Sem RMN

Brenda Fina
RMN, RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR

RMN es una espectroscopia basada en la absorcin de radiacin electromagntica de la regin de la radiofrecuencia (10MHz-1GHz). El fenmeno de RMN ocurre debido a las propiedades mecanocunticas de los espines, es decir, a las propiedades magnticas de los ncleos atmicos, los cuales cuando se colocan en un campo magntico intenso (B0), absorben la energa necesaria para que vayan a otro estado energtico. Si se aplica energa (E) que obligue a los ncleos a invertir el sentido de su orientacin con respecto al B, se dice que el sistema est en resonancia. Este fenmeno de excitacin de los espines nucleares se lo conoce como RMN, y la E aplicada, E, corresponde a la radiacin electromagntica de la regin de las radiofrecuencias. Descripcin Mecnico Cuntica Propiedades magnticas del ncleo: espn nuclear Los ncleos atmicos tienen espines que les confieren un momento magntico, es decir, ncleos magnticamente activos I. El espn es intrnseco del ncleo y est determinado por el nmero desapareado de partculas elementales (neutrones y protones) que lo forman. El modelo atmico describe al ncleo como un cuerpo esfrico con la carga nuclear uniformemente distribuida alrededor de su superficie. Np Par Par Impar Impar Nn par Impar Par Impar Spin 0 Inactivos Semienteros
1/2 3/2 1/2 3/2 1, 2
Un ncleo sin espn, tiene un momento magntico igual a cero porque no tiene carga circulando. Estos ncleos tienen un valor de espn igual a cero, I=0. Todos los ncleos que poseen un nmero msico(N) y un nmero de carga (Z) 12 16 par tienen un nmero de espn igual a cero (ej: C y O). Los ncleos que poseen un nmero impar de neutrones y protones generalmente tienen un nmero cuntico de espn entero distinto a cero porque el nmero total de nucleons (creo que se refiere a los neutrones y protones desapareados) desapareados es par, y cada uno contribuye en al nmero cuntico. Tambin estn los ncleos que tienen un nmero par de protones y un nmero impar de neutrones, o viceversa, que poseen un nmero de espn no entero (tienen nmero fraccionados) porque poseen cantidad de nucleons desapareados impares. Dentro de este ltimo grupo de ncleos, se encuentran ncleos con importancia biolgica como 13 15 19 31 H, C, N, F y P que tienen nmero de espn igual a , I=1/2. En el modelo, actan como cuerpos esfricos con carga uniformemente distribuida en su superficie que giran sobre un eje provocando la circulacin de la carga, y esto genera un campo magntico que da como resultado un momento magntico nuclear. Que tenga un I=1/2 significa que cualquier carga que se aproxime al ncleo va a experimentar el mismo campo magntico sin importar la direccin por la cual se acerca. Esto da como resultado, un momento elctrico cuadripolar igual a cero (igual que en los ncleos con I=0); este parmetro describe la forma efectiva que tiene la distribucin de la carga del ncleo elptico.
1
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Sin embargo, la mayora de los ncleos magnticos actan como cuerpos que giran sobre un eje con la carga distribuida de forma no esfrica, estos son ncleos con nmeros de espn igual 1 o igual a mltiplos enteros de . El modelo, los describe como elipsoides que giran sobre su eje principal. Estos pueden tener forma de prolato o de oblato, ambos presentan un campo magntico anisotrpico (diferentes caractersticas segn la direccin), es decir, que el trabajo electroesttico al traer una carga a una dada distancia es distinto segn la direccin a la cual se aproxime. Por esta razn, tienen momentos elctricos cuadripolares 2 14 17 33 35 distintos a cero, por convencin, el prolato tiene un valor mayor a cero ( H y N) y el oblato menor a cero ( O, S y Cl). Nmero Magntico Cuntico Una propiedad macano-cuntica del espn nuclear es que el valor promedio del vector del momento magntico sobre una direccin dada toma valores especficos descriptos por un grupo de nmeros cunticos magnticos, m=2I+1, integrado desde +I a I. (I= valor de spin) El vector del momento angular del espn, I, tiene magnitud igual a [I(I+1)] , y su componente en z es m. Tanto la direccin como la magnitud del vector del momento angular de espn estn cuantizados (slo pueden tomar valores determinados). En la ausencia de un campo magntico externo, este vector no tiene una direccin preferencial y el eje z es arbitrario; pero cuando se aplica un campo magntico externo, la direccin de este determina el eje z. El momento angular de un ncleo con espn dentro de un campo magntico externo, tiene dos direcciones posibles, Iz=+-1/2 (m = 2.+1= 2); mientras que un ncleo con espn igual a 1 tiene tres orientaciones posibles, Iz=0,+-1/2 (m = 2.1+1= 3).
1/2
Energa aplicada
Magnetizacin Nuclear Un ncleo cargado que gira sobre un eje crea un campo magntico y el momento magntico () resultante est orientado sobre el eje del espn y es directamente proporcional al vector del momento angular (I). = I es la cte giromagntica. Para un dado B, determina la diferencia de energa entre los dos estados de espn El momento magntico de un ncleo es paralelo al momento angular de espn si la cte giromagntica es positiva, y es antiparalelo si la cte giromagntica es negativa. En ausencia de un campo externo B0, todas las orientaciones 2I+1 de un ncleo con espn I tienen la misma energa. Esta situacin cambia cuando se aplica un B externo, donde la energa del momento magntico est dada por, E= - . B0 (producto escalar) Debido a que el eje z deja de ser arbitrario, y coincide con la direccin z del B, E=-z B0 Por lo mencionado antes, sabemos que: Iz=m E= B0 z=Iz Los ncleos con espn dan lugar a dos posibles estados: m=+1/2, -1/2. La diferencia de energa entre ambos est dada por,
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E= - B E= + B
E= B0 = h/2
E= B0 h/2 la diferencia de E es muy chica
= es la cte giromagntica, que es caracterstica de c/ncleo B0 = es el campo magntico externo h = es la cte de Plank Segn la ley de Plank, la diferencia de E entre los dos estados es: E= h, donde es la frecuencia de transicin, entonces:
B0 sensibilidad
E= h = B0 h/2
= B0 /2 [Hz]
Cada ncleo absorbe a una dada sensibilidad
Si la cte giromagntica es positiva, el estado de menor energa es +1/2; pero si la cte es negativa este es el estado de mayor energa.
En RMN se trabaja principalmente con ncleos que tienen I=1/2 porque, adems de estar presentes en las molculas biolgicas, son ms sencillos debido a que, en presencia de un B estos espines van a tener slo dos orientaciones posibles (a favor y en contra de B) y por lo tanto dos niveles de E. La situacin ms favorable, el estado de menor E (E), va a ser a favor del B; mientras que la situacin menos favorable, el estado de mayor E (E), va a ser en contra del B. Distribucin del ncleo entre los distintos estados energticos Cuando se aplica un B, los ncleos tienden a alinearse con el campo adquiriendo el estado energticamente ms favorable; esta alineacin se opone a la agitacin trmica de las partculas en general. El porcentaje de ncleos en cada estado cuntico se puede calcular por la distribucin de Boltzmann:
N N
=e
E kT
=e
h kT
Debido a que h <<kT a la temperatura que se realiza un experimento de RMN, hay solamente un pequeo exceso de espines en el estado de menor energa, en otras palabras, en las condiciones de experimentacin de RMN la diferencia de energa entre los estados es muy chica, entonces el estado de mayor energa est poblado. Por esta razn, la tcnica de
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RMN no es sensible comparada con otras espectroscopias (la relacin seal/ruido en RMN es baja). Para solucionar este problema se pueden usar campos magnticos ms fuertes y se pueden sumar muchos espectros (sumar scans) de manera que las seales se van sumando mientras que el ruido aleatorio se va cancelando; adems, es preferible usar ncleos con 1 ctes giromagnticas altas y que tengan abundancia natural, ej: H. Sustituyendo ,
N N
=e
hB0 2kT
En presencia de un B0, los spines no estn orientados totalmente a favor o en contra del campo, sino que estn inclinados un cierto ngulo y estn precesando alrededor de la direccin del campo con una velocidad B0=w0. si el B0 esta en la direccin z, los spines estarn distribuidos como un abanico. Luego, existe un vector a favor del B0 que va a tener mayor magnitud porque es mayor la poblacin de spines Magnetizacin resultante.
En el equilibrio, un diagrama de energa representando la distribucin de Boltzmann para 2n ncleos incluye los momentos magnticos individuales distribuidos en dos conos sobre el eje +z y el z. Dependiendo del signo de la cte giromagntica uno de los dos ejes va a estar un poco ms poblado que el otro dando lugar a una magnetizacin neta en esa direccin. Por ejemplo, si es positiva, una cantidad mayor de ncleos van a estar alineados con el campo, y la magnetizacin resultante tendr direccin +z. Si escribimos la ecuacin anterior como una serie de Maclaurin slo hasta el segundo trmino, obtenemos un importante resultado: N/N=1-hB/2kT La relacin entre los ncleos en un estado y en el otro est relacionada linealmente con el campo magntico; esto demuestra que la intensidad de la seal de RMN incrementa linealmente con la fuerza del campo magntico. Descripcin Mecnica Clsica Si consideramos un solo espn, es necesario hacer un anlisis mecnico cuntico porque los fenmenos atmicos no se comportan bajo las leyes clsicas (no obedecen la mecnica de Newton). Sin embargo, la seal observada en un experimento de RMN proviene de un gran conjunto de espines, entonces la seal detectada (el valor de la magnetizacin en el eje x o y) s se comporta de manera clsica. Esto es obvio si tenemos en cuenta que la muestra que utilizamos en un experimento de RMN es un objeto clsico, entonces se espera que se comporte como tal. Ahora consideramos una muestra compuesta por muchos ncleos idnticos con un I=1/2. Se puede representar un 1/2 momento angular con una longitud igual a [I (I+1)] y su componente en z es m. El principio de incertidumbre no nos permite especificar las componentes x e y del momento angular, slo sabemos que est en algn lugar en el cono alrededor del eje z. En usencia de un campo magntico B0, la muestra est compuesta por el mismo nmero de espines de distinta energa con sus vectores ubicados a ngulos () al azar sobre el cono. Los ngulos () son impredecibles, y en este paso consideramos los vectores de los espines como estacionarios. La magnetizacin de la muestra (M), su momento nuclear neto, es cero. (M=0).
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El efecto del campo esttico Dos cambios ocurren en la magnetizacin cuando hay un campo magntico presente: 1. Precesin Nuclear: la fuerza aplicada por el campo magntico sobre el eje de rotacin causa un movimiento NO en el plano de la fuerza, sino perpendicular a este plano. De esta forma, el eje de la partcula que est rotando se mueve en una rbita circular, se dice que precesa alrededor del vector del campo magntico aplicado con una velocidad angular igual a . 0= B0 [rad/s] La velocidad angular puede ser convertida en la frecuencia de precesin, 0= B0 /2 [Hz] Ecuacin de Larmor Si consideramos al ncleo como un imn que gira, podemos usar la ecuacin de Larmor para explicar el fenmeno de RMN. Esta ecuacin puede ser igualada a la ecuacin de la frecuencia de resonancia que se obtuvo teniendo en cuanta las propiedades mecnico cunticas de los ncleos. En la descripcin clsica, el ncleo experimenta una resonancia con una frecuencia de precesin (frecuencia de Larmor) que es proporcional al campo magntico a travs de su cte giromagntica. Se puede apreciar a partir de las ecuaciones hasta ahora descriptas, que la energa del sistema NO depende del momento magntico de ncleo, sino que slo depende de la proyeccin de este vector sobre en eje del B. todos precesan con una direccin segn la distribucin de Boltzman. La poblacin de 2. Magnetizacin nuclear espines en los dos estados se altera segn esta distribucin: aunque la diferencia de poblaciones es pequea, hay una magnetizacin (M) neta representada por un vector con direccin en el eje z y con una longitud proporcional a la diferencia de poblacin.
Marco Rotatorio de Coordenadas El modelo clsico describe la resonancia nuclear en trminos de la precesin del vector de magnetizacin alrededor del campo magntico aplicado con una frecuencia de precesin igual a la de Larmor. Una forma de ver este sistema, es a travs de un marco rotatorio de coordenadas. En esta representacin, los ejes cartesianos comunes, x, y y z, son remplazados por los ejes, x, y y z, los cuales rotan a la frecuencia de Larmor del espn. En este sistema, el vector de magnetizacin aparece estacionario. Es una forma de simplificar el anlisis de los resultados cuando se trabaja con complejas se secuencias de pulsos.
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El efecto del campo de radiofrecuencia Ahora supongamos que aplicamos un campo magntico oscilante en el plano xy con una frecuencia igual a la frecuencia Larmor de los espines. El ncleo va a experimentar un campo magntico esttico BI porque el campo magntico rotatorio est en fase con la precesin de los espines (B1 B0). Bajo la influencia de este campo magntico, la magnetizacin comienza a precesar alrededor de la direccin de este campo. Si aplicamos BI en un pulso de cierta duracin, la magnetizacin precesa al plano xy con la frecuencia de Larmor. El movimiento de la Magnetizacin Rotatoria (M) induce una seal en el detector que es amplificada y procesada.
Procesos de Relajacin Hay dos tipos de procesos de relajacin en RMN 1. El primero est relacionado con el establecimiento del equilibrio trmico debido a la asociacin de imanes nucleares con diferentes energas. Suponiendo que la frecuencia de Larmor es similar para todos los ncleos, estos se encuentran en fase y pueden intercambiar energa. El sistema vuelve a su equilibrio trmico de forma exponencial, con una cte de tiempo denominada tiempo de relajacin longitudinal, Tl . Esta cte refleja la eficiencia de acoplamiento entre un espn nuclear y su entorno (lattice), por eso tambin se denomina tiempo de relajacin spin-lattice. Tl es una medida de la regeneracin de la componente en Mz, la cual es funcin del intercambio de energa. Este proceso depende de cmo la muestra le puede ceder energa al medio; por esto es un proceso conservativo. Este proceso de relajacin es un efecto -3 2 energtico, que toma valores entre 10 a 10 s para lquidos y un rango mayor para slidos. Un valor de Tl menor implica un acoplamiento efectivo, y viceversa. El T1 dar informacin acerca de: Tiempo de correlacin rotacional (r) Acoplamiento dipolar 2. El segundo proceso est relacionado con la perdida de fase de algn ncleo con respecto a todos los ncleos que estn precesando a la misma frecuencia. Si por cualquier proceso los ncleos pierden su coherencia de fase, va a haber tantos componentes negativos como positivos en el plano xy dando como resultado un vector que se mueve hacia el eje z. Este proceso que involucra la cada de las componentes xy de la magnetizacin a cero, ocurre exponencialmente con una cte de tiempo denominada tiempo de relajacin transversal, T2. Esta relajacin se debe a procesos no conservativos porque son procesos que dependen de la entropa del sistema. T2 est relacionada con el ancho de banda espectral: 1/2= 1/ T2. Los valores tpicos de T2 en RMN de protn son del orden de los segundos, que corresponde a un ancho de banda de 0.1Hz. Hay que tener en cuenta que en la prctica el campo magntico no es homogneo, y ests diferencia son las que ms afectan a la frecuencia de Larmor y por ende al ancho de banda. Se puede dar por: Interacciones spin-spin por desfasajes en Mxy Imperfecciones en la homogeneidad del magneto No puede ser mayor que T1
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T2 esta relacionado con r: T2 1/ancho de banda T2 1/ r
Ancho de banda r Para MM de PM, r BAJA RESOLUCION ancho de banda
Molculas grandes, como la protenas, tiende a relajarse lentamente debido a la gran interaccin con el medio, dando como resultados Tl grandes. Hay que tener en cuenta que distintas regiones pueden tener distintos tiempos de relajacin, lo que indica diferencias en la movilidad de la molcula. r: tiempo de correlacin rotacional Segn las medidas de r se pueden dividir a las protenas en: Rotacin rpida: c =r=10 s 2 2 wH r <<1 -1 T2 =k. 5 c -1 T2=T1 T1 =k. 5 c Rotacin lenta: r=10 s 2 2 wH r >>1 -1 T2 =k. 15 c -1 2 T2>>T1 T1 =k. 2/ wH c
-8 -11
wH r=2,5 10
-2
wH r=250
1/ T2=
MM > r > nuevo problema en protenas (MM), mucho .

