma aparece con grnulos redondos de color basfilo Eosinfilos? $omo Neutrfilos pero su citoplasma aparece con grnulos redondos de color eosinfilo "onocito? $,lulas grandes de 00 a 0> micras con citoplasma transparente y nAcleo arri:onado o con forma de frijol #infocitos? $,lulas de tama:o muy variable de 7 a 0I micras con citoplasma transparente, nAcleo basfilo abundante que ocupa la mayora del espacio citoplasmtico laquetas? )on restos celulares de color basfilo de aspecto fusiforme y tama:o de 0 a I micras Candas? )on c,lulas inmaduras de la lnea celular neutrfila y se reconocen por su forma nuclear en forma de media luna $,lulas lasmticas? Eienen citoplasma transparente alargado y nAcleo e-c,ntrico de color basfilo &C!NR), 0120*

J J J

J J

E4 /:)* @ R)=&85)*+ L)%,',8&'*+ J

#os Neutrfilos son llamados Beterfilos? $,lulas de 7 a 00 micras, con nAcleo segmentado en 6 a I partes en aves &!#"!N, 0117*, pero Anico de forma redonda y e-c,ntrico en reptiles &(@P#E', 0123*. En los dos casos el citoplasma se aprecia con grnulos abundantes de forma alargada y color eosinfilo &(@P#E', 0123*. Casfilos? $omo en "amferos, son c,lulas con grnulos redondos que se ti:en de basfilo &B!PREO y CENNEE, 0123*. Eosinfilos? $omo los de "amferos, son c,lulas con grnulos redondos de color eosinfilo &B!PREO y CENNEE, 0123*.

"onocitos? $,lulas grandes de 1 a 0> micras con citoplasma transparente y nAcleo arri:onado o en forma de frijol &B!PREO y CENNEE, 0123*. #infocitos? $,lulas de tama:o muy variable de 9 a 0I micras con citoplasma transparente, nAcleo basfilo abundante que ocupa la mayora del espacio citoplasmtico &B!PREO y CENNEE, 0123*. Erombocitos? !nlogo de las plaquetas, son c,lulas verdaderas de tama:o homog,neo de 9 micras con nAcleo muy basfilo &$romatina muy condensada* &B!PREO y CENNEE, 0123*. $,lulas lasmticas? 4guales a las halladas en "amferos con nAcleo basofilo y e-c,ntrico y citoplasma transparente &B!PREO y CENNEE, 0123*. !Gudofilos? )imilares a las basfilas, solo estn presentes en reptiles y se reconocen por su coloracin basfila total con un nAcleo &B!PREO y CENNEE, 0123*.

)e debe tener en cuenta que cada una de estas c,lulas leucocticas descritas para "amferos, !ves y 'eptiles tienen unas proporciones que estn bien referenciadas para algunas especies en la bibliografa mientras que para otras no hay referencia. or lo tanto es necesario conte-tualiGar para cada especie y relacionarlo con el sistema inmunolgico para as determinar en cada caso si estn o no actuando en un proceso patolgico en curso= aclarando que este protocolo escapa a esos objetivos, que si estn bien pueden estar citados en te-tos especficos para ciertos grupos de animales como "amferos &P!##!$E 0126= (@P#E', 0123*, !ves &!#"!N et. al., 0117= 8'4(@#), 0113= P!##!$E 0126= (@P#E', 0123* y 'eptiles &"!'E4NET, 0113= P!##!$E 0126= (@P#E', 0123* no siempre son la regla general, como por ejemplo? En Neutrofilos se puede descubrir la cronicidad o agudeGa de un patologa ? .esviaciones a la 4Gquierda &Candas* J rocesos !gudos .esviaciones a la .erecha & Bipersegmentacin* J rocesos $rnicos En monocitos, la inmunoreactividad !umento J 'eactividad inmunolgica, buena respuesta inmune

.isminucin inmune

J .,bil reactividad inmunolgica, mala respuesta

En Casfilos &vasomodulacin* inflamacin !umento J roceso inflamatorio en curso .isminucin J Normal

En Eosinfilos, inflamacin, alergia, parasitosis !umento J roceso inflamatorio en resolucin, alergia o parasitosis .isminucin J Normal

En #infocitos, produccin de anticuerpos !umento con o sin $,lulas lasmticas J roduccin activa de anticuerpos, proceso crnico y;o viral .isminucin J .,bil respuesta humoral; predominio respuesta celular &(@P#E', 0123= P!##!$E, 0126= 8'4(@#), 0113= +B!'E O .EE", 6<<<= B4## O C+'.4$R, 0113*.

