UNJBG- ECOLOGA MICROBIANA

2013

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE BIOLOGIA MICROBIOLOGIA

FUNDAMENTO DE LA PRUEBA BIOQUMICA VOGES- PROSKAUER

CURSO : ECOLOGA MICROBIANA DOCENTE : MSc. CESAR JULIO CACEDA QUIROZ ALUMNAS : THALA YOLANDA FLORES MEGO 2010-35470

TACNA PERU 2013

UNJBG- ECOLOGA MICROBIANA

2013

UNJBG- ECOLOGA MICROBIANA

2013

PRUEBA DE VOGES PROSKAUER

I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de algunos microorganismos para producir un producto final neutro, acetil-metil-carbinol (AMC, acetona), a partir de la fermentacin de la glucosa. Voges y Proskauer fueron los primeros

bacterilogos en observar una coloracin roja en los medios de cultivo despus del tratamiento con hidrxido de potasio. II. OBJETIVO Determinar el fundamento de la prueba bioqumica de Voges Proskauer al trabajar con un cultivo de enterobacterias.

III. FUNDAMENTO La prueba de Voges-Proskauer (VP) se basa en la deteccin de acetona, un producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. La glucosa es metabolizada a cido pirvico, el principal intermediario en la gluclisis. A partir del cido pirvico, las bacterias pueden seguir muchos caminos metablicos de la degradacin de la glucosa en las bacterias. La prueba de Voges-Proskauer para la acetona se utiliza sobre todo para separar Escherichia coli de los grupos Klebsiella-Enterobacter. Los miembros de la familia Enterobacteriaceae se clasifican de manera caracterstica como fermentadores de cidos mixtos o del cido frmico, lo que indica que sus productos finales de la fermentacin de la glucosa son cidos: cido frmico, cido actico, cido succnico, etanol, hidrgeno y dixido de carbono. Los fermentadores de cidos mixtos con posterioridad pueden ser divididos en dos grupos: a) los que producen cidos pero no 2,3-butanodiol, como E. coli (VP-) y b) los que producen 2,3-butanondiol como sus principales productos finales, como los grupos Klebsiella-Enterobacter (VP+). El principal producto final de la utilizacin del piruvato de los grupos Klebsiella-Enterobacter, especies de Serratia, especies de Bacillus y muchos otros microorganismos es el 2,3-butanodiol.
3

UNJBG- ECOLOGA MICROBIANA

2013

La produccin de 2,3-butanodiol aumenta la produccin de dixido de carbono, lo que da por resultado en la formacin de menos cidos y la acumulacin de acetona. El balance entre acetona y 2,3-butanodiol est determinado por la cantidad de hidrgeno disponible o por las diferencias en los potenciales de oxidacin-reduccin. En presencia de oxgeno atmosfrico y lcali, los productos finales neutros acetona y 2,3-butanodiol son oxidados a diacetilos, el reactante del color producido en la prueba de Voges-Proskauer. En consecuencia, el diacetilo es un producto de oxidacin de la acetona. El pH en el medio Voges-Proskauer es muy importante, debe evitarse un pH cido. Por encima de 6,3; se acumula cido actico y cido frmico con supresin en la produccin de CO2, H2, acetona y 2,3-butanodiol. Por debajo del pH 6,3; el cido actico es convertido a acetona y 2,3-butanodiol y se suprime la produccin de H2 mientras que se incrementa la produccin de CO2. Se basa en la capacidad que poseen determinados organismos de producir acetil-metil-carbinol a partir de la degradacin de la glucosa. En presencia de oxgeno y de una solucin de KOH al 40%, el acetil-metil-carbinol se convierte en diacetilo, el cual, en contacto con alfa-naftol, produce color rojo. Los tres ingredientes principales en la prueba de VP son el alfa-naftol, una solucin nitrogenada presente en la peptona y el diacetilo. El primer reactivo agregado a una alcuota incubada es el catalizador alfa-naftol debido a que acta como un intensificador del color, lo que incrementa la sensibilidad de la reaccin sin prdida de la especificidad. El alfa-naftol se combina con el producto de la reaccin de diacetilo y con el compuesto de tipo guanidina, la arginina, presente en la peptona al comienzo de la reaccin; por esto debe ser agregado en primer trmino. El segundo reactivo es el KOH al 40%, el cual ayuda a la absorcin de CO 2 en el medio VP. No debe excederse de la cantidad exacta de 0,2 ml. Estos dos reactivos, alfa-naftol y KOH al 40%, deben ser agregados en ese orden. El KOH reacciona con la peptona para dar un color salmn-rosa y el posterior agregado de alfa-naftol no altera el color.