El T1 y el T2 dependen de cada tomo, por lo que nos dan informacin sobre la movilidad. Efectos del medio ambiente nuclear en RMN La frecuencia de Larmor de un dado ncleo est fuertemente afectada por su entorno qumico. Como consecuencia, el espectro de RMN de una protena da informacin que permite elucidar su estructura qumica. El corrimiento en la frecuencia de absorcin de un ncleo debido a su entorno qumico se denomina Desplazamiento Qumico (Chemical shift). Otro efecto que tiene el entorno nuclear sobre los ncleos es el Desdoblamiento spin-spin. Mientras que el primer efecto es dependiente de la fuerza del campo magntico, el segundo efecto no lo es.
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Parmetros en RMN: Desplazamiento qumico Acoplamiento spin-spin: Escalar y Dipolar T1 T2 Desplazamiento Qumico Este fenmeno ocurre porque el campo magntico, B, que experimenta el ncleo atmico difiere ligeramente del campo magntico externo aplicado, B0. B es un poco ms pequeo que B0 (B< B0) debido al apantallamiento que producen los electrones cercanos. El campo externo induce la circulacin de los electrones alrededor de las orbitas atmicas, que 4 5 genera un pequeo campo magntico B opuesto en direccin al B. B es tpicamente unas 10 -10 veces menor que B. El campo que siente el ncleo esta dado por, B= B - B = B (1-)
Donde es la cte de apantallamiento, y es muy sensible al entorno qumico, depende del medio. La frecuencia de resonancia se transforma en, = B(1-)/2 la frecuencia de resonancia de un ncleo en su tomo es menor que la del mismo ncleo desnudo. El desplazamiento qumico no puede compararse con resultados de diferentes equipos porque depende de las propiedades del campo magntico. Adems, la cte de apantallamiento no es una medida conveniente para calcular el corrimiento. Por estas razones, se define el desplazamiento qumico en trminos de la diferencia de resonancias entre el ncleo de inters y un ncleo de referencia (ej: tetrametil silano, TMS): = (x-ref)/o [ppm] o es la frecuencia del campo es independiente del B0 De esta forma, este parmetro es independiente del equipo que se use. El desplazamiento qumico depende de muchos factores, pero el ms importante y significativo es la densidad electrnica del entorno. Una alta densidad electrnica causa un gran efecto de apantallamiento (B), lo que implica que el campo magntico aplicado debe ser incrementado para obtener resonancia. Esto da lugar a un corrimiento de la seal a regiones de mayor campo y menor . B se debe B0 Lo contrario sucede si la densidad electrnica es baja. Por ejemplo, si un protn est unido directamente a un tomo electronegativo como un grupo carbonilo, que tiene una densidad electrnica baja, el desplazamiento qumico ser grande y tendr valores de altos.
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tomos electronegativos densidad electrnica < apantallamiento La intensidad de absorcin es estrictamente proporcional a la concentracin de ncleos que dan esa seal. Ncleos idnticos dan la misma seal.
Arom ati co Amina/da
A g u a HC HC,
Protones amdicos Protones