1.8 RECUENTO TOTAL DE LEUCOCITOS O FBC+ Nos indica cuantos leucocitos hay en un mm cubico de sangre. )u valor puede estar aumentado indicndonos concretamente leucocitosis o disminuido lo cual indica leucopenia &"+))"!N y '!%E, 0172* &+B!'E y .E"", 6<<<*. $onociendo el conteo diferencial o porcentual de leucocitos &ver 0.7* y el PC$ podemos calcular el valor verdadero de cada uno de los leucocitos, es decir cuantos hay de cada uno de ellos por mm cubico lo cual nos genera una mejor apro-imacin hacia un proceso patolgico si e-iste &.!%4.)@N y BEN'O, 0172*. C'4&)' FBC ,'4 =8=)&/ /?'(/3/ C%)4&/95'>%5'* 3) N)%>/%)(+ En 0/01?)('* se hace con una solucin de EuerD previamente preparada, la cual se elabora en dos fases?

0J )e disuelven <,I gr. de !Gul de "etileno en 0<< ml de !gua destilada. 2- En otro recipiente a 6<< ml de !gua destilada se la adicionan > ml. de !cido IJ !c,tico 8lacial y finalmente a esta )olucin se la adicionan 0< gotas de la meGcla &@ ), 0126* C'4&)' L)%,',8&'* + $on la ipeta de conteo para leucocitos se toma )olucin de EuerD hasta el aforado 00, se libera en un vidrio de reloj hasta el aforado 9 y lo dems se desecha = se toma sangre hasta el aforado 9 con la misma pipeta y se meGcla con el liquido que esta en el vidrio de reloj. )e enjuaga la pipeta succionando y e-pulsando I veces. )e monta el hemocitmetro de Neubauer con la laminilla. )e esperan 9 min. y se lee Q. $lculo L M de $,lulas - 6<<<. &@ ), 0126* BSe suma el nmero de clulas contadas y se divide por el nmero de cuadros contados El 'ecuento celular de leucocitos en hemocitmetro de Neubauer con pipeta corriente. )i en el #aboratorio no hay pipeta cuentaglobulos, se procede de as? $on pipeta se toman <.19 ml de )olucin de EuerD, se liberan en un vidrio de reloj= se adicionan luego <.<9 ml de sangre y se meGclan con el liquido que esta en el vidrio de reloj. )e enjuaga la pipeta succionando y e-pulsando I veces. )e monta el hemocitmetro de Neubauer con la laminilla. )e esperan 9 min. y se lee. E4 /:)* @ ()=&85)* el PC$ J se hace con el m,todo de estimado indirecto A?&)( L. . M,E4&)) obteniendo un frotis coloreado de buena calidad &una sola capa de c,lulas* te:ido con Prigth o 8iemsa, como esta rese:ado en el te-to arriba. )e procede contando en 0< campos con objetivo de >< U, el numero de leucocitos totales se divide en el numero de campos contados. El promedio obtenido se multiplica por 6<<< y el resultado es el PC$. )i el Bematocrito esta aumentado por debajo o por encima de lo normal se genera un factor de correccin para PC$ dividiendo el Bematocrito observado por el normal terico. !s PC$ se multiplica por el valor de correccin y PC$ corresponde al valor

real &!#"!N, et al, 0117* &B4## y C+'.4$R, 0113* & +B!'E y .E"", 6<<<* 1.9 T8)0=' 3) C'/9%5/,8D4+ #a sangre tiene factores de coagulacin que se activan e-trnsecamente una veG estn por fuera del conducto vascular. El m,todo de P'48BE se realiGa con capilares no hepariniGados a los cuales se les hace ingresar sangre de una sangra, despu,s de > min. el capilar se parte, observando que las fracturas se mantienen unidas entre las partes por un hilo de fibrina, el tiempo de coagulacin es el transcurrido entre la toma de la muestra y el hilo de fibrina &@ ) 0126*.

