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)
durante
4min. Para determinar -glucanos se utiliz un Test kit -glucans of Megazyme
internacional establecido por los Mtodos enzimticos 3.10.1 y 4.16.1 de la
Analytica EBC, 2003. El mtodo consisti en hidrolizar los -glucanos con la
actividad de diversas enzimas:
1. Se tomaron 0.5 g de muestra de harina fina de cebada y se dispersaron
mediante la adicin de etanol acuoso 50% v/v. Posteriormente, la muestra se
ajust a pH= 6.5 con buffer de fosfato de sodio. Se adicionaron 0.2 l de enzima
endo-(13) (14)-D-glucanasa (liquenasa) para convertir los -glucanos en tri
y tetrasacridos. La reaccin se llev a cabo a 40C durante 1h; posteriormente la
muestra se centrifug en una centrfuga (HERMLE Z323K) a 3500 rpm durante 15
min.
IV. MATERIALES Y MTODOS
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2. Los oligosacridos formados, se transformaron a glucosa con la actividad de
la enzima -glucosidasa, para ello, se distribuyeron dos alcuotas de la siguiente
manera:
Alcuota 1 (Muestra): 0.1 l de muestra centrifugada + 0.1 l de -glucosidasa (el
pH se ajust a 4.0 con buffer de acetato de sodio).
Alcuota 2 (Blanco): 0.1 l muestra centrifugada + 0.1 l de buffer de acetato de
sodio pH= 4.0.
Las muestras se incubaron durante 15 min. a 40C.
3. La glucosa obtenida en la reaccin anterior se cuantific mediante la actividad
del complejo glucosa oxidasa/peroxidasa (agente GOPOD), en presencia de 4-
Aminoantipirina y cido p-hidroxibenzico. En esta reaccin ocurri una
degradacin de glucosa hasta obtener quinoniemina (compuesto colorido en
tonos rosas). Para llevar a cabo esta reaccin se adicionaron 3ml del agente
GOPOD a todas las muestras, a los blancos y a los estndares de glucosa; las
muestras se mantuvieron a 40C durante 20 min.
4. Finalmente se ley la absorbancia de las muestras, blancos y glucosa
estndar a 510 nm ( 20 nm) en celdas de vidrio de 1 cm en un espectrofotmetro
ultravioleta GENESIS (TERMOELECTRON).
E Ex xp pr re es si i n n d de e R Re es su ul lt ta ad do os s. .
BS =?E*(F/W)*27
Donde:
BS =-glucanos en % en muestra seca
?E = Absorbancia de la reaccin - absorbancia del blanco
27 = Factor de ajuste para determinacin de -glucanos.
W = Peso de la muestra seca en mg
F = 100 g de glucosa/ absorbancia de 100 mg de glucosa
1g= 1000 mg = 1*106 g
IV. MATERIALES Y MTODOS
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4.3.3 Determinacin de humedad
Se trata de la determinacin de agua contenida en el grano mediante la prdida
de masa que se logra al aplicar un secado bajo condiciones especficas de tiempo
y temperatura, este anlisis se realiz en base a la determinacin de humedad
especificada en los mtodos: 4.2; Analytica EBC, 2003 y 6.4; AOAC, 1990. Se
determinaron dos tipos de humedades a las muestras analizadas.
a) Humedad alcanzada despus del remojo
Se pesaron 3g de cebada remojada en charolas de aluminio previamente taradas,
posteriormente se colocaron en una estufa para secado con recirculacin de aire
(FISHER SCIENTIFIC
)
con recirculacin de aire; las muestras se mantuvieron bajo las condiciones
IV. MATERIALES Y MTODOS
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anteriores hasta obtener una humedad de 3.8 a 7.3% (Analtica EBC; 2003). Se
determin la humedad de las muestras antes de someterlas a secado y
posteriormente cada 6h.
4.5 Diseo de experimentos
En base a las pruebas preeliminares, se realiz un diseo de experimentos (tabla
5) con las condiciones ms importantes de malteado; adems se complement
con referencias de investigaciones similares reportadas en la bibliografa (Yang et
al, 1998; Hornsey, 1999; Jesper et Lars, 2003).