0
=7 y 10 ppm
= 4 y 6 ppm
10
HN backbone
En el caso de compuestos que contienen dobles o triples enlaces, los no pueden explicarse solamente por los efectos locales. Pueden ser explicados si se tienen en cuenta las propiedades magnticas anisotrpicas de estos enlaces. Teora de la corriente del anillo: Las propiedades magnticas de los compuestos aromticos cambian significativamente dependiendo de la orientacin del anillo con respecto al campo magntico externo, este efecto se denomina efecto de la corriente del anillo (ring-current effect). Cuando el plano del anillo se encuentra perpendicular al campo magntico externo se induce una corriente de electrones . El campo inducido tiene direccin opuesta al campo aplicado arriba y abajo del plano de la molcula, y la misma direccin en los lados de la molcula. Entonces, un protn que se encuentra cerca de un anillo aromtico es apantallado si est arriba o abajo del centro del anillo plano, mientras que es desapantallado (su aumenta) si se encuentra por fuera del plano del anillo. Este efecto desaparece si el anillo tiene otra orientacin con respecto al campo externo. En el caso de dobles o triples enlaces sucede lo mismo si la corriente de electrones es perpendicular al campo externo. Acoplamiento Espn-Espn Hay dos tipos de acoplamientos: el acoplamiento escalar y el acoplamiento dipolar. Ambos son propiedades espectroscpicas fundamentales en la interpretacin de espectros complejos de RMN. Acoplamiento escalar Se transmite a travs de los enlaces No depende de la orientacin Depende del ngulo diedro Acoplamiento dipolar Se transmite a travs de una distancia < 5 Depende de la orientacin
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El acoplamiento escalar se representa como la influencia que ejerce un ncleo activo en RMN sobre otro ncleo activo. Al tener dos ncleos acoplados, uno de ellos siente a travs de los enlaces qumicos un incremento o decremento de campo magntico debido al espn a favor o en contra del ncleo vecino. Este fenmeno produce seales de RMN ms complejas, por ejemplo, si un ncleo A se acopla a otro ncleo B con I=1/2, la seal de A se ver como dos seales de intensidades 1:1. La distancia entre estas dos seales se conoce como la cte de acoplamiento, J. Esta cte depende de la estructura nuclear y NO del campo magntico externo. Otro ejemplo, si un ncleo B se acopla con dos ncleos equivalentes con I=1/2 la seal ser un triplete con intensidades 1:2:1, la distancia entre las seales con intensidades 1 y 2 es la cte de acoplamiento, y la distancia total entre las seales con intensidades 1:1 es dos veces esta cte. El acoplamiento escalar se observa de 1 a 3 enlaces de distancia y no se manifiesta entre ncleos equivalentes. La regla general es que el nmero de desdoblamientos de banda en un espectro de primer orden es igual a n + 1, donde n es el nmero de protones magnticos equivalentes. Los valores de J van de 0 a 20 Hz aprox.
Hay un orden de J: Primer orden: interaccin entre 2 ncleos unidos por un enlace. Si este enlace es CC J si paso a un enlace doble o triple. Segundo orden: ncleos separados entre 2 enlaces. Ej: HCH Tercer orden: Acoplamiento de tres enlaces: es el acoplamiento escalar ms til para analizar estructuras moleculares. El valor de este acoplamiento esta dado por la ecuacin de Karplus: 2 J () = A cos + B cos + C Donde es al ngulo diedro entre protones. Los valores de A, B y C son parmetros experimentales. Los valores tpicos son A=2Hz, B=-1Hz y C=10Hz.
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Esta ecuacin muestra como a partir de la constante de acoplamiento entre el NH y el C se puede obtener informacin conformacional del backbone de la protena a travs de su ngulo diedro. Los dos mayores componentes de la estructura secundaria de una protena, hlices y lminas : -hlice tiene un =120 J< 6Hz -sheet tiene un =180 J= 7Hz Tcnica de irradiacin selectiva 1 Se utiliza para averiguar que H estn acoplados con otros. HA esta acoplado con HM y HX veo 2 dobletes, uno con JAX y el otro con JAM. En un experimento de irradiacin selectiva: 1 se realiza un espectro de RMN 1D (normal) de protn para obtener todas las seales y saber a que frecuencia absorben. 2 se realiza un espectro de protn, en el que adems de excitar todas las bandas, se excita selectivamente al ncleo que absorbe a 8,5 ppm. Excitando No se tienen en cuenta porque se continuamente a la frecuencia de absorcin del ncleo x, hago que se igualen las intercambian muy rpido con el solvente poblaciones y como resultado la seal desaparece. Se hace que HA tenga transiciones muy rpidas a favor y en contra del campo B0 de modo que ahora HA ve un promedio y el doblete desaparece. El acoplamiento dipolar se presenta a travs del espacio, es decir, que se requiere proximidad espacial y depende de la orientacin del campo magntico externo. Este acoplamiento se presenta como la influencia que ejerce el campo magntico de un ncleo activo sobre otro ncleo activo cercano. 15 15 1 El B en N en la direccin del B0, puede o en relacin a B0 dependiendo de la orientacin del vector N H y 1 del spin H.
B0
Solo la componente paralela al campo magntico externo lleva a la interaccin. La componente z del campo dipolar del ncleo I cambia la frecuencia de resonancia del ncleo S por una cantidad que depende en la distancia internuclear r y en el ngulo .
B0 C
15 1
Los acoplamientos dipolares ensanchan el espectro de RMN, en estado solido son muy anchos. En solucin, este acoplamiento no se observa dado que el promedio de los diferentes acoplamientos en molculas que se encuentran en movimiento aleatorio con respecto a B se promedian obteniendo un valor cero, debido a que las molculas se reorientan muy rpido. Entonces se ve un promedio en el tiempo, as, se resuelve mejor, pero se pierde informacin si hay un poco de alineamiento Residual Dipolar Coupling (RDC). Pese a esto, este acoplamiento se manifiesta a travs del efecto nuclear Overhauser (NOE). Este efecto es un cambio de intensidad que nace de esta interaccin dipolar. La intensidad de la seal debido al NOE guarda una relacin con la distancia entre los ncleos interactuantes: 6 I (NOE) = k / (rAB)
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La constante de acoplamiento dipolar es un vector: Rjk Los acoplamientos dan informacin: Dipolar NOE y RDC Escalar J
DD
= j k h / 4<rjk >
TCNICAS EXPERIMENTALES Transformada de Fourier Tradicionalmente, se utilizaban espectrmetros de onda continua, lo que implicaba largos experimentos y una recopilacin de datos muy lenta. Luego se utilizaron espectrmetros con muchos canales, lo que permita la medicin simultnea de numerosos puntos; pero el instrumento tiene como lmite la cantidad de canales que puede tener. No fue hasta que se crearon los instrumentos de pulso de Fourier que se pudo utilizar la tcnica de RMN de manera sensible y de alta resolucin. Como se tienen que resolver diferencias de energa muy chicas, se necesitara mucho tiempo; para cada valor de frecuencia hay que hacer muchos espectros se excita a TODAS las frecuencias con un pulso que dure poco tiempo. La intensidad que corresponde a cada frecuencia se obtiene analizando cmo vuelven al equilibrio los momentos magnticos luego del pulso.
Bobina de deteccin
En el instrumento de pulso de Fourier, los datos son recolectados en funcin del tiempo; pero el investigador est interesado en la respuesta de los sistemas de espn en funcin de la frecuencia. Por suerte, estos dos dominios estn relacionados y se pueden convertir uno en el otro usando un procedimiento denominado Transformada de Fourier. Esta transformacin, relaciona los datos en funcin del tiempo f(t) con los datos en funcin de la frecuencia f():
f ( ) = f (t ) e it dt
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Esta es una transformada continua porque la integracin abarca desde infinito positivo a infinito negativo. En la prctica puede acotarse sobre un rango de tiempo finito:
f ( ) = f (t ) e it t
La existencia de dos dominios relacionados nos permite definir las Parejas de Fourier. Algunas de stas son especialmente tiles en RMN. Por ejemplo, la transformada de Fourier en funcin del tiempo cayendo exponencialmente representada por una lnea Lorenzana a una frecuencia cero, es idntica a la relacin entre el FID (free induction decay) y el espectro de RMN. Otra pareja de Fourier es la transformada de Fourier del pulso de radiofrecuencia. Un resultado bsico de la transformada de Fourier tiempo-frecuencia es que un corto pulso en el tiempo puede ser considerado como una fuente de multifrecuencia, lo que permite la excitacin simultnea de diferentes frecuencias de resonancia en un experimento de RMN. Para clarificar este punto, uno examina la magnetizacin de la muestra bajo la influencia de un campo de radiofrecuencia esttico. En el marco de referencia, la magnetizacin nuclear, Mj, de un ncleo con frecuencia resonante, wi, precesa con una velocidad angular igual a w alrededor del campo efectivo: 2 2 1/2 |Beff| = (1/) [(i ) + (Bl) ] Bl es elegido de modo que se cumpla: Bl >>2; donde (Hz) es todo el rango de desplazamiento qumico de la muestra medido con respecto a la radiofrecuencia, entonces para cualquier i del espectro el trmino i puede ser insignificante, haciendo Beff Bl. Esto significa que el vector de magnetizacin precesa alrededor de Bl para TODOS los ncleos con la frecuencia de Larmor en el rango , es decir, se aplica un B de forma que TODOS los ncleos estn precesando con la de Largor en . El ancho del pulso de tiempo para cubrir este rango de frecuencia debe ser << 1/. Denominamos al rango de frecuencias a ser examinado. Debido a lo heterogneo que es el sistema de deteccin, no es la frecuencia de resonancia, i, lo importante sino la diferencia entre esta y el campo de radiofrecuencia aplicado, i . Si la del B1 es elegida dentro del rango , algunas de las diferencias van a ser positivas y otras negativas. Durante la recoleccin de datos, como el detector mide en funcin del tiempo, no puede distinguirse entre frecuencias positivas y negativas. Como las frecuencias negativas y positivas difieren en sus fases, se utilizan dos detectores de fase para revelar el espectro. El anlisis de Fourier tambin es esencial para entender el efecto del pulso propiamente dicho. Un pulso rectangular en el tiempo de radiacin monocromtica con frecuencia, , puede ser descripto en funcin de la frecuencia como una banda centrada en . Esta frecuencia monocromtica es producida por un generador de pulso y se denomina frecuencia de espectrmetro. Siguiendo las reglas de la transformada de Fourier, si la duracin del pulso disminuye, el ancho de la banda de la frecuencia aumenta. Se asume que el largo del pulso es relativamente menor que Tl y T2 para que no se produzca la relajacin durante el tiempo que dura el pulso. El intervalo entre pulsos se denomina T. Durante este tiempo, una seal de radiofrecuencia en funcin del tiempo denominada FID (Free induction Decay) es emitida por los ncleos excitados a medida que se van relajando. FID es detectado con un espiral recibidor (receiver coil), ubicado perpendicular al campo magntico esttico. Espectrmetro de RMN La sensibilidad y resolucin de espectrmetro dependen de la fuerza y calidad del campo magntico. El campo debe ser altamente homogneo y reproducible. Estas caractersticas slo pueden ser alcanzadas con un solenoide superconductor. Este espiral de radiofrecuencia acta como detector y como transmisor de la frecuencia de resonancia. La