2. PROCEDIMIENTOS ESPECIALES 2.1 HEMOPAR SITOS $uando se generan lminas coloreadas se hace una revisin preliminar antes de hacer el cuadro hemtico, ya que eventualmente pueden e-istir en sangre fuera de las c,lulas o al interior de ellas elementos e-trnsecos como hemoparsitos? resencia de Bemoparsitos ? E-tracelulares= Erypanosoma spp. , (ilaria spp. y #eucocytoGoon spp En "onoctos= #eishmania spp. y #eucocytoGoon spp. En Eritrocitos= Bemobartonella, lasmodium, Baemoproteus, Cabesia y !naplasma spps & )@+#)CO, 0126*.

T(@=/4'*'0/* @ F85/(8/*+ Estos parsitos se pueden descubrir en sangre en preparaciones de conteo diferencial &(igura I*, pero tambi,n por coloracin de gota gruesa &@ ), 0126*. E-iste sin embargo un m,todo de concentracin por centrifugaciones repetidas cuando se sospecha de la enfermedad pero los m,todos anteriores no lo demuestran. )e hace puncin venosa y se dispone en tubo cnico de 1 partes. ! este se le adiciona una parte de $itrato de )odio al I.2 K. )e meGcla y se centrifuga tres minutos a velocidad media. )e e-trae el sobrenadante

&plasma* y la lnea celular blanca se deposita en tubo marcado con el nAmero dos y se centrifuga a velocidad media por cinco minutos. )e e-trae el lquido sobrenadante el cual se deposita en un tubo marcado con el numero tres, se vuelve a centrifugar pero a velocidad alta por dieG minutos. )e e-aminan los sedimentos del tubo dos para deteccin de (ilarias y del tubo tres para deteccin de Erypanosomas &@ ), 0126*. F85/(8/*8*+ $uando en biopsia de piel se sospecha la e-istencia de microfilaria se procede como sigue? #a muestra de la biopsia con un tama:o de entre 6 a I mm se dispone sin cubreobjetos en una lamina previamente impregnada con una gota de solucin fisiolgica de $loruro de )odio, posteriormente se pone un cubreobjetos rellenando el rea faltante con mas solucin fisiolgica y se esperan 0< minutos. $on escasa abertura del condensador en objetivo 0< U se observa al microscopio detectando las microfilarias tratando de salir al liquido. )i hay microfilarias se ti:en como en frotis con 8iemsa &@ ), 0126= +B!'E y .E"", 6<<<*. L)8*70/48/*8*+ En #eishmaniasis visceral se procede preparando previamente 0<< ml de agua destilada con 6 ml de !cido !c,tico 8lacial. )e toman luego 1 partes de esta solucin y se le adiciona 0 parte de sangre venosa. )e meGclan por tres minutos y se realiGan e-tensiones de sangre en porta objetos. )e fijan en "etanol y ti:en como en 8iemsa. )i se observan en los macrfagos inclusiones citoplasmticas de color rojo es positivo. $uando se encuentran lesiones con #eishmaniasis cutnea los bordes indurados se raspan y la secrecin de carcter seroso por irritacin del borde de la ppula se pone en un porta objeto, se fija y se ti:e como en 8iemsa &R@NE"!N et al, 0127*.

F89%(/ 3. M8,('?85/(8/* )4,'4&(/3/* )4 %4 8438:83%' 3) Saguinus leucopus

H/)0'=('&)%* *=.. L)%,'@&'2''4 *=.. H/)0'>/(&'4)55/ *=.. E(58,78/. A4/=5/*0/+

P5/*0'38%0

*=.

)e detectan muy bien en sangre, se colorean convencionalmente con el m,todo Prigth o 8iemsa. Baemoproteus sp. se observa como un gametocito alargado dentro de los glbulos rojos con grnulos negros en forma de haltera, sin deformar la c,lula eritroctica. lasmodium sp. se observa dentro de las c,lulas eritrocticas con forma redonda y pigmentos negros. #eucocytoGoon sp. &(igura >*se observa de forma alargada sin pigmentos y deformando el eritrocito o monocito &(@P#E', 0123= P!##!$E, 0126= "EB#@'" et al, 011I= !#"!N et al, 0117* Baemobartonella sp. se reconoce por dos o tres puntos basfilos en c,lulas. Erlichia sp se reconoce por la coloracin eosinfila dentro de los eritrocitos y !naplasma sp. por su carencia de coloracin o birrefingencia en eritrocitos &"EB#@'" et al, 011I*.