UNJBG- ECOLOGA MICROBIANA

2013

Despus del agregado del alfa-naftol y del KOH, el tubo debe agitarse con suavidad para exponer el medio al oxgeno atmosfrico a fin de oxidar la acetona presente a diacetilo. El KOH acta como un agente oxidante y acelera la oxidacin de acetona a diacetilo. El diacetilo es el reactante esencial que da una reaccin de color con el KOH y la peptona. En consecuencia, cuando se mezclan en proporciones correctas diacetilo, peptona y alfa-naftol se desarrolla de manera casi instantnea un color rojo en la superficie del medio; la velocidad de desarrollo del color depende de la cantidad de acetona en el cultivo de prueba, esta coloracin solo en la superficie, sugiere un proceso de oxidacin. La reaccin positiva por lo comn ocurre en 2-5 minutos, mediante un tenue color rosa; no obstante, exhibe una marcada coloracin (rojo oscuro) cuando se lo deja durante 30 minutos. El mximo color se obtiene despus de 1 hora. La exposicin durante 1 hora o ms de un cultivo negativo con los reactivos VP puede mostrar un color similar al cobre por la accin del KOH sobre el alfa-naftol. IV. PROCEDIMIENTO Inoculacin. Con asa de platino, 1 a 2 colonias. Incubacin de 24 a 48 horas a 35-37 C existen microorganismos que precisan de otra temperatura de incubacin o de un tiempo ms prolongado. V. MATERIALES Medios de cultivo. Medio de Clark-Lubs modificado (Caldo MR/VP). El medio MR/VP comercial es una modificacin del medio de Clark-Lubs. Clark-Lubs utilizaron una concentracin de 1% de peptona y glucosa, pero una concentracin de no menos de 0,5% es el mnimo satisfactorio. Una concentracin de 0,5% de peptona otorga menos color al medio, lo que facilita la interpretacin de la reaccin. Reactivo. Se utiliza el reactivo VP de Barrit, que est compuesto por dos soluciones: a) alfa-naftol al 5% en etanol absoluto (intensificador del color), b) hidrxido potsico al 40% en agua (agente oxidante).

UNJBG- ECOLOGA MICROBIANA

2013

VI. RESULTADOS ESPERADOS Interpretacin de resultados. Despus de la incubacin aadir al caldo de cultivo 0,6 ml de la solucin A, y a continuacin 0,2 ml de la solucin B, agitando unos instantes para favorecer un mayor contacto del lquido con el oxgeno del aire. La lectura se efecta a los 10-15 minutos de aadir los reactivos, considerando como prueba positiva la aparicin de una coloracin roja. VP positivo (+): color rosado-rojo en la superficie del medio (acetona presente). VP negativo (-): color amarillo en la superficie del medio (igual color que el reactivo). Puede formarse un color cobrizo, pero es un resultado negativo (debido a la accin de los reactivos cuando se mezclan).

Serratia (positivo) VII. BIBLIOGRAFA

E. coli (negativo)

Jos Garca Bermejo, 2004. MODULO II, Microbiologa, Enzimologa e Inmunologa. Manual del Tcnico Superior de Laboratorio de Anlisis Clnicos. Primera Edicin.

UNJBG- ECOLOGA MICROBIANA

2013

Jean Mac Faddin, 2003. Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. Tercera Edicin.