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seal medida procesada en una computadora es una lnea de baja frecuencia obtenida de la diferencia entre la frecuencia transmitida y la detectada. La muestra es ubicada en el centro del imn cilndrico para asegurarse de que todos los ncleos magnticos experimenten el mismo campo. El imn superconductor opera a la temperatura del Helio lquido (4K), pero la muestra est a temperatura ambiente. Con el objetivo de perturbar el sistema de espn con energa del orden de las radiofrecuencias, el espectrmetro posee sofisticados programas de pulso y unidades de transmisin que permiten la aplicacin de complejas secuencias de pulsos. La fuente de la radiofrecuencia es un cristal oscilador estable que funciona continuamente, y todas las frecuencias en el espectrmetro derivan de l. La seal de onda continua proveniente de esta fuente se controla en amplitud y fase con una unidad de puerta. La secuencia pulso/adquisicin/retardo se repite N veces para aumentar la relacin seal/ruido. Experimentos de Simple Pulso Adquisicin y procesamiento de datos Despus de un retardo inicial, se le aplica el pulso a la muestra con un espiral de radiofrecuencia. El detector se enciende y, luego de un tiempo muerto corto, se mide la respuesta del sistema de espn y se almacena en la computadora. El tiempo de adquisicin de datos debe ser largo para asegurarse de que la respuesta del sistema decay lo suficiente hasta hacerse insignificante (un par de veces T2). Otro retardo permite que la muestra de espines vuelva completamente al equilibrio (relajacin Tl). Cuando la frecuencia del pulso, , se iguala a la frecuencia de Larmor, el vector de magnetizacin nuclear se inclina fuera de la direccin z. Como el pulso es sobre la direccin x, y el ngulo de inclinacin es hacia y. Esto puede explicar por que RMN es una tcnica de resonancia. Resonancia es una condicin en la cual la energa es trasladada de tal manera que una pequea perturbacin produce un gran cambio en algunos parmetros del sistema perturbado. RMN es una tcnica de resonancia porque una pequea perturbacin peridica, Bl, produce un gran cambio en la orientacin del vector de magnetizacin de la muestra. El ngulo de inclinacin est dado por, = B l tp
Free Induction Decay (FID) Magnetizacin por un pulso de 90 En la prctica, el B0 no es completamente homogneo, lo que causa que los grupos de ncleos en distintas partes de la muestra experimenten diferentes B0 locales, es decir, que causa divergencias locales en la frecuencia de Larmor haciendo que los vectores de magnetizacin nuclear se separen unos de otros. Esto es lo que principalmente afecta a T2, que representa la relajacin de la magnetizacin en el eje xy, en otras palabras, es el proceso por el cual la componente y de la magnetizacin se vuelve cero. Al mismo tiempo, el proceso de relajacin Tl provoca que la magnetizacin vuelva al equilibrio en la direccin z. Como la no homogeneidad del campo provoca que T2 sea menor a Tl, ocurre una situacin intermedia en la que la componente de la magnetizacin en y se vuelve cero antes de que la poblacin de espines pueda llegar al equilibrio de Boltzmann. Despus de un tiempo (despus de cinco veces Tl) la magnetizacin alcanza el equilibrio. A medida que la componente y disminuye, el voltaje oscilante del espiral tambin decae y alcanza el valor cero, aun cuando los espines no alcanzaron el equilibrio. El registro del voltaje recibido en funcin del tiempo se denomina FID,
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porque los ncleos pueden procesar libremente en la ausencia de Bl. FID es la sumatoria de los voltajes oscilantes individuales provenientes de los distintos ncleos de la muestra, cada uno con su frecuencia, amplitud y T2 caracterstico. FID es la pareja de Fourier del espectro de frecuencias de RMN.
Experimentos de Mltiples Pulsos En un experimento de mltiples pulsos, una secuencia de pulsos de radiofrecuencia especficos es aplicada a la muestra antes de medir FID. Estos experimentos proveen informacin que es imposible de obtener con los experimentos de simple pulso. Una secuencia de pulso est definida por la amplitud y el ancho de cada pulso y el tiempo de demora entre ellos (T). Hay una gran cantidad de experimentos de pulsos mltiples, pero todos s pueden dividir en tres grandes grupos: 1. Grupo I: incluye secuencias de pulsos para la medicin de los tiempos de relajacin. Para medir el tiempo de relajacin longitudinal (Tl) se utiliza el mtodo de inversin-recuperacin (inversin-recovery) que se basa en una secuencia simple de dos pulsos. Tambin incluye el mtodo de espn- eco (spin-echo) para medir el tiempo de relajacin transversal (T2), y se basa en una secuencia de pulsos distintos. 2. Grupo II: incluye tcnicas de transferencia de la polarizacin a travs del acoplamiento escalar de heteroncleos con el fin de aumentar la sensibilidad. Estas tcnicas son importantes para la observacin de ncleos raros con una cte giromagntica baja. El truco bsico implica borrar la polarizacin de los ncleos ms sensibles (con cte giromagnticas altas) para poder observar la polarizacin de los menos sensibles. Uno de los mtodos ms simples es el INEPT, aumento del ncleo insensible por transferencia de polarizacin. Hoy en da casi todos los experimentos de RMN heteronucleares y multidimensionales usan el mtodo INEPT para transferir la magnetizacin entre distintas especies de espn, pero la gran desventaja de esta tcnica es que su eficiencia se deteriora a medida que aumenta el tiempo de correlacin rotacional (movimiento browniano molecular). Hay otra tcnica que supera esta desventaja porque en independiente del tiempo de correlacin rotacional, CRIPT, transferencia de polarizacin por la polarizacin inducida de la relajacin cruzada. La combinacin de estas dos tcnicas nos lleva a otra altamente eficiente para muestras en solucin de molculas de gran tamao, CRINEPT. 3. Grupo III: usa el efecto nuclear Overhauser (NOE) basado en la transferencia de polarizacin a travs de acoplamiento dipolar.
Brenda Fina
Mtodo de inversin recuperacin para medir Tl
Se eligen valores pequeos entre 4-5 veces T1 Durante el intervalo , el sistema regresa al equilibrio por el proceso de relajacin longitudinal. El proceso de relajacin espn-espn no est involucrado en este caso porque el vector de magnetizacin, M, se encuentra en el eje z. A medida que los momentos magnticos individuales vuelven a sus orientaciones ms favorables sobre el eje +z, el vector de magnetizacin neto se vuelve cada vez ms corto sobre la direccin z. Dependiendo de la duracin del retardo (), M pasa por cero y finalmente alcanza su magnitud original en el eje +z. Con el fin de determinar la extensin de la relajacin, M debe convertirse en una magnetizacin observable en el plano xy. Esto se logra aplicando un segundo pulso, pero en este caso de 90. Dependiendo de cuan negativa sea todava la magnetizacin (todava est en el eje z), rotar hacia el eje +y; pero si la relajacin ya se completo cuando se aplica este pulso la seal rotar hacia el eje y. La intensidad I del pico que resulta de la transformada de Fourier del FID vara con desde un valor mximo negativo para =0, a un valor mximo positivo en =. I = I [1-2 e ] Si I=0 /T1 = ln 2
(-/Tl)
El efecto del espn-eco para medir T2 Eco de espn: es un pulso de magnetizacin que se deja dispersar, es reflejado, y despus es detectado como otro pulso un tiempo ms tarde.
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La secuencia de pulsos de esta tcnica permite la medicin independiente de la componente de no homogeneidad del campo magntico externo. Se debe tener en cuenta que la magnetizacin en el plano xy va a ser perdido por procesos * que no afectan a la componente z. la cte de velocidad para esto es la reciproca de la cte de tiempo de FID, T2 . * T2 esta dado por: Heterogeneidad de B0 * Tiempo de relajacin spin-spin T2 .
El pulso inicial de 90 inclina el vector de magnetizacin sobre el eje y. Si los ejes estuvieran rotando exactamente a la frecuencia de Larmor de los ncleos, el efecto de T2 es el gradual acortamiento de M en la direccin y. Pero como B0 no es perfectamente homogneo, algunos de los espines de la muestra precesan ms rpido (1 y 2) y otros ms lento (3 y 4) que el marco de coordenadas rotatorio; los ms rpidos se mueven en contra de las agujas del reloj mientras que los ms lentos lo hacen en direccin de las agujas. Como resultado de esta disparidad, los vectores de los espines se dispersan (se separan) sobre el plano xy durante 1, despus del pulso de 90. Al final de 1, se aplica un pulso de 180 que manda los espines al eje +y. Los vectores dispersados todava precesan en la misma direccin y a la misma velocidad. Durante el 2 (misma duracin que el anterior), todos los vectores se refocalizan sobre el eje +y para dar la magnetizacin mxima en el plano xy (este es el eco). Si se monitorea la seal de RMN durante esta secuencia 90- -180- , la seal desaparece durante el primer y despus se recupera para dar el mximo, el eco de espn, cuando los vectores son refocalizados. La amplitud se reduce por la relajacin T2 y por los efectos residuales del sistema espn-lattice. La cte de tiempo por la disminucin de la magnitud del eco es la verdadera T2, porque los efectos de la prdida de homogeneidad del B0 son eliminados en el proceso de refocalizacin. Nuclear Overhauser Enhancement (NOE) permite medir interacciones dipolares El NOE se ilustra como un sistema de 2 spines I y S no equivalentes y sin acoplamiento escalar (J=0). Cuando uno es excitado (S), el dipolo magntico perturba el estado de equilibrio del otro (interaccin dipolo-dipolo), producindose lo que se conoce como relajacin cruzada: un spin transfiere magnetizacin a travs del espacio al otro. Por tanto, la intensidad de la seal del espn I cambia cuando se perturba el estado de equilibrio del espn vecino. La perturbacin puede realizarse mediante saturacin o inversin con pulsos de radiofrecuencia. El cambio de intensidad que nace de esta interaccin dipolar se denomina efecto Overhauser nuclear.
Sin acoplamiento escalar el espectro de RMN consiste en un singlete en cada . Luego de la saturacin de S, I puede volverse: Mas fuerte Mas dbil invertido
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Sistema de spin: cuando un ncleo se excita como en RMN, la diferencia de energa entre los estados fundamental y excitado es muy pequea, entonces los ncleos permanecen bastante tiempo en el estado excitado y se relajan lentamente. La forma de volver al estado fundamental es transfiriendo la energa a los ncleos vecinos. As, cuando se satura un spin, este va a volver al estado fundamental transfiriendo la energa a los ncleos vecinos de tal manera que se altera la diferencia de poblacin entre los estados fundamental y excitado de ste ltimo y esto se manifiesta como un cambio en la intensidad de la seal. El cambio de intensidad del espn I est gobernado por tres probabilidades de transicin: de cero, uno y doble cuanto, denominadas W0IS, W1IS y W2IS, respectivamente. Estas describen los mecanismos de relajacin cruzada en un sistema ideal de dos espines.
No se ven porque S esta saturado W0 y W2 gobiernan el regreso al equilibrio
Sin embargo, cuando el sistema vuelve al equilibrio NO hay Reglas de seleccin (vuelve por donde puede). Si W2 domina:
Vaco el excitado y lleno el fundamental
intensidad I ( seal)
NOE +
Si W0 domina:
Vaco el fundamental y lleno el excitado
intensidad I ( seal)
NOE -
La diferencia entre estas probabilidades (W2 - W0), se denomina constante de velocidad de relajacin cruzada (IS), y describe la velocidad de las transiciones dipolo-dipolo que dan lugar al NOE. Por tanto, IS es una medida de cun rpido crece el NOE entre los spines I y S. El otro trmino (IS), se llama constante de velocidad de relajacin dipolar longitudinal (W0 + 2W1 + W2) y define la parte del mecanismo de relajacin responsable de restablecer el estado de equilibrio del spin I. Por tanto, incorporando estas definiciones y considerando, por ejemplo, la saturacin del spin S, en el estado estacionario debe cumplirse que dIZ/dt = SZ = 0, con lo que: NOE = (W2 - W0) / (W0 + 2W1 + W2)= IS / IS De que depende si la relajacin es por W2 o W0? Depende del tiempo de correlacin rotacional de la protena:
Brenda Fina
Molculas pequeas: movilidad rpida, c 10 s; c >>, c <<1. Dado que: W0 2c /r y W2 12c/r