F89%(/ 4. L)%,',@&'2''4 )4,'4&(/3' )4 %4 8438:83%' 3) Buteo platypterus

2.2 CITOLOGA+ "uchas muestras biolgicas obtenidas por biopsia o necropsia e inclusive las secreciones obtenidas post Jpuncin nos pueden dan pistas por su naturaleGa celular y sobre que evento fisiolgico o patolgico esta sucediendo. ara ello la Eincin rpida de B V E debido a sus capacidades tintoriales por gradientes de pB permite establecer con certeGa la naturaleGa de la muestra biolgica &8!%4W@ et al, 0179*. En este caso se procede as? T84,8D4 3) H)0/&'H8584/ @ E'*84/+ 0* Eincin general de Bemato-ilina V Eosina 6* oner la muestra sobre la lamina y si es necesario hacer squach !dicionar Bemato-ilina 06J 09 min. I* #avar con !gua >* !dicionar )olucin !cida 09 seg. m-imo 9* #avar con agua !gregar )olucin Csica hasta que el frotis muestre un color aGul. !pro-imadamente, 09 seg. 2* #avar con agua !dicionar Eosina m-imo 6< seg. 1* #avar con agua 0<* @bservar? #as estructuras acidfilas &NAcleos $elulares* se ti:en de color aGul= las estructuras Casfilas &$itoplasmas, (ibras y (ormes * se ti:en de color rosado &8!%4W@ et al, 0179*.

3. QUMICA SANGUNEA

)ustancias qumicas endgenas o e-genas circulan en sangre en cantidades permanentes y son reguladas por ciclos bioqumicos= de hecho la alta o baja concentracin de estas sustancias reflejan tasas de actividad metablica altas o bajas e inclusive da:o en un rgano o sistema &P4."!NN, 0120*. )in e-cepcin el calculo de la cantidad de estas sustancias qumicas se hace en suero o plasma por t,cnicas espectrofotom,tricas a trav,s de R4E) diagnsticos comerciales &"+))"!N y '!%E, 0172= .!%4.)@N y BEN'O, 0172= C!''E4'@, 0116*. +sualmente, se requieren determinaciones precisas de

Eransaminas, !spartato !lanino EransaminasJ !)E, !lanino Eransaminas !#E, rotenas Eotales, Nitrgeno +r,ico )anguneo J C+N, $reatinina y eventualmente 8lucosa. !lanina transaminasa !#E;8 E y !spartato transaminasa !)E;8@E )e realiGan con Rits $omerciales "arca )E'! !R de C!OE', cuyo m,todo es el enGimtico de 'eitman y (ranDel, con lectura a I39, I>< y II3 nm. $reatinina se realiGa con Rits $omerciales "arca )E'! !R de C!OE', cuyo m,todo es Xaffe con desproteiniGacin y lectura a >1< nm. 8lucosa se lee con Rits $omerciales "arca )E'! !R de C!OE'Y. #a t,cnica enGimtica colorim,trica 8@.; ! &8lucosa @-idasa ero-idasa* y se lee a 9>3 nm. C+N se lee con Rits $omerciales de C@BE'4N8E' "!NNBE4". #a t,cnica es la enGimtica colorim,trica uricasa y se lee a >9< nm. rotenas Eotales se lee con EE$N4$! $@N%EN$4@N!# colorim,trica .E C4+'EE. El espectrofotmetro usado para hacer las lecturas es un Teiss U#69 .igital sobre un volumen final de muestra de <,9 ml

4. PARASITOLOGA GASTROINTESTINAL

#a determinacin de parsitos tiene el fin biolgico de identificar ta-onmicamente hasta donde sea posible el organismo y el inter,s veterinario de conocer informacin acerca del grado de infestacin y establecer el plan sanitario correspondiente. )e hace un muestreo directo en materia fecal, luego se realiGa e-tendido en portaobjetos con una gota de agua en un e-tremo y al otro e-tremo una de lugol. )e observa con cubreobjetos en el menor aumento con diafragma cerrado en el microscopio &@ ), 0126* &%E#ET, 0119*. MI&'3' 3) C'4,)4&(/,8D4 CI*&'3'* @ N)06&'3'*+ =/(/ P('&'2'/(8'*. T()06&'3'*