Tabla 5. Factores y niveles para el malteado de 7 variedades de cebada
Etapa de malteado Temperatura Tiempo
1. Remojo 10 C 2 y 4 das
2. Germinacin 16 y 20 C 2 y 4 das
3. Secado 55C 58h
El diseo planteado fue de tipo factorial (2
4-1
); este diseo de experimentos se
realiz con el programa estadstico Statgraphics plus, versin 4.0; en la tabla 6 se
muestran detalladamente los tipos de malteado, los cuales se realizaron por
triplicado.
Tabla 6. Matriz del diseo de experimentos del proceso de malteado
Corridas
Tiempo
Remojo
(das)
Tiempo
Germ.
(das)
Temperatura
Germ.
(C)
Temperatura
Secado
(C)
Tiempo
Secado
(h)
1
2
3
4
5
6
7
8
2
2
2
2
4
4
4
4
2
2
4
4
2
2
4
4
16
20
16
20
16
20
16
20
55
55
55
55
55
55
55
55
58
58
58
58
58
58
58
58
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4.6 Malteado de cebada
4.6.1 Seleccin y limpieza
Se realiz una inspeccin visual para evaluar el color y olor de la muestra,
posteriormente, cada una de las variedades se hizo pasar por tamices de nmero
6 y 8 (W. S. Tyler
). Al finalizar el tiempo
de remojo, se determin la humedad de la muestra.
4.6.3 Germinacin
Una vez finalizada la fase de remojo, se elimin el agua de las muestras; las
cebadas remojadas se colocaron en recipientes hermticos de 2L, posteriormente
se sellaron con papel parafilm
). Se determin
humedad despus del secado y las maltas se almacenaron a 5C en bolsas de
plstico con cierre hermtico para evitar contaminaciones posteriores causadas
principalmente por microorganismos.
4.6.5 Molienda y eliminacin de raicillas
Las races originadas durante la germinacin se eliminaron por abrasin de las
maltas (Pelembe et al, 2002); aunque no se cuantific el peso de raicillas
eliminadas. Se realiz una molienda seca a las maltas; las muestras se trituraron
durante 1min. en la picadora manual (MOULINEX PLUS
) de manera que no
hubiese una fragmentacin excesiva del endospermo del grano. (Figueroa, 1985).
4.7 Anlisis de calidad de maltas terminadas
La evaluacin de las maltas se realiz mediante anlisis de prdidas por
malteado, -glucanos, poder diastsico, nitrgeno y protenas.
4.7.1 Prdidas por malteado
El objetivo de este anlisis fue determinar el rendimiento de la cebada ante el
proceso de malteado y consiste en calcular las prdidas de materia prima
despus de haber elaborado la malta (Pelembe et al, 2002; Gomez et al, 1997).
Antes de comenzar el malteado, se obtuvo el peso inicial de cada una de las
muestras de cebada y despus de la fase de secado, se pesaron de nueva cuenta
las maltas para obtener las prdidas por diferencia de peso. Mayores prdidas de
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malta se relacionan con crecimientos excesivos de raicillas o con altos
porcentajes de germinacin (Figueroa, 1985). Las prdidas por malteado no
deben ser mayores que 20 25% pues si estas exceden, el rendimiento de la
malta se considera como deficiente.
E Ex xp pr re es si i n n d de e R Re es su ul lt ta ad do os s. .
Prdida por malteado (%) = ((W1 W2)/ W1)*100.
Donde:
W1 = Peso de la cebada antes del malteado (g)
W2 = Peso de la malta despus del secado (g)
4.7.2 -glucanos en malta
Este anlisis se realiz en malta termi nada, para ello las muestras (1g) se lavaron
con 5 ml de etanol acuoso (50% v/v) y se incubaron en agua hirviendo,
posteriormente, se lavaron otras dos veces con la misma solucin de etanol; las
actividades anteriores se realizaron para remover la glucosa y otros
oligosacridos de bajo peso molecular que pudiesen estar presentes en las
muestras de malta. Despus se procedi como el mtodo descrito en el apartado
4.3.2.