6 6
-11
-1
W2 > W0
-1
NOE >0
2 2
Macromolculas: movilidad lenta, c 10-8s; c << , c >>1. Dado que:
W2 < W0
NOE <0.
Por supuesto, en la realidad, no existen sistemas de espines ideales y la relajacin dipolar entre los espines I y S no es el nico mecanismo por el que tiene lugar la relajacin. La interaccin dipolar depende de: tiempo de correlacin rotacional porque ste es capaz de modular la velocidad de relajacin 1 distancia entre los H interactuantes 3 Interaccin dipolar c/ r A su vez, el NOE (interaccin dipolar) NOE c / r NOE con la distancia y mas all de los 5 la interaccin es muy dbil y NO se ve. Esta tcnica de transferencia de la polarizacin se basa en aplicar selectivamente un campo de radiofrecuencia saturante al espn con mayor cte giromagntica, S. Esto resulta en una redistribucin de la poblacin de espines de S que provoca una magnificacin de la polarizacin de los espines I, suponiendo que los procesos de relajacin son favorables. El campo de radiofrecuencia selectivo se aplica en la posicin donde se encuentra el pico de resonancia del espn que quiero saturar. Cuantitativamente, el NOE se expresa en trminos del incremento relativo de la intensidad de la seal: NOE= (I-I) / I Donde I e I son las intensidades con y sin la saturacion. NOE es la consecuencia de la modulacin (modulacin: modificacin de la frecuencia o amplitud de las ondas elctricas) del acoplamiento dipolo-dipolo entre dos espines a travs del movimiento Browniano. La ecuacin que describe a NOE: NOE f(r) f (C) El trmino f(rIS) es un efecto de relajacin cruzada debido a la interaccin dipolo-dipolo. 3 3 6 1/r x 1/r = 1/r Esta ecuacin demuestra porque NOE es aplicable a ncleos acoplados que se encuentran muy cercanos, aproximadamente a 5 de distancia. El mximo valor de NOE para el caso de heteroncleos est dado por, NOEmax = 0.5 S/I +1 Donde S/I es el radio de las cte giromagnticas del ncleo saturado y del ncleo observado. Una de las principales dificultades que surgen cuando uno quiere correlacionar las intensidades de NOE con las distancias intramoleculares es la difusin de espn. Los arreglos geomtricos de los protones dentro de las estructuras espaciales de las biomolculas permiten que la difusin de espn se d en una variedad de rutas distintas a la relajacin cruzada directa que nos interesa analizar. Estas relajaciones cruzadas subsecuentes afectan significativamente el NOE resultante.
2 2 6
El trmino f(C) muestra que el fenmeno de NOE est relacionado con la relajacin del espn.
Brenda Fina
NOE vara como una funcin del producto de la frecuencia de Larmor y el tiempo de correlacin -10 -12 8 9 rotacional (C). C es del orden de 10 -10 s para molculas pequeas y es del orden de 3.6x10 -3.6x10 rad/s. Entonces el producto C es aproximadamente 0.1-0.01. Igualmente, hay que tener en cuenta que C aumenta con el tamao de la molcula y la viscosidad del solvente. 2 2 Si el producto C<<0.1, el trmino C contribuye muy poco y el NOE est cercano a +0.5. Pero cuando el producto C = 10 o ms, el NOE se acerca al lmite de -1, que corresponde a la desaparicin de la seal de I. Tambin se puede irradiar un H y observar la relajacin de un heteronucleo con spin ( C). Respecto al equipo lo que se hace es realizar una serie de 1 Pico del H saturado invertido experimentos en los cuales alternativamente se adquiere un espectro saturado y uno sin saturar. El quipo registra el espectro del NOE diferencial, lo cual es simplemente la resta algebraica de los 2 espectros. En el caso que I>I0 NOE >0. 1 NOE >0 Como en una protena hay muchos H, uno tendra que irradiar a cada uno para ver lo que le sucede al resto para solucionar este problema se diseo RMN en 2 dimensiones. Aproximaciones para identificar NOEs 1 1 15 13 H- H Homonuclear N- o C- Heteronuclear 1 1 2D H H 3D
1 1 13
H H H
3D
15
H H
13
H H
RMN en Dos Dimensiones Tiempos mayores Mayor resolucin El trmino RMN en una dimensin se refiere a un experimento en el cual la seal transformada se presenta en funcin de de una sola frecuencia. Anlogamente, en un experimento de dos dimensiones el espectro de RMN se presenta en funcin de dos frecuencias. Un tpico experimento en dos dimensiones consta de cuatro perodos sucesivos: preparacin, evolucin, mezclado y deteccin. El perodo de preparacin generalmente consiste en un tiempo de demora durante el cual se alcanza el equilibrio trmico, p. Despus de esta etapa, el sistema de espines est preparado para alcanzar un estado de no equilibrio inicial, normalmente debido a un pulso de radiofrecuencia de 90. La etapa de evolucin define el tiempo t1. Las seales provenientes de los tiempos del perodo de evolucin y del perodo de deteccin, t1 y t2, se mezclan en el tiempo de mezclado, m. La adquisicin de datos de las seales de RMN se realiza slo durante el
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perodo de deteccin, t2. Variando el tiempo de demora t1 de forma sistemtica, y manteniendo los otros parmetros inalterados, se obtiene una matriz del tipo s(t1, t2). Haciendo una doble transformada de Fourier obtenemos el espectro en dos dimensiones S(1, 2). Clasificacin de los experimentos en dos dimensiones segn Ernst: 1. COSY (correlation spectroscopy), este experimento est diseado para correlacionar las transiciones de espines acoplados por transferencia de magnetizacin transversal desde una transicin a otra en el curso de procesos de mezclado especialmente diseados. Es un experimento en 2D a partir del cual se obtiene informacin de la estructura 2ria y 3ria de una protena teniendo en cuenta SOLO los acoplamientos escalares spin-spin. 2. Homonuclear or Heteronuclear Two-dimensional J-resolved Spectroscopy o Spin-echo Spectroscopy (Espectroscopia de espn eco), estos experimentos fueron diseados para separar las diferentes interacciones (corrimiento qumico y acoplamiento espn-espn) en dimensiones ortogonales (que forman ngulo recto) de frecuencia, con el propsito de resolver seales que se superponen en experimentos de una dimensin. Ests tcnicas requieren condiciones particulares para que la informacin obtenida en el perodo de evolucin y la obtenida en el perodo de deteccin sean distintas. 3. NOESY (Nuclear Overhauser Enhaced Spectroscopy), esta tcnica se utiliza para estudiar procesos dinmicos, como intercambio qumico, relajacin cruzada o el efecto de Overhauser transitorio. Espectroscopia de Correlacin (COSY) n La secuencia de pulso es 90-kt1-90-adquisicin de datos, donde k=o,1,2.2 . El experimento se repite k veces. Las seales de FID se miden y plotean como s(t1, t2), donde t1 y t2 son variables independientes. Se aplica la transformada de Fourier a los valores digitales de t1 y t2 para obtener el espectro S(1, 2) en frecuencia. Consideremos dos protones, A y B, que estn acoplados escalarmente. Despus del primer pulso de 90, durante el tiempo de demora t1, cada protn resuena a su frecuencia de Larmor, A y B; aunque en realidad dos frecuencias estn involucradas para cada ncleo debido al acoplamiento, A JAB y B JAB. Despus del segundo pulso de 90, podra parecer como que el pulso no tiene efecto sobre los espines porque siguen precesando a las mismas frecuencias de Larmor. Alternativamente, una porcin de la magnetizacin asociada al espn A durante el tiempo t1 puede ser transferida al espn B durante t2. Este resultado viene del proceso conocido como Transferencia Coherente (Coherence Transfer). Coherencia significa que un grupo de espines parecidos tienen la misma fase en el plano xy. En otras palabras, una porcin de la magnetizacin que precesaba a B durante t1 ahora precesa a A durante t2.
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En el espectro que se obtiene hay picos que estn sobre una diagonal, estos picos son el resultado de la evolucin de la magnetizacin que tiene frecuencias de transicin originadas por la interaccin de espines iguales durante ambas transiciones; NO DAN INFORMACION. Los picos que estn fuera de la diagonal son los importantes porque resultan de la interaccin de espines distintos que estn acoplados de forma escalar. El espectro es simtrico respecto a la diagonal. Teniendo en cuenta que los crosspeaks que se observan corresponden a protones separados por tres o menos enlaces en la estructura de los aminocidos (AA), el espectro de COSY permite identificar los residuos de los distintos AA que componen la molcula. Hay una zona del espectro denominada zona de la huella dactilar que resulta de la interseccin del rango 7-10ppm de los protones amdicos con el rango 46ppm de los protones alfa. En esta zona va a haber un crosspeak por cada AA, excepto en el caso de la prolina, que no tiene protn alfa, y en el caso de la glicina, que tiene dos protones alfa. Si quiero asignar tengo que fijarme en las zonas en las cadenas laterales del espectro, se asignan puntos en la diagonal empezando por la parte mas resuelta. El tiempo que lleva hacer un 2D respecto a uno normal es mucho mayor, por lo que solo 1 es ventajoso usarlo cuando tengo muchos H. Hay veces que existe una superposicin de 2 crosspeaks, que puede deberse a: 2 ncleos interaccionando con un tercero Ncleos sin relacin y los 2 crosspeaks caen casualmente en el mismo lugar Para poder discernir entre estas posibilidades se hace un R-Cosy. En estos experimentos, se irradia con secuencias de pulso de tiempos intermedios donde interaccionan los spines: COSY interaccin escalar
Brenda Fina
NOESY interaccin dipolar En protenas de gran tamao, la resolucin del 2D no es suficiente, entonces se realiza un 3D, que al igual que en el 4D, se usan los trazos bidimensionales. Otra manera de resolver los espectros es con la utilizacin de Heteronucleos, en los cuales se puede ver la correlacin HN o HC.
Relayed COSY (R-COSY): si hay dos seales que caen en la misma zona de frecuencia, esto puede deberse a ncleos que estn interaccionando con un tercero en comn o simplemente son ncleos que no tienen nada que ver. Para diferenciar entre estos dos casos, se realiza este experimento que produce un espectro en el cual veo crosspeaks entre ncleos que estn interaccionando con un tercero en comn. El crosspeak no significa que estn interaccionando entre ellos. De esta forma, si A y C estn acoplados a B de forma independiente, voy a ver un crosspeak formado por A y C a la altura de B. si vuelvo a tener una superposicin de picos hago un DR-COSY o un TOCSY.
Total correlation spectroscopy (TOCSY): me permite ver ncleos que estn acoplados directamente y ncleos que estn acoplados a un tercero en comn, es decir que es la sumatoria del COSY y R-COSY. Sirve para caracterizar los sistemas de spin completos: hay un sistema de spin para cada AA, pudiendo reconocerse entre que residuos estn involucrados.
RMN Heteronuclear 15 13 Se marca la protena con N o C y se estudia la interaccion HN o HC. Esto tiene la ventaja de que estos ncleos, por lo general, tienen J de 1er orden, porque solo estn separados por un solo enlace y la 1 interaccion es muy fuerte. Adems, una protena tiene menos cantidad de N y C que de H. Estos C y N son ms sensibles al ambiente qumico, entonces tienen ms rango de desplazamiento qumico, por lo que las seales estn ms dispersas y menos superpuestas Resolucin. 15 Para marcar con N: se trabaja con protenas recombinantes, expresadas en una bacteria. 13 Para marcar con C: tambin se trabaja con protenas recombinantes. En general esto posee un problema intrnseco: los heteronucleos activos son menos abundantes en la naturaleza y tienen ctes giromagneticas muy bajas, entonces son muy difciles de observar sensibilidad