)e usa esta t,cnica cuando se obtienen huevos que pueden ser fotografiados debido a la limpieGa con la cual aparecen= )e conoce como "4( o ",todo de concentracin de (ormaldehdo Eter y se usa

para huevos, larvas y especialmente para quistes de protoGoos, aunque funciona bien en huevos de Nemtodos, $,stodos y Eremtodos. )e procede as? )e deshacen 6 g de e-crementos en 0< ml de solucin fisiolgica de Na$l , luego se filtra con gasa, el liquido recolectado se centrifuga a I<<< rpm por I min., se desecha el sobrenadante y se vuelve a lavar con solucin fisiolgica= se vuelve a desechar el sobrenadante. )e a:aden 0< ml de formaldehdo al 0< K, se meGcla y se deja reposar por 9 min. se agregan luego I ml de Eter y se agita vigorosamente por I< seg. )e centrifuga 0 min. a baja velocidad y se remueven todas las capas dejando el sedimento. )e monta y se observa &"EB#@'" et al, 011I= %E#ET, 0119*. L/ T84,8D4 *) debe hacer con solucin de LUGOL la que se logra meGclando 0g de Oodo con 6 g. de R4 en 0<< ml de agua destilada y guardar en frascos !mbar &@ ), 0126*. @tra de las t,cnicas para deteccin de arsitos se basa en la (lotacin en soluciones .ensas y es la t,cnica que se usa por su fcil acceso y rpido diagnstico. L/ *'5%,8D4 3) F855* ;N/C5< 4ndicada para !scaroideos y Estyrongilidos con densidad de 0.6<< para el m,todo de flotacin se prepara adicionando a 9<< ml. de agua destilada 069 g de Na$l. Enfriar y dejar reposar = si despu,s del reposo toda la sal esta disuelta se agregan 9< g. mas de Na$l hasta saturacin &.+NN, 012I= "EB#@'" et al, 011I= %E#ET, 0119*. L/ *'5%,8D4 3) S7)/&7)( ;A2J,/(< con una gravedad de entre 0.007 y 0.I<< se prepara adicionando >9> g de sucrosa y 3ml de formol al 0< K en I99 ml de agua &.+NN, 012I= C!''E4'@,0116= %E#ET, 0119= +B!'E y .E"", 6<<<*. S'5%,8D4 3) S%5?/&' 3) K84, para tremtodos con una densidad de 0.02< &II K* y sulfato de magnesio para estronglidos, metastrongilos y ascaroideos con una densidad de 0.62< &I9 K*. )e usa cuando e-isten huevos que no flotan fcilmente.

S'5%,8D4 3) N8&(/&' 3) S'38' con una densidad de 0.I2< para spirocerca y tricuroideos &.+NN, 012I= "EB#@'" et al, 011I= %E#ET, 0119*.

R%&84/ =/(/ )43'=/(6*8&'* ='( )5 0I&'3' 3) ?5'&/,8D4 0* Eomar un gramo de materia fecal 6* .iluirla en 0< ml de solucin fisiolgica agitando vigorosamente filtrar en gasa y recoger filtrado I* $entrifugar a 62<< rpm por > min. y desechar el sobrenadante >* !dicionar al sedimento la solucin saturada &sin llenar el tubo* 9* !gitar hasta que el sedimento desaparece 3* $ompletar el contenido con solucin saturada hasta invertir el menisco 7* $olocar una laminilla sobre el menisco y esperar de 09 min. a 6 horas 2* 'etirar la laminilla manteniendo el tubo en posicin vertical 1* Ee:ir la lamina y los frotis directos con lugol &.+NN, 012I= C!''E4'@, 0116= "EB#@'" et al, 011I= %E#ET, 0119 = +B!'E y .E"", 6<<<*. F8E/3'( =/(/ )H60)4)* E43'=/(/*8&'5D98,'* #a solucin de formol al 0< K se prepara meGclando 0<< ml de agua con 0< ml de formol comercial &><K* , se usa para mantenimiento de c,stodos &(igura 9*, helmintos, huevos o larvas de protoGoos quistes &.+NN, 0129= "EB#@'" et al, 011I = %E#ET, 0119= +B!'E y .E"", 6<<<*.