4.7.3 Determinacin del poder diastsico de malta
Esta determinacin consisti en extraer las enzimas a y -amilasas de la malta
con agua a 40C, posteriormente una solucin estndar de almidn fue
hidrolizada por estas enzimas y finalmente se estim por un mtodo yodomtrico
la cantidad de azcares reductores formados por la accin amiloltica. La
determinacin del poder diastsico se realiz en base al mtodo 4.12 de Analytica
EBC, 2003.
1. Extraccin enzimtica. Se sometieron 2g de malta molida con 48ml de agua
a 40C y agitacin durante una hora. Terminada la extraccin de enzimas se
enfri a temperatura ambiente y se filtr con papel filtro # 40.
2. Hidrlisis enzimtica del almidn. Se adicionaron 0.5ml del extracto
enzimtico a 10ml de una solucin de almidn (20 g/L) a pH 4.3 (ajustado con
buffer de acetato de sodio), la hidrlisis se llev a cabo a 20C durante 30min. La
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reaccin anterior se detuvo con la adicin 0.4ml de NaOH (1.0 M), la alcalinidad
de la muestra se comprob con la adicin de timoftalena (color azul claro). Se
prepar un blanco por cada muestra con las mismas condiciones pero sin
muestra de enzimas.
3. Determinacin de azcares reductores. Se adicionaron 2.5 ml de yodo (0.1
M) y 0.3 ml de NaOH a una alcuota de 0.5 ml de la muestra y al blanco.; la
mezcla se mantuvo durante 15min. Cuando la reaccin finaliz se adicionaron
0.45 ml de cido sulfrico (0.5 M) (las muestras cambiaron a color azul opaco).
Posteriormente, las muestras se titularon con una solucin de tiosulfato de sodio
(0.1 M) hasta desaparecer el color azul, el cual form complejos con el yodo que
no reaccion con el cido sulfrico.
E Ex xp pr re es si i n n d de e R Re es su ul lt ta ad do os s. .
DP
1
= F (V
B
-V
T
) DP
2
= (DP
1
*100)/ 100 - M
Donde:
DP
1
= Poder Diastsico en la muestra (Unidades de Windish Kolbalch; UWK)
DP
2
= Poder diastsico en maltas secas (UWK)
V
B
= Valor de titulacin del yodo que no reaccion en el blanco (ml)
V
T
= Valor de titulacin de yodo que no reaccion en la muestra (ml)
F =Factor de correccin (resultados por cada 100g de malta usados para la extraccin.
M = Humedad en malta (%)
4.7.4 Nitrgeno total en malta y determinacin de protenas
Se trata del proceso de determinacin de protenas Kjeldahl-Gunning (Mtodos
3.3.1 y 4.3.1 Analytica EBC, 2003 y Mtodo 46-12, AACC, 2001), el cual se llev a
cabo mediante tres pasos bsicos:
1. Digestin. Se tomaron 3g de malta seca, se adicionaron 20ml de cido sulfrico
concentrado y una mezcla catalizadora formada por sulfato de cobre (0.3g) y
sulfato de potasio (5g). Posteriormente la muestra se someti a 450C, durante 4h
en un equipo de digestin (ESEVE). Durante la digestin, el nitrgeno proteico y
el no proteico se combinan a altas temperaturas con iones de hidrgeno formando
amoniaco, este ltimo vuelve a reaccionar con hidrgeno, cido sulfrico y
oxgeno para formar sulfato de amonio, se libera dixido de carbono y agua como
IV. MATERIALES Y MTODOS
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productos de la digestin. Cuando las muestras tenan un color transparente, se
sacaron y se les adicion 70ml de agua destilada para evitar precipitacin del
catalizador.
2. Las muestras se destilaron en un equipo de destilacin automtico Gerhardt
(Vapodest