Brenda Fina
Para resolver el problema de las se desarrollo la Deteccin de Heteronucleos mediante H (HSQC). Es un experimento de deteccin inversa, se detecta la seal del heteronucleo a travs del protn que es ms 1 sensible y ms abundante, es decir, se excita al heteronucleo, le pasa la informacin al H y uno lo detecta. 1 15 Se aplica un pulso excitando los H, lo cual es transferido a los N; se deja relajar y se aplica otro pulso a distintos tiempos, observando as como el N le transfiere la magnetizacin al H. As se puede determinar si el 1 N esta asociado al H. Los H que estn interactuando con los ncleos marcados van a tener frecuencias distintas a la frecuencia de Larmor de los que no estn interactuando.
15
Espectroscopia de Magnificacin del Overhauser Nuclear (NOESY) Secuencia de pulsos que permite ver el acoplamiento dipolar. La secuencia de pulso es 90-t1-90-m90-t2-adquisicin de datos. En el delay de equilibrio y el pulso inicial de 90, se prepara al ncleo llevando el M al plano xy. Durante t1 los ncleos son marcados por frecuencias por sus valores de desplazamiento qumico. El 2do pulso de 90 rota parte de la magnetizacin de nuevo al eje z. Durante el m la magnetizacin longitudinal puede relajarse, esto produce una mezcla de magnetizacin entre ncleos que estn relacionados por el mecanismo de relajacin dipolar. El tercer pulso es necesario para llevar la magnetizacin al plano xy y poder detectar la seal durante el perodo t2. Los componentes de magnetizacin que no intercambien con otras componentes durante m, mantienen sus frecuencias iguales en t1 y t2. Por esta razn, los picos correspondientes caen sobre la diagonal en el espectro. Por otro lado, un intercambio de magnetizacin entre dos componentes debido al acoplamiento dipolar durante el perodo de mezclado se manifiesta con el cruce de picos (crosspeaks). Fundamentalmente, el espectro en dos dimensiones de NOESY muestra todas las combinaciones posibles de protones en la molcula. Un cruce de picos (crosspeaks) indica que la pareja de protones est separada por menos de 5, mientras que la ausencia de pico indica una distancia mayor.
Brenda Fina
Espectroscopia de Relajacin Transversal Optimizada (TROSY) Esta tcnica fue desarrollada para superar las limitaciones que presentan otras tcnicas debido al aumento de la fuerza del campo magntico externo. En experimentos heteronucleares generales, se produce un gran aumento en el ancho de banda debido al alto grado de relajacin transversal que se produce en campos magnticos fuertes. En la tcnica de TROSY, primero se crea la magnetizacin del protn. Despus, sta es transferida al 15 ncleo N por un elemento que transfiere la polarizacin. Despus de la frecuencia de marcado de la 15 magnetizacin del N durante el perodo de evolucin, t1, 1 la magnetizacin es transferida nuevamente a H por un 1 elemento que transfiere polarizacin reversa y detectada en H durante el tiempo de adquisicin, t2. La proporcin de de relajacin transversal nuclear aumenta con la masa molecular de la molcula. Esta tcnica utiliza el desacoplamiento de los ncleos durante los perodos de evolucin y adquisicin para tener espectros ms simples y mejorar la sensibilidad. No obstante, a campos magnticos altos, la 1 15 13 anisotropa del corrimiento qumico (CSA) de los ncleos de H, N y C pueden ser fuentes importantes de relajacin transversal, adems de la relajacin del acoplamiento dipolar que est siempre presente. TROSY explota constructivamente la interferencia entre la relajacin del acoplamiento dipolar y la relajacin de la anisotropa del corrimiento qumico (CSA), y utiliza la relajacin CSA a campos altos para cancelar la relajacin dipolar independiente del campo. Usando esta tcnica, la estructura de multiplete se desacopla pero slo la lnea ms angosta y con la relajacin ms lenta de cada multiplete es retenida. RMN Multidimensional Homo y Heteronuclear Al igual que en RMN en dos dimensiones, los ejes en tres y cuatro dimensiones corresponden a tres y cuatro dominios de frecuencia, respectivamente. Los perodos que constituyen las secuencias de pulsos son bsicamente las mismas, slo que se van agregando etapas antes de la deteccin: 2D RMN: PaEa(t1) Ma Da(t2) 3D RMN: PaEa(t1) Ma Eb(t2) Mb Db(t3) 4D RMN: PaEa(t1) Ma Eb(t2) Mb Ec(t3) Mc Dc(t4) La aplicabilidad de experimento en tres dimensiones con homoncleos est limitado a molculas con masas iguales o menores que 10KDa. En cambio, el experimento en tres y cuatro dimensiones con heteroncleos permite el estudio de molculas con masas de 25KDa. El principal objetivo de los 1 1 experimentos de RMN heteronucleares es obtener la mayor cantidad de picos H- H NOE individuales en el sistema estudiado. Alineamiento Estrico Inducido Se trata de una nueva clase de experimento basado en la anisotropa de las interacciones magnticas que normalmente no son observadas en espectros de RMN de alta resolucin es estado lquido. Los experimentos dan restricciones estructurales de largo alcance que estn basadas en la orientacin, y no en la distancia. Dependen de la medicin del acoplamiento dipolar residual, y, en algunos casos, del CSA bajo condiciones particulares.
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Acoplamiento Dipolar Residual El acoplamiento dipolar es una interaccin entre ncleos vecinos que se produce porque la corriente magntica de uno de los ncleos afecta el campo magntico esttico que est experimentando el otro ncleo. La componente z del campo dipolar del ncleo I cambia la frecuencia de resonancia del ncleo S en una magnitud que depende de la distancia internuclear, r, y del ngulo entre los vectores internucleares I-S y la direccin del campo magntico externo, B. La interaccin dipolar, DIS, est dada por, DIS = cte (ISh/4 r IS) (3cos2-1)/2) Los smbolos denotan un promedio de tiempo. En una solucin isotrpica, la interaccin dipolar internuclear es cero debido al difusin Browniana rotacional. Como consecuencia, un espectro de RMN de una solucin muestra lneas de resonancia finas; pero no tiene informacin rotacional valiosa. La mayora de las biomolculas presentan algn grado susceptibilidad anisotrpica magntica que provoca su alineamiento en un campo magntico y lleva a un movimiento Browniano anisotrpico (tumbar), pero este alineamiento no es muy efectivo. Se puede conseguir un buen grado de alineamiento en un campo magntico si se utilizan agentes orientacionales, como ser. Bicelas fosfolpidas planas, virus o fagos con forma de vara, membranas y geles polimricos. En el caso de las bicelas, las protenas y pptidos se alinean por la presencia de superficies discoidales orientadas. En una solucin acuosa la protena tumba rpidamente, pero de forma anisotrpica, en el espacio interbicelar. En el caso de fagos, las biomolculas parecen alinearse debido a un mecanismo estrico y no por la unin de las macromolculas con el fago. El alineamiento parece estar inducido por colisiones entre la molcula asimtrica y el fago alineado magnticamente. Con estos agentes logro una mayor resolucin el espectro de RMN. Anisotropa del Corrimiento Qumico (CSA) Los corrimientos qumicos tambin son interacciones de espn anisotrpicas y pueden contribuir con informacin estructural. El corrimiento qumico surge porque ncleos en distintos grupos funcionales resuenan a distintas frecuencia dependiendo del apantallamiento electrnico del entorno. Los entornos electrnicos son rara vez isotrpicos, entonces los apantallamientos son distintos segn la orientacin que tengan los grupos funcionales. Por esta razn, el corrimiento qumico tiene una dependencia angular que es similar a la del acoplamiento residual. Los resultados con macromolculas orientadas muestran que el acoplamiento dipolar residual y CSA no tienen ms un valor de cero y pueden ser medidos. Los parmetros resultantes dan una valiosa informacin estructural.
2 3
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RMN DE PROTEINAS En RMN se puede elegir lo que quiero ver, se hacen experimentos de secuencias de pulsos (al C, al N o al H) para ver selectivamente algunas cosas. Los distintos experimentos lo que hacen es mandar al plano xy lo que quiero ver y dejar perpendicular lo que no quiero ver. Antes de hacer las asignaciones y ver estructuras por RMN es indispensable conocer la frecuencia de AA de la protena. Como primera medida tenemos que tener en cuenta que no TODOS los ncleos estn mutuamente acoplados. Cada AA da lugar a un sub-espectro diferente (sistema de spin: NHCHR) que es ms simple que el espectro completo de la protena. Regiones del espectro corresponden a diferentes partes de los AA y la estructura terciaria incrementa la dispersin de las resonancias, es decir, los no van a estar todos juntos en una zona sino dispersados por el espectro.
H -H Metil (Leu, Val, Ile)
Interacciones del backbone (Tener cuidado con la Gly y Pro)
HN-H
Metil (Ala, Thr)
Aromticos
1) Lo primero que se debe hacer es la asignacin de la secuencia, es decir, poner a cada seal una etiqueta (decir a que residuo pertenece cada C, N o H). Para esto se debe conocer la secuencia de AA.
Estrategia bsica para asignar resonancias en una protena I. Identificar las resonancias para cada AA sistema de spin por acoplamiento escalar.
T L S G
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II. Poner los AA en orden acoplamiento dipolar Asignacin secuencial (R-G-S, T-L-G-S) se debe poner no solo el nombre del residuo (Cys) sino 134 tambin la posicin en la secuencia (Cys ) 1 2 3 4 5 6 7 Asignacin especifica de secuencia R -G -S - T -L -G -S I. Lo que primero se hace es analizar la zona de mayor dispersin, es decir, la de los H (entre 7 y 10 N ppm); se mira en la zona de H -H , es decir, veo el enlace peptdico. Es la zona de mayor dispersin porque hay pocos NH y abarcan mayores desplazamientos qumicos. COSY el acoplamiento escalar permite identificar cada sistema de spin de cada AA. (2D HOMONUCLEAR)
N
Excepciones: la Pro no tiene NH y la Gly tiene 2 H . Cada NH ve su propio H porque para observar el H del AA siguiente hay 4 enlaces y no se ve acoplamiento. El H entonces se acopla con el NH y con la cadena lateral, es decir, H, H , etc esta empaquetado en un sistema de spin NHCHR. Las constantes de acoplamiento 3J estn restringidas a cada AA. Los espectros suelen ser simtricos con respecto a la diagonal. Como cada AA tiene un sistema de spin caracterstico, se puede ir sabiendo que AAs componen la estructura primaria de la protena, porque se N conocen los patrones de spin de cada AA. En la huella dactilar (H -H ) se cuentan los picos nmero de AA. As: COSY (1 acoplamiento) R-COSY (2 acoplam) DR-COSY (3 acoplam) TOCSY (todos)