F89%(/ !. CI*&'3'* )4,'4&(/3'* )4 %4/ >'/

!. ECTOPAR SITOS P8'E'*. P%59/* @ G/((/=/&/*+ )e hacen observaciones directas de los ectoparsitos que han sido obtenidos por raspado, con una superficie plana u hoja de bistur impregnada con glicerina pura o aceite mineral, se dispone en una lmina portaobjeto y con cubreobjeto se observa en objetivo I.6 U con condensador levemente cerrado &%E#ET, 0119*. A,/('*+ .e una lesin hacer raspado profundo hasta sangrar se obtiene la muestra que con aceite mineral se dispone sobre el cubre objetos, se a:ade una gota de Na@B al 9 K, se calienta &hasta digestin parcial* y se cubre con laminilla. Esperar 0< min. hasta que se aclare y observar. )i no se observan meGclar todo el raspado con 0< ml. de Na@B al 0< K y calentar al ba:o de "ara hasta ebullicin &evitar ebullicin prolongada*. Enfriar y centrifugar a 6<<< r.p.m. por 6 min. @bservar el sedimento emulsionando con 8licerina &"EB#@'", et al, 011I=%E#ET, 0119= +B!'E y .E"", 6<<<*. H'49'*+ )e procede con t,cnica similar a la anterior &digestin de queratina*. )e obtiene una muestra de pelo &9J0< *, adicionar una gota de Na@B al 6< K y se cubre con un laminilla. )e pasa por una llama I< segundos y se enfra. )e observa en microscopio en ><U con condensador disminuido alrededor del fantasma de los pelos. #os hongos y esporas unicelulares se observan en agrupaciones de formas redondas con membranas transparentes. Bongos filamentosos se

observan fuera o en el interior del pelo a lo largo con burbujas en el interior. ara descartar posibles errores se realiGa un procedimiento paralelo con pelos provenientes de Gonas sanas & R@NE"!N et al, 0127*.

". MICROBIOLOGA El estudio y conocimiento bsico de la microbiologa aporta en medicina veterinaria la etiologa de las enfermedades infecciosas lo cual desencadena finalmente en la medicina preventiva, que es el corolario de la proteccin en salud pAblica. #a investigacin microbiolgica bacteriana se realiGa con base en la tincin diferencial de 8ram y la ta-onoma bacteriana basada en la forma &cocos y bacilos*. Estas son la base del diagnstico clnico &R@NE"!N et al, 0127*. ara ello se usa la Eincin de 8ram se utiliGan las siguientes soluciones? )olucin saturada de cristal violeta o violeta de genciana se prepara meGclando > g. de colorante en 6< ml de alcohol etlico al 19 K. )e le agrega 0< ml de o-alato amnico al 0 K. )olucin yodada de 8ram se logra meGclando 0g de yodo con 6 g. de R4 en I<< ml de agua destilada y guardar en frascos !mbar )olucin de alcoholJacetona se prepara meGclando 7< partes de alcohol etlico al 19 K por I< partes de acetona. )olucin acuosa de fuscina se logra meGclando 6 g. de colorante en 09 ml de alcohol etlico al 19 K &@ ), 0126* T84,8D4 3) G(/0+ 0* )e toma frotis y se seca al ambiente con posterior adicin de calor por 0 a I min evitando quemar. 6* !dicionar cristal violeta por 3< seg. I* #avar con agua destilada >* !dicionar el mordiente de lugol por 0 min. %erter el e-ceso 9* !dicionar alcohol acetona y secar por 09 seg. ma-. 3* #avar con agua 7* !dicionar el colorante de contraste fucsina por 3< seg. 2* #avar con agua

1* @bservar morfologa y tincin de 8ram? positivo color aGul y negativo color 'ojo @tras tinciones diferenciales y los reactivos que las componen son? T84,8D4 3) S7/)?)(L F%5&'4+ ara bacilos esporoformadores con verde de malaquita al 0K p;v en 0<<mol de agua R%&84/ 3) C'5'(/,8D4+ El frotis se cubre en e-ceso con verde de malaquita y se calienta hasta emanacin de vapores I o > veces por I< seg. )e lava el e-ceso de colorante con agua destilada durante I< seg. )e la adiciona fuscina de 8ram y luego lavar. @bservar bacilos esporulados con esporas de color verde y las partes vegetativas de color rojo &.!%4E) et al, 012>= R@NE"!N et al, 0127*. T84,8D4 K8)75 N8)5*)4+ ara mycobacterium acido resistentes, requiere de? #a solucin de fuscina fenicada se prepara meGclando 0 gr. de fuscina bsica con 0< ml de alcohol etlico al 19 K a los que se les adicionan 1< ml. de fenol o cido f,nico al 9 K. )olucin alcohol cido? )e prepara meGclando 6 ml. de B$# de alta graduacin con 12 ml de alcohol etlico al 19 K )olucin de aGul de metileno al 9 K. )e meGclan 0< g. de aGul de metileno en 0<< ml. de agua destilada. R%&84/ 3) C'5'(/,8D4+ !l frotis habitual se le adiciona la fuscina fenicada en e-ceso y luego se calienta hasta produccin de vapores por espacio de I min. )e decolora con solucin alcohol cido y finalmente se colorea de nuevo con solucin de aGul de metileno. #avar y observar. !cido resistentes positivos ti:en rojo y cido resistente negativo aGul &.!%4E) et al, 012>= R@NE"!N et al, 0127*.

#. CULTIVOS Es necesario en el laboratorio aislar colonias bacterianas con el fin de establecer de manera particular actividades bioqumicas de las bacterias que posteriormente permiten hacer una apro-imacin ta-onmica hasta genero &R@NE"!N, et al, 0127*. #as normas generales para realiGar los medios de cultivo son? 0* El material de vidrio se esteriliGa en calor seco y;o autoclave. 6* )e preparan los agares segAn las proporciones mencionadas por el fabricante en la cantidades requeridas. I* )e calienta el agua en un erlenmeyer y se disuelve el agar. >* )e esteriliGa con calor hAmedo o autoclave a 06< Zc y 09 libras de presin por 6< min. 9* )e sirve en cajas de petri previamente esteriliGadas 3* )e dejan 6> horas en sensibilidad a I7 Z$ &R@NE"!N et al, 0127* C%5&8:'* =/(/ GRAM ='*8&8:'* A9/( N%&(8&8:'+ Es el mismo agar comAn= su relacin es de 62 g ; #. Este es un medio general base. !ll crecen todo tipo de hongos y bacterias. Es importante conocer la morfologa de la colonia. )i es cremosa redonda probablemente son cocos= si es seca e irregular probablemente son bacilos. )obre este agar se realiGa el antibiograma respectivo a trav,s de sensidiscos segAn el antibitico &R@NE"!N et al, 0127*. A9/( S/49()+ )e prepara inicialmente como el agar nutritivo hasta servirlo en cajas de petri y se calienta hasta llegar a >6 Z$ cuando se le adiciona sangre sin anticoagulante en relacin de 0<< ml. de agar en volumen &preparado* por cada I ml de sangre. Es un medio diferencial para establecer patrones de alfaJemolisis incompleta o betaJhemlisis completa en cepas patgenas . #a hemlisis se lee como halo de transparencia alrededor de la colonia &R@NE"!N et al, 0127= .!%4E) et al, 012>* A9/( S/5/3' M/48&'5+ )u relacin es de 0<2 g ;#. .etermina manitol [ en cepas de stafilococos patgenas quienes son adems halfitas. El medio preparado es de color rosado o rojiGo. #as colonias manitol [ se