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Cada NH en cada lnea voy a tener el sistema de spin completo. Ventaja: no tengo que mirar la zona de alifticos (picos muy juntos) y no se superponen. Tambin se mira la zona de los H entre 4 y 6 ppm para ver que protones estn acoplados con que NH. Pero para poder distinguir en que posicin estn (por ejemplo 2 Gly) se hace el NOESY. se observan los picos de los residuos i a (i+1). Se mira especficamente quien es el que II. NOESY tiene al lado, acoplamiento interresiduo. Los crosspeaks son para distancias < 5. La intensidad de cada pico se relaciona con la distancia internuclear. En el NOESY no hay regiones selectivas, se ven 4 cuadrantes y las interacciones de todos con todos. Si con el COSY ya se cuales son los protones y me anoto los desplazamientos qumicos, voy al espectro de NOESY y miro esos protones y veo si estn cerca (crosspeak) o estn lejos (no crosspeak), entonces, saco la DISTANCIA. Lo puedo usar cualitativamente (estn cerca o lejos) o cuantitativamente (saco distancia a travs de la intensidad del pico).
Los experimentos NOESY pueden utilizarse para detectar acoplamientos dipolares de corto, medio y largo alcance. En general, lo que se hace es COSY-NOESY WALK
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Para evitar esta tarea tan ardua, tambin se puede hacer un EXPERIMENTO DE DOBLE MARCA CON HETERONUCLEOS.
2) Asignacin de cadenas laterales COSY Se utiliza el COSY, pero ahora se trabaja en la zona donde interacciona el H con el resto de la cadena lateral, por ejemplo con el H; uno corrobora con la frecuencia. Existe un diagrama de conectividad para cada AA: los patrones de acoplamiento entre los protones de un AA van a ser siempre los mismos, van a cambiar los desplazamientos qumicos debido a que el ambiente es distinto. Se mira en la zona de H - H .
3) Estructura secundaria Este es un paso intermedio entre la asignacin y la estructura terciaria. Si se quiere ver estructura secundaria, se puede estudiar solamente asignando el backbone, sin necesidad de las cadenas laterales, porque toda la informacin la tengo asignando los NH y los . En el caso que tengamos protenas complejas que no me interesa la estructura, pero quiero ver la interaccin dinmica, no necesito asignar cadenas laterales. Se puede obtener datos de estructura secundaria a partir de: desplazamientos qumicos, acoplamientos dipolares, acoplamientos escalares, cte de acoplamiento J y ngulos de torsin. Se puede hacer mediante la medicin de NOEs o de J-couplings. As para estudiar la estructura secundaria se tienen que plantear las restricciones; se puede medir: Distancia NOESY Desplazamiento qumicos con HETERONUCLEOS 1 1 ngulos diedros se calculan con los J 1D H- H o COSY En cada estructura secundaria tengo geometras que se repiten, voy a tener distancias (acop dipolar) tpicas de cada estructura secundaria y ngulos diedros (acop escalar) que se repiten en y en . Se pueden usar los desplazamientos qumicos, sobre todo de heteronucleos, como sensores de la estructura secundaria. Siempre los heteronucleos son mucho ms tiles porque tienen ms dispersin intrnseca que el protn.
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Otra cosa que se puede utilizar son los NOEs, el acoplamiento dipolar. En el caso de la -hlice, despus de una vuelta, voy a tener NOEs entre un residuo y el otro que esta 4 mas adelante en la secuencia. Si hay un NOE entre una Gly de una punta con una Ala de la otra punta, quiere decir que es una -hlice, nunca puede ser una hoja-. Voy a tener distancias caractersticas de las hojas- y voy a poder diferenciar paralelas de anti-paralelas. Ventaja: voy a poder asignar residuo por residuo en que estructura esta y no solo hablar de porcentaje como en dicrosmo.
Distancias tpicas para distinguir un -hlice de una hoja-: adems de tener un NOE entre un residuo y el que esta 3 o 4 posiciones mas adelante, en la -hlice voy a tener un NOE muy intenso entre los NH de residuos contiguos, mientras que en una hoja- voy a tener un NOE muy intenso entre el H y el NH de residuos contiguos.
El otro criterio que tengo es que las constantes de acoplamiento J las puedo correlacionar con los ngulos diedros. Valores caractersticos: un -hlice tiene una J=4hz, las hojas- J=9-10 Hz e incluso hay diferencia entre las que son paralelas y antiparalelas.
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Para calcular las J se pueden hacer 2 experimentos: 1 1 1. Espectro comn, 1D H- H, pero como se ve hay mucha superposicin de los picos, por lo que se 1 1 hace un 2D H- H (COSY).
2. En un COSY con la protena acoplada, de modo que se pueda ver bien el coplamiento:
4) Estructura terciaria Para determinarla se miden los NOEs entre residuos que estn alejados en la secuencia, pero cercanos en el espectro. Esto se denomina NOE de largo alcance: se ingresan los datos en una compu y se obtiene una familia de estructuras posibles (DYANA). La desviacin media estndar (rmsd) es un parmetro que da medida de la confianza que se le puede tener a la estructura. Un rmsd indica que hay mucha movilidad, por lo tanto, da incertidumbre. Un rmsd<1 es una buena aproximacin a la estructura.
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Mtodos de marcado 15 13 Para introducir N o C se utilizan, por lo general, mtodos biosintticos utilizando como organismo 15 13 husped a E. Coli, levaduras, etc. En general, los reactivos son: NH4Cl, [ C] glucosa y D2O. En general: 1 H 1D: hasta 10KDa 1 15 H- N 2D: hasta 15KDa (preferible por su bajo costo) 1 15 13 H- N- C 3D: hasta 20KDa (ms caro) Aumenta la resolucin 1 15 13 1 H- N- C- H: hasta 20-30KDa TROSY: hasta ahora no hay lmites H- N HSQC: detecta el acoplamiento escalar de un enlace ( J). Veo una seal H- N por cada residuo, as tengo un patrn general de toda la protena. Sirve para distinguir plegamiento de protenas.
1 15 1 1 15
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Estrategia H homonuclear extendida: cuando el backbone H se superpone 15 15 1 1 con N Heteronuclear 3D aumenta la resolucin ( N Dispersed H- H TOCSY)
1
se utiliza la dispersin
H 1H 15N
HSQC
TOCSY
Experimento de pares, doble marca 15 13 Se marca con N y con C. Se observan residuos consecutivos, no necesita el NOESY. Lo que se hace es seleccionar los J de primer orden los enlaces que se quieren ver, porque los J de los distintos enlaces son distintos.
Por ejemplo: HNCA/HN(CO)CA (3D) en este caso se ve la interaccin del HN con el C del mismo AA (intramolecular) o del AA contiguo (intermolecular), pasando por el C=O.
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1.HNCA
el HN ve el C de su propio AA
2.HN(CO)CA
El HN ve el C del AA contiguo.
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ESTUDIOS ESTRUCTURALES Y DINMICOS Del anlisis de los datos obtenidos por RMN, se obtiene aproximadamente un grupo de 50 modelos estructurales; esto es distinto a lo que sucede con cristalografa de rayo X que genera slo un set de coordenadas dando lugar a una estructura. Por esta razn, los modelos obtenidos por RMN deben ser juzgados por distintos criterios que los obtenidos por de estructuras ms rgidas en cristalografa. Indistintamente del algoritmo utilizado, cualquier estructura determinada por RMN busca un mnimo de la funcin Etot, dada por, Etot = Ecov + Evdw + ERMN Donde: Ecov: representa la geometra covalente (enlaces, ngulos, planaridad y quiralidad). Evdw: representa los contactos que regiones que no estn enlazadas. ERMN: representa las restricciones obtenidas por RMN. Los dos primeros trminos tienen asociada mucha incertidumbre, y la mayor determinacin de precisin reside en las restricciones de RMN. El experimento de RMN que aporta mayor cantidad de informacin geomtrica (o de restricciones geomtricas) es el NOE. La exactitud de las estructuras obtenidas por RMN se ve afectada por errores en las restricciones de las distancias interprotnicas, estos errores surgen de tres fuentes: mal asignamiento, errores en las estimaciones de distancias y restricciones de NOE incompletas. La mejor forma de chequear cuan correctos son estos datos es verificando que todas las distancias cortas interprotnicas (<3.5) ests en el espectro de NOE. Adems de las restricciones aportadas por el NOE, hay otros experimentos de RMN que aportan informacin estructural de corto alcance como ser, cte de acoplamiento escalar de tres enlaces, corrimiento 13 1 qumico secundario C, y corrimiento qumico de H. Hay otros experimentos de RMN que aportan restricciones que definen informacin estructural de largo alcance. El primer experimento se basa en la 15 dependencia de las ctes de tiempo de relajacin transversal (T2) y longitudinal (Tl) de los heteroncleos ( N 13 o C) con la difusin rotacional anisotrpica. El segundo experimento depende del acoplamiento dipolar residual en macromolculas orientadas. Estos dos experimentos aportan restricciones que estn relacionadas de manera geomtrica a la orientacin del vector de un enlace internuclear con respecto a aun tensor externo. En el caso de T1/T2, el tensor es el tensor de difusin; y en el caso del acoplamiento dipolar residual, el tensor puede ser el tensor de susceptibilidad magntica o el tensor de alineamiento molecular. Ambos mtodos permiten el posicionamiento relativo de elementos estructurales que no tienen una distancia interprotnica corta. Estructura en Tres Dimensiones de Macromolculas Biolgicas Protenas: Protenas pequeas (6-10 KDa): en principio, la estructura de protenas compactas y pequeas de 100 AA o menos puede ser determinada con las restricciones de NOE. En la prctica, estas restricciones se suplementan con restricciones basadas en acoplamiento J y en el corrimiento qumico. Protenas medianas (20-60 KDa): se utiliza marcado con istopos. En la tcnica de doble marcado, 13 15 un tipo de AA se marca con C en la posicin del carbonilo y un segundo tipo de AA se marca con N. 13 15 Fragmentos de dipptidos en los que un C prosigue un N, se pueden identificar fcilmente va el 1 15 desdoblamiento de los picos por el acoplamiento J en un espectro de correlacin H- N. Para protenas de 150-200 AA, el enriquecimiento completo de la protena con istopos y el desarrollo de RMN tridimensional