observan con halo amarillo luminoso y las manitol J son colonias peque:as y sin brillo &R@NE"!N et al, 0127= .!%4E) et al, 012>*. C/53' T8'958,'5/&'+ Es un medio lquido de color amarillo pardo preparado con una relacin de 61 g ; lt. )e envasa en tubos de 9 ml. de capacidad y sirve como medio de transporte. )e usa para cultivos anaerbicos al sellarlo con parafina o aceite de ricino despu,s del sembrado. Bay anaerobiosis si aparecen burbujas o si hay desplaGamiento del tapn de parafina &R@NE"!N et al, 0127 = .!%4E) et al, 012>*. P(%)>/* =/(/ T8=8?8,/,8D4 B8'M%108,/+ P/(/ GRAM ='*8&8:' P(%)>/ 3) 5/ C/&/5/*/+ ! una colonia aislada se le adiciona una gota de B6@6 . )i hay burbujeo es catalasa [ y cuando es catalasa negativo no hay cambios. El per-ido de hidrogeno debe estar preparado al I K. P(%)>/ 3) 5/ C'/9%5/*/+ ! un frotis de una colonia aislada se le adiciona una gota de plasma sanguneo con E.E!. )i aglutina el plasma es coagulasa [ y lo contrario es coagulasa negativo &R@NE"!N et al, 0127= .!%4E) et al, 012>*. P/(/ GRAM 4)9/&8:'* EMB+ El medio usa una relacin de I3 g ;#. Es un medio selectivo indicado para enterobacterias en las cuales adems se puede determinar su capacidad para fermentar lactosa, clasificndose como colonias lactosa [ cuyo color es rojiGo con brillo verde metlico y lactosa negativo para colonias cuya coloracin es clara, mbar o casi incolora. &R@NE"!N et al, 0127= .!%4E) et al, 012>*. P(%)>/* =/(/ &8=8?8,/,8D4 >8'M%108,/ *)(8/3/+ Eodas las pruebas bioqumicas aqu mencionadas se hacen con sistemas comerciales de identificacin microbiana para enterobacterias, usando el Rit comercial ! 4 6< &(igura 3* el cual consta de una serie de microtAbulos con 6< agares deshidratados que se reconstituyen al hacer la respectiva siembra por inoculacin. Entre las pruebas que realiGa el R4E sobresalen?

F89%(/ ". N8& ,'0)(,8/5 API 2$

TSIL Eriple aGAcar hierro. .etermina formacin de B6) por reduccin del tiosulfato y degradacin de aGucares por peso especfico ordenados de arriba a abajo as ? #ac, )ac, 8luc. #a fermentacin del aGAcar especifico se detecta por viraje del color del medio de rojo fenol originalmente a amarillo. Eambi,n se puede establecer la formacin de gas por desplaGamiento del medio en el tubo de ensayo. SIML )ulfuro indol motilidad. El medio originalmente es de color amarillo. .etermina la formacin de B6) por motilidad con migracin perpendicular a la puncin. 4ndol [ se lee al agregarle 9 gotas de reactivo de Erlich o de Rovacs, encontrando que si han degradado el triptofano y formado en anillo de 4ndol se colorear el medio de color rojo. LIA L #isindescarbo-ilasa. El medio preparado es de color violeta dado por el pArpura de bromocresol. )i el medio vira a pardo es #isin [, )i vira a amarillo es #isin J. C8&(/&' 3) *80'4* A (ermentacin del citrato. El medio es de color verde dado por el colorante purpura de bromotimol. %ira de verde a aGul cuando es citrato [ y no hay cambio cuando es citrato negativo. MRLVPA. 'ojo de "etiloJ %oges rostDauer. El medio debe hacerce en prueba doble? para "' se le adicionan 9 gotas de rojo de metilo y vira a rojo si es "' [. ara % se adiciona alfa naftol y Na@B al >< K .)e lee positivo por formacin del anillo de color rojo. UREAA El medio es amarillo siendo ureasa positivo al virar al rojo &R@NE"!N, et al, 0127*.

8. UROAN LISIS ! trav,s de cintas reactivas comerciales $ombur0< EestY o "ultisi-Y que permiten un diagnstico rpido y semicuantitativo manejando hasta dieG parmetros fsicos como densidad y pB= qumicos como bilirrubina, glucosa, cuerpos cetnicos, hemoglobina y biolgicos como c,lulas tipo leucocitos y eritrocitos. #a t,cnica consiste en verter una gota de orina en la cinta reactiva, dejndola actuar por un minuto y luego comparar el cambio de color con respecto al patrn &.!%4.)@N y BEN'O, 0172*. aralelamente al e-amen qumico se establece un anlisis microscpico del sedimento el cual se realiGa centrifugando en tubos capilares una cantidad de orina suficiente, y posteriormente observando si hay presencia de c,lulas y;o cristales que indiquen problemas fisiolgicos y;o patolgicos &.!%4.)@N y BEN'O, 0172= C!''E4'@, 0116*.

F89%(/ #. C84&/* ()/,&8:/* C'0>%(1$ T)*&O =/(/ %('/4658*8*

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TABLA DE CONTENIDO

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