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permite que el anlisis estructural sea ms fcil. Sin embargo, el estudio de protenas con ms de 200-300 AA todava resulta dificultoso. Para estos casos, la sensibilidad ha mejorado gracias a la tcnica de 2 deuteracin (marcado con deuterio, H) al azar. El nivel de deuteracin depende de la masa molecular. Complejos moleculares grandes: las tcnicas de TROSY y CRINEPT fueron desarrolladas para estos casos y tienen muy buenos resultados. Interaccin protena-protena: se ha desarrollado una tcnica de RMN para estudiar residuos de la 2 interfase. sta se basa en que la protena target no est marcada mientras que el ligando proteico s ( H15 1 N), excepto por sus protones amidas. Si se aplica un campo de radiofrecuencia a los protones alifticos ( H) de la protena target, sus protones aromticos y amidas se saturan debido a la difusin de espn (este 1 fenmeno es altamente efectivo si los espines de H se encuentran cerca). La saturacin puede ser 1 1 transferida desde la molcula target a la molcula marcada a travs de contactos cercanos entre H- H de la interface formada por el complejo. cidos Nuclicos: El NOE arroja restricciones insuficientes para la determinacin de la estructura porque los c Nuclicos tienen baja densidad de protones (0.35) y no presentan un plegamiento globular. Estas limitaciones se superaron con el desarrollo de marcado isotrpico selectivo y el alineamiento molecular en medios ordenados. En molculas con mltiples dominios, se puede utilizar acoplamiento dipolar para determinar la orientacin relativa de los distintos dominios. Para aplicar esta tcnica es necesario saber la estructura secundaria de los dominios. RMN permite una observacin directa de los puentes hidrgeno entre las pares de bases a travs del acoplamiento escalar entre los protones aminos, el dador y el aceptor. Carbohidratos: Estos compuestos presentan gran movilidad, tienen dos tipos de movimientos internos: uno consiste en un movimiento modesto en el que el ngulo diedro se mueve 15; y el otro es un movimiento ms pronunciado de los ngulos diedros. En este ltimo caso, el NOE no puede asociarlo a una nica conformacin y la molcula se considera como un grupo de conformeros. El avance en RMN de alta resolucin permite medir el acoplamiento dipolar en medios orientados. En algunos casos, se mide el acoplamiento dipolar residual como la diferencia entre el acoplamiento en un medio orientado y el acoplamiento en un medio isotrpico.
Dinmica de Macromolculas Biolgicas Muchos experimentos de RMN permiten monitorear la dinmica de las macromolculas en un rango de tiempo amplio. Por ejemplo, la relajacin nuclear de espn es sensible a movimientos que ocurren en tiempos ms cortos que la correlacin molecular (10-20ns); el intercambio de corrimiento qumico entre dos sitios ocurre en micro o milisegundos; y los efectos de resolucin espectral y el ensanchamiento de banda ocurren en el orden de los segundos. Estas caractersticas permiten que RMN sea una tcnica nica para el estudio de dinmica. RMN permite estudiar: Funcionalidad de una molcula Movilidad Contribuciones entrpicas a los fenmenos de unin Folding unfolding Para los fenmenos biolgicos, tenemos distintas escalas de tiempo. Dentro de los mas rpidos se encuentran la rotacin molecular o las reorientaciones de bucles.
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Intercambio qumico Se encuentra dentro de los fenmenos ms lentos. Un cambio conformacional puede deberse a: Unin de un ligando Temperatura Solvente Un residuo puede protonarse y desprotonarse, por lo que se esperan 2 seales: una para la forma protonada y otra para la protonada. Sin embargo, debido a la escala de tiempo, stas 2 seales no se observan; se ve un promedio de las seales. Para que pueda ser visto por RMN, le velocidad de intercambio del fenmeno tiene que ser menor que la diferencia de frecuencia de ambos.
Se observa que k depende de la temperatura T intercambio. Para considerar a un proceso rpido, la velocidad debe ser 3-4 veces mayor que W, esto puede obtenerse con el . Consideremos que tenemos una Y disuelta en agua, la cual tiene 4 H aromticos con 2 tipos de H 1 equivalentes se ven 2 seales. En una protena, obtendr 4 seales porque dejara de haber H equivalentes; sin embargo, si T, las 4 seales pasan a 2, lo que sugerira que al T la Y empieza a tener movilidad.
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Otra posibilidad es disolver la protena en D2O y se observa el subespectro de H en la zona de 7-10 1 ppm a distintos tiempos. Cuando T va aumentando el intercambio N- H que se vuelven N-D van desapareciendo progresivamente crosspeaks (porque D2O no tiene seal en RMN). Luego, depende de la exposicin al solvente y la velocidad de intercambio sirva para el estudio de Folding.
Dinmica de protenas provenientes de medidas de relajacin Asumimos que los movimientos atmicos internos de una macromolcula son independientes de su geometra global y provienen de tumbos o de la difusin transversal. Es decir, que el tiempo de correlacin efectivo interno, e, es mucho menor que el tiempo de correlacin rotacional, c (tiempo de correlacin: es el tiempo caracterstico entre fluctuaciones significantes del campo magntico local que experimenta un espn debido a la movilidad molecular). Las tres velocidades de relajacin medidas por RMN, R1=1/Tl, R2=1/T2 y la heteronuclear NOE, son sensibles a la movilidad interna en la escala de los nanosegundos. 2 En un modelo, se obtienen dos parmetros independientes: el parmetro de orden, S , que es la medida de las restricciones espaciales del movimiento; y e. 2 El parmetro de orden, S , mide la magnitud de la fluctuacin angular del vector de un enlace qumico 2 en la protena, por lo tanto, refleja la flexibilidad de la cadena en ese sitio. S se interpreta como si estuviera describiendo la cantidad de libertad espacial que tiene el vector como resultado de la movilidad interna. Si 2 el vector difunde en forma de cono, S decrece rpidamente a medida que el ngulo del cono c aumenta de 0 a 75. Si la movilidad del vector es completamente libre, es decir que todas las orientaciones de son
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igualmente probables, S=0; mientras que si la movilidad est completamente restringida, S=1. Esto se 15 estudia con marcado de N.
Mediante T1 y T2 puede determinarse si es la mayor movilidad la razn para los valores altos de rmsd en una familia de estructuras. Interaccin con un ligando Hay experimentos que determinan si una conformacin es igual cuando se une un ligando. Se realiza 1 midiendo transferencia de NOE. Se hace un NOE entre 2 H cuando el ligando esta libre y dar una distancia, si cambia la distancia cuando se une el ligando, entonces cambio la conformacin. Tambin puede estudiarse por desplazamientos qumicos. Existe otro NOE especial NOE editado que se basa en colocar filtros que seleccionan NOEs de 2 molculas con un patrn de marcado nico. Dinmica de Protenas provenientes del intercambio del protn amida El intercambio entre el protn amida en protenas y el solvente puede ser medido de diferentes maneras. Los intercambios lentos (de minutos a das) son determinados siguiendo la prdida de la seal del protn amida de una protena disuelta en D2O, y provee informacin sobre la accesibilidad relativa del solvente a los distintos compartimentos de la estructura secundaria y terciaria. Los intercambios rpidos (5500ms) pueden ser monitoreados siguiendo el intercambio de la magnetizacin del protn amida con los protones del agua. A pH altos, el intercambio de protones es muy rpido, y el intercambio de la magnetizacin mide directamente la velocidad lmite de abertura conformacional que permite el acceso del solvente. Parmetros de dinmica de RMN Nmero de seales por tomo: mltiple seales para intercambios lentos entre estados conformacionales. Ancho de banda: angostos para movimientos rpidos, anchos para movimientos lentos; depende de la masa molecular y del estado conformacional. Intercambio de NH con solvente: tiempos lentos. Requiere eventos de unfolding locales o globales, los NH involucrados en enlaces se intercambian muy lentamente, las regiones flexibles o de superficie tienen un intercambio rpido. Mediciones de relajacin: R1, R2 y NOE heteronuclear. La calidad de las estructuras obtenidas esta dado por rmsd (la desviacin media cuadrtica, rmsd) es una medida utilizada con frecuencia de las diferencias entre los valores pronosticados por un modelo o un
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estimador y los valores observados de la realidad. rmsd es una buena medida de la precisin. Puedo 2 comparar los resultados de rmsd con los de S para saber si los valores altos de rmsd se deben a una alta 2 flexibilidad de la regin (S bajos). RMN en estado slido Obtener informacin de un espectro de RMN en estado slidos es mucho ms complicado que en estado lquido. Es necesario aplicar secuencias de pulsos ms complicados, usar tcnicas especiales para las muestras y aplicar energas de radiofrecuencias superiores un campo magntico externo ms fuerte. La principal diferencia entre RMN en solucin y en estado slido es la movilidad de las molculas en la muestra. La principal restriccin para muestras en solucin es que deben tener un movimiento isotrpico mientras que para muestras slidas mientras ms rgidas mejor. Esto refleja diferencia entre RMN en estado slido, donde observo sistemas anisotrpicos, y RMN en solucin, donde veo sistemas isotrpicos. El rango de masa molecular que puede ser estudiado por RMN en estado slido no tiene lmites. En realidad los espectros de muestras slidas ofrecen ms informacin que los otros pero esta informacin est escondida debajo de picos anchos y solapados. Para eliminar esta imitacin, se coloca a la muestra en un ngulo caracterstico (ngulo mgico) con respecto al campo magntico externo y de esta forma se elimina el 2 trmino 3cos -1, que est presente en el corrimiento qumico y en el acoplamiento dipolar. Esto resulta en espectros mejor resueltos con bandas ms angostas. Formacin de imgenes por RMN (RMN imaging) RMI se basa en utilizar un gradiente de campo magntico con el fin de dispersar las frecuencias de resonancia de elementos con distintos volmenes. En este experimento, se detecta la sensibilidad de cada ncleo ante pequeos cambios en el campo magntico aplicado debido a los distintos microambientes. Como estos cambios son muy pequeos es necesario aplicar un campo magntico homogneo y fuerte a travs del volumen de la muestra. La intensidad de la seal es proporcional a la cantidad de espines por unidad de volumen. Para obtener una imagen tridimensional, el objeto o el campo magntico deben rotarse para producir distintas secciones en distintas direcciones, y luego el objeto es reconstruido usando reconstruccin de imagen. Tipos de experimentos: Acoplamiento Escalar Acoplamiento Dipolar Homonuclear COSY TOCSY NOESY Heteronuclear HSQC TOCSY-HETERO NOESY-HSQC NOESY-HMQC
Calidad de la estructura obtenida por RMN depende de: 1. N de restricciones 2. Rmsd del ensamblado estructural 3. Violacin de las restricciones 4. Energa de molculas 5. Comparacin con homlogos 6. Calcular otra vez los parmetros experimentales
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Aspectos prcticos B0 homogneo Medio ambiente, temperatura, humedad, precisin Concentracin: 1D 100M-10M nD 400M-50M volumen: 200-300l pureza >95% 15 13 sensibilidad () enriquecimiento con N y C mantener baja la fuerza inica NO cristales

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RMN, RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR

1/2 3/2 1/2 3/2 1, 2

E= B0 h/2 la diferencia de E es muy chica

T2 esta relacionado con r: T2 1/ancho de banda T2 1/ r

Ancho de banda r Para MM de PM, r BAJA RESOLUCION ancho de banda

MM > r > nuevo problema en protenas (MM), mucho .

Arom ati co Amina/da

Protones amdicos Protones

Mtodo de inversin recuperacin para medir Tl

No se ven porque S esta saturado W0 y W2 gobiernan el regreso al equilibrio

Vaco el excitado y lleno el fundamental

Vaco el fundamental y lleno el excitado

Molculas pequeas: movilidad rpida, c 10 s; c >>, c <<1. Dado que: W0 2c /r y W2 12c/r

Macromolculas: movilidad lenta, c 10-8s; c << , c >>1. Dado que:

H -H Metil (Leu, Val, Ile)

Interacciones del backbone (Tener cuidado con la Gly y Pro